JP5334269B2 - イヌ又はヒトの抗原特異的IgEを定量する方法 - Google Patents
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Description
皮内反応によって抗原Xに対する感作が明らかとなったイヌの血清を、抗原Xに対する特異的IgEを含んでいるとみなすことを前提として、前記血清を「標準血清」として用いることにより標準曲線を作成し、抗原特異的IgE定量検査を構築する方法が、一部の抗原(スギ花粉抗原等)では研究で行われてきた(非特許文献2)。しかし、この方法では、使用する標準血清はそれぞれの実験室で設定するため、抗原特異的IgE定量値はLaboratory Unit/mlと表示することになる。したがって、その表示単位はそれぞれの実験室によってその実験毎に特別に設定したものとなり、実験系や実験室が異なる場合は、測定系が同じであっても使用する標準血清が異なることから、測定値をそのまま比較することができなかった。また、同じ実験室内での抗原特異的IgE測定系であっても、抗原が違った場合にはその抗原の感作血清を用いなければならず、抗原間で表示単位を一致させることは不可能であった。したがって、同じ測定系であっても抗原間で抗原特異的IgE量を比較できていなかった(同じLaboratory Unit/mlでも抗原間で比較できない)。これらは、ヒトについてもほぼ同様である(非特許文献1)。
感作イヌの血清から目的の抗原特異的イヌIgEを精製する方法が理論上は考えられる。イヌは総IgE量がもともと多いため、この目的のためには2段階の精製工程が必要となる。まず、IgE吸着カラムで血清中の総IgEを精製し、次に目的抗原吸着カラムで抗原特異的IgEを精製する。しかし、この方法では総IgEを精製することは可能であるが、抗原特異的IgEの精製はIgEの抗原結合力が強いことから、カラムに吸着した抗原特異的IgEをうまく溶出して取り出すことが可能かどうかが大きな課題となる。そのため、総IgEを精製した例はあるが(特許文献4)、実際にイヌやヒトの血清を用いて、上記方法で抗原特異的IgEを精製した実施例はない。
抗原特異的イヌIgE産生ハイブリドーマ細胞株を樹立することができれば、血清から抗原特異的イヌIgEを精製する必要はなくなる。そのためには、イヌの場合は、抗原感作イヌを作製し、そのリンパ節もしくは脾臓の細胞、又は目的抗原で刺激培養した末梢血リンパ球を用い、それらとマウスのミエローマ細胞を融合させなければならない。しかしながら、この方法によってうまく融合する確率は非常に少なく、これまでに1つのクローン(線虫抗原に対するイヌIgE)しか作製されていない(非特許文献4)。しかも、たとえ細胞融合に成功しても、目的のクローンを選別して細胞株として樹立する期間は1年間以上を要し、何十種類の抗原を考えた場合には実用的ではない。ヒトの場合は、倫理上、かかるハイブリドーマの作製は困難である。
(1)で使用する標準血清を実験イヌで作製した場合、その費用がかかることが大きな問題となる。例えば、イヌ1頭購入費10〜20万円とし、感作血清作成期間を2ヶ月として、その飼育費は3万円/イヌ/1ヶ月と算出した場合、標準血清作成には1抗原あたり16〜26万円が最低必要となる。したがって、50抗原の抗原特異的IgE定量検査システムを確立する場合、800万〜1300万円のコストがかかることになる。コストを下げるために1頭のイヌに数種類の抗原感作を行うことも考えられるが、抗原間の交差性を検出してしまう課題を克服することはできない。また、感作イヌ1頭からは100〜200mLの大量の血清が1度に取れるが(毎日測定して300年分に相当)、検査を実施するためにはそれほどの量は必要ない。むしろ血清を長期保管するための冷凍庫スペース等を考えると、感作イヌを作製することは、マウスに比べれば、コストパフォーマンスが非常に悪いこととなる。ヒトの場合は、標準血清を作製することは倫理上不可能である。
[1] 下記の工程(A)〜(D)を含む、抗原特異的イヌIgEを定量する方法:
(A)被験イヌの生体試料と抗原とを接触させ、当該試料中のIgEと当該抗原とを結合させる工程、
(B)イヌのIgEを認識し、かつイヌを除く実験動物のIgEを認識する物質を用いて、工程(A)の抗原で感作した当該実験動物の標準試料中のIgEを測定し、標準曲線を作成する工程、
(C)工程(A)で形成された結合体を、工程(B)で使用したイヌのIgEを認識し、かつイヌを除く実験動物のIgEを認識する物質を用いて検出する工程、及び
(D)工程(C)で検出された結合体量と工程(B)で作成した標準曲線とを用いて被験イヌの生体試料中のIgE量を定量する工程。
[2] 下記の工程(A)〜(E)を含む、アレルギー疾患の診断方法:
(A)被験イヌの生体試料と抗原とを接触させ、当該試料中のIgEと当該抗原とを結合させる工程、
(B)イヌのIgEを認識し、かつイヌを除く実験動物のIgEを認識する物質を用いて、工程(A)の抗原で感作した当該実験動物の標準試料中のIgEを測定し、標準曲線を作成する工程、
(C)工程(A)で形成された結合体を、工程(B)で使用したイヌのIgEを認識し、かつイヌを除く実験動物のIgEを認識する物質を用いて検出する工程、
(D)工程(C)で検出された結合体量と工程(B)で作成した標準曲線とを用いて被験イヌの生体試料中のIgE量を定量する工程、及び
(E)工程(D)の定量結果に基づいて、アレルギー疾患の有無又は程度を判定する工程。
[3] 工程(A)、(B)、(C)及び(D)が抗原毎に同時に又は別々に繰り返される、[1]又は[2]に記載の方法。
[4] 工程(B)が工程(A)、(C)及び(D)と同時に又は別々に行われる、[1]又は[2]に記載の方法。
[5] アレルギー疾患が花粉症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、ワクチン接種後アレルギー、アナフィラキシー、食物アレルギー、高IgE血症を引き起こす疾患、及びIgEが病態に関与していると推測される疾患からなる群より選ばれる少なくとも1種である、[2]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[6] 被験イヌの生体試料が血液、血清、血漿、鼻汁、涙液、唾液、尿又は糞便である、[1]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[7] 前記抗原が植物の花粉、葉茎の乾燥物又はラテックス、食物の抽出物、カビの抽出物及び節足動物の虫体抽出物からなる群より選ばれる少なくとも1種である、[1]〜[6]のいずれかに記載の方法。
[8] 前記抗原がハンノキ、ゴムノキ、ギョウギシバ、シラカンバ、ヒナギク、タンポポ、アキノキリンソウ、カモガヤ、ブタクサ、ハルガヤ、オオアワガエリ、スギ及びヒノキの花粉、葉茎の乾燥物又はラテックス;小麦、七面鳥、大豆、鮭、ライ麦、米、ジャガイモ、豚肉、牛乳、羊肉、卵黄、卵白、トウモロコシ、果物、タラ、鶏肉、ナマズ、牛肉、シシャモ、カニ、エビ及びホヤの食物抽出物;アルテリナリア属、ペニシリウム属及びクラドスポリウムのカビ抽出物;ならびにダニ、ノミ、蚊、ゴキブリ及びガの虫体抽出物からなる群より選ばれる少なくとも1種である、[1]〜[6]のいずれかに記載の方法。
[9] 前記物質がイヌのIgE及びイヌを除く実験動物のIgEの両方を認識する抗体である[1]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[10] 前記実験動物がマウス、ラット、モルモット、ハムスター及びウサギからなる群より選ばれる動物である[1]〜[9]のいずれかに記載の方法。
[11] イヌのIgEを認識し、かつイヌを除く実験動物のIgEを認識する物質、抗原及び当該抗原で感作した当該実験動物の標準試料を別々の容器に含む、抗原特異的イヌIgEの定量キット。
[12] イヌのIgEを認識し、かつイヌを除く実験動物のIgEを認識する物質、抗原、当該抗原で感作した当該実験動物の標準試料及びアレルギー疾患に罹患していない当該実験動物の対照試料を別々の容器に含む、イヌのアレルギー疾患の診断キット。
[13] アレルギー疾患が花粉症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、ワクチン接種後アレルギー、アナフィラキシー、食物アレルギー、高IgE血症を引き起こす疾患及びIgEが病態に関与していると推測される疾患からなる群より選ばれる少なくとも1種である、[12]に記載のキット。
[14] 前記抗原が植物の花粉、葉茎の乾燥物又はラテックス、食物の抽出物、カビの抽出物及び節足動物の虫体抽出物からなる群より選ばれる少なくとも1種である、[11]〜[13]のいずれかに記載のキット。
[15] 前記物質がイヌのIgE及びイヌを除く実験動物のIgEの両方を認識する抗体である[11]〜[14]のいずれかに記載のキット。
[16] 前記実験動物がマウス、ラット、モルモット、ハムスター及びウサギからなる群より選ばれる動物である[11]〜[15]のいずれかに記載のキット。
[17] 下記の工程(A)〜(D)を含む、抗原特異的ヒトIgEを定量する方法:
(A)被験者の生体試料と抗原とを接触させ、当該試料中のIgEと当該抗原とを結合させる工程、
(B)ヒトのIgEを認識し、かつ実験動物のIgEを認識する物質を用いて、工程(A)の抗原で感作した当該実験動物の標準試料中のIgEを測定し、標準曲線を作成する工程、
(C)工程(A)で形成された結合体を、工程(B)で使用したヒトのIgEを認識し、かつ実験動物のIgEを認識する物質を用いて検出する工程、及び
(D)工程(C)で検出された結合体量と工程(B)で作成した標準曲線とを用いて被験者の生体試料中のIgE量を定量する工程。
[18] 工程(A)、(B)、(C)及び(D)が抗原毎に同時に又は別々に繰り返される、[17]に記載の方法。
[19] 工程(B)が工程(A)、(C)及び(D)と同時に又は別々に行われる、[17]に記載の方法。
[20] 被験者の生体試料が血液、血清、血漿、鼻汁、涙液、唾液、尿又は糞便である、[17]〜[19]のいずれかに記載の方法。
[21] 前記抗原が植物の花粉、葉茎の乾燥物又はラテックス、食物の抽出物、カビの抽出物及び節足動物の虫体抽出物からなる群より選ばれる少なくとも1種である、[17]〜[20]のいずれかに記載の方法。
[22] 前記抗原がハンノキ、ゴムノキ、ギョウギシバ、シラカンバ、ヒナギク、タンポポ、アキノキリンソウ、カモガヤ、ブタクサ、ハルガヤ、オオアワガエリ、スギ及びヒノキの花粉、葉茎の乾燥物又はラテックス;小麦、七面鳥、大豆、鮭、ライ麦、米、ジャガイモ、豚肉、牛乳、羊肉、卵黄、卵白、トウモロコシ、果物、タラ、鶏肉、ナマズ、牛肉、シシャモ、カニ、エビ及びホヤの食物抽出物;アルテリナリア属、ペニシリウム属及びクラドスポリウムのカビ抽出物;ならびにダニ、ノミ、蚊、ゴキブリ及びガの虫体抽出物からなる群より選ばれる少なくとも1種である、[17]〜[20]のいずれかに記載
の方法。
[23] 前記物質がヒトのIgE及び実験動物のIgEの両方を認識する抗体である[17]〜[22]のいずれかに記載の方法。
[24] 前記実験動物がマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ及びサルからなる群より選ばれる動物である[17]〜[23]のいずれかに記載の方法。
[25] ヒトのIgEを認識し、かつ実験動物のIgEを認識する物質、抗原及び当該抗原で感作した当該実験動物の標準試料を別々の容器に含む、抗原特異的ヒトIgEの定量キット。
[26] ヒトのIgEを認識し、かつ実験動物のIgEを認識する物質を含有してなるヒトのアレルギー疾患の診断薬。
[27] ヒトのIgEを認識し、かつ実験動物のIgEを認識する物質、抗原、当該抗原で感作した当該実験動物の標準試料及びアレルギー疾患に罹患していない当該実験動物の対照試料を別々の容器に含む、ヒトのアレルギー疾患の診断キット。
[28] アレルギー疾患が花粉症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、ワクチン接種後アレルギー、アナフィラキシー、食物アレルギー、高IgE血症を引き起こす疾患及びIgEが病態に関与していると推測される疾患からなる群より選ばれる少なくとも1種である、[26]に記載の診断薬又は[27]に記載のキット。
