WO2018115553A1 - Método in vitro para predecir y/o pronosticar la compatibilidad de biomateriales en un sujeto - Google Patents

Método in vitro para predecir y/o pronosticar la compatibilidad de biomateriales en un sujeto Download PDF

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WO2018115553A1
WO2018115553A1 PCT/ES2017/070825 ES2017070825W WO2018115553A1 WO 2018115553 A1 WO2018115553 A1 WO 2018115553A1 ES 2017070825 W ES2017070825 W ES 2017070825W WO 2018115553 A1 WO2018115553 A1 WO 2018115553A1
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marker
biomaterial
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PCT/ES2017/070825
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English (en)
French (fr)
Inventor
Julio José SUAY ANTÓN
Ana María Sanchez Pérez
Isabel GOÑI ECHAVE
Mariló Gurruchaga Torrecilla
Félix ELORTZA BASTERRIKA
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Universitat Jaume I
Universidad Del País Vasco / Euskal Herriko Unibertsitatea
Asociación Centro De Investigación Cooperativa En Biociencias – Cic Biogune
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals

Definitions

  • the terms “marker”, “markers”, “biomarker” or “biomarkers” are used interchangeably throughout this document, and refer to a molecule, or the gene expression product , preferably proteins, or fragments and variants thereof that show substantial changes in a given condition and that can be used both for detection, and for the diagnosis and / or prognosis of a state and / or condition of an object or individual.
  • said terms refer particularly to the detection and quantification of said biomarkers, to predict and / or predict the compatibility of biomaterials, as described herein.
  • changes in the biomarker are changes in the amount thereof, as well as, alternatively, changes in their expression levels, relative to a reference value.
  • complement C5 refers to a protein encoded by the human n cOS 'gene that encodes a protein comprising the sequence SEQ ID NO: 12 and / or collected in the UniProtKB database with the number P01031.
  • C1 plasma protease or "IC1” refers to a protein encoded by the human “serpingl” gene that encodes a protein comprising the sequence SEQ ID NO: 13 and / or collected in the UniProtKB database with the number P05155.
  • Ficolin-2 refers to a protein encoded by the human “FCN2 'gene that encodes a protein comprising the sequence SEQ ID NO: 17 and / or collected in the UniProtKB database with the number Q15485.
  • MASP-1 mannose binding lectin serine protease 1 or “MASP-1” refers to a protein encoded by the human “MAPS1" gene encoding a protein comprising the sequence SEQ ID NO: 18 and / or collected in the UniProtKB database with the number P48740.
  • step (b) Compare the value obtained in step (b) with a reference value obtained for each biomarker, in a reference biomaterial,
  • biological sample refers to any biological material from a subject that comprises cells.
  • the sample is preferably a sample of tissue and / or a biological fluid.
  • tissue sample may comprise, for example, renal tissue, joint tissue, vascular tissue and / or heart tissue, among others.
  • the biological fluid includes, without limitation, lymph, cerebrospinal fluid (FCS), amniotic fluid, pleural effusion, bone marrow, lymph node, lymph fluid, synovial fluid, a single cell suspension prepared from solid tissue or urine cell lines, saliva , sweat, tears, blood, serum and blood plasma.
  • FCS cerebrospinal fluid
  • the sample may be, but is preferably peripheral blood, blood, plasma or serum and more preferably the sample is serum.
  • the terms "subject”, “individual” or “patient”, used interchangeably throughout this document, refers to any mammalian animal and includes, but is not restricted to domestic, farm animals, Primates and humans, preferably humans. These terms are not intended to be limiting in any aspect, and these may be of any age, sex and physical condition.
  • the subject is a subject suffering from a pathology that is susceptible to being treated by implanting a biomaterial, as described herein.
  • the method of the invention is characterized in that it further comprises the determination and quantification of at least one of the biomarkers selected from the list consisting of: C4BPA, KNG1, C05, IC1, CFAH , C03, C1 R, ficolin-2, MASP-1, and / or any combination thereof.
  • step b) of the method of the invention it is characterized in that it comprises the determination and quantification of at least one of the ratios between the C4BPA, CFAH and VTN biomarkers with respect to the CRP and SAMP biomarkers.
  • at least one of the ratios selected from any of the following list is determined: CFAH / CRP; CFAH / SAMP; C4BPA / CRP; C4BPA / SAMP; VTNC / CRP and VTNC / SAMP.
  • the determination of the biomarker profile described in the present invention is carried out by identifying and determining the values of said biomarkers that have adhered to the biomaterial problem once it has been in contact with the biological sample of the subject to which said biomaterial will be implanted.
  • the measurement of the quantity or concentration can be carried out directly or indirectly.
  • Direct measurement refers to the measure of the amount and / or concentration of the proteins or biomarkers of the invention.
  • Said signal to which we can also refer to as an intensity signal - can be obtained, for example, by measuring an intensity value of a chemical or physical property of said biomarkers.
  • the indirect measurement includes the measurement obtained from a secondary component or a biological measurement system (for example the measurement of cellular responses, ligands, "tags" or enzymatic reaction products).
  • quantity refers to, but is not limited to, the absolute or relative amount of the biomarkers of the invention, but also refers to any other value or parameter related thereto or that can be derived from these.
  • Said values or parameters comprise values of signal intensity obtained from any of the physical or chemical properties of said biomarkers, obtained by direct measurement. Additionally, said values or parameters include all those obtained by indirect measurement, for example, any of the measurement systems described elsewhere in this document.
  • the detection and quantification of Sos biomarkers of the present invention can be carried out by quantifying the levels of the proteins or peptides by conventional methods, known to those skilled in the art, including, but not limited to, luminescent chemo methods, immunohistochemical staining or biochemical detection (eg, immunohistochemical tests), immunogenic techniques, flow cytometry, immunoprecipitation (or their equivalents for non-antibody reagents), high efficiency liquid chromatography (HPLC ), mass spectrometry (MS), measurement of plasma resonance absorbency, etc.
  • the quantification of the levels of Sos biomarkers identified in Sa present invention associated with the compatibility of a biomateria!
  • immunological techniques such as ELISA ("Enzyme-Linked Immunosorbent Assay"), Western-blot, RIA (radioimmunoassay), competitive E1A (competitive enzyme immunoassay), DAS-ELISA ("Doubie Antibody Sandwich ELISA”), spectroscopy of masses, immunocytochemical and immunohistochemical techniques, techniques based on the use of protein biochips or microarrays that include specific antibodies or tests based on colloidal precipitation in formats such as "dipstick ⁇ .
  • ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
  • Western-blot Western-blot
  • RIA radioimmunoassay
  • competitive E1A competitive enzyme immunoassay
  • DAS-ELISA Doubie Antibody Sandwich ELISA
  • spectroscopy of masses immunocytochemical and immunohistochemical techniques, techniques based on the use of protein biochips or microarrays that include specific antibodies or tests based on colloidal precipitation in formats such as "dipstick ⁇ .
  • the proteins are detected by Western blotting.
  • ELISA a protein array or matrix or by two-dimensional electrophoresis, more preferably the detection of the protein profile described in the present invention is carried out by ELISA.
  • the present invention relates not only to the biomarkers described in the invention, but also to fragments thereof that could be generated, for example, by alternative processing or splicing phenomena, proteolytic breakdown of said peptides or proteins, etc. Such fragments retain the ability to be used as markers for the determination of the biocompatibility of a medical material as described herein.
  • the biomarkers of the invention, as well as their fragments may include post-translational modifications, such as phosphorylation, gyrosylation, acetylation, isoprenylation, myristoylation, proteolytic processing, etc.
  • step c the determination and quantification value of the markers of the invention obtained in step b) is compared with the values obtained for said markers in a reference biomaterial, which It has also been contacted with a biological sample isolated from the subject, where a value of at least twice higher for each of the biomarkers obtained in step b) with respect to the value obtained for said biomarkers in the reference biomaterial, is indicative that the biomaterial problem is not compatible with the subject.
  • biomaterial problem refers to a biomaterial whose compatibility or incompatibility with a subject is not known.
  • the term "reference biomaterial” refers to a biomaterial whose compatibility with a subject is known, particularly with a mammal and more particularly with a human being.
  • the levels of the markers identified in this invention associated with the compatibility of a biomaterial in the reference sample can be determined in a manner similar to how the levels of said markers are determined in the problem biomaterial.
  • reference quantity or “reference value”, used interchangeably throughout this document, is obtained from the values, preferably quantity values of the markers of the invention, analyzed in a reference biomaterial, of the Its compatibility with a subject is known.
  • a biocompatible material from which to obtain the reference amount for the biomarkers of the invention may be titanium, preferably of medical grade.
  • the reference amount or value is obtained from a reference biomaterial.
  • comparison refers to, but is not limited to, the comparison of the amount of biomarkers as described in the invention, adhered to the problem biomaterial that is grown or incubated together. with the biological sample of a subject, with respect to the amount of the same biomarkers that have adhered to a reference biomaterial also grown together with a biological sample obtained from the same subject.
  • the reference biomaterial can be analyzed, for example, simultaneously or consecutively, together with the problem biomaterial.
  • the comparison described in step c) of the method of the present invention can be performed manually or assisted by a computer.
  • step c) of the method of the invention is characterized in that the value obtained for at least one of the markers adhered to the problem biomaterial is compared where said marker is selected from the list consisting of: CRP , SAMP, C1QC, C1QB, C07, C1S, VTN, LAC2 and KV402, preferably the value obtained for the set of said markers is preferably compared with the reference value obtained for said markers in the reference biomaterial.
  • the problem biomateria will not be compatible with that subject; and / or if the level of at least one of the markers described in the invention, in the biomateria problem under study is maintained and / or decreased with respect to the reference level of said marker in the reference biomateria, then the material Problem will be supported.
  • the amount and / or level of the biomarker or biomarkers of the invention is (n) increased” with respect to the amount and / or the level of said (s) biomarker (s) in the reference biomateria, "when the quantity and / or level of expression of said biomarker (s) is high (or higher) in the problem biomateria with respect to the quantity and / or level of expression of said biomarker (s) in the reference biomateria.
  • the quantity and / or level of the biomarker (s) in a problem biomateria is increased with respect to the quantity and / or at the level of said biomarker (s) in the reference biomateria when the quantity and / or level of said biomarker (s) in the problem biomateria is increased by at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, (n) times , regarding the quantity and / or the level of expression of said biomarker (s) in the reference biomateria.
  • the amount and / or level of a biomarker (s) is decreased” with respect to the amount and / or level of said biomarker (s) in the reference biomaterial when the quantity and / or level of said biomarker (s) is reduced (or is lower) with respect to the quantity and / or level of said biomarker (s) in the reference biomaterial.
  • the amount and / or level of a biomarker (s) in a biomaterial problem under study is decreased with respect to the amount and / or level of said biomarker (s) in the biomaterial.
  • predict or “forecast” refer to the assessment of the probability according to which a biomaterial is compatible with respect to the subject to be implanted with said biomaterial.
  • biomaterials that are predicted to be compatible may not be correct for 100% of the biomaterials that are predicted to be compatible.
  • the term requires that a statistically significant part of biomaterials can be identified as being compatible or available to be. If a part is statistically significant, it can be determined by the person skilled in the art using several well-known statistical evaluation tools, for example, determination of confidence intervals, determination of p-values, Student's t-test, Mann-Whitney test , etc.
  • Preferred confidence intervals are at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%.
  • the values of p are preferably 0.2, 0.1, 0.05.
  • the third aspect of the present invention relates to a kit for predicting and / or predicting the compatibility of a biomaterial, hereinafter kit of the invention, useful for carrying out the described in vitro method of the invention.
  • the kit of the invention comprises the elements necessary to carry out the determination and quantification of at least one of the markers described in the present invention.
  • the elements necessary for Determining at least one of the markers of the invention are selected from the list consisting of: oligonucleotides, probes, oligosondes, antibodies, reagents, or any combination of the foregoing, which allow to detect and quantify the presence of at least one of the markers.
  • the kit of the invention comprises the elements necessary to detect and quantify the presence of the set of markers comprising: CRP, SAMP, C1QC, C1QB, C07, C1S, VTN, LAC2 and KV402.
  • the kit further comprises the elements necessary to detect and quantify the presence of the markers of the invention that are selected from the list consisting of: C4BPA, KNG1, C05, IC1, CFAH, C03, C1R, Ficolin -2, MASP-1, and / or any combination thereof.
  • the kit of the invention comprises the elements necessary to detect and quantify the presence of the set of markers comprising: CRP, SAMP, C1QC, C1QB, C07, C1S, C4BPA, KNG1, C05, IC1, CFAH, C03, C1 R, Ficolin-2 and MASP-1.
  • the determination and quantification of the markers of the invention, by means of the kit of the invention is carried out after contacting the biomaterial problem with a biological sample isolated from a subject, as described herein, preferably the isolated biological sample being a serum sample.
  • the kit of the invention can also include, without any limitation, buffers, protein extraction solutions, agents to prevent contamination, inhibitors of protein degradation, etc.
  • the kit can include all the supports and containers necessary for commissioning and optimization.
  • the kit further comprises instructions for carrying out the methods of the invention.
  • kits of the invention to predict and / or predict the compatibility of a biomaterial with a subject.
  • the word "comprises” and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps.
  • other objects, advantages and features of the invention will be derived partly from the description and partly from the practice of the invention.
  • the following examples and figures are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.
  • FIGURES Figure 1 Micrographs obtained by scanning electron microscopy (SEM) of hybrid sol-gel coatings applied on SAE titanium discs: (a) 70% methyltrimethoxysilane (MTMOS) - 30% tetraethyl orthosilicate (TEOS) ) [70M30T], (b) 35% MTMOS - 35% 3-glycidoxypropyl-trimethoxysilane (GPTMS) - 30% TEOS [35M35G30T], (c) 50% MTMOS - 50% GPTMS [50M50G] and (d) 50% triethoxyvinylsilane (VTES) - 50% GPTMS [50V50G]. 10 ⁇ ⁇ calibration bar.
  • MTMOS 70% methyltrimethoxysilane
  • TEOS tetraethyl orthosilicate
  • FIG. 1 AFM images of the sol-gel hybrid coatings on titanium discs: 70M30T (a), 35M35G30T (b), 50M50G (c) and 50V50G (d).
  • FIG. 5 Cell viability and in vitro mineralization of mouse osteosarcoma cells (MC3T3-E1).
  • ALP alkaline phosphatase
  • As a positive control cells grown in the absence of a disc were used and as a negative control, cells grown in the presence of uncoated titanium disc. There were no statistically significant differences between the different formulations in the measured times (ANOVA, p ⁇ 0.05).
  • Figure 6 Representative optical microscopy images of histological sections obtained from the in vivo test (EXAKT® Gomori trichrome and cut) after two weeks of implantation of the coated implants: a) 70M30T, b) 35M35G30T, c) 50M50G and d) 50V50G.
  • the area corresponding to fibrous connective tissue (FOT) is delimited by the dashed lines.
  • MAT material
  • FCT fibrous connective tissue
  • NB new bone / osteoid. 20x magnification.
  • Figure 7 Area (mm 2 ) occupied by connective fibrous tissue for the implants coated by each of the four coatings. Significant differences were found between the 70M30 / 35M35G30T and 50M50G / 50V50G coatings (p ⁇ 0.05 ANOVA with a Kruskal-Wallis post-test).
  • Hybrid silicon coatings were obtained through the sol-gel method.
  • the precursors used were: methyltrimethoxysilane (MTMOS), 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMS), tetraethyl orthosilicate (TEOS) and triethoxyvinylsilane (VTES) (Sigma-Aldrich).
  • MTMOS methyltrimethoxysilane
  • GPS 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane
  • TEOS tetraethyl orthosilicate
  • VTES triethoxyvinylsilane
  • the contact angle was measured using an automatic contact angle meter (Dataphysics OCA 20). 10 ⁇ of ultrapure water was deposited on the sol gel coated surface at a dosing rate of 27.5 ⁇ L / s at room temperature. The contact angles were determined with the SCA 20 software. 5 discs of each biomaterial were studied by depositing 2 drops in each of them. The surface topography of the coated titanium discs was characterized using atomic force microscopy (AFM) under dry conditions. The measurements were carried out at a scan size of 60 ⁇ with a scan speed of 1 Hz. To determine the roughness, a 6k (Veeco) Dektack mechanical profilometer was used. Two coated discs of each composition were tested. Three measurements were made for each disk, to obtain the average value of the Ra parameter. The coatings were studied by SEM with a Leica-Zeiss device under vacuum. A platinum coating was applied to make the samples more conductive for SEM observation.
  • MC3T3-E1 cells (mouse osteosarcoma) were cultured in sol-gel coated titanium discs, at a concentration of 1x10 4 cell / well in DMEM medium (Dulbecco's modified Eagle's medium) with red phenol (Gibco-Life Technologies, Grand Island, NY, USA) with 1% 100x penicillin / streptomycin (Biowest Inc., USA) and 10% Fetal Bovine Serum (FBS) (Gibco-Life Technologies, Grand Island, NY, USA).
  • DMEM medium Dulbecco's modified Eagle's medium
  • red phenol Gibco-Life Technologies, Grand Island, NY, USA
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • ALP alkaline phosphatase
  • p-NPP p-nitrophenyl phosphate
  • 0.1 mL aliquots were used to carry out the test.
  • 100 ⁇ L of p-NPP (1mg mL-1) in buffer (50 mM glycine; 1mM MgCI 2 pH 10.5) was added to 100 ⁇ of the supernatant resulting from the lysate. After 2 h of incubation in the dark (37 ° C, 5% C0 2 ), absorbance was measured spectrophotometrically in a microplate reader at a wavelength of 405 nm.
  • the activity of the ALP was determined from a standard curve obtained from different solutions of p-nitrophenol and 0.02 mM sodium hydroxide. The results were presented as mmol of p-nitrophenol hour (mM PNP h-1), and the data were expressed as normalized ALP activity for total protein content (Mg ⁇ ) with the Pierce BCA test kit (Thermofisher) after 7 and 14 days.
  • the rabbits were kept for 12 hours. in cyclic light-dark conditions at room temperature of 20 ° C and a relative humidity between 45 and 65%.
  • the animals were caged individually and fed a standard diet and filtered water ad libidum.
  • the implants were supplied by llerimplant SL (Spain)
  • the implants were internally connected in grade IV titanium of the GMI dental implants brand, 3.75 mm in diameter and 8 mm long Frontier model. A total amount of 40 of these implants was used, 20 uncoated as a control and 5 coated with each of the aforementioned biomaterials to test their compatibility. Both control and test samples were implanted under the same conditions and the results were compared.
  • a total of 20 rabbits between 2,000 and 3,000 g of weight were used, corresponding to ages close to the physical closure, indicative of a bone volume suitable for the study.
  • the period of implantation of the experimental model was 2 weeks. This time was chosen in order to obtain a complete osseointegration process.
  • the implants were inserted in the proximal region of the left tibia. and right, so that each animal had a total of 2 implants, one as a control and the other as a biomaterial problem to be tested.
  • the animals were sedated by intramuscular (IM) administration of Clopromazine Hydrochloride (10 mg kg).
  • Antibiotic prophylaxis (Amoxicillin) was administered and prepared for the intervention.
  • Ketamine Hydrochloride 50 mg kg (Imalgene®, Merial, Georgia, USA)
  • the maintenance schedule was "on demand” by administration of 20 mg / kg, via IM before The smallest sign of agitation of the animal.
  • the tibia was de-periostized and the implantation area was marked with a graphite tip.
  • the bone defect was performed by successive milling (2.0, 2.8 and 3.2 mm in diameter), with low speed micromotor and continuous irrigation of physiological serum.
  • the root prostheses were implanted by press-fit (hand pressure placement).
  • the titanium discs were coated and their physical-chemical analysis and characterization proceeded.
  • Four different and homogeneous sol-gel coating biomaterials have been analyzed: 70M30T, 35M35G30T, 50M05G and 50V50G, as can be seen in the SEM micrographs (Fig. 1).
  • Figure 1 shows the partial roughness coverage of the SAE treated titanium, provided by the different coatings.
  • the biomaterial 70M30T (Fig. La) shows a higher level of conservation of the initial topography. In the AFM images it is clearly observed that the coating with the 70M30T biomaterial has a greater roughness (Fig. 2a).
  • biomaterial 35M35G30T shows an intermediate aspect (Fig. 2b).
  • the measurements with the mechanical profilometer reveal that the 70M30T coating has a significantly higher Ra value compared to the 35 35T30G, 50M50G and 50V50G biomaterials. This result may be due to the presence of GPTMS in the last biomaterials that could finally affect the thickness of the coating and therefore the roughness.
  • the contact angle measurements (Fig. 4) obtained with the automatic Dataphysics OCA 20 contact angle meter show that the coatings with the TEOS precursor (organically unmodified precursor), 70M30T and 35M35G30T have the most hydrophilic surfaces, while 50M50G and 50V50G show a higher contact angle, probably as a result of the higher organic content in their compositions. All these variations should affect the biological response and therefore the compatibility of said biomaterials.
  • Example 3 Analysis of the in vivo compatibility of the biomaterials of the invention.
  • the inventors implanted in the tibia of a rabbit animal model the implants coated with the biomaterials analyzed in the present invention (see materials and methods).
  • the formation of the fibrous capsule surrounding the implant is contemplated as a natural immune response to the presence of the biomaterial. Therefore, the first layer of proteins that adheres can induce the immediate response of the host organism to the biomaterial.
  • Example 4 Determination by proteomic analysis of the profile of biomarkers that determine the compatibility of biomaterials. Once the poor correlation between in vitro vs in vivo results was demonstrated to determine the compatibility of a biomaterial, the proteins, particularly the peptide pattern, adhered to the surface of in vitro cultured biomaterials in the presence of human serum were analyzed. . Since the cellular response to contact with the biomaterial depends on the first layer of proteins adsorbed on it, it is intended to establish a correlation between the pattern of proteins detected and the in vivo results obtained.
  • Proteomic analysis reveals a correlation between the composition of the protein layer adhered to biomaterials or coatings and their response in vivo.
  • the materials were classified into two groups according to the results obtained for each of them in the in vivo model.
  • the first of the groups comprises the biomaterials 70M30T and 35M35G30T, which according to the results in vivo showed a good osseointegration or compatibility with the subject (positive result), while the second group is formed by the biomaterials 50M50G and 50V50G, which of According to the results in vivo, it leads to the formation of fibrous connective tissue around the implant area, so that these results show a poor compatibility of said biomaterials with the subject (negative result) (Fig. 7).
  • Table 1 shows nine proteins that have been identified and that appear differentially present when the two biomaterials are compared with positive results in vivo (35M35G30T and 70M30T). Of the nine proteins identified above, six were detected that showed a greater presence, statistically significant in the biomaterial or 35M35G30T coating, the MYH1 protein (17.19-fold) being the most predominant, and related to the integrity of the cytoskeleton. Proteins related to the immune system were also found (C1QA and FCN2) or with the metal binding function such as the HBA protein.
  • the CLUS protein that could have a protective role against the establishment of chronic inflammatory disorders
  • the FAXII that is capable of triggering coagulation
  • the APOA5 that is related to lipid transport and carbohydrate binding function.
  • biomaterials 50M50G vs 50V50G Only three proteins were predominantly detected in biomaterials 50M50G vs 50V50G. Although both biomaterials have different chemical compositions, they have a very similar protein profile composition. The HORN and DSC1 proteins are clearly more present in the 50V50G biomaterial, and both have the function of metallic binding, and the LCN1 protein, with endopeptidase activity, was more present in 50V50G biomaterial.
  • VTNC A group of fifteen proteins were found differentially more absorbed on the surface of the 50M50G biomaterial than in the in vivo positive response materials (70M30T and 35M35G30T).
  • VTNC, APOE and KNG1 have a role in bone metabolism and could intervene in the process of regeneration of said tissue.
  • VTNC could be involved in the complement regulation cascade.
  • some immunoglobulins and many proteins related to the immune system were also present.
  • the proteins CRP, SAMP, C1QB, C1QC, C07, C1S and C4BPA were classified with the DAVID database within the group related to the acute inflammatory response.
  • Keratins, HORN and FILA2 were absorbed more, differentially, in 70M30T and 35 35G30T coatings than in 50M50G. These proteins play a role in the integrity of the cytoskeleton and have peptidase activity.
  • proteomic results of the biomaterials or coatings 70M30T and 35 35G30T were compared with the proteins adsorbed and detected in the biomaterial or 50V50G coating (negative in vivo compatibility result).
  • Table 4 presents the sixteen proteins that were identified with differential presence, among them fifteen were with greater presence in the biomaterial or 50V50G coating.
  • Table 5 shows the proteins that are attached statistically significantly at the same time in the 50M50G and 50V50G biomaterials (no compatibility shown in the in vivo model), with respect to the 35 35G30T and 70M30T coatings (compatibility shown in the in vivo model) .
  • CRP chronic myelogenous leukemia
  • SAMP SAMP
  • C1QB C1QB
  • C1QC C1S
  • LAC2 LAC2
  • KV402 VTNC
  • C7 all of them are involved in the acute inflammatory response process.
  • CRP is particularly more present in the worst response materials in vivo and its role in the complement cascade is well known, it is an activator of the classical route.

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Abstract

La presente invención se refiere a un conjunto de marcadores, preferentemente proteínas, todas ellas relacionadas con la vía del sistema de activación del complemento, que son particularmente útiles para predecir y/o pronosticar la compatibilidad in vitro de un biomaterial, tal como por ejemplo, prótesis articulares, prótesis dentales, válvulas, stens, etc., en su sujeto. Adicionalmente, la presente invención comprende un método in vitro para predecir y/o pronosticar la compatibilidad de dichos materiales mediante la determinación del perfil peptídico descrito en la invención, así como un kit y/o dispositivo para llevar a cabo dicho método.

Description

MÉTODO IN VITRO PARA PREDECIR Y/O PRONOSTICAR LA COMPATIBILIDAD
DE BIOMATERIALES EN UN SUJETO
DESCRIPCIÓN
La presente invención se refiere a un conjunto de proteínas particularmente útil para predecir y/o pronosticar la compatibilidad in vitro de un biomaterial, utilizado como dispositivo médico implantable, como por ejemplo cualquier tipo de prótesis, tales como stents, cánulas, marcapasos, implantes dentales etc. Adicionalmente, la presente invención comprende además un método in vitro para predecir y/o pronosticar la compatibilidad, de dichos biomateriales mediante la determinación y cuantificación del perfil peptídico adherido a dichos biomateriales, así como un kit y/o dispositivo para llevar a cabo dicho método. ESTADO DE LA TÉCNICA
El éxito de un implante depende de su aceptabilidad biológica, es decir, que produzca un mínimo daño y una mínima reacción inmune en el sujeto implantado, siendo para ello necesario que el primer requisito que debe cumplir dicho implante sea su compatibilidad, y por supuesto, la no existencia de reacción a cuerpo extraño. En este sentido, las pruebas que tiene que pasar el biomaterial para ser empleado como implante son múltiples y complicadas, incluyendo desde ensayos in vitro frente a diferentes líneas celulares (las propias del tejido que vaya a estar en contacto con el implante), para determinar su citotoxicidad, proliferación celular, etc., hasta ensayos in vivo con aquellos prototipos que han demostrado unas buenas propiedades in vitro. Además, son necesarios estudios preclínicos y ensayos clínicos en humanos. Todo este proceso implica un largo período de realización, además del sacrificio de un número significativo de animales, y un enorme coste económico. Adicionalmente, los ensayos clínicos no están exentos de problemática y riesgo para los pacientes que dan su consentimiento para participar en los mismos.
En la actualidad, en la práctica clínica, no existe ningún tipo de ensayo personalizado que permita predecir y/o pronosticar el éxito o fracaso de un implante, sea del tipo que sea, (por ejemplo, implante dental, prótesis de rodilla, de cadera o tornillería diversa en contacto con hueso, tales como estabilizadores de columna vertebral o placas de unión para huesos con rotura, stents, válvulas cardiacas, implantes dérmicos...)- De la misma forma, tampoco existe actualmente ningún ensayo acelerado que sea capaz de predecir y/o pronosticar la compatibilidad de un biomaterial, que se esté desarrollando por parte de los fabricantes productores de implantes y/o biomateriales, teniendo que llevar a cabo todos los ensayos descritos anteriormente para llevar al mercado dicho material. Adicionalmente hay una presión cada vez mayor para reducir el número de animales de experimentación por cuestiones éticas, pero la opción de realizar la selección del biomaterial mediante experimentación in vitro es compleja, por la no existencia de una buena correlación entre ambos tipos de experimentación, in vitro vs in vivo.
Hay que tener en cuenta que para llevar a cabo un proceso de regeneración, preferiblemente regeneración ósea, se requieren ciertas condiciones, como la señalización celular, la presencia de células progenitoras, así como los procesos de vascularización, cicatrización, y en el caso de tejido óseo la osteoinducción. La interacción de la superficie del biomaterial-implante con los sistemas biológicos determina el éxito o el fracaso del implante en el sujeto. Las propiedades superficiales del implante (hidrofilia, rugosidad o energía superficial) afectan a la interacción de este con los fluidos corporales del individuo. Así, esta interacción puede ser positiva y promover la integración del biomaterial-implante (interacción directa entre la superficie del biomaterial y el tejido sin mediar tejido fibroso), o bien negativa dando lugar a una inflamación crónica y aguda, alta producción de macrófagos que constituyen una respuesta denominada reacción a cuerpo extraño, que supone en la mayor parte de los casos el fracaso de la implantación. La comprensión de la secuencia de eventos biológicos que tienen lugar tras la implantación, tales como procesos de coagulación de la sangre, el desarrollo de infecciones, la respuesta inmune al cuerpo extraño, y finalmente el rechazo del implante, es crucial para determinar la compatibilidad de un biomaterial, y por lo tanto, de las prótesis per se. En este sentido, la primera capa de proteínas adsorbida sobre el biomaterial y/o implante es la responsable de desencadenar la respuesta celular a este.
En la literatura se pueden encontrar diferentes ensayos in vitro en los que se pone en contacto el implante con una muestra obtenida de un individuo y se analiza el patrón de proteínas adsorbidas en la superficie de los implantes para determinar la compatibilidad de éstos en el sujeto. No obstante, por lo visto en literatura, se ha demostrado que existe una correlación mínima y muy pobre entre los resultados obtenidos in vitro respecto a los obtenidos in vivo, lo que indica una clara necesidad de un mayor desarrollo de los ensayos in vitro pertinentes. En la patente JP4710006B2 se describe un método in vitro para evaluar la compatibilidad de un biomaterial, como por ejemplo una prótesis, que comprende poner en contacto dicho biomaterial con el suero de un sujeto al que implantar la prótesis. Se recupera entonces el sobrenadante y se analiza en dicho sobrenadante la presencia/expresión/actividad diferencial de la enzima lactato deshidrogenasa para pronosticar la compatibilidad de dicho biomaterial. Pero este documento no determina ni analiza la existencia de correlación entre los resultados obtenidos in vitro con resultados de compatibilidad in vivo.
De la misma manera, en la solicitud de patente US2005170445 se describe un método in vitro para determinar la compatibilidad de biomateriales de implante mediante la determinación e identificación de perfiles de expresión de proteínas, específicamente citoquinas y factores de crecimiento, que están asociados con la respuesta del organismo huésped a los biomateriales implantados. Entre las muestras biológicas utilizadas para determinar el perfil de citoquinas y factores de crecimiento que determinan la compatibilidad del material analizado se encuentran: (i) cualquier fluido recogido tras la puesta en contacto del biomaterial con tejido del organismo huésped donde se ha implantado tal biomaterial, o (ii) el sobrenadante de un cultivo celular al que se ha expuesto el biomaterial. Los autores del documento tampoco analizan la existencia de correlación entre los resultados mostrados in vitro, con la compatibilidad in vivo de dicho material, analizando el perfil peptídico que describen.
Müller R. y coi. se refieren a un método para evaluar la adsorción de proteínas en la superficie de biomateriales, y valorar su compatibilidad (Müller R. et al. Analytical Biochemistry. 2006. Vol. 359 (2): 194-202). Emplean un método basado en grupos amino-marcados, donde el método va acoplado a una reacción de quimioluminiscencia para la determinación directa de las proteínas adsorbidas sobre la superficie de los materiales analizados. Específicamente evalúan la adsorción de albúmina y fibronectina a partir de muestras de suero y saliva humanas. Al igual que se ha comentado anteriormente, en los resultados mostrados, no se indica la existencia de correlación alguna entre los resultados in vitro y la medición de compatibilidad de un biomaterial y/o prótesis in vivo.
El grupo de Weber N. y col. (Weber N. et al. Journal of Biomedical Materials Research. 2004, 68(3): 496-503) describe una técnica rápida para determinar la compatibilidad de materiales que se basa en el análisis de los cambios en la estructura polimérica del material de recubrimiento de la prótesis y su influencia sobre la adsorción de fibrinógeno sobre la superficie de dicho biomaterial, concluyendo que la adsorción selectiva de proteínas del plasma en los materiales en contacto con la sangre, o tejido, afecta a todas las interacciones posteriores relacionadas con la compatibilidad de las superficies artificiales. En este estudio, haciendo uso de la fluorescencia, se ha desarrollado una técnica de cribado utilizando un formato de 384 pocilios para analizar las interacciones polímero-fibrinógeno y predecir y/o pronosticar así la compatibilidad del biomaterial, pero al igual que en los casos mencionados anteriormente no hay ningún tipo de correlación establecida entre los resultados mostrados y la medición de biocompatibilidad in vivo.
Teniendo en cuenta lo anterior, existe en el estado de la técnica la necesidad de desarrollar métodos in vitro fiables, rápidos y comparables con los resultados obtenidos a nivel in vivo, que permitan determinar la compatibilidad de biomateriales y/o prótesis recubiertas por dichos biomateriales, para su traslado más rápido a la clínica.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores de la presenta invención han identificado un perfil de marcadores, preferiblemente marcadores proteicos, la mayoría de ellos relacionados con la vía del sistema de activación del complemento, donde su determinación y/o cuantificación es capaz de predecir y/o pronosticar la biocompatibilidad de biomateriales, preferiblemente biomateriales implantables, y más preferiblemente tales como por ejemplo, prótesis articulares y/o dentales, catéteres, etc..
En particular, los inventores han identificado y cuantificado los marcadores seleccionados de la lista que consiste en: proteína C reactiva (CRP), componente amiloide P sérico (SAMP), subunidad C del subcomponente C1q del complemento (C1QC), subunidad B del subcomponente C1q del complemento (C1QB), componente C7 del complemento (C07) y el subcomponente C1s del complemento (C1S), vitronectina (VTN), inmunoglobulina Lambda-2 región cadena C (LAC 2) e inmunoglobulina Kappa variable 4-1 (KV402), preferiblemente como marcadores proteicos asociados a la predicción y/o pronóstico de la compatibilidad de los biomateriales. Estas proteínas son por lo tanto marcadores de la compatibilidad de biomateriales en un sujeto. Por lo tanto, la identificación y cuantificación in vitro de la presencia de este conjunto de marcadores, supone una mejora sustancial del actual estado de la técnica, ya que hasta ahora no se ha determinado ningún tipo de patrón de proteínas que puedan ser determinadas y cuantificadas in vitro y que predigan qué resultado va a ser obtenido in vivo.
Así, un primer objeto de la invención, es el uso in vitro de la identificación y cuantificación de la presencia de al menos uno de los marcadores seleccionados de entre cualquiera de la lista que consiste en: CRP (SEQ ID NO: 1), SAMP (SEQ ID NO: 2), C1QC (SEQ ID NO: 3), C1QB (SEQ ID NO: 4), C07 (SEQ ID NO: 5), C1S (SEQ ID NO: 6), VTN (SEQ ID NO: 7), LAC 2 (SEQ ID NO: 8), KV402 (SEQ ID NO: 9) y/o cualquier combinación de los mismos, para predecir y/o pronosticar la compatibilidad de un biomaterial que ha estado en contacto con una muestra biológica aislada de un sujeto.
En una realización particular del primer objeto de la invención, este se caracteriza por que el(los) marcadores) que se identifican y cuantifican se encuentran adsorbidos al biomaterial, una vez que este ha estado en contacto con la muestra biológica aislada de un sujeto, particularmente de un sujeto al que se le tiene que implantar el biomaterial. Dichos marcadores son preferiblemente marcadores presentes en la muestra biológica aislada del sujeto. Además, la presencia de dichos marcadores adsorbidos a la superficie de los biomateriales analizados determinará la compatibilidad o incompatibilidad de dichos biomateriales con el sujeto al que pertenece la muestra biológica.
A efectos de la presente invención, el término "compatible" "compatibilidad", "biocompatibilidad" o "biocompatible", utilizados indistintamente a lo largo del presente documento, se refiere a la capacidad de un material para estar en contacto con un sistema vivo sin generar un efecto adverso, tóxico o dañino, y adicionalmente desarrollar una actividad específica positiva y beneficiosa en el organismo. El análisis de compatibilidad de un sistema formado por un biomaterial y el tejido con el que se encuentra en contacto, incluye un elevado número de diferentes ensayos \n vitro e in vivo que se recogen en ISO10993.
A efectos de la presente invención, el término "osteointegración" se refiere a la capacidad del biomaterial o implante para proporcionar una unión estructural y funcional directa con el tejido óseo mediante la formación de nuevo hueso o de una nueva estructura similar al hueso en la proximidad de la interfaz biomaterial/tejido. La osteogénesis se refiere aquí al proceso de formación y crecimiento del hueso nuevo. También puede asumir la formación respectiva de otros tejidos tales como tejido fibroso o cartílago.
A efectos de la presente invención los términos "biomaterial", "material médico", "dispositivo médico", "implante" o "prótesis", se utilizan indistintamente a lo largo del presente documento, y hacen referencia a cualquier biomaterial y/o dispositivo que es implantable quirúrgicamente. Generalmente, los implantes se usan en combinación con tejidos u órganos corporales temporalmente, permanentemente o semipermanentemente, para remediar un problema y opcionalmente pueden ser retirados quirúrgicamente o desaparecer por biodegradación dentro del cuerpo. Ejemplos de implantes incluyen vendajes, suturas, grapas, abrazaderas, tela, mallas, redes, huesos artificiales, tornillos, placas óseas, varillas ortopédicas, clavos, implantes de cadera, implantes de rodilla, corazones artificiales, dientes, implantes dentales, catéteres y similares.
A efectos de la presente invención, los términos "marcador", "marcadores", "biomarcador" o "biomarcadores", se usan indistintamente a lo largo del presente documento, y hacen referencia a una molécula, o al producto de expresión de un gen, preferentemente proteínas, o a fragmentos y variantes de éstas que muestran cambios sustanciales en una condición determinada y que se pueden usar tanto para la detección, como para el diagnóstico y/o pronóstico de un estado y/o condición de un objeto o individuo. A efectos de la presente invención, dichos términos hacen referencia particularmente a la detección y cuantificación de dichos biomarcadores, para predecir y/o pronosticar la compatibilidad de biomateriales, tal y como se describe en el presente documento. En una forma de realización preferida, los cambios en el biomarcador son cambios en la cantidad de los mismos, así como también, alternativamente, cambios en los niveles de expresión de éstos, respecto a un valor de referencia. El término "expresión", como se usa aquí, se refiere particularmente a la determinación de la cantidad de cada biomarcador respecto a un valor de referencia. Se apreciará que la cantidad y/o niveles de un biomarcador se pueden establecer mediante la determinación de los niveles del polipéptido correspondiente, o de polipéptidos generados tras su digestión en el caso de que se utilicen medios proteómicos para su determinación. De forma alternativa, los biomarcadores peptídicos pueden ser variantes resultantes de modificaciones postraduccionales, incluyendo fragmentos de los mismos.
El término "Proteína C reactiva" o "CRP' se refiere a una proteína codificada por el gen "cip' humano que codifica para una proteína que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 y/o recogida en la base de datos UniProtKB con el número P02741.
El término "componente amiloide P sérico" o "SAMP' se refiere a una proteína codificada por el gen "apcs" humano que codifica para una proteína que comprende la secuencia SEQ ID NO: 2 y/o recogida en la base de datos UniProtKB con el P02743. El término "subunidad C del subcomponente C1q del complemento" o "C1QC" se refiere a una proteína codificada por el gen "dqc" humano que codifica para una proteína que comprende la secuencia SEQ ID NO: 3 y/o recogida en la base de datos UniProtKB con el número P02747. El término "subunidad B del subcomponente C1q del complemento" o "C1QB" se refiere a una proteína codificada por el gen "dqb" humano que codifica para una proteína que comprende la secuencia SEQ ID NO: 4 y/o recogida en la base de datos UniProtKB con el número P02746. El término "componente C7 del complemento" o "C07" se refiere a una proteína codificada por el gen "co7' humano que codifica para una proteína que comprende la secuencia SEQ ID NO: 5 y/o recogida en la base de datos UniProtKB con el número P10643. El término "subcomponente C1s del complemento" o "C1S" se refiere a una proteína codificada por el gen "cís" humano que codifica para una proteína que comprende la secuencia SEQ ID NO: 6 y/o recogida en la base de datos UniProtKB con el número P09871.
El término "Vitronectina" se refiere a una proteína codificada por el gen "vtrf humano que codifica para una proteína que comprende la secuencia SEQ ID NO: 7 y/o recogida en la base de datos UniProtKB con el número P04004. El término "Inmunoglobulina Lambda-2 región cadena C" o "LAC2", se refiere a una proteína codificada por el gen "Iac2' humano que codifica para una proteína que comprende la secuencia SEQ ID NO: 8 y/o recogida en la base de datos UniProtKB con el número P0CG05. El término "Inmunoglobulina Kappa variable 4-1" o "KV402", se refiere a una proteína codificada por el gerí'kv402' humano que codifica para una proteína que comprende la secuencia SEQ ID NO: 9 y/o recogida en la base de datos UniProtKB con el número P06312. En una realización particular del primer aspecto de la invención, éste se refiere al uso in vitro de la identificación y cuantificación de cantidad del conjunto de marcadores que se seleccionan de la lista que consiste en: CRP (SEQ ID NO: 1), SAMP (SEQ ID NO: 2), C1QC (SEQ ID NO: 3), C1QB (SEQ ID NO: 4), C07 (SEQ ID NO: 5), C1S (SEQ ID NO: 6), VTN (SEQ ID NO: 7), LAC 2 (SEQ ID NO: 8) y KV402 (SEQ ID NO: 9), que se han adsorbido al biomaterial puesto en contacto con una muestra biológica de un sujeto, para predecir y/o pronosticar la compatibilidad de dicho biomaterial.
En otra realización particular, el primer aspecto de la invención comprende además la identificación y cuantificación de la cantidad de al menos un marcador seleccionado de la lista que consiste en: cadena alfa de la proteína de unión a C4b (C4BPA) (SEQ ID NO: 10), kininógeno-1 (KNG1) (SEQ ID NO: 11), complemento C5 (C05) (SEQ ID NO: 12), inhibidor de la proteasa plasmática C1 (IC1) (SEQ ID NO: 13), factor H del complemento (CFAH) (SEQ ID NO: 14), componente C3 del complemento (C03) (SEQ ID NO: 15), subcomponente C1r del complemento (C1R) (SEQ ID NO: 16), Ficolina-2 (SEQ ID NO: 17), Lectina de unión a mañosa serin proteasa 1(MASP1) (SEQ ID NO: 18), y/o cualquier combinación de los mismos.
El término "cadena alfa de la proteína de unión a C4b" o "C4BPA" se refiere a una proteína codificada por el gen nc4bpsT humano que codifica para una proteína que comprende la secuencia SEQ ID NO: 10 y/o recogida en la base de datos UniProtKB con el número con secuencia P04003.
El término "kininógeno-1" o "(KNG1)" se refiere a una proteína codificada por el gen "kngf humano que codifica para una proteína que comprende la secuencia SEQ ID NO: 11 y/o recogida en la base de datos UniProtKB con el número P01042.
El término "complemento C5" o "C05" se refiere a una proteína codificada por el gen ncOS' humano que codifica para una proteína que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12 y/o recogida en la base de datos UniProtKB con el número P01031.
El término "proteasa plasmática C1" o "IC1" se refiere a una proteína codificada por el gen "serpingl" humano que codifica para una proteína que comprende la secuencia SEQ ID NO: 13 y/o recogida en la base de datos UniProtKB con el número P05155.
El término "factor H del complemento" o "CFAH" se refiere a una proteína codificada por el gen "CFH' humano que codifica para una proteína que comprende la secuencia SEQ ID NO: 14 y/o recogida en la base de datos UniProtKB con el número P08603. El término "componente C3 del complemento" o "C03" se refiere a una proteína codificada por el gen "c3" humano que codifica para una proteína que comprende la secuencia SEQ ID NO: 15 y/o recogida en la base de datos UniProtKB con el número P01024. El término "subcomponente C1r del complemento" o "C1R" se refiere a una proteína codificada por el gen "c1r" humano que codifica para una proteína que comprende la secuencia SEQ ID NO: 16 y/o recogida en la base de datos UniProtKB con el número P00736. El término "Ficolina-2" se refiere a una proteína codificada por el gen "FCN2' humano que codifica para una proteína que comprende la secuencia SEQ ID NO: 17 y/o recogida en la base de datos UniProtKB con el número Q15485. El término "Lectina de unión a mañosa serin proteasa 1" o "MASP-1" se refiere a una proteína codificada por el gen "MAPS1" humano que codifica para una proteína que comprende la secuencia SEQ ID NO: 18 y/o recogida en la base de datos UniProtKB con el número P48740. En una realización preferida, el primer aspecto de la invención se caracteriza por el uso in vitro de la identificación y cuantificación de cantidad del conjunto de marcadores que se seleccionan de la lista que consiste en: CRP (SEQ ID NO: 1), SAMP (SEQ ID NO: 2), C1QC (SEQ ID NO: 3), C1QB (SEQ ID NO: 4), C07 (SEQ ID NO: 5), C1S (SEQ ID NO: 6), VTN (SEQ ID NO: 7), LAC 2 (SEQ ID NO: 8), KV402 (SEQ ID NO: 9), C4BPA (SEQ ID NO: 10), KNG1 (SEQ ID NO: 11), C05 (SEQ ID NO: 12), IC1 (SEQ ID NO: 13), CFAH (SEQ ID NO: 14), C03 (SEQ ID NO: 15), C1 R (SEQ ID NO: 16), Ficolina-2 (SEQ ID NO: 17) y MASP1 (SEQ ID NO: 18).
Un segundo aspecto de la invención se refiere a un método in vitro para predecir y/o pronosticar la compatibilidad de un biomaterial, preferiblemente un biomaterial problema, tal y como se describe en el presente documento, en una muestra biológica aislada obtenida de un sujeto susceptible de utilizar dicho biomaterial, donde el método comprende las siguientes etapas:
a. Incubar el biomaterial, preferiblemente un biomaterial problema, con la muestra biológica aislada,
b. Determinar y cuantificar la presencia de al menos uno de los biomarcadores que se seleccionan de la lista que consiste en: CRP, SAMP, C1QC, C1QB, C07, C1S, VTN, LAC 2 y KV402, y
c. Comparar el valor obtenido en la etapa (b) con un valor de referencia obtenido para cada biomarcador, en un biomaterial de referencia,
en donde un valor de al menos dos veces superior para cada uno de los biomarcadores respecto al valor obtenido en el biomaterial de referencia, es indicativo de que el biomaterial no es compatible con el sujeto. En una primera etapa [etapa a.], el método in vitro de la invención comprende la incubación, en una muestra biológica, del biomaterial problema del que se pretende determinar si es compatible o no, con el sujeto del que se ha obtenido la muestra biológica.
Cualquier muestra biológica puede ser usada para poner en práctica el método de la invención. El término "muestra biológica" está referido a cualquier material biológico procedente de un sujeto que comprende células. La muestra es preferiblemente una muestra de tejido y/o de un fluido biológico. Tal muestra de tejido puede comprender, por ejemplo, tejido renal, tejido articular, tejido vascular y/o tejido del corazón, entre otros. El fluido biológico incluye, sin limitarse, linfa, fluido cerebroespinal (FCS), fluido amniótico, efusión pleural, médula ósea, nodulo linfático, fluido linfático, fluido sinovial, una suspensión celular única preparada a partir de tejido sólido o líneas celulares orina, saliva, sudor, lágrimas, sangre, suero y plasma sanguíneo. La muestra puede ser, pero es preferiblemente sangre periférica, sangre, plasma o suero y más preferiblemente la muestra es suero.
Típicamente, la muestra es humana en origen, pero alternativamente, puede proceder de cualquier otro animal mamífero como los animales de granjas tales como caballos, bovinos, ovejas o cerdos o pueden ser alternativamente mascotas como gatos o perros.
A efectos de la presente invención, los términos "sujeto", "individuo" o "paciente", utilizados indistintamente a lo largo del presente documento, se refiere a cualquier animal mamífero e incluye, pero no se restringe a animales domésticos, de granja, primates y humanos, preferiblemente humanos. Dichos términos no pretenden ser limitativos en ningún aspecto, pudiendo ser éstos de cualquier edad, sexo y condición física. En una realización particular, el sujeto es un sujeto que padece una patología que es susceptible de ser tratada mediante la implantación de un biomaterial, tal y como se ha descrito en el presente documento.
Una vez la muestra biológica es aislada del sujeto, dicha muestra se incuba con el biomaterial problema para determinar en una etapa posterior del método [etapa b.], los marcadores que se adhieren a dicho biomaterial. En una realización preferida, el biomaterial problema se incuba con la muestra biológica aislada del sujeto durante un intervalo de 2 a 10 horas, preferiblemente durante un intervalo de entre 3 y 6 horas, más preferiblemente durante un intervalo de entre 3 y 4 horas.
A continuación, una vez la muestra biológica se ha incubado con el biomaterial problema, el método de la invención comprende una [etapa b] donde se identifican, o determinan y cuantifican la presencia de los biomarcadores aquí descritos, que se han adheridos al biomaterial problema en contacto con la muestra biológica aislada.
En una realización particular, la etapa b) del método de la invención se caracteriza por que comprende determinar y cuantificar la presencia simultánea del conjunto de marcadores que comprende: CRP, SAMP, C1QC, C1QB, C07, C1S, VTN, LAC 2 y KV402.
En otra realización más particular de la etapa b), el método de la invención se caracteriza por que comprende además la determinación y cuantificación de al menos uno de los biomarcadores seleccionados de la lista que consiste en: C4BPA, KNG1 , C05, IC1, CFAH, C03, C1 R, ficolina-2, MASP-1, y/o cualquier combinación de los mismos.
En otra realización más particular de la etapa b) el método de la invención se caracteriza por que comprende la determinación y cuantificación simultánea del conjunto de biomarcadores seleccionados de la lista que consiste en: CRP, SAMP, C1QC, C1QB, C07, C1S, VTN, LAC 2, KV402, C4BPA, KNG1, C05, IC1, CFAH, C03, C1 R, ficolina-2 y MASP-1.
En otra realización alternativa de la etapa b) del método de la invención, éste se caracteriza por que comprende la determinación y cuantificación de al menos uno de los ratios entre los biomarcadores C4BPA, CFAH y VTN respecto a los biomarcadores CRP y SAMP. En una realización más particular, se determinan al menos uno de los ratios seleccionados de entre cualquiera de la siguiente lista: CFAH/CRP; CFAH/SAMP; C4BPA/CRP; C4BPA/SAMP; VTNC/CRP y VTNC/SAMP. En una realización más preferida, se determina el conjunto de los ratios que se seleccionan de la lista que consiste en: CFAH/CRP; CFAH/SAMP; C4BPA/CRP; C4BPA/SAMP; VTNC/CRP y VTNC/SAMP. Valores de los ratios CFAH/CRP, C4BPA/CRP y VTN/CRP inferiores a 25, 7 y 30, respectivamente indicarían que el biomaterial no tiene características de biocompatibilidad con el paciente. Tal y como se ha mencionado anteriormente, la determinación del perfil de biomarcadores descrito en la presente invención se lleva a cabo identificando y determinando los valores de dichos biomarcadores que han quedado adheridos al biomaterial problema una vez éste ha estado en contacto con la muestra biológica del sujeto al que se le va a implantar dicho biomaterial.
Transcurrido el periodo de incubación de la muestra biológica del sujeto con el biomaterial problema, éste es sometido preferiblemente a una serie de lavados para eliminar los biomarcadores que no están fuertemente adheridos al biomaterial. En una realización preferida dichos lavados se llevan a cabo preferiblemente con agua bidestilada y más preferiblemente, un último lavado con una solución tampón que comprende preferiblemente cloruro sódico a una concentración de entre 50-500 mM.
En otra realización más particular, los marcadores adheridos al biomaterial problema se recolectan o eluyen de dicho biomaterial, preferiblemente mediante un tratamiento de la superficie del biomaterial con una solución tampón, preferiblemente donde la solución tampón es una solución de bicarbonato de trietilamonio, aunque se puede utilizar cualquier solución tampón conocida por el experto en la materia y útil para obtener las proteínas o biomarcadores adheridas a dicho biomaterial. A continuación, en otra realización particular, en dichos eluidos que comprenden los biomarcadores adheridos al biomaterial, se determinan y cuantifican los biomarcadores que forman el perfil proteico de la invención.
La determinación y cuantificación de la presencia de los marcadores de la invención se lleva a cabo, preferiblemente mediante la determinación de la cantidad de biomarcador adherido al material en contacto con la muestra biológica, preferiblemente en los eluidos obtenidos según se ha descrito anteriormente, y también de manera alternativa, mediante la determinación de los niveles de expresión proteicos de dichos marcadores, mediante cualquier método conocido en el estado de la técnica. Los autores de la presente invención han demostrado que la detección de la cantidad y/o la concentración de estos productos de expresión de manera semicuantitativa o cuantitativa permiten diferenciar entre un biomaterial compatible de uno no compatible. La presencia, así como la cantidad del biomarcador detectada establece un perfil diferencial entre biomateriales compatibles y no compatibles.
La medida de la cantidad o la concentración, preferiblemente de manera semicuantitativa o cuantitativa, puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad y/o la concentración de las proteínas o biomarcadores de la invención. Dicha señal a la que también podemos referirnos como señal de intensidad -puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física de dichos biomarcadores. La medida indirecta incluye la medida obtenida de un componente secundario o un sistema de medida biológica (por ejemplo la medida de respuestas celulares, ligandos, "etiquetas" o productos de reacción enzimática).
El término "cantidad" tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la cantidad absoluta o relativa de los biomarcadores de la invención, sino que también se refiere a cualquier otro valor o parámetro relacionado con los mismos o que pueda derivarse de éstos. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de la señal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades físicas o químicas de dichos biomarcadores, obtenidos mediante medida directa. Adicionalmente, dichos valores o parámetros incluyen todos aquellos obtenidos mediante medida indirecta, por ejemplo, cualquiera de los sistemas de medida descritos en otra parte del presente documento.
La detección y cuantificación de Sos biomarcadores de la presente invención, asociados a la determinación de la biocompatibilidad de un biomaterial, puede llevarse a cabo mediante la cuantificación de los niveles de las proteínas o péptidos por métodos convencionales, conocidos por los técnicos en la materia, incluyendo, aunque sin limitarse a, métodos quimio luminiscentes, tinción inmunohistoquímica o detección bioquímica (e.g., ensayos inmunohistoquímicos), técnicas inmunoiógicas, citometria de flujo, inmunoprecipitación (o sus equivalentes para reactivos que no sean anticuerpos), cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC), espectrometría de masas (MS), medida de la absorbencia de resonancia de plasma, etc. En una realización particular, la cuantificación de los niveles de Sos biomarcadores identificados en Sa presente invención asociados con la compatibilidad de un biomatería! se realiza mediante técnicas inmunológicas, tales como ELISA ("Enzyme-Linked Immunosorbent Assay"), Western-blot, RIA (radioinmunoensayo), E1A competitivo (inmunoensayo de enzima competitivo), DAS-ELISA ("Doubie Antibody Sandwich ELISA"), espectroscopia de masas, técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el uso de biochips de proteínas o microarrays que incluyan anticuerpos específicos o ensayos basados en la precipitación coloidal en formatos tales como los "dipstick^.
Preferiblemente, ías proteínas se detectan por Western-blot. ELISA, un array o matriz proteico o por electroforesis bidimensional, más preferiblemente la detección del perfil proteico descrito en la presente invención se lleva a cabo mediante ELISA. Asimismo, el técnico en la materia reconocerá que la presente invención se relaciona no sólo con los biomarcadores descritos en la invención, sino también con fragmentos de los mismos que pudieran generarse, por ejemplo, por fenómenos de procesamiento alternativo o splicing, ruptura proteolítica de dichos péptidos o proteínas, etc. Dichos fragmentos conservan la capacidad de ser utilizados como marcadores para la determinación de la biocompatibilidad de un material médico tal y como se describe en el presente documento. Los biomarcadores de la invención, así como sus fragmentos, pueden incluir modificaciones post-traduccionales, tales como fosforilación, giicosilación, acetilación, isoprenilación, miristoilación, procesamiento proteoiítico, etc.
En el siguiente paso del método de la invención, [etapa c], la determinación y el valor de cuantificación de los marcadores de la invención obtenidos en la etapa b) se compara con los valores obtenidos para dichos marcadores en un biomaterial de referencia, que también se ha puesto en contacto con una muestra biológica aislada del sujeto, en donde un valor de al menos dos veces superior para cada uno de los biomarcadores obtenidos en la etapa b) respecto al valor obtenido para dichos biomarcadores en el biomaterial de referencia, es indicativo de que el biomaterial problema no es compatible con el sujeto.
A efectos de la presente invención el término "biomaterial problema" se refiere a un biomaterial del que no se conoce su compatibilidad o incompatibilidad con un sujeto.
A efectos de la presente invención el término "biomaterial de referencia" se refiere a un biomaterial del que se conoce su compatibilidad con un sujeto, particularmente con un mamífero y más particularmente con un ser humano. Los niveles de los marcadores identificados en esta invención asociados con la compatibilidad de un biomaterial en la muestra de referencia pueden ser determinados de manera similar a como se determinan los niveles de dichos marcadores en el biomaterial problema.
El término "cantidad de referencia" o "valor de referencia", utilizados indistintamente a lo lardo del presente documento, se obtiene a partir de los valores, preferiblemente valores de cantidad de los marcadores de la invención, analizados en un biomaterial de referencia, del que se conoce su compatibilidad con un sujeto. A efectos de la presente invención, y a modo de ejemplo, un material biocompatible del que obtener la cantidad de referencia para los biomarcadores de la invención, puede ser titanio, preferentemente de grado médico.
En otra realización preferida de este aspecto de la presente invención, la cantidad o valor de referencia se obtiene a partir de un biomaterial de referencia.
El término "comparación", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la comparación de la cantidad de los biomarcadores tal y como se describe en la invención, adheridos al biomaterial problema que se cultiva o incuba junto con la muestra biológica de un sujeto, respecto a la cantidad de los mismos biomarcadores que se han adherido a un biomaterial de referencia cultivado también junto con una muestra biológica obtenida del mismo sujeto.
El biomaterial de referencia puede ser analizado, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con el biomaterial problema. La comparación descrita en la etapa c) del método de la presente invención, puede ser realizada manualmente o asistida por ordenador.
En otra realización más preferida de la etapa c) del método de la invención, éste se caracteriza porque se compara el valor obtenido para al menos uno de ¡os marcadores adheridos al biomaterial problema donde dicho marcador se selecciona de la lista que consiste en: CRP, SAMP, C1QC, C1QB, C07, C1S, VTN, LAC2 y KV402, preferiblemente se compara el valor obtenido para el conjunto de dichos marcadores, con el valor de referencia obtenido para dichos marcadores en el biomaterial de referencia. En otra realización más preferida de la etapa c) del método de la invención, éste se caracteriza porque se compara el valor obtenido en el biomateriaí problema para el conjunto de los marcadores CRP, SAMP, C1QC, C1QB, C07, C1S, VTN, LAC2, KV402, y además para al menos uno de los marcadores seleccionados de entre cualquiera de la lista que consiste en: C4BPA, KNG1, C05, IC1, CFAH, C03, C1R, Ficolina-2, MASP-1, más preferiblemente para el conjunto de los marcadores CRP, SAMP, C1QC, C1QB, C07, C1S, VTN, LAC2, KV402, C4BPA, KNG1, C05, IC1, CFAH, C03, C1R, Ficolina-2 y MASP-1, con el valor de referencia obtenido para dichos marcadores en el biomateriaí de referencia.
De acuerdo con el método de la invención, tal y como se describe aquí, si el nivel de al menos uno de los marcadores descritos en la invención en el biomateriaí problema está aumentado, preferiblemente al menos dos veces respecto al nivel de dicho marcador en el biomateriaí de referencia, entonces, el biomateriaí problema no será compatible con dicho sujeto; y/o si el nivel de al menos uno de los marcadores descritos en la invención, en el biomateriaí problema bajo estudio se mantiene y/o está disminuido con respecto al nivel de referencia de dicho marcador en el biomateriaí de referencia, entonces, el material problema será compatible. En el contexto de la presente invención, se dice que la cantidad y/o el nivel del biomarcador o biomarcadores de la invención "está(n) aumentado(s)" con respecto a la cantidad y/o al nivel de dicho(s) biomarcador(es) en el biomateriaí de referencia", cuando la cantidad y/o el nivel de expresión de dicho(s) biomarcador(es) está elevado (o es superior) en el biomateriaí problema con respecto la cantidad y/o al nivel de expresión de dicho biomarcador(s) en el biomateriaí de referencia. De acuerdo con la presente invención, se considera que la cantidad y/o el nivel del biomarcador(es) en un biomateriaí problema está aumentado con respecto a la cantidad y/o al nivel de dicho(s) biomarcador(es) en el biomateriaí de referencia cuando la cantidad y/o el nivel de dicho(s) biomarcador(es) en el biomateriaí problema está aumentado en al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, (n) veces, respecto a la cantidad y/o al nivel de expresión de dicho(s) biomarcador(es) en el biomateriaí de referencia.
Asimismo, en el contexto de la presente invención, se dice que la cantidad y/o el nivel de un(os) biomarcador(es) "está disminuido" con respecto a la cantidad y/o al nivel de dicho(s) biomarcador(es) en el biomaterial de referencia cuando la cantidad y/o el nivel de dicho biomarcador(es) está reducido (o es inferior) con respecto a la cantidad y/o al nivel de dicho biomarcador(es) en el biomaterial de referencia. De acuerdo con la presente invención, se considera que la cantidad y/o el nivel de un biomarcador(es) en un biomaterial problema bajo estudio está disminuido con respecto a la cantidad y/o al nivel de dicho biomarcador(es) en el biomaterial de referencia cuando la cantidad y/o el nivel de dicho biomarcador(es) en el biomaterial problema está disminuido en al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, (n) veces, respecto a la cantidad y/o al nivel de expresión de dicho biomarcador(es) en el biomaterial de referencia.
En la presente invención los términos "predecir" o "pronosticar" se refieren a la valoración de la probabilidad según la cual un biomaterial es compatible respecto al sujeto que va a ser implantado con dicho biomaterial.
Como entenderán los expertos en la materia, tal valoración, aunque se prefiere que sea, normalmente puede no ser correcta para el 100% de los biomateriales que se van pronosticar su compatibilidad. El término, sin embargo, requiere que una parte estadísticamente significativa de los biomateriales se pueda identificar como que es compatible o que tiene disponibilidad a serlo. Si una parte es estadísticamente significativa se puede determinar sin más por el experto en la materia usando varías herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación de valores p, prueba t de Student, prueba de Mann-Whitney, etc. Los intervalos de confianza preferidos son al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%. Los valores de p son, preferiblemente, 0.2, 0.1 , 0.05.
El tercer aspecto de la presente invención se refiere a un kit para predecir y/o pronosticar la compatibilidad de un biomaterial, de ahora en adelante kit de la invención, útil para la realización del método in vitro descrito de la invención.
En una realización preferida, el kit de la invención comprende los elementos necesarios para llevar a cabo la determinación y cuantificación de al menos uno de los marcadores descritos en la presente invención. En una realización más preferida del kit de la invención, éste se caracteriza por que los elementos necesarios para determinar al menos uno de los marcadores de la invención se seleccionan de la lista que consiste en: oligonucleótidos, sondas, oligosondas, anticuerpos, reactivos, o cualquier combinación de los anteriores, que permiten detectar y cuantificar la presencia de al menos uno de los marcadores seleccionados de la lista que consiste en: CRP, SAMP, C1QC, C1QB, C07, C1S, VTN, LAC2, KV402, C4BPA, KNG1, C05, IC1 , CFAH, C03, C1 R, Ficolina-2, MASP-1 , y/o cualquier combinación de los mismos.
En otra realización más preferida, el kit de la invención comprende los elementos necesarios para detectar y cuantificar la presencia del conjunto de marcadores que comprende: CRP, SAMP, C1QC, C1QB, C07, C1S, VTN, LAC2 y KV402. En otra realización más preferida, el kit comprende además los elementos necesarios para detectar y cuantificar la presencia de los marcadores de la invención que se seleccionan de la lista que consiste en: C4BPA, KNG1 , C05, IC1, CFAH, C03, C1R, Ficolina-2, MASP-1 , y/o cualquier combinación de los mismos.
En otra realización más preferida, el kit de la invención comprende los elementos necesarios para detectar y cuantificar la presencia del conjunto de marcadores que comprende: CRP, SAMP, C1QC, C1QB, C07, C1S, C4BPA, KNG1 , C05, IC1 , CFAH, C03, C1 R, Ficolina-2 y MASP-1.
En otra realización más preferida aún, la determinación y cuantificación de los marcadores de la invención, mediante el kit de la invención se lleva a cabo tras contactar el biomaterial problema con una muestra biológica aislada de un sujeto, tal y como se ha descrito aquí, preferiblemente siendo la muestra biológica aislada una muestra de suero.
En otra realización preferida, el kit de la invención además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc. Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención.
Otro aspecto se refiere al uso del kit de la invención, para predecir y/o pronosticar la compatibilidad de un biomaterial con un sujeto. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Micrografías obtenidas mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) de los recubrimientos híbridos sol-gel aplicados en los discos de titanio SAE: (a) 70% metiltrimetoxisilano (MTMOS) - 30% tetraetil-ortosilicato (TEOS) [70M30T], (b) 35% MTMOS - 35% 3-glicidoxipropil-trimetoxisilano (GPTMS) - 30% TEOS [35M35G30T], (c) 50% MTMOS - 50% GPTMS [50M50G] y (d) 50% trietoxivinilsilano (VTES) - 50% GPTMS [50V50G]. Barra de calibración 10 μπ\.
Figura 2. Imágenes AFM de los recubrimientos híbridos sol-gel sobre los discos de titanio: 70M30T (a), 35M35G30T (b), 50M50G (c) y 50V50G (d).
Figura 3. Medidas de perfilometría mecánicas de Ra. Las barras indican las desviaciones estándar.
Figura 4. Resultados del ángulo de contacto para recubrimientos híbridos sol-gel aplicados sobre discos de titanio. Las barras indican las desviaciones estándar.
Figure 5. Viabilidad celular y mineralización in vitro de células de osteosarcoma de ratón (MC3T3-E1). (a) Porcentaje de supervivencia celular analizando la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) (PNP mM/h) normalizada respecto a los niveles de la cantidad de proteína total (μς/μΙ) de las células MC3T3-E1 cultivadas en discos de titanio recubiertos con las formulaciones 70M30T, 35M35G30T, 50M50G y 50V50G. Como control positivo se utilizaron células cultivadas en ausencia de disco y como control negativo, células cultivadas en presencia de disco de titanio sin recubrir. No hubo diferencias estadísticamente significativas entre las diferentes formulaciones en los tiempos medidos (ANOVA, p < 0,05).
Figura 6. Imágenes representativas de microscopía óptica de cortes histológicos obtenidos del ensayo in vivo (EXAKT® corte y tricrómico de Gomori) tras dos semanas de implantación de los implantes recubiertos: a) 70M30T, b) 35M35G30T, c) 50M50G y d) 50V50G. El área correspondiente al tejido conectivo fibroso (FOT) está delimitada por las líneas de trazos. Abreviaturas: MAT = material; FCT= tejido conectivo fibroso; NB = nuevo hueso/osteoide. Ampliación 20x.
Figura 7. Área (mm2) ocupada por tejido fibroso conectivo para los implantes recubiertos por cada uno de los cuatro recubrimientos. Diferencias significativas se encontraron entre los revestimientos 70M30/35M35G30T y 50M50G/50V50G (p≤ 0.05 ANOVA con un post-test de Kruskal-Wallis).
EJEMPLOS A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.
Materiales y métodos Discos de titanio
Los discos de titanio (12 mm de diámetro y 1 mm de espesor) se fabricaron a partir de una barra de titanio comercial puro de grado 4 (llerimpiant SL). Los discos de titanio granalíados y con tratamiento ácido (Sandblasted Acid Etching-SAE) se sometieron a ía abrasión con partículas de óxido de aluminio de 4 μm y se les dio eí tratamiento ácido por inmersión en ácido sulfúrico durante 1 h para simular una superficie de implante moderadamente rugosa. Los discