JP2000321274A - 小胞輸送蛋白ミントの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は神経に特有でかつβアミロイド（Ａ
β）生成にからみ、かつ神経伝達機構にも関与する分子
マーカーを利用してすべてのアルツハイマー痴呆症の新
たな診断法を提供するものである。即ち、本発明は神経
性疾患、特にアルツハイマー病の新規な診断マーカーを
提供するものである。 【解決手段】 本発明は、神経性疾患を判定するための
体液又は組織中のミント、好ましくはミント１又は２の
検出、同定又は定量に用いるための判定用組成物、当該
組成物を含有してなる神経性疾患を判定、診断するため
のキットに関する。また、本発明は、神経性疾患、例え
ば痴呆症、アルツハイマー病などの診断マーカーとして
のミント又はそれに対する抗体の使用に関する。さら
に、本発明は、検体中のミントを検出、同定又は定量す
る方法に関する。本発明の方法により、簡便にかつ正確
に痴呆症などの神経性疾患を診断することができ、神経
性疾患の予防、治療に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、体液又は組織中の
ミントを検出、同定又は定量することからなる神経性疾
患、好ましくは痴呆症、アルツハイマー病などの診断
剤、診断マーカーとしてのミント又はそれに対する抗体
の使用、及び、検体中のミントを検出、同定又は定量す
る方法に関する。本発明はアルツハイマー病をはじめと
する痴呆性疾患の診断に利用できる診断剤、検査法に関
するもので、この検査法により測定される神経伝達に必
須のシナプス小胞輸送蛋白（Ｍｉｎｔｓ）の濃度および
活性は神経活動の指標として広く利用できる。

【０００２】

【従来の技術】アルツハイマー病は神経変性を伴う痴呆
性疾患である。家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）以外
はその原因が不明であるため診断治療法は確立していな
い。アルツハイマー脳の病理学的検討から、アルツハイ
マー病にみられる活性物質の変化があるが、現在ではこ
れらを指標として診断の一助としているに過ぎない。そ
の例として、痴呆脳・老化脳にみられる神経伝達物質の
変化や、老人班（senileplaque；ＳＰ）やアルツハイマ
ー原線維変化（neurofibrillary tangle；ＮＦＴ）形成
に関わる活性物質の測定がなされている。

【０００３】痴呆脳・老化脳にみられる神経伝達物質の
変化としては、例えば、アセチルコリン（Acetylcholin
e（Ａｃｈ））量の減少、コリンアセチル転移酵素（cho
lineacetyltransferase（ＣＡＴ））活性の減少、アセ
チルコリンエステラーゼ（acetylcholine esterase（Ａ
ｃｈＥ））活性の減少、アセチルコリン合成酵素（Ａｃ
ｈ synthetase）量の減少、アセチルコリン受容体（Ａ
ｃｈ receptor）量の減少などが知られている。また、
ソマトスタチン（Somatostatin）や神経ペプチドＹ（Ne
uropeptide Ｙ）などの神経ペプチド、ノルアドレナリ
ン（Noradrenaline）、ドーパミン（Dopamine）、セレ
トニン（Serotonin（５ＨＴ））、５−ヒドロキシイン
ドールアミノ酸（5-hydrooxyindoraminoacid（５ＨＩＡ
Ａ））などの神経伝達物質の量の変化を調べることも知
られている。

【０００４】これら神経伝達物質はおもに脳脊髄液（ce
rebrospinal fluid；ＣＳＦ）で測定されるが、その変
化は正常脳や他の痴呆性疾患の脳でも見られアルツハイ
マー型痴呆との関連性については未だ確立されておら
ず、アルツハイマー型痴呆であることを特定するための
診断法としての診断的価値は少ないと思われる。

【０００５】アルツハイマー病の神経病理学的変化の主
なものとしては、神経原線維変化（Neurofibrillary ta
ngle；ＮＦＴ）と老人班（Senile plaque；ＳＰ）が挙
げられる。アルツハイマー神経原線維変化（Neurofibri
llary tangle；ＮＦＴ）は特異なねじれを有するフィラ
メント（Paired Helical Filament（ＰＨＦ））が主成
分であり、このＰＨＦは微小管結合蛋白質（microtuble
associate proteins（ＭＡＰｓ））の一種であるタウ
蛋白（τ蛋白質）の異常リン酸化で生成される。老人班
（ＳＰ）は、アミロイド物質が細胞外に蓄積したもので
あり、その主な構成成分としてβアミロイド前駆体蛋白
質（β−Amyloid Precursor protein（βＡＰＰ））か
ら生成されるＡβ／Ａ４Ａｍｙｌｏｉｄ（Ａβ）などが
ある。

【０００６】一方、アルツハイマー病の神経病理学的変
化で注目されているβアミロイド（Ａβ）生成沈着機構
の解明により、これに関わる多くの活性分子が明らかと
なってきた。これらには、Ａβの前駆体であるβアミロ
イド前駆タンパク（β−amyloid precursor protein；
βＡＰＰ）や、その切断酵素であるセクレターゼ（secr
etase）、その選別蛋白質（sorting protein）の可能性
があるプレセニリン（presenirin；ＰＳ）があげられ
る。これらの異常は遺伝的アルツハイマー病の原因であ
ることはすでに報告されているが、これら遺伝的アルツ
ハイマー病の頻度は全アルツハイマー病の５％以下であ
り、その大部分を占める孤発性アルツハイマー病の原因
は未だ不明である。Ａβがアルツハイマー病の主因を説
明する最も重要な分子である限り、この生成沈着に関わ
る新たな分子の存在確認とその制御機構の解明は是非必
要な作業であるといわざるを得ない。全アルツハイマー
病患者の数％は家族性である。その原因遺伝子としてこ
れまで同定されているのはβＡＰＰ、プレセニリン１お
よび２（ＰＳ−１、ＰＳ−２）の３種である。また、Ａ
βのキャリアー蛋白質（carrier蛋白質）であるアポリ
ポ蛋白質Ｅ（Apolipoprotein Ｅ（ＡＰＯＥ））のある
種の対立遺伝子産物（ＡＰＯＥ４）もアミロイド物質の
沈着の危険因子であるとされている。このような家族性
アルツハイマー病の遺伝的背景をまとめると次の表１の
ようになる。

【０００７】 表１ アルツハイマー病の遺伝的要因 分類 発症／頻度 原因遺伝子 遺伝子座 ダウン症候群 早期発症 βＡＰＰ ２１ 家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ） ＡＤ１ 早期発症ＦＡＤ／５％ βＡＰＰ ２１ ＡＤ２ 晩期発症ＦＡＤ ＡｐｏＥ １９ ＡＤ３ 早期発症ＦＡＤ／７０％ ＰＳ−１ １４ ＡＤ４ Ｖｏｌｇａ Ｇｅｒｍａｎ家系 ＰＳ−２ １ ＡＤ５ 晩期発症ＦＡＤ １２？ ＨＣＨＷＡ−Ｄ オランダ家系 βＡＰＰ ２１

【０００８】家族性アルツハイマー病に関与すると考え
られている種々の遺伝子が解明されてきているが、アル
ツハイマー病患者の９０％以上を占める孤発例では遺伝
的要因が明らかではないため生前の診断は困難であり、
これらは大部分の孤発性アルツハイマー病の診断マーカ
ーとなるものではない。

【０００９】さらにこれらの分子（βＡＰＰ、ＰＳ、ｓ
ｅｃｒｅｔａｓｅ、ＡｐｏＥなど）は脳神経細胞のみな
らず非神経細胞すなわち他臓器の体細胞でも産生してい
るため、これらの異常が神経特有の変性疾患であるアル
ツハイマー病の病態を完全には説明しえず、当然診断マ
ーカーとしての期待は出来ない。従って、神経特有の分
子であり、かつＡβとの関わりを持つ新たな分子に診断
マーカーとしての可能性を期待しなければならない。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は神経
に特有でかつＡβ生成にからみ、かつ神経伝達機構にも
関与する分子マーカーを利用してすべてのアルツハイマ
ー痴呆症の新たな診断法を提供するものである。即ち、
本発明は神経性疾患、特にアルツハイマー病の新規な診
断マーカーを提供するものである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、体液又は組織
中のミントを検出、同定又は定量することからなる神経
性疾患の診断剤、当該診断剤を含有してなる神経性疾患
を診断するためのキットに関する。また、本発明は、神
経性疾患を判定するための体液又は組織中のミントの検
出、同定又は定量に用いるための判定用組成物、当該組
成物を含有してなる神経性疾患を判定、診断するための
キットに関する。本発明は、神経性疾患、例えば痴呆
症、アルツハイマー病などの診断マーカーとしてのミン
ト又はそれに対する抗体の使用に関する。さらに、本発
明は、検体中のミントを検出、同定又は定量する方法に
関する。

【００１２】本発明者らは、上記の課題を解決すべく種
々検討した結果、神経に特有でかつ神経伝達機構の根幹
をなすシナプス伝達に必須の小胞輸送蛋白に注目した。
発明者の一人である岡本らは小胞輸送蛋白であるマンク
１８（Ｍｕｎｃ１８）に特異的に結合し、シナプス小胞
（synaptic vesicle）のエクソサイトーシス（exocytos
is）に関与する新規小胞輸送蛋白マンク１８関連蛋白質
（Munc18-interactingproteins）であるミント（Ｍｉｎ
ｔｓ）をクローニングした(M.Okamoto., et al., J. Bi
ol. Chem., 272(50),31459-31464,1997 ; Eur. J. Cell
Biol., 77, 161-165, 1998)。ミント（Ｍｉｎｔｓ）
は、少なくともミント１（Ｍｉｎｔ１）からミント３
（Ｍｉｎｔ３）からなるファミリーを形成し、ミント１
と２は神経に特異的に発現する小胞輸送蛋白である。そ
の後の研究により、ミントはＰＴＢドメインとふたつの
ＰＤＺドメイン（ＰＤＺａドメイン及びＰＤＺｂドメイ
ン）という蛋白間の相互作用に重要な働きを持つ二つの
基本機能構造（モジュール）を持つことが判明した。こ
の２種のモジュールを一つの蛋白が持つのは現在の所こ
のミントのみであり、この点からもミントの神経伝達機
能における特異性が示唆されている(M.Okamoto., et a
l., J. Biol. Chem., 272(50),31459-31464,1997)。

【００１３】ミントは他に例をみない特徴的なドメイン
構造をしている。ミント１及び２のＮ−末端側半分には
二つのプロリンリッチな領域が存在し、マンク１８結合
ドメイン（ＭＩＤ）が保存されている以外には相同性が
極めて低いが、Ｃ−末端側半分には共通して１つのＰＴ
Ｂドメインと２つのＰＤＺドメインが存在し、相同性は
極めて高い。一方ミント１は、前シナプス終末蛋白であ
るＣＡＳＫ及びベリ（ｖｅｌｉ）と複合体を形成し、神
経細胞膜蛋白であるニューレキシン（neurexin）などと
相互作用し、シナプス形成に関与していると考えられて
いる。この機構は生物進化上極めてよく保存されている
ことが明らかにされている。実際、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇ
ａｎｓ）ではＣＡＳＫ、ベリ（ｖｅｌｉ）、ミント１の
各ホモログであるリン（ＬＩＮ）−２，７，１０が複合
体を形成して細胞分化制御をすることが明らかにされて
いる。これらのことより、ヒトでも同様の蛋白相互作用
が行われていると考えられる。

【００１４】さらにミント１はβＡＰＰと結合すること
が明らかとなった（J P. Borg, etal., Mol. Cell. Bio
l., 16, 6229-6241, 1996）。ミント１はそのＰＴＢド
メインを介してβＡＰＰのＣ末端のＹＥＮＰＴＹ配列と
特異的に結合する。ミント１とβＡＰＰの結合は、Ａβ
生成を制御し、ミント１の異常は神経伝達機能不全を引
き起こすと同時にＡβ生成を増強する。一方、βＡＰＰ
のエンドサイトーシス（Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）に
は、βＡＰＰのＣ末端のＹＥＮＰＴＹ配列が必要であ
り、Ａβはその後β／γセクレターゼによって細胞内で
産生される。すなわち、Ａβの生成にはＹＥＮＰＴＹ配
列が必要であり、ミント１はこのＡβ生成の機構を制御
していると考えられる。

【００１５】ミントのもつこのような機能を次のように
して確認した。まず、抗ミント１ポリクローナル抗体を
用いた免疫組織化学で、マウスの脳のミント１の局在を
検討した（図１参照）。電子顕微鏡による微細構造の検
討では、ミント１は前シナプス神経終末に存在するシナ
プス小胞とそのアクティブゾーン（active zone）に限
局していることが示された（図２参照）。さらにラット
の細胞株ＰＣ１２細胞を神栄養因子（ＮＧＦ）により、
神経細胞に分化させ、培養ディシュ上でシナプス結合を
形成させ、その時の内在性ミント１の局在を蛍光抗体法
により観察した結果、ミント１は前シナプス終末に限局
していた。以上のことより、ミント１がシナプス小胞輸
送蛋白であることが示された。さらに、ミント分子中の
各ドメインの機能を解析するために、種々の欠失変異体
を遺伝子工学的手法により作成し、培養細胞に導入発現
させた。この結果ミントが細胞内で小胞に結合するため
にはＰＤＺドメインが必須であることが明らかとなった
（図５参照）。一方、ミントがβＡＰＰに結合するのは
ＰＴＢドメインを介してである。

【００１６】生体内で実際にミントがβＡＰＰと結合し
ていることを確認するためにヒト細胞株ＨＥＫ２９３細
胞のミント１／βＡＰＰ強制発現細胞においてβＡＰＰ
とミント１の局在を共焦点レーザー顕微鏡を用いた二重
標識間接蛍光抗体法で検討した（図４参照）。その結
果、ミント１とβＡＰＰは一致して局在することが明ら
かとなり、細胞内でミント１はβＡＰＰと結合している
ことが示された。従って、ミント１はＰＤＺドメインを
介してβＡＰＰを輸送する小胞の動きを制御し、その過
程でＰＴＢドメインを介してβＡＰＰと結合し、最終的
にＡβの産生にいたる蛋白質代謝分解経路をも調節する
ものと考えられる。

【００１７】つぎに、マウスの脳虚血モデルを用いてミ
ント１の発現を検討した（図３参照）。この結果ミント
１の発現は脳虚血により変動することが明らかとなっ
た。このことは神経伝達物質の放出時にミント１がシナ
プス伝達機能を果たしていることを示す。また、マウス
の脳をホモジュネートし、その抽出液からウエスタンブ
ロッティング（Western blotting）によりミント１の同
定を試みたところ、ミント１はマウス脳に存在してお
り、他臓器には存在しないことが明らかとなった。さら
に、脳虚血を加えた脳ではミント１蛋白量が虚血負荷後
経時的に変動することが明らかとなった（図３及び図６
参照）。

【００１８】家族性、孤発性を問わずアルツハイマー病
にいたる異常はβＡＰＰの代謝分解異常である。βＡＰ
Ｐと強固に結合しその機能を制御するミントは同時にシ
ナプス伝達をも制御すると考えられる。以上のことか
ら、Ａβの蓄積がみられるアルツハイマー病の初期には
ミントの異常による神経障害がみられると考えられる。
このことはミント１の測定が神経変性疾患としてまた痴
呆性疾患としてのアルツハイマー病の診断に適している
ことを示している。特に、これらの疾患の初期症状の診
断に適したものということができる。従来からアルツハ
イマー病の診断をめざして多数の神経物質が用いられて
きたが、いずれもアルツハイマー病にのみ関連するもの
ではなく、各器官に点在する神経物質の量の増減を測定
し、この結果からアルツハイマー病である可能性をみる
というものであった。しかしながら、本発明のミントの
測定は、Ａβの生成に直接関連し、かつ脳に局在する蛋
白質を測定するものであることから、アルツハイマー病
などの神経性疾患の発病の状況を直接知ることができる
ものである。

【００１９】本発明は、小胞輸送蛋白ミント、好ましく
はミント１及び／又はミント２を検出、同定又は定量す
ることにより神経性疾患、例えば痴呆症、アルツハイマ
ー病などを診断することができることを見い出したもの
である。本発明の小胞輸送蛋白ミントを検出、同定又は
定量する方法としては、例えば抗ミント抗体を使用する
ことができる。抗ミント抗体はミント又はミントの部分
配列からなる蛋白質で感作させた動物から得ることがで
きる。例えば、ラットのミントをウサギに感作させるこ
とにより、ウサギ抗ラットミント抗体を得ることができ
る。抗原として使用されるミントの部分配列としては、
ミント１又はミント２のＮ−末端部分、Ｃ−末端部分、
ＰＴＢドメイン、ＰＤＺドメイン、およびβ−アミロイ
ド前駆体蛋白質（βＡＰＰ）の側からはミントとの結合
部分であるＹＥＮＰＴＹ配列などを用いることができ
る。

【００２０】使用される抗体としては、抗ヒト抗体が好
ましいが、ミント１をはじめとするこれらの蛋白の免疫
原性は種間で極めて交差性が高く、異種生物の抗体を使
用してもヒトミントの測定をすることができる。また、
異種生物の抗体を必要に応じてキメラ型やヒト型などに
変性させて使用することもできる。抗体はポリクローナ
ル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であって
もよい。本発明者らは、ラットミントに対するウサギポ
リクローナル抗体を製造し、これを本発明の方法とし
た。

【００２１】本発明の診断剤における小胞輸送蛋白ミン
トの検出、同定又は定量のための手段としては、抗原−
抗体反応による通常の手段を使用することができる。例
えば、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosolubent ass
ay）法などを用いることができる。また、βＡＰＰ抗体
を用いた免疫沈降法との組み合わせて、ミント蛋白の定
量とβＡＰＰ結合能の両者を測定することもできる。

【００２２】また、本発明における検体としては、各種
の体液や組織を用いることができるが、痴呆症などの診
断において通常使用されている脳脊髄液（ＣＳＦ）を使
用するのが好ましい。本発明のミント蛋白測定ＥＬＩＳ
Ａシステムは生体試料の正常及び異常ミント蛋白量、活
性、ＰＴＢ、ＰＤＺドメイン活性、βＡＰＰ結合能など
が測定でき、シナプス機能の分子マーカーとして使用す
ることが出来る。特に、βＡＰＰ結合能の測定からはア
ルツハイマー病発症の予知診断を下すことが出来る。

【００２３】

【実施例】次に具体例により本発明をより詳細に説明す
るが、本発明はこれらの具体例に限定されるものではな
い。

【００２４】実施例１（ミントの存在部位） ラットの各器官からノーザンブロット解析によりミント
１の発現分布を検討した。ミント１、２、３にそれぞれ
特異的なＮ−末端側領域を含むＤＮＡ断片をプローブと
して使用するために、ラジオアイソトープで標識し、
脳、心臓、肺、脾臓、肝臓、腎臓、筋、精巣の各臓器よ
り抽出したｍＲＮＡをプロットしたフィルターに対して
ハイブリダイゼーションを行った。この結果からミント
１はラット脳に存在しており、他臓器には存在しないこ
とが明らかとなった。

【００２５】実施例２（ミント１の脳内での局在） 抗ミント１ポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学で
マウス脳のミント１の局在を検討した。マウスを経心的
に４％パラフォルムアルデヒドを含む固定液で潅流固定
後、脳を摘出し、ビブラトームを用いて脳切片を作成し
た。その後脳切片をミント１に対する免疫組織化学に供
した。即ち、脳切片をラビットポリクローナル抗ラット
ミント１抗体を含むリン酸緩衝液(2000倍希釈)にて12時
間反応させ（第一反応）、洗浄後ビオチン標識ヤギ抗ラ
ビットIgG（第二反応）、次いでアビヂン／ビオチン／
ペルオキシダーゼ複合体と反応させた。ミント１の可視
化はＤＡＢ反応により行い、光学顕微鏡観察に供した。
一部の脳切片はその後オスミウム固定、ウラン染色、脱
水、エポン包埋を経て超薄切片とし、電子顕微鏡観察に
供した。結果を図面に代る写真により図１（ａ）及び
（ｂ）に示す。また、さらに他の脳切片においては第一
反応後に金コロイド標識のヤギ抗ラビットIgGを用いて
第二反応を施行し、その後銀染色（silver enhancemen
t）をして可視化した後に電子顕微鏡観察に供した。結
果を図面に代る写真により図２Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤとし
て示す。光学顕微鏡による検討結果では、ミント１は海
馬への興奮性伝導路と苔状線維に多量に局在していた。
以上のことより、ミント１が側頭葉海馬という記憶中枢
に豊富に含まれていることが示された（図１参照）。電
子顕微鏡による微細構造の検討結果では、ミント１は前
シナプスボタンのシナプス小胞とアクティブゾーン（ac
tive zone）に限局していた。以上のことより、ミント
１がシナプス小胞輸送蛋白であることが示された。（図
２参照）

【００２６】実施例３（抗ミント１ポリクローナル抗体
の製造） ラットミント１のＮ−末端側に存在するマンク１８結合
ドメインを含むミント１に特異的な領域とＧＳＴの融合
蛋白質を大腸菌内で製造し、これをアフィニティーカラ
ムにて精製して抗原として用いた。この抗原蛋白質をウ
サギに投与することにより感作し、抗体を含む血清を得
た。この抗体のミント１に対する特異性はリコンビナン
トミント１、ＧＳＴ融合蛋白質、ＧＳＴのウエスタンブ
ロットで確認した。

【００２７】実施例４（脳虚血によるミント１の発現の
変動） マウスの脳虚血モデルを用いた検討ではミント１の発現
は脳虚血により変動することが明かになった。マウスの
両側総頚動脈の15分間結紮による一過性前脳虚血を作成
した。血流再開後１，３，５日目にマウスを経心的に４
％パラフォルムアルデヒドを含む固定液で潅流固定後、
脳を摘出した。その後、実施例２と同様にしてビブラト
ームを用いて脳切片を作成し、ミント１に対する免疫組
織化学に供した。光学顕微鏡による結果を、図面に代る
写真として図３ａ〜ｆに示す。図３のａ〜ｃはミント１
の１日目、３日目及び５日目をそれぞれ示し、図３のｄ
〜ｆはマンク１８の１日目、３日目及び５日目をそれぞ
れ示す。ミント１は虚血負荷後１日目では苔状線維で免
疫反応性が低下し、３日目では逆にコントロールよりも
増強していた（図３ａ〜ｃ参照）。このことによりミン
ト１蛋白量が虚血負荷後経時的に変動することが明かと
なり、また神経伝達物質の放出時にミント１が機能して
いることを示す。

【００２８】実施例５（ミント１のβＡＰＰとの結合
能） ＨＥＫ２９３細胞のミント１／βＡＰＰ強制発現細胞に
おいてミント１とβＡＰＰの局在を共焦点レーザー顕微
鏡を用いた二重標識間接蛍光抗体法で行った。結果を図
４に図面に代る写真として示す。図４の左上はＦＩＴＣ
標識され緑色に蛍光を発色するミント１の局在を、右上
はＣｙ３標識され赤色に蛍光を発色するβＡＰＰの局在
を、左下は両者の蛍光が一致した時に黄色に発色するミ
ント１／βＡＰＰの局在を示す。即ち図４の左上はミン
ト１単独、右上はβＡＰＰ単独、左下はミント１とβＡ
ＰＰの結合体を示す。その結果、Ｍｉｎｔ１とβＡＰＰ
は細胞内局在が一致することが明らかとなり、細胞内で
Ｍｉｎｔ１はβＡＰＰと結合していることが示された
（図４参照）。

【００２９】実施例６（ミント１の各ドメインの小胞輸
送機構に対する役割） ＰＣＲ法と標準的な遺伝子工学組みかえＤＮＡ作製手法
により、ミントの各ドメインとＥＧＦＰ（enhanced gre
en fluorescence protein）の融合蛋白質を作製し、ヒ
ト細胞株Ａ４３１細胞の中で発現させた。その結果を図
面に代る写真として図５に示す。図５の上段はＥＧＦＰ
単独の場合を、中段はＥＧＦＰとミント３のＰＴＢドメ
インとの融合蛋白質の場合を、下段はＥＧＦＰとミント
３のＰＤＺドメインを含む融合蛋白質の場合をそれぞれ
示す。この結果、ＰＤＺドメインを含む融合蛋白質のみ
がゴルジ装置と小胞上に分布した。

【００３０】実施例７（脳におけるミント１蛋白の半定
量的測定） マウス脳（全脳又は海馬）をホモジュネートし、その抽
出液から免疫ブロッティング法（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ
ｔｉｎｇ）によりミント１の同定を試みた。正常および
虚血脳（一過性虚血後１、３、７日後）から抽出した蛋
白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により泳動したあとニトロセ
ルロース膜に転写し、抗ミント１抗体を用いて同定し
た。結果を図面に代る写真として、図６Ａ及びＢに示
す。図６Ａのレーン１は正常脳の海馬を示し、レーン２
は虚血後１日目の海馬を示し、レーン３は虚血後３日目
の海馬を示し、レーン４は虚血後５日目の海馬を示し、
レーン５はレーン１と同じである。図６Ｂのレーン１は
正常脳の大脳皮質を示し、レーン２は虚血後１日目の大
脳皮質を示し、レーン３は虚血後３日目の大脳皮質を示
し、レーン４は虚血後５日目の大脳皮質を示し、レーン
５はレーン１と同じである。各レーンの上段のブロット
は約１４０ｋＤａの全長のミント１蛋白を、下段の約７
０ｋＤａのブロットはそのミント１蛋白が切断された一
断片蛋白質を示している。この結果より、ミント１は海
馬（Ａ）大脳皮質（Ｂ）に豊富に存在していることがわ
かる。また、海馬では虚血後３日目にミント蛋白および
その断片蛋白の発現産生量が増加しているが、断片蛋白
の増加が正常蛋白の増加より顕著であることから、ミン
ト１の産生代謝量が虚血により亢進することが示され
た。一方、大脳皮質ではミント１の産生量は虚血後も大
きくは変化しない。以上のことから、虚血後の神経障害
が大きい海馬での神経伝達物質放出時にミント１産生量
が変動すると考られた。

【００３１】

【発明の効果】本発明はアルツハイマー病をはじめとす
る痴呆性疾患の診断に利用できる診断剤、検査法に関す
るもので、この検査法により測定される神経伝達に必須
のシナプス小胞輸送蛋白ミント（Ｍｉｎｔｓ）の濃度お
よび活性は神経活動の指標として広く利用できる。本発
明の方法は、ヒト由来の微量試料を用いて簡便に利用で
き、且つ神経機能を特異的に測定できる痴呆の診断法を
提供する。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、マウスにおけるミント１の脳内局在を
示す免疫組織化学の結果を示す図面に代る写真である。

【図２】図２は、ミント１の微細局在を示す図面に代る
電子顕微鏡写真である。

【図３】図３は、脳虚血後のミント１の変動を示す免疫
組織化学の結果を示す図面に代る写真である。

【図４】図４は、ＨＥＫ２９３細胞におけるミント１と
βＡＰＰの局在の一致を示す図面に代る共焦点レーザー
顕微鏡写真である。

【図５】図５は、ミントのＰＤＺドメインがミントが小
胞に結合するために必須であることを示す図面に代る写
真である。

【図６】図６は、正常および虚血後のミント１の半定量
的測定結果を示す免疫ブロットの結果を示す図面に代る
写真である。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 体液又は組織中のミントを検出、同定又
   は定量することからなる神経性疾患の診断剤。
2. 【請求項２】 ミントがミント１又は２である請求項１
   に記載の診断剤。
3. 【請求項３】 神経性疾患が痴呆症又はアルツハイマー
   病である請求項１又は２に記載の診断剤。
4. 【請求項４】 ミントの検出、同定又は定量が、ミント
   に対する抗体を用いるものである請求項１〜３のいずれ
   かに記載の診断剤。
5. 【請求項５】 抗体がモノクローナル抗体である請求項
   ４に記載の診断剤。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれかに記載の診断剤
   を含有してなる神経性疾患を診断するためのキット。
7. 【請求項７】 神経性疾患の診断マーカーとしてのミン
   ト又はその抗体の使用。
8. 【請求項８】 神経性疾患がアルツハイマー病である請
   求項７に記載の使用。
9. 【請求項９】 ミントに対する抗体を用いて検体中のミ
   ントを検出、同定又は定量する方法。
10. 【請求項１０】 抗体がモノクローナル抗体である請求
    項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 ＥＬＩＳＡによる請求項９又は１０に
    記載の方法。
12. 【請求項１２】 ＥＬＩＳＡ法により検体中のミントを
    検出、同定又は定量するためのミント蛋白測定ＥＬＩＳ
    Ａシステム。
13. 【請求項１３】 βＡＰＰに対する抗体を用いたβＡＰ
    Ｐ結合能の測定を組み合わせてなる請求項１２に記載の
    システム。