[29] 前記抗原が植物の花粉、葉茎の乾燥物又はラテックス、食物の抽出物、カビの抽出物及び節足動物の虫体抽出物からなる群より選ばれる少なくとも1種である、[25]又は[27]に記載のキット。
[30] 前記物質がヒトのIgE及び実験動物のIgEの両方を認識する抗体である[25]若しくは[27]に記載のキット又は[26]に記載の診断薬。
[31] 前記実験動物がマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ及びサルからなる群より選ばれる動物である[25]若しくは[27]に記載のキット又は[26]に記載の診断薬。
さらに、非特異的吸着や非特異的反応を抑制するためにフィッシュゼラチン、牛血清アルブミン(BSA)又は牛ミルクタンパク質等のリン酸緩衝溶液を固相と接触させ、抗原によってコートされなかった固相表面部分を当該フィッシュゼラチン、BSA又は牛ミルクタンパク質等でブロッキングすることが一般に行なわれる。
(A)被験イヌの生体試料と抗原とを接触させ、当該試料中のIgEと当該抗原とを結合させる工程、
(B)イヌのIgEを認識し、かつイヌを除く実験動物のIgEを認識する物質を用いて、工程(A)の抗原で感作した当該実験動物の標準試料中のIgEを測定し、標準曲線を作成する工程、
(C)工程(A)で形成された結合体を、工程(B)で使用したイヌのIgEを認識し、かつイヌを除く実験動物のIgEを認識する物質を用いて検出する工程、
(D)工程(C)で検出された結合体量と工程(B)で作成した標準曲線とを用いて被験イヌの生体試料中のIgE量を定量する工程、及び
(E)工程(D)の定量結果に基づいて、アレルギー疾患の有無又は程度を判定する工程。
イヌ抗体とマウスIgEに交差反応を示すモノクローナル抗体のスクリーニング
イヌIgEを定量するための抗体として、抗イヌIgEモノクローナル抗体含有ラット腹水(クローン1-2腹水、クローン1-10腹水及びクローン1-13腹水)を日本全薬工業株式会社から購入した。
抗マウス×イヌIgE抗体の精製
次に、DEAEセルロースクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、プロテインGカラムクロマトグラフィーの3つの段階を用いて、イヌとマウスのIgEに交差性を確認したクローン1-2腹水液より、ラットIgGを精製した(図3)。精製ラットIgGをNHS-PEO4-Biotin(PIERCE社)を用いてビオチン標識した。その後、Sephadex G25カラム(NAP-5 Columns、GEヘルスケアバイオサイエンス社)を用いたゲル濾過法によって未反応のビオチンを除いた。ビオチン化ラットIgG(ビオチン化抗マウス×イヌIgE抗体)を、以下の実施例に使用した。
スギ花粉特異的IgEの定量
スギ花粉粗抗原(400μg)と水酸化アルミニウム(20mg)をビーグル犬(メス、5ヶ月齢)に2週間間隔で2回皮下投与して、スギ花粉感作イヌを作製した。このイヌからスギ花粉-IgE上昇イヌ血清を採取して被検体サンプルとした。
典型的なイヌアトピー性皮膚炎と診断した野外症例イヌ4頭(下記参照)の血清中におけるノミ、牛肉、アスペルギルス(カビ、Aspergillus Nidulans)特異的IgE量を測定した。
症例1 チワワ 雄 9歳
症例2 ヨークシャテリア 避妊雌 7歳
症例3 柴犬 雄 5歳
症例4 柴犬 去勢雄 7歳
ノミ感作血清 17171.9ng/ml
牛肉感作血清 5937.7ng/ml
アスペルギルス感作血清 4666.2ng/ml
Claims (14)
- 下記の工程(A)〜(D)を含む、抗原特異的イヌIgEを定量する方法:
(A)被験イヌの生体試料と抗原とを接触させ、当該試料中のIgEと当該抗原とを結合させる工程、
(B)イヌのIgEを認識し、かつイヌを除く実験動物のIgEを認識する物質を用いて、工程(A)の抗原で感作した当該実験動物の標準試料中のIgEを測定し、標準曲線を作成する工程、
(C)工程(A)で形成された結合体を、工程(B)で使用したイヌのIgEを認識し、かつイヌを除く実験動物のIgEを認識する物質を用いて検出する工程、及び
(D)工程(C)で検出された結合体量と工程(B)で作成した標準曲線とを用いて被験イヌの生体試料中のIgE量を定量する工程。 - 下記の工程(A)〜(E)を含む、アレルギー疾患の診断方法:
(A)被験イヌの生体試料と抗原とを接触させ、当該試料中のIgEと当該抗原とを結合させる工程、
(B)イヌのIgEを認識し、かつイヌを除く実験動物のIgEを認識する物質を用いて、工程(A)の抗原で感作した当該実験動物の標準試料中のIgEを測定し、標準曲線を作成する工程、
(C)工程(A)で形成された結合体を、工程(B)で使用したイヌのIgEを認識し、かつイヌを除く実験動物のIgEを認識する物質を用いて検出する工程、
(D)工程(C)で検出された結合体量と工程(B)で作成した標準曲線とを用いて被験イヌの生体試料中のIgE量を定量する工程、及び
(E)工程(D)の定量結果に基づいて、アレルギー疾患の有無又は程度を判定する工程。 - 工程(A)、(B)、(C)及び(D)が抗原毎に同時に又は別々に繰り返される、請求項1又は2に記載の方法。
- 工程(B)が工程(A)、(C)及び(D)と同時に又は別々に行われる、請求項1又は2に記載の方法。
- アレルギー疾患が花粉症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、ワクチン接種後アレルギー、アナフィラキシー、食物アレルギー、高IgE血症を引き起こす疾患及びIgEが病態に関与していると推測される疾患からなる群より選ばれる少なくとも1種である、請求項2〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 被験イヌの生体試料が血液、血清、血漿、鼻汁、涙液、唾液、尿又は糞便である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記物質がイヌのIgE及びイヌを除く実験動物のIgEの両方を認識する抗体である請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記実験動物がマウス、ラット、モルモット、ハムスター及びウサギからなる群より選ばれる動物である請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 下記の工程(A)〜(D)を含む、抗原特異的ヒトIgEを定量する方法:
(A)被験者の生体試料と抗原とを接触させ、当該試料中のIgEと当該抗原とを結合させる工程、
(B)ヒトのIgEを認識し、かつ実験動物のIgEを認識する物質を用いて、工程(A)の抗原で感作した当該実験動物の標準試料中のIgEを測定し、標準曲線を作成する工程、
(C)工程(A)で形成された結合体を、工程(B)で使用したヒトのIgEを認識し、かつ実験動物のIgEを認識する物質を用いて検出する工程、及び
(D)工程(C)で検出された結合体量と工程(B)で作成した標準曲線とを用いて被験者の生体試料中のIgE量を定量する工程。 - 工程(A)、(B)、(C)及び(D)が抗原毎に同時に又は別々に繰り返される、請求項9に記載の方法。
- 工程(B)が工程(A)、(C)及び(D)と同時に又は別々に行われる、請求項9に記載の方法。
- 被験者の生体試料が血液、血清、血漿、鼻汁、涙液、唾液、尿又は糞便である、請求項9〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記物質がヒトのIgE及び実験動物のIgEの両方を認識する抗体である請求項9〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記実験動物がマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ及びサルからなる群より選ばれる動物である請求項9〜13のいずれか1項に記載の方法。
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