ES2948232T3 - Biomarcadores para diagnosticar el riesgo de revisión del implante relacionado con el implante debido a un aflojamiento aséptico - Google Patents
Biomarcadores para diagnosticar el riesgo de revisión del implante relacionado con el implante debido a un aflojamiento aséptico Download PDFInfo
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Abstract
La presente invención se refiere en general al campo del riesgo de revisión relacionado con implantes, en particular el riesgo de revisión relacionado con implantes no causado por una infección o reacción de metal sobre metal. La presente invención proporciona métodos para diagnosticar el riesgo de revisión relacionado con el implante, el uso de kits para dichos fines de diagnóstico y composiciones para usar en el tratamiento del riesgo de revisión relacionado con el implante, en particular el riesgo de revisión relacionado con el implante no causado por una infección o metal sobre metal. reacción. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Biomarcadores para diagnosticar el riesgo de revisión del implante relacionado con el implante debido a un aflojamiento aséptico
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general al campo del riesgo de revisión relacionado con implante, en particular el riesgo de revisión relacionado con implante no provocado por una infección o una reacción metal contra metal. La presente invención proporciona métodos para diagnosticar riesgo de revisión relacionado con implante y el uso de un kit para diagnosticar riesgo de revisión relacionado con implante, en particular riesgo de revisión relacionado con implante no causado por una infección o una reacción metal contra metal.
Antecedentes de la invención
Aproximadamente 1.5 millones de operaciones de reemplazo total de cadera (artroplastia total de cadera - ATC) se llevan a cabo anualmente en todo el mundo. Es probable que esto aumente a aproximadamente 3 millones en todo el mundo por año en la próxima década. Además, otros tipos de implantes y reemplazos articulares, como rodilla, hombro, pie, tobillo, mano, muñeca, codo, cráneo-maxilofacial y dental, también se están utilizando en cantidades cada vez mayores.
Las prótesis para ATC a menudo consiste de dos componentes. Un encaje artificial, o componente acetabular (figura 3), se ubica en una cavidad preparada en el acetábulo de la pelvis (figuras 2 y 3). Este se articula con un componente femoral que comprende una cabeza femoral unida a un vástago femoral (figura 3), que se introduce en una cavidad preparada en la médula del fémur. Existen muchas variaciones de ambos componentes y se pueden retener con o sin cementos. Los objetivos de la ATC son aumentar la movilidad, mejorar la función de la articulación de la cadera y aliviar el dolor. Sin embargo, a pesar de su éxito como procedimiento quirúrgico, la ATC todavía se considera un tratamiento de último recurso porque requiere la extirpación de toda la cabeza femoral. Es esta importante alteración del fémur la que a menudo dificulta el reemplazo de revisión.
Si bien el procedimiento ATC tiene una tasa de supervivencia de la prótesis del 90 % o más en los ancianos (que generalmente no sobreviven al implante), la vida útil del implante es significativamente más corta en los pacientes más jóvenes y más activos. Como resultado, los pacientes más jóvenes se enfrentan a la perspectiva de múltiples y difíciles revisiones a lo largo de su vida. Por lo general, una prótesis de cadera dura al menos 15 a 20 años antes de que sea necesario reemplazarla. La tasa de fracaso esperada de los implantes protésicos durante los primeros 10 años es de aproximadamente 3-5 % y la tasa de fracaso va en aumento durante los siguientes 10 años. En Noruega, los datos de 2012 demuestran que las revisiones constituyen el 8.5 % de todas las operaciones de prótesis de cadera.
La osteólisis y el posterior aflojamiento aséptico de la articulación, ambos categorizados como una condición de inicio de la patología, son las razones más comunes para la revisión de la articulación. En una etapa temprana, esta afección generalmente se asocia con micromovimientos en la interfaz entre el implante y el hueso, lo que provoca una destrucción progresiva del hueso. Inicialmente, esta afección suele ser indolora y, debido a este rango asintomático, la pérdida de masa ósea puede ser masiva antes de que los pacientes busquen ayuda. Para entonces, las condiciones para un procedimiento de revisión pueden ser desfavorables y se reduce el tiempo de supervivencia esperado para una nueva prótesis. Además, si el inicio de la patología se diagnostica antes de que progrese a una patología más aguda, la afección puede tratarse favorablemente, p. ej., usando medicamentos antiinflamatorios. Si el tratamiento tiene éxito, puede que no sea necesario continuar con un procedimiento de revisión.
Por lo tanto, existe la necesidad de métodos que permitan diagnosticar el aflojamiento del implante en una etapa temprana, es decir, el inicio de la patología, incluso en pacientes asintomáticos.
Además, también existe la necesidad de métodos rentables que permitan identificar a los pacientes que están en riesgo de revisión; es decir, identificar a aquellos pacientes que necesitan tratamiento.
Los biomarcadores de diagnóstico y pronóstico tienen el potencial de proporcionar un diagnóstico temprano, preciso y no invasivo de estos resultados no deseados, así como ayudar a diseñar intervenciones para prevenir algunas de estas complicaciones, especialmente el aflojamiento aséptico, la dislocación del implante y la osteólisis. Se han reportado varios estudios que discuten el uso de biomarcadores para diagnosticar el aflojamiento aséptico.
En t. J. Clin. Exp. Patol. 2016;9(2): 1954-1960 sugiere que la morfología y la actividad de los osteoclastos en la sangre periférica y los niveles de expresión de MCP-1 pueden usarse para el diagnóstico temprano del aflojamiento aséptico después del reemplazo total de cadera.
En t. Orthop. 2013 junio; 37(6): 1025-1031 se refiere a un estudio que indica que hubo un cambio significativo en el nivel plasmático de múltiples biomarcadores, incluidos PICP, OPG, TNF-a, n Tx , RANKL e IL-1p, en pacientes con aflojamiento aséptico de prótesis.
J Arthroplasty. 2005 diciembre; 20 (8): 1049-54 demuestra que tanto la IL-6 como la IL-8 están asociadas con el aflojamiento aséptico.
European Journal of Inflammation, vol. 12, núm. 1, 1 de enero de 2014 (2014-01-01), páginas 147-159 demuestra que el aflojamiento aséptico y la infección asociada al implante están asociados con la generación de osteoclastos y una respuesta inflamatoria local, con una mayor expresión de citoquinas relacionadas con la inflamación, tales como IL-1p, CXCL8 y S100A9. Esto se apoyó aún más en el Journal of Translational Medicine, Bio Meo Central, vol. 12, núm.
1, 21 de marzo de 2014, página 74, y se encontró que el ambiente proinflamatorio, particularmente la generación de las citocinas CXCL8 e IL1-p inductoras de osteoclastos promueve la resorción ósea. La pérdida de hueso provoca el aflojamiento del implante, lo que provoca los principales síntomas de metalosis, dolor y reducción del rango de movimiento.
Journal of Leukocyte Biology, vol. 98, núm. 4, 12 de marzo de 2015, páginas 575-582 encontró que las concentraciones plasmáticas de MRP-14 (también conocido como S100A9 o calgranulina B) eran significativamente más altas en pacientes con infección asociada a implantes en comparación con pacientes con inflamación estéril o individuos sanos, lo que recomienda que MRP-14 sea un nuevo marcador de diagnóstico.
Aunque los biomarcadores adecuados para diagnosticar el aflojamiento del implante después de un reemplazo total de cadera ya se han discutido en la técnica anterior, todavía hay una necesidad de más biomarcadores y, en particular, biomarcadores que sean fácilmente detectables en una etapa temprana del aflojamiento del implante incluso en pacientes asintomáticos.
Resumen de la invención
Los presentes inventores han resuelto esta necesidad al haber identificado biomarcadores, y en particular la calprotectina, que permiten el diagnóstico en etapas tempranas del aflojamiento del implante, incluso en pacientes asintomáticos. El alcance de la invención está definido por las reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones y descripciones que ya no caen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas se consideran simplemente como ejemplos adecuados para comprender la invención.
Métodos de la invención
La presente invención proporciona en un primer aspecto un método para diagnosticar el riesgo de revisión relacionado con el implante, comprendiendo el método las siguientes etapas :
- detectar un nivel de calprotectina en una muestra biológica de un sujeto con un implante;
donde
- la muestra biológica es líquido sinovial del sitio del implante;
- la calprotectina a detectar es un polipéptido secretado y no un polipéptido intracelular de células intactas presentes en la muestra;
- un nivel < 4 mg/l de calprotectina es indicativo de un diagnóstico de riesgo de revisión no relacionado con el implante; y
- un nivel > 4 mg/l de calprotectina es indicativo de un diagnóstico de riesgo de revisión relacionado con el implante.
En una realización de acuerdo con la presente invención, el riesgo de revisión no relacionado con el implante es un implante estable.
En una realización de acuerdo con la presente invención, un sujeto diagnosticado con riesgo de revisión relacionado con el implante es un sujeto que sufre i) aflojamiento aséptico, dislocación del implante, osteólisis y/o cualquier combinación de los mismos; o ii) infección asociada al implante o reacción metal contra metal.
En una realización de acuerdo con la presente invención, un nivel > 50 mg/l, tal como > 55 mg/l, > 60 mg/l, > 70 mg/l, > 80, > 90 mg/l o > 100 mg/l, de la calprotectina es indicativo de infección asociada al implante o reacción metal contra metal, en particular infección asociada al implante.
De acuerdo con realizaciones particulares, la infección asociada al implante se selecciona del grupo que consiste en aflojamiento séptico, infección articular crónica, infección por biopelícula y/o cualquier combinación de las mismas.
En otra realización de acuerdo con la presente invención, un nivel > 50 mg/l de la calprotectina es un nivel de 51 1000 mg/l, 55-1000 mg/l, 60-1000 mg/l, 70-1000 mg/l, 80-1000 mg/l, 90-1000 mg/l, 100-1000 mg/l, 51-900 mg/l, 51 850 mg/l, 51-800 mg/l, 51-700 mg/l, 51-650 mg/l, 51-600 mg/l, 51-550 mg/l o 51-500 mg/l.
En una realización de acuerdo con la presente invención en la que el método es para diagnosticar aflojamiento aséptico, dislocación del implante, osteólisis y/o cualquier combinación de los mismos.
El método puede no ser para el diagnóstico de infección asociada al implante o reacción de metal contra metal. El método puede ser para diagnosticar el riesgo de revisión relacionado con el implante que no está causado por una infección asociada al implante. La infección asociada al implante se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en aflojamiento séptico, infección articular crónica, infección por biopelícula y/o cualquier combinación de las mismas. De acuerdo con realizaciones particulares, el método es para diagnosticar el riesgo de revisión relacionado con el implante que no es causado por una reacción de metal contra metal.
El método puede comprender además un paso de comparar el nivel de al menos un polipéptido en la muestra biológica con el nivel de al menos un polipéptido en una muestra de control. La muestra de control es preferiblemente una muestra de líquido sinovial de un sujeto que no sufre riesgo de revisión relacionado con el implante.
De acuerdo con realizaciones particulares, el sujeto a ser diagnosticado no muestra ningún síntoma perceptible con el que se asocie el riesgo de revisión relacionado con el implante.
De acuerdo con realizaciones particulares, el sujeto a diagnosticar es un sujeto asintomático.
De acuerdo con realizaciones particulares, el sujeto a diagnosticar no presenta ningún síntoma de riesgo de revisión relacionado con el implante.
De acuerdo con realizaciones particulares, el implante es un implante articular. De acuerdo con realizaciones particulares, el implante es una prótesis. De acuerdo con realizaciones particulares, el implante es una prótesis articular. De acuerdo con realizaciones particulares, el implante es una prótesis de cadera y la muestra biológica es líquido sinovial de la articulación de la cadera. De acuerdo con otras realizaciones particulares, el implante es una prótesis de rodilla y la muestra biológica es preferentemente líquido sinovial de la articulación de la rodilla.
En una realización de acuerdo con la presente invención, el nivel de calprotectina se detecta mediante un ensayo adecuado para detectar la calprotectina en una muestra de líquido sinovial, preferiblemente el ensayo es un ensayo inmunocromatográfico de flujo lateral o un ensayo ELISA, más preferiblemente un ensayo ELISA.
El nivel de calprotectina puede detectarse mediante un ensayo ELISA que comprende las siguientes etapas :
- introducir la muestra biológica en un soporte sólido recubierto de anticuerpos monoclonales específicos de calprotectina;
- eliminar del soporte sólido la parte de la muestra biológica que no está unida a los anticuerpos monoclonales; - introducir un conjugado enzimático en el soporte sólido, comprendiendo el conjugado enzimático anticuerpos policlonales marcados con enzima específicos para calprotectina, siendo la enzima preferiblemente fosfatasa alcalina; - eliminar la parte del conjugado enzimático que no está unida a la calprotectina;
- introducir un sustrato enzimático al soporte sólido; comprendiendo el sustrato enzimático un sustrato para el conjugado enzimático, siendo el sustrato enzimático preferiblemente fosfato de p-nitrofenilo; y
- medir la cantidad de sustrato enzimático que ha sido sometido a tratamiento enzimático por el conjugado enzimático en una cantidad de tiempo predeterminada después de la introducción del sustrato enzimático en el soporte sólido; siendo preferiblemente el soporte sólido una placa de microtitulación.
En una realización de acuerdo con la presente invención, el diagnóstico se basa únicamente en el nivel detectado de calprotectina.
En una realización de acuerdo con la presente invención, se proporcionan al menos dos muestras biológicas, procediendo las dos muestras biológicas de diferentes sujetos; dichos sujetos que tienen un implante; con la condición de que al menos uno de dichos sujetos sufra aflojamiento aséptico, dislocación del implante, osteólisis y/o cualquier combinación de los mismos. Se está detectando el nivel de calprotectina en las muestras biológicas; siendo las muestras biológicas líquido sinovial.
El método puede comprender además agrupar y estratificar al sujeto de acuerdo con el diagnóstico, identificar progresos y no progresos, orientar las opciones de tratamiento e identificar la respuesta al tratamiento.
Uso de un kit
La presente invención proporciona en un segundo aspecto uso de un kit para diagnosticar el riesgo de revisión relacionado con el implante en un sujeto con un implante de acuerdo con el método del primer aspecto de la presente invención, siendo el kit adecuado para detectar un nivel de calprotectina en una muestra biológica; en el que la muestra biológica es líquido sinovial, siendo el líquido sinovial preferentemente recogido del sitio del implante.
En una realización preferida, el segundo aspecto de la invención se refiere al uso de un kit para diagnosticar el riesgo de revisión relacionado con el implante en un sujeto con un implante de acuerdo con el método del primer aspecto de la presente invención.
En una realización de acuerdo con el segundo aspecto de la invención, el kit es un kit para realizar un ensayo ELISA o un kit para realizar un ensayo inmunocromatográfico de flujo lateral.
En una realización preferida de acuerdo con el segundo aspecto de la invención, el kit es un kit para realizar un ensayo ELISA.
En una realización preferida de acuerdo con el segundo aspecto de la invención, el kit es un kit para realizar un ensayo ELISA, comprendiendo el ensayo ELISA las siguientes etapas:
- introducir una muestra biológica en un soporte sólido recubierto de anticuerpos monoclonales específicos de calprotectina;
- eliminar del soporte sólido la parte de la muestra biológica que no está unida a los anticuerpos monoclonales; - introducir un conjugado enzimático en el soporte sólido, comprendiendo el conjugado enzimático anticuerpos policlonales marcados con enzima específicos para la calprotectina; siendo la enzima preferiblemente fosfatasa alcalina;
- eliminar la parte del conjugado enzimático que no está unida a la calprotectina;
- introducir un sustrato enzimático al soporte sólido; comprendiendo el sustrato enzimático un sustrato para el conjugado enzimático, siendo el sustrato enzimático preferiblemente fosfato de p-nitrofenilo; y
- medir la cantidad de sustrato enzimático que ha sido sometido a tratamiento enzimático por el conjugado enzimático en una cantidad de tiempo predeterminada después de la introducción del sustrato enzimático en el soporte sólido; siendo preferiblemente el soporte sólido una placa de microtitulación.
El kit para realizar un ensayo ELISA puede comprender:
- un soporte sólido recubierto de anticuerpos monoclonales específicos de calprotectina;
- al menos una solución de lavado;
- un conjugado enzimático, comprendiendo el conjugado enzimático anticuerpos policlonales marcados con enzima específicos para calprotectina, siendo la enzima preferiblemente fosfatasa alcalina; y
- un sustrato enzimático, comprendiendo el sustrato enzimático un sustrato para el conjugado enzimático, siendo el sustrato enzimático preferiblemente fosfato de p-nitrofenilo.
Breve descripción de los dibujos.
Figura 1. ilustra una articulación sana de la cadera.
Figura 2. ilustra una articulación sana de la cadera en comparación con una articulación desgastada con hueso femoral expuesto que puede estar en contacto directo con el hueso pélvico.
Figura 3. ilustra un implante de reemplazo total de cadera.
Figura 4A. ilustra una prótesis de cadera que muestra un aflojamiento aséptico (flechas).
Figura 4B. ilustra una prótesis de cadera dislocada.
Figura 5. ilustra los resultados del ejemplo 1 y proporciona una visión general de las condiciones que pueden diagnosticarse mediante el método de acuerdo con la presente invención.
El grupo “sin riesgo de revisión” representa a pacientes con implantes estables que no necesitan tratamiento. El grupo de “riesgo de revisión” que representa a los pacientes con implantes que probablemente necesiten tratamiento. Además, el grupo de “riesgo de revisión” se divide en dos subgrupos. El grupo “ iniciación de la patología” representa pacientes que padecen una etapa temprana de aflojamiento, es decir, aflojamiento aséptico, dislocación del implante, osteólisis y/o cualquier combinación de los mismos. Este grupo puede estar sujeto a tratamiento farmacológico y, por lo tanto, aumentar la posibilidad de evitar la cirugía de revisión. El grupo “patología aguda” representa a los pacientes que sufren una etapa tardía de aflojamiento, es decir, una infección asociada al implante o una reacción metal contra metal, y es probable que necesiten una cirugía de revisión inmediata. Cada número en el eje X se refiere a una muestra de un paciente. Los números en el eje Y se refieren a la cantidad de calprotectina (mg/l) en cada muestra.
Descripción detallada de la invención
A menos que se defina específicamente en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos utilizados tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en los campos de la bioquímica y la biología.
Cuando se establece un límite o rango numérico en este documento, se incluyen los puntos finales. Además, todos los valores y subrangos dentro de un límite o rango numérico se incluyen específicamente como si estuvieran escritos explícitamente.
Aproximadamente 1.5 millones de operaciones de reemplazo total de cadera (artroplastia total de cadera - ATC) se llevan a cabo anualmente en todo el mundo. La tasa de fracaso esperada de los implantes protésicos durante los primeros 10 años es de aproximadamente 3-5 % y la tasa de fracaso va en aumento durante los próximos 10 años. La osteolisis y el posterior aflojamiento articular aséptico, ambos pertenecientes al grupo de “ inicio de la patología”, es el motivo más frecuente de revisión articular. En una etapa temprana, esta afección generalmente se asocia con micromovimientos en la interfaz entre el implante y el hueso, lo que provoca una destrucción progresiva del hueso. Inicialmente, esta afección suele ser indolora y, debido a este rango asintomático, la pérdida de masa ósea puede ser masiva antes de que los pacientes busquen ayuda. Para entonces, las condiciones para un procedimiento de revisión pueden ser desfavorables y se reduce el tiempo de supervivencia esperado para una nueva prótesis. Por lo tanto, existe la necesidad de métodos que permitan diagnosticar el aflojamiento del implante en una etapa temprana incluso en pacientes asintomáticos.
Además, también existe la necesidad de métodos rentables que permitan identificar a los pacientes que están en riesgo de revisión; es decir, separar a los pacientes que necesitan tratamiento de los pacientes con un implante estable que no necesita tratamiento. Los presentes inventores han resuelto esta necesidad al haber identificado biomarcadores, y en particular la calprotectina, que permiten el diagnóstico en etapas tempranas del aflojamiento del implante, incluso en pacientes asintomáticos.
Así, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un método para diagnosticar el riesgo de revisión relacionado con el implante, comprendiendo el método las siguientes etapas:
- detectar un nivel de calprotectina en una muestra biológica de un sujeto con un implante;
donde
- la muestra biológica es líquido sinovial del sitio del implante;
- la calprotectina a detectar es un polipéptido secretado y no un polipéptido intracelular de células intactas presentes en la muestra;
- un nivel < 4 mg/l de calprotectina es indicativo de un diagnóstico de riesgo de revisión no relacionado con el implante; y
- un nivel > 4 mg/l de calprotectina es indicativo de un diagnóstico de riesgo de revisión relacionado con el implante.
En una realización de acuerdo con la presente invención, la muestra biológica es líquido sinovial recogido en el sitio del implante, por ejemplo, un líquido sinovial de una articulación artificial.
En una realización de acuerdo con la presente invención, el implante es un implante articular. En otra realización de acuerdo con la presente invención, el implante es una prótesis tal como una prótesis articular y en particular una prótesis de cadera.
En una realización de acuerdo con la presente invención, el implante es una prótesis de cadera y la muestra biológica es líquido sinovial de la articulación de la cadera.
La calprotectina pertenece a la familia de proteínas S100. El nombre deriva del hecho de que son resistentes a la precipitación por sulfato de amonio, por lo que son solubles incluso en una solución de sulfato de amonio saturada al 100 por ciento (por lo tanto, S100). Una característica común de estas proteínas es que pueden unir calcio y zinc y, por lo tanto, volverse resistentes a la degradación enzimática; esto es especialmente cierto para la calprotectina. La calprotectina es un complejo de las proteínas de mamíferos S100A8 y S100A9. Cada uno de S100A8 y S100A9 contienen dos sitios de unión de Ca2+, y la calprotectina es capaz de unir un total de cuatro iones de calcio por dímero u ocho iones de calcio por tetrámero. La unión de calcio induce un cambio conformacional en el complejo que mejora su afinidad por los metales de transición y promueve la formación de tetrámeros. Un máximo de dos iones de metales de transición pueden unirse a cada dímero de calprotectina S100A8-S100A9. Este secuestro de metales proporciona las complejas propiedades antimicrobianas.
Un experto en la materia sabrá fácilmente cómo detectar la calprotectina y sus monómeros en una muestra biológica. El documento WO2013/132347 divulga el uso de un ensayo ELISA para determinar la concentración de calprotectina en una muestra biológica. Una alternativa al uso de un ensayo ELISA es el conocido ensayo inmunocromatográfico de flujo lateral (LFA).
En una realización de acuerdo con la presente invención, el nivel de calprotectina se detecta mediante un ensayo adecuado para detectar la calprotectina en una muestra de líquido sinovial, preferiblemente el ensayo es un ensayo inmunocromatográfico de flujo lateral o un ensayo ELISA, más preferiblemente un ensayo ELISA.
En el caso de un ensayo ELISA, el ensayo comprende preferiblemente las siguientes etapas:
- introducir la muestra biológica en un soporte sólido recubierto de anticuerpos monoclonales específicos de calprotectina;
- eliminar del soporte sólido la parte de la muestra biológica que no está unida a los anticuerpos monoclonales; - introducir un conjugado enzimático en el soporte sólido, comprendiendo el conjugado enzimático anticuerpos policlonales marcados con enzima específicos para calprotectina, siendo la enzima preferiblemente fosfatasa alcalina; - eliminar la parte del conjugado enzimático que no está unida a la calprotectina;
introducir un sustrato enzimático al soporte sólido; comprendiendo el sustrato enzimático un sustrato para el conjugado enzimático, siendo el sustrato enzimático preferiblemente fosfato de p-nitrofenilo; y
- medir la cantidad de sustrato enzimático que ha sido sometido a tratamiento enzimático por el conjugado enzimático en una cantidad de tiempo predeterminada después de la introducción del sustrato enzimático en el soporte sólido; siendo preferiblemente el soporte sólido una placa de microtitulación.
La calprotectina comprende hasta el 60 % del contenido de proteína soluble del citosol de un neutrófilo. Lo que debe detectarse es la cantidad de calprotectina secretada y no el contenido intracelular en las células intactas presentes en la muestra. Por lo tanto, es esencial que las muestras que comprenden células no se sometan a un tratamiento que provocaría la liberación de calprotectina intracelular.
En una realización de acuerdo con la presente invención, la calprotectina a detectar no representa la calprotectina que formaba parte del contenido intracelular de las células intactas en el momento de la toma de muestras.
En una realización de acuerdo con la presente invención, el diagnóstico se basa únicamente en el nivel detectado de calprotectina.
Como se usa aquí, el término “sujeto” se refiere a un animal, y en particular a un mamífero tal como un ser humano. En una realización de acuerdo con la presente invención, el sujeto a diagnosticar es un sujeto asintomático, tal como un animal asintomático y, en particular, un mamífero asintomático, tal como un ser humano asintomático. Un ser humano asintomático puede, p. ej., ser un paciente asintomático.
En el contexto de la presente invención, el término “ implante” se refiere a un implante médico que se implanta en un organismo vivo, tal como los humanos. Un implante médico es un dispositivo hecho por el hombre, en contraste con un trasplante, que es un tejido biomédico trasplantado.
En una realización de acuerdo con la presente invención, el término “ implante” se refiere a un implante ortopédico. Un implante ortopédico es un dispositivo médico fabricado para reemplazar una articulación o hueso faltante o para
sostener un hueso dañado. El implante médico generalmente se fabrica con acero inoxidable y aleaciones de titanio para mayor resistencia y el revestimiento de plástico que se aplica actúa como un cartílago artificial. La fijación interna es una operación en ortopedia que implica la implementación quirúrgica de implantes con el fin de reparar un hueso. Entre los tipos más comunes de implantes médicos se encuentran los clavos, varillas, tornillos y placas que se utilizan para anclar los huesos fracturados mientras sanan.
En una realización preferida, el término “ implante” se refiere a un dispositivo médico fabricado para reemplazar una articulación faltante, tal como una prótesis articular y, en particular, una prótesis de cadera.
De acuerdo con la presente invención, un nivel < 4 mg/l de la calprotectina es indicativo de un diagnóstico de riesgo de revisión no relacionado con el implante, es decir, un implante estable. Si a un paciente se le diagnostica un riesgo de revisión no relacionado con el implante, el implante es estable y no es necesario ningún examen médico adicional.
En el contexto de la presente invención, cualquier referencia a una cantidad específica de calprotectina (por ejemplo, menos de 4 mg/l) se refiere a la cantidad específica medida mediante el Kit ELISA de calprotectina (ALP) CALPROLAB™. El kit ELISA de calprotectina (ALP) CALPROLAB™ se describe con más detalle en el ejemplo 1. Dicho en otras palabras, si se dice que una muestra contiene 4 mg/l de calprotectina, la muestra contiene 4 mg/l de calprotectina de acuerdo con lo medido por el Kit ELISA de calprotectina (ALP) CALPROLAB™ al que se hace referencia en el Ejemplo 1.
De acuerdo con la presente invención, un nivel > 4 mg/l de calprotectina indica un diagnóstico de riesgo de revisión relacionado con el implante. El nivel de calprotectina a un nivel medido por el Kit ELISA de calprotectina (ALP) CALPROLAB™ al que se hace referencia en el ejemplo 1. Los pacientes que sufren de riesgo de revisión relacionado con el implante tienen un mayor riesgo de aflojamiento del implante y deben ser derivados a un especialista para un examen médico adicional.
Un examen médico adicional puede revelar si el paciente tiene un aflojamiento en etapa temprana, es decir, i) aflojamiento aséptico, dislocación del implante, osteólisis y/o cualquier combinación de los mismos; o ii) infección asociada al implante o reacción metal contra metal. Si bien la infección asociada al implante o la reacción metal contra metal requieren una cirugía de revisión, los pacientes con aflojamiento aséptico, dislocación del implante, osteólisis y/o cualquier combinación de los mismos pueden beneficiarse de la terapia con medicamentos. Si la terapia con medicamentos no tiene éxito, es posible que se requiera una cirugía de revisión en una etapa posterior.
En el contexto de la presente invención, el término “cirugía de revisión” pretende significar el reemplazo del implante, por ejemplo, el reemplazo de la prótesis.
Por lo tanto, en otra realización de acuerdo con la presente invención, un sujeto diagnosticado con riesgo de revisión relacionado con el implante es un sujeto que padece una patología de inicio (aflojamiento aséptico, dislocación del implante, osteólisis y/o cualquier combinación de las mismas) o patología aguda (infección asociada al implante o reacción metal contra metal) (ver figura 5).
Sorprendentemente, los inventores de la presente invención han descubierto que los resultados del método de diagnóstico del riesgo de revisión relacionado con el implante también pueden indicar si los pacientes que padecen riesgo de revisión relacionado con el implante sufren de aflojamiento en etapa temprana, es decir, i) aflojamiento aséptico, dislocación del implante, osteólisis y/o cualquier combinación de los mismos; o ii) infección asociada al implante o reacción metal contra metal.
Así, en otra realización de acuerdo con la presente invención, un nivel en el rango de 4-50 mg/l de calprotectina es indicativo de aflojamiento aséptico (figura 4A), dislocación del implante (figura 4B), osteólisis y/o cualquier combinación de los mismos. Este último se refiere a una etapa temprana de aflojamiento de la prótesis que requerirá la revisión del implante si no se trata. Esta condición generalmente se asocia con micromovimientos en la interfaz implante-hueso que causan la destrucción progresiva del hueso. Inicialmente, esta afección suele ser indolora y, debido a este rango asintomático, la pérdida de masa ósea puede ser masiva antes de que los pacientes busquen ayuda.
El Aflojamiento aséptico se caracteriza por tejido conjuntivo pobremente vascularizado dominado por fibroblastos y macrófagos. Posteriormente, la secreción de factores proinflamatorios, gelatinasas y proteasas contribuye a la osteólisis periprotésica y al fracaso del implante articular. El aflojamiento aséptico puede ser el resultado de una fijación inicial inadecuada, la pérdida mecánica de la fijación con el tiempo o la pérdida biológica de la fijación provocada por la osteólisis inducida por partículas alrededor del implante.
El término “osteólisis” generalmente se refiere a un problema común a los reemplazos de articulaciones artificiales, como reemplazos totales de cadera, reemplazos totales de rodilla y reemplazos totales de hombro. Hay varios mecanismos biológicos que pueden conducir a la osteólisis. En el reemplazo total de cadera, la explicación generalmente aceptada para la osteólisis implica partículas de desgaste (desgaste de la superficie de contacto de la bola artificial y la articulación de cavidad). A medida que el cuerpo intenta limpiar estas partículas de desgaste (que generalmente consisten en plástico o metal), esto desencadena una reacción autoinmune que provoca la reabsorción
del tejido óseo vivo. Se ha reportado que la osteolisis ocurre tan pronto como 12 meses después de la implantación y generalmente es progresiva.
El término “dislocación” generalmente se refiere a la dislocación del implante. La dislocación de la prótesis de cadera ocurre principalmente en los primeros 3 meses después de la inserción, principalmente debido a la formación incompleta de una cicatriz y a la relajación de los tejidos blandos. Los tejidos blandos lesionados o cortados durante la cirugía tardan de ocho a doce semanas en sanar. Durante este período, la bola de la cadera puede salirse de la cavidad. La posibilidad de que esto suceda disminuye si se corta menos tejido, si se repara el corte del tejido y si se utilizan bolas de cabeza de gran diámetro. Las dislocaciones que ocurren entre 3 meses y 5 años después de la inserción generalmente ocurren debido a una mala posición de los componentes o disfunción de los músculos cercanos.
En otra realización de acuerdo con la presente invención, un nivel en el rango de 4-50 mg/l, tal como 5-50 mg/l, 10 50 mg/l, 20-50 mg/l o 30-50 mg/l, del al menos un polipéptido es indicativo de aflojamiento aséptico, dislocación del implante, osteólisis y/o cualquier combinación de los mismos.
En otra realización de acuerdo con la presente invención, un nivel > 50 mg/l de calprotectina es indicativo de una infección asociada al implante o una reacción metal contra metal. Los pacientes que sufren de infección asociada al implante o reacción de metal contra metal necesitan una cirugía de revisión inmediata.
El término “ infección asociada al implante” se refiere a una condición típicamente causada por bacterias que se adhieren a la superficie de un implante y posteriormente forman una biopelícula en el sitio de implantación. La formación de biopelículas tiene lugar en varias etapas, comenzando con una rápida unión a la superficie, seguida por la proliferación de células bacterianas multicapa y la adhesión intercelular en una matriz de polisacáridos extracelulares.
La formación de biopelículas en dispositivos médicos presenta tres problemas principales. En primer lugar, las comunidades bacterianas en estas superficies representan un reservorio de bacterias que pueden pasar al cuerpo y provocar una infección crónica. En segundo lugar, las bacterias del biopelícula son muy resistentes al tratamiento con antibióticos; por lo tanto, una vez que se forman estas comunidades bacterianas, son extremadamente difíciles de eliminar con las terapias antimicrobianas convencionales. Finalmente, debido a que las respuestas del huésped y las terapias antimicrobianas a menudo no pueden eliminar las bacterias que crecen en una biopelícula, se puede producir una respuesta inflamatoria crónica en el sitio de la biopelícula.
Si la adhesión bacteriana se produce antes de que tenga lugar la regeneración tisular, las defensas del huésped a menudo no pueden evitar la colonización superficial de ciertas especies bacterianas que son capaces de formar una capa de biopelícula protectora. Por lo tanto, la inhibición de la adhesión bacteriana es esencial para prevenir infecciones asociadas a implantes, ya que las biopelículas son extremadamente resistentes tanto al sistema inmunitario como a los antibióticos. Por lo tanto, para tener éxito en los implantes ortopédicos, los materiales de los implantes deben ser habitables por las células formadoras de hueso (favoreciendo la adhesión de los osteoblastos), dificultar la formación de tejido conectivo blando (obstaculizando la adhesión de los fibroblastos) y ser antiinfecciosos (desalentando la adhesión bacteriana).
En una realización de acuerdo con la presente invención, la infección asociada al implante se selecciona del grupo que consiste en aflojamiento séptico, infección crónica de las articulaciones, infección por biopelícula y/o cualquier combinación de las mismas.
El término “reacción metal contra metal” típicamente se refiere a condiciones relacionadas con la liberación de diminutas partículas metálicas o iones metálicos por el desgaste de los implantes, que causan dolor y discapacidad. La causa de estos fallos sigue siendo controvertida y puede incluir factores de diseño, factores técnicos y factores relacionados con las respuestas inmunitarias del paciente (reacciones de tipo alérgico).
En otra realización de acuerdo con la presente invención, un nivel > 55 mg/l, tal como > 60 mg/l, > 70 mg/l, > 80 mg/l, > 90 mg/l o > 100 mg/l de calprotectina es indicativo de infección asociada al implante o reacción metal contra metal. En otra realización de acuerdo con la presente invención, un nivel de al menos un polipéptido de 51-1000 mg/l, 55 1000 mg/l, 60-1000 mg/l, 70-1000 mg/l, 80-1000 mg /l, 90-1000 mg/l, 100-1000 mg/l, 51-900 mg/l, 51-850 mg/l, 51 800 mg/l, 51-700 mg/l, 51-650 mg/l, 51-600 mg/l, 51-550 mg/l o 51-500 mg/l es indicativo de un diagnóstico de infección asociada al implante o reacción metal contra metal.
La presente invención proporciona una forma novedosa y fácil de separar a los pacientes en dos o más grupos y subgrupos de los mismos. Una caracterización en grupos y subgrupos es de interés, ya que puede funcionar como una estratificación novedosa de pacientes en grupos que responden y no responden a la terapia, además de usarse para aumentar la sensibilidad y especificidad diagnósticas.
Por lo tanto, el método puede comprender además agrupar y estratificar al sujeto de acuerdo con su diagnóstico, identificar progresos y no progresos, guiar opciones de tratamiento e identificar la respuesta al tratamiento.
En una realización de acuerdo con la presente invención, el método es para diagnosticar aflojamiento aséptico, dislocación del implante, osteólisis y/o cualquier combinación de los mismos.
El método puede no ser para el diagnóstico de infecciones asociadas a implantes o reacciones de metal contra metal. El método puede ser para diagnosticar el riesgo de revisión relacionado con el implante que no está causado por una infección asociada al implante.
El método puede ser para diagnosticar el riesgo de revisión relacionado con el implante que no está causado por una reacción de metal contra metal.
El método puede comprender además un paso de comparar el nivel de calprotectina en la muestra biológica con el nivel de calprotectina en una muestra de control. La muestra de control es preferiblemente una muestra de líquido sinovial de un sujeto que no sufre riesgo de revisión relacionado con el implante.
En otra realización de acuerdo con la presente invención, se proporcionan al menos dos muestras biológicas, procediendo las dos muestras biológicas de diferentes sujetos; dichos sujetos que tienen un implante; con la condición de que al menos uno de dichos sujetos sufra aflojamiento aséptico, dislocación del implante, osteólisis y/o cualquier combinación de los mismos. Se está detectando un nivel de calprotectina en las muestras biológicas, siendo las muestras biológicas líquido sinovial.
Un segundo aspecto de la presente invención se refiere al uso de un kit para diagnosticar el riesgo de revisión relacionado con el implante en un sujeto con un implante de acuerdo con el método de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención, siendo el kit adecuado para detectar un nivel de calprotectina en una muestra biológica; en el que la muestra biológica es líquido sinovial recogido del sitio del implante.
En una realización de acuerdo con la presente invención, el kit es un kit para realizar un ensayo ELISA o un kit para realizar un ensayo inmunocromatográfico de flujo lateral.
En una realización de acuerdo con la presente invención, el kit es un kit para realizar un ensayo ELISA en el que el ensayo ELISA comprende las siguientes etapas:
- introducir una muestra biológica en un soporte sólido recubierto de anticuerpos monoclonales específicos de calprotectina;
- eliminar del soporte sólido la parte de la muestra biológica que no está unida a los anticuerpos monoclonales; - introducir un conjugado enzimático en el soporte sólido, comprendiendo el conjugado enzimático anticuerpos policlonales marcados con enzima específicos para la calprotectina; siendo la enzima preferiblemente fosfatasa alcalina;
- eliminar la parte del conjugado enzimático que no está unida a la calprotectina;
- introducir un sustrato enzimático al soporte sólido; comprendiendo el sustrato enzimático un sustrato para el conjugado enzimático, siendo el sustrato enzimático preferiblemente fosfato de p-nitrofenilo; y
- medir la cantidad de sustrato enzimático que ha sido sometido a tratamiento enzimático por el conjugado enzimático en una cantidad de tiempo predeterminada después de la introducción del sustrato enzimático en el soporte sólido; siendo preferiblemente el soporte sólido una placa de microtitulación.
En una realización de acuerdo con la presente invención, el kit es un kit para realizar un ensayo ELISA en el que el ensayo ELISA comprende:
- un soporte sólido recubierto de anticuerpos monoclonales específicos de calprotectina;
- al menos una solución de lavado;
- un conjugado enzimático, comprendiendo el conjugado enzimático anticuerpos policlonales marcados con enzima específicos para calprotectina, siendo la enzima preferiblemente fosfatasa alcalina; y
- un sustrato enzimático, comprendiendo el sustrato enzimático un sustrato para el conjugado enzimático, siendo el sustrato enzimático preferiblemente fosfato de p-nitrofenilo.
En otra realización de acuerdo con la presente invención, el kit es un kit para realizar un ensayo ELISA en el que el ensayo ELISA comprende las siguientes etapas:
- introducir una muestra biológica en un soporte sólido recubierto con fracciones de unión, tales como anticuerpos y en particular anticuerpos monoclonales, específicos para calprotectina;
- eliminar la parte de la muestra biológica que no está unida a los restos de unión del soporte sólido;
- introducir un conjugado enzimático en el soporte sólido, comprendiendo el conjugado enzimático restos de unión marcados con enzima, tales como anticuerpos policlonales, específicos para la calprotectina; siendo la enzima preferiblemente fosfatasa alcalina;
- eliminar la parte del conjugado enzimático que no está unida a la calprotectina;
- introducir un sustrato enzimático al soporte sólido; comprendiendo el sustrato enzimático un sustrato para el conjugado enzimático, siendo el sustrato enzimático preferiblemente fosfato de p-nitrofenilo; y
- medir la cantidad de sustrato enzimático que ha sido sometido a tratamiento enzimático por el conjugado enzimático en una cantidad de tiempo predeterminada después de la introducción del sustrato enzimático en el soporte sólido; siendo preferiblemente el soporte sólido una placa de microtitulación.
En otra realización de acuerdo con la presente invención, el kit es un kit para realizar un ensayo ELISA en el que el ensayo ELISA comprende las siguientes etapas:
- introducir una muestra biológica en un soporte sólido recubierto con fracciones de unión (preferiblemente, las fracciones de unión no están marcadas), tales como anticuerpos y, en particular, anticuerpos monoclonales, específicos para la calprotectina;
- eliminar la parte de la muestra biológica que no está unida a los restos de unión del soporte sólido;
- introducir restos de unión marcados específicos para la calprotectina, pudiendo los restos de unión marcados producir una señal detectable proporcional a la concentración del al menos un polipéptido a detectar;
- eliminar la parte de los restos de unión marcados que no están unidos a la calprotectina;
- medir la señal detectable para determinar el nivel de calprotectina a detectar en la muestra biológica.
En una realización preferida, los restos de unión que preferiblemente no están marcados son anticuerpos monoclonales y los restos de unión marcados son anticuerpos policlonales.
Los soportes sólidos adecuados son bien conocidos en la técnica. Sin embargo, un soporte particularmente adecuado es MaxiSorp™, producido por Nunc NS, y descrito en la Patente de Estados Unidos N° 4.980.299 de Batz et al., que emplea resinas sintéticas tales como poliestireno, Luran, polipropileno o cloruro de polivinilo. En la técnica se conocen diversos formatos para tales soportes sólidos; un formato especialmente adecuado es el uso de una placa de micropocillos con 96 pocillos. Se describen soportes sólidos adicionales, por ejemplo, en D. Wild & W. Kusnezow, “Separation Systems” en The Immunoassay Handbook (D. Wild, ed., 3rded., Elsevier, Amsterdam, 2005, ch. 10, pp.
179-185.
El recubrimiento del soporte sólido con los restos de unión se realiza normalmente mediante métodos conocidos en la técnica. Un tampón particularmente preferido para recubrir el soporte sólido con anticuerpo anti-S100A9 monoclonal no marcado es citrato de sodio 0.1 M, pH 6.0. Típicamente, para recubrir un soporte sólido, el anticuerpo monoclonal se usa a una concentración de aproximadamente 1 a 4 μg/ml, preferiblemente aproximadamente 2 μg/ml, en el tampón, tal como el tampón citrato descrito anteriormente. Preferiblemente, el soporte sólido se cubre con plástico adhesivo hermético al vapor y se almacena a una temperatura de aproximadamente 0° C a aproximadamente 8 °C, preferiblemente aproximadamente 4 °C, durante un período de incubación de aproximadamente 6 horas a varias semanas. Preferiblemente, el período de incubación es de aproximadamente 2 a 3 días. Alternativamente, el soporte sólido se puede almacenar a una temperatura de aproximadamente 9 °C a aproximadamente 37 °C.
Antes de la actuación del inmunoensayo sándwich ELISA, el soporte sólido se lava para eliminar el exceso de anticuerpos no unidos. Típicamente, el soporte sólido se lava con un tampón de lavado convencional tal como una solución salina tamponada con fosfato. Normalmente, el soporte sólido se lava tres o cuatro veces antes de realizar el ensayo.
Tal como se utiliza aquí, el término “resto de unión” se refiere a una molécula, complejo o agregado, que se une específica o selectivamente a una molécula, célula, partícula, tejido o agregado diana. Por lo tanto, un resto de unión
a calprotectina se refiere a una molécula, complejo o agregado, que se une específica o selectivamente a la calprotectina. De manera similar, un resto de unión a S100A8 se refiere a una molécula, complejo o agregado, que se une específica o selectivamente a S100A8 y un resto de unión a S100A9 se refiere a una molécula, complejo o agregado, que se une específica o selectivamente a S100A9.
Como se usa en este documento, el término “unión específica” se refiere al reconocimiento específico de una molécula en comparación con un reconocimiento sustancialmente menor de otras moléculas. Los ejemplos de unión específica incluyen, pero no se limitan a, interacciones anticuerpo-antígeno, interacciones enzima-sustrato y similares. En algunas realizaciones, un resto de unión puede tener una constante de asociación de equilibrio intrínseca (KA) para el objetivo no inferior a aproximadamente 105 M'1 en condiciones ambientales tales como un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 8 y una temperatura que oscila entre aproximadamente 0 °C y aproximadamente 37 °C.
En una realización, los restos de unión son anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos inespecíficos u otros anticuerpos multivalentes, u otras moléculas o compuestos basados en anticuerpos. Sin embargo, también pueden usarse otros restos de unión conocidos en la técnica, tales como aptámeros, avímeros o péptidos dirigidos.
Como se usa aquí, el término “anticuerpo” se refiere a una inmunoglobulina que se une específicamente y por lo tanto se define como complementaria con una organización particular de otra molécula. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal y puede prepararse mediante técnicas bien conocidas en la técnica, como la inmunización de un huésped y la recolección de sueros (policlonal), o mediante la preparación de líneas celulares híbridas continuas y la recolección de la proteína secretada (monoclonal), o mediante la clonación y expresión de secuencias de nucleótidos o versiones mutagenizadas de las mismas, que codifican al menos para las secuencias de aminoácidos requeridas para la unión específica de anticuerpos naturales. Los anticuerpos pueden incluir una inmunoglobulina completa o un fragmento de la misma, cuyas inmunoglobulinas incluyen diversas clases e isotipos, tales como IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3, IgM. Los fragmentos de anticuerpos funcionales pueden incluir porciones de un anticuerpo capaz de retener la unión con una afinidad similar al anticuerpo de longitud completa (por ejemplo, Fab, Fv y F(ab')2, o Fab'). Además, se pueden usar agregados, polímeros y conjugados de inmunoglobulinas o sus fragmentos cuando sea apropiado siempre que se mantenga sustancialmente la afinidad de unión por una molécula particular.
En el presente documento se divulga una forma novedosa y fácil de separar a los pacientes en dos o más grupos y subgrupos de los mismos. Una caracterización en grupos y subgrupos es de interés ya que puede funcionar como una estratificación novedosa de pacientes en grupos que responden y no responden a la terapia.
La invención se describirá más detalladamente, con referencia al siguiente ejemplo.
Ejemplo 1
KIT para medir los niveles de Calprotectina en una muestra
El ELISA de Calprotectina CALPROLABTM (ALP) es un ensayo cuantitativo para medir la calprotectina en muestras. El ensayo está disponible comercialmente.
Principio de la prueba:
En ELISA, las muestras y los estándares se incuban en pocillos de microtitulación separados recubiertos con anticuerpos monoclonales que se unen a la calprotectina. Después de la incubación y el lavado de los pocillos, se permite que la calprotectina unida reaccione con anticuerpos específicos de calprotectina purificados por inmunoafinidad marcados con enzimas. Después de esta reacción, la cantidad de enzima unida en los pocillos de microtitulación es proporcional a la cantidad de calprotectina en la muestra o estándar, que se determina mediante la incubación con un sustrato para la enzima dando un producto coloreado. La intensidad del color se determina por absorbancia utilizando un lector de placas ELISA, y es proporcional a la concentración de calprotectina en los estándares y muestras. El ensayo se calibra utilizando calprotectina purificada a partir de extracto de leucocitos.
Reactivos suministrados con el kit:
ratón purificados por afinidad específicos para calprotectina. La placa se almacena en una bolsa sellada con desecante.
T _ampón de dilución de muestra (5x conc.) ***: 1 * 20 ml, concentrado 5x, para diluir con agua destilada/desionizada; pH 8.0 ± 0.2, solución de color amarillo, frasco con tapa azul.
destilada/desionizada, para lavar los pocilios de microtitulación; pH 7.8 ± 0.2, solución transparente, frasco con tapa blanca.
destilada/desionizada; pH 8.0 ± 0.2, solución transparente, frascos con tapas blancas.
tapas de diferentes colores:
color amarillo; Ctr Low: vial con tapa marrón; Ctr High: vial con tapa morada.
fosfatasa alcalina, purificados por inmunoafinidad, listos para usar; solución de color rojo, tubo de reactivo Dynex de 25 ml con tapa blanca.
frasco opaco con tapa amarilla. El frasco contiene gránulos estabilizadores.
Nota: Si utiliza un instrumento Dynex, el sustrato debe transferirse a un tubo de reactivo Dynex de 25 ml antes de realizar la prueba.
* Contiene 0.1 % Kathon
** Contiene < 0.1 % de azida sódica
*** Contiene 0.1 % de kathon y <0.1 % de azida sódica
**** Contiene 0.02 % de metilisotiazolona y 0.02 % de bromonitrodioxano
Muestras sinoviales de pacientes con implante
Se recogieron muestras sinoviales de 37 pacientes durante la cirugía de revisión utilizando una aguja. El diagnóstico clínico fue decidido por el cirujano en base a su observación durante la cirugía de revisión. Las muestras sinoviales se congelaron inmediatamente a una temperatura de -20 °C.
A continuación, las muestras se descongelaron en hielo. A continuación, las muestras descongeladas se sometieron a una preparación adicional de acuerdo con el procedimiento que se describe a continuación.
Preparación de reactivos
Todos los reactivos, muestras y controles se llevan a temperatura ambiente antes de comenzar la prueba.
El tampón de extracción 2.5x se diluyó añadiendo 1 parte (20 ml) a 1.5 partes (30 ml) de agua destilada/desionizada en un recipiente limpio hasta un volumen final de 50 ml y se mezcló bien.
El tampón de dilución de muestra concentrado 5x se diluyó agregando 1 parte (20 ml) a 4 partes (80 ml) de agua destilada/desionizada en un recipiente limpio hasta un volumen final de 100 ml. El diluyente de muestra diluido se mezcló bien.
La solución de lavado concentrada 20x se diluyó agregando 1 parte (10 ml) a 19 partes (190 ml) de agua destilada/desionizada en un recipiente limpio hasta un volumen final de 200 ml y se mezcló bien.
Los viales etiquetados con A-F estándar, así como los controles, contienen 1.0 ml cada uno de una solución lista para usar. La concentración de calprotectina está impresa en la etiqueta de cada vial. Se omitió el estándar más alto (tubo F) para producir una curva estándar robusta en el interesante rango de concentración de calprotectina y para dejar espacio para un estándar adicional (dilución al 50 % del tubo estándar C) en este rango.
El tubo de conjugado enzimático contiene 13 ml de anticuerpos de conejo purificados por inmunoafinidad y marcados con fosfatasa alcalina (ALP) contra la calprotectina en un tampón con 20 estabilizadores, conservantes y un colorante rojo inerte. La solución está lista para usar.
El frasco de solución de sustrato enzimático contiene 13 ml de solución de p-nitrofenilfosfato. La solución está lista para usar.
Medición de los niveles de Calprotectina en muestras sinoviales de pacientes con un implante
1) Las muestras sinoviales primero se diluyeron 1:100 en tampón de extracción 1x y se mezclaron bien mediante agitación vorticial. Posteriormente, las muestras se sometieron a una dilución adicional de 1:10 en el tampón de dilución de muestras y se mezclaron bien mediante agitación vorticial, generando un factor de dilución final de 1:1000.
2) Se añadieron 100 μl de cada estándar, control y muestra sinovial diluida en los pocillos de la microplaca apropiados. Los estándares se agregaron en paralelos de cuatro y las muestras se agregaron por triplicado.
3) La placa se cubrió con una lámina de sellado y se incubó a temperatura ambiente durante 40 minutos en un agitador de placas horizontal a 600 rpm.
4) Al final del tiempo de incubación, se eliminó el líquido y se lavaron los pocillos añadiendo 300 μl de solución de lavado a cada pocillo. Este procedimiento se repitió hasta realizar un total de tres lavados. Después de cada etapa de lavado, la placa se invierte y se golpea ligeramente sobre material absorbente para eliminar cualquier resto de solución de lavado. Se tiene cuidado en la última de las tres etapas de lavado para eliminar cualquier exceso de líquido. 5) Se añaden 100 μl de solución de conjugado enzimático a cada pocillo.
6) La placa se cubre con una lámina de sellado y se incuba a temperatura ambiente durante 40 minutos en un agitador de placas horizontal a 600 rpm.
7) Se repiten las etapas de lavado descritas en el punto 4). Tres veces con 300 μl de solución de lavado por pocillo.
8) Se añaden 100 μl de solución de sustrato de enzima a cada pocillo.
9) La placa se incuba a temperatura ambiente (sin agitación) durante 25 minutos, protegida de la luz.
10) Los valores de densidad óptica (OD) a 405 nm se leen usando un lector ELISA.
11) Se prepara una curva estándar basada en las mediciones ópticas de los estándares de calprotectina y la concentración conocida de calprotectina en cada muestra estándar.
12) Las concentraciones de calprotectina en muestras sinoviales se calculan en base a la curva estándar preparada en el punto 11).
Resultados “riesgo de revisión relacionado con el implante” (tabla 1)
Se analizaron 37 muestras de pacientes con implante respecto a PCR y calprotectina. Los resultados se presentan en la tabla 1. “Diagnóstico clínico” se refiere al diagnóstico clínico correcto. Se establece un diagnóstico de prueba basado en los niveles detectados de calprotectina en muestras sinoviales de los pacientes. Si el nivel de calprotectina es > 4 mg/l, el paciente tiene riesgo de revisión relacionado con el implante. Sin embargo, si el nivel de calprotectina es < 4 mg/l, el paciente no tiene riesgo de revisión relacionado con el implante. “Prueba (4 mg/l)” indica si el diagnóstico de prueba proporciona un resultado correcto en comparación con el diagnóstico clínico real. TN (Negativo Verdadero) se refiere a una situación en la que tanto la prueba como el diagnóstico clínico concluyen que el paciente no tiene riesgo de revisión relacionado con el implante (la prueba de diagnóstico proporciona un resultado correcto). TP (Verdadero positivo) se refiere a una situación en la que tanto la prueba como el diagnóstico clínico concluyen que el paciente tiene riesgo de revisión relacionado con el implante (la prueba de diagnóstico proporciona un resultado correcto). FN se refiere a una situación en la que el diagnóstico de la prueba concluye incorrectamente que el paciente no tiene riesgo de revisión relacionado con el implante (la prueba de diagnóstico proporciona un resultado incorrecto). FP se refiere a una situación en la que el diagnóstico de la prueba concluye incorrectamente que el paciente tiene riesgo de
revisión relacionado con el implante (la prueba de diagnóstico proporciona un resultado incorrecto). El aflojamiento aséptico, la dislocación, el aflojamiento séptico y el metal contra metal están todos asociados con el riesgo de revisión relacionado con el implante. Los resultados verdaderos positivos y verdaderos negativos se presentan en la figura 5.
Tabla 1:
*La proteína C reactiva (PCR) es una proteína pentamérica anular (en forma de anillo) que se encuentra en el plasma sanguíneo, cuyos niveles aumentan en respuesta a la inflamación. Es una proteína de fase aguda de origen hepático que aumenta tras la secreción de interleucina-6 por macrófagos y células T La PCR se utiliza principalmente como marcador de inflamación. Medir y graficar los valores de PCR puede resultar útil para determinar el progreso de la enfermedad o la efectividad de los tratamientos.
Número total de pacientes con verdaderos positivos : 26
Número total de pacientes con falsos positivos : 1
Número total de pacientes con falsos negativos : 1
Número total de pacientes con verdaderos negativos : 9
Sensibilidad:
(Número total de pacientes con verdaderos positivos) / (Número total de pacientes con falsos negativos
+ Número total de pacientes con verdaderos positivos)
Sensibilidad = 26/ (1+26) = 0.963
Especificidad:
(Número total de pacientes con verdadero negativo) / (Número total de pacientes con falso positivo Número total de pacientes con verdadero negativo)
Especificidad = 9/(1+9) = 0.9
Valor predictivo negativo:
(Número total de pacientes con verdadero negativo) / (Número total de pacientes con falso negativo
+ Número total de pacientes con verdaderos negativos)
Valor predictivo negativo = 9/(1+9) = 0.9
Valor predictivo positivo
(Número total de pacientes con verdaderos positivos) / (Número total de pacientes con falsos positivos Número total de pacientes con verdaderos positivos)
Valor predictivo positivo = 26/ (1+26) = 0.963
La prueba Exacta de Fisher proporciona un valor de p inferior a 0.0001 (a = 0.05).
Resultados “ inicio de patología” (Tabla 2)
Se analizaron 37 muestras de pacientes con implante respecto a PCR y calprotectina. Los resultados se presentan en la tabla 2. “Diagnóstico clínico” se refiere al diagnóstico clínico correcto. Se establece un diagnóstico de prueba basado en los niveles detectados de calprotectina en muestras sinoviales de los pacientes. Si el nivel de calprotectina está en el rango de 4-50 mg/l, el paciente tiene indicación de inicio de patología. “Prueba (4-50 mg/l)” indica si la pruebadiagnóstico proporciona un resultado correcto en comparación con el diagnóstico clínico correcto. TN (verdadero negativo) se refiere a una situación en la que tanto la prueba como el diagnóstico clínico concluyen que el paciente no tiene indicios de inicio de patología. TP (verdadero positivo) se refiere a una situación en la que tanto la prueba como el diagnóstico clínico concluyen que el paciente tiene indicación de inicio de patología (la prueba de diagnóstico proporciona un resultado correcto). FN se refiere a una situación en la que el diagnóstico de la prueba concluye incorrectamente que el paciente no tiene indicación de inicio de patología (la prueba de diagnóstico proporciona un resultado incorrecto). FP se refiere a una situación en la que el diagnóstico de la prueba concluye incorrectamente que el paciente tiene indicación de inicio de patología (la prueba de diagnóstico proporciona un resultado incorrecto).
Tabla 2:
* La proteína C reactiva (PCR) es una proteína pentamérica anular (en forma de anillo) que se encuentra en el plasma sanguíneo, cuyos niveles aumentan en respuesta a la inflamación. Es una proteína de fase aguda de origen hepático que aumenta tras la secreción de interleucina-6 por macrófagos y células T. La PCR se utiliza principalmente como marcador de inflamación. Medir y graficar los valores de PCR puede resultar útil para determinar el progreso de la enfermedad o la efectividad de los tratamientos.
Número total de pacientes con verdaderos positivos : 14
Número total de pacientes con falsos positivos : 2
Número total de pacientes con falsos negativos : 6
Número total de pacientes con verdaderos negativos : 15
Sensibilidad:
(Número total de pacientes con verdaderos positivos) / (Número total de pacientes con falsos negativos Número total de pacientes con verdaderos positivos)
Sensibilidad = 14/(6+14) = 0.7
Especificidad:
(Número total de pacientes con verdaderos negativos) / (Número total de pacientes con falso positivos Número total de pacientes con verdaderos negativos)
Especificidad = 15/(2+15) = 0.882
Valor predictivo negativo:
(Número total de pacientes con verdadero negativo) / (Número total de pacientes con falso negativo Número total de pacientes con verdadero negativo)
Valor predictivo negativo = 15/(6+15) = 0.714
Valor predictivo positivo
(Número total de pacientes con verdaderos positivos) / (Número total de pacientes con falsos positivos Número total de pacientes con verdaderos positivos)
Valor predictivo positivo = 14/(2+14) = 0.875
En la prueba exacta de Fisher el valor de p de dos colas igual a 0.0001.
Claims (9)
1. Un método para diagnosticar el riesgo de revisión relacionado con el implante, comprendiendo el método las siguientes etapas:
- detectar un nivel de calprotectina en una muestra biológica de un sujeto con un implante;
en el que
- la muestra biológica es líquido sinovial del sitio del implante;
- la calprotectina a detectar es un polipéptido secretado y no un polipéptido intracelular de células intactas presentes en la muestra;
- un nivel < 4 mg/l de calprotectina es indicativo de un diagnóstico de riesgo de revisión no relacionado con el implante; y
- un nivel > 4 mg/l de calprotectina es indicativo de un diagnóstico de riesgo de revisión relacionado con el implante.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que ningún riesgo de revisión relacionado con el implante es un implante estable.
3. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que un nivel en el rango de 4 50 mg/l de calprotectina es indicativo de aflojamiento aséptico, dislocación del implante, osteólisis y/o cualquier combinación de los mismos.
4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que un nivel > 50 mg/l del al menos un polipéptido es indicativo de una infección asociada al implante o una reacción metal contra metal.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la infección asociada al implante se selecciona del grupo que consiste en aflojamiento séptico, infección articular crónica, infección por biopelícula y/o cualquier combinación de las mismas.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sujeto a diagnosticar es un sujeto asintomático.
7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el implante es una prótesis de cadera y la muestra biológica es líquido sinovial de la articulación de la cadera.
8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el nivel de calprotectina se detecta mediante un ensayo inmunocromatográfico de flujo lateral o un ensayo ELISA.
9. Uso de un kit para diagnosticar el riesgo de revisión relacionado con implante en un sujeto con un implante de acuerdo con el método de la reivindicación 1, en el que el kit es adecuado para detectar un nivel de calprotectina en el líquido sinovial.
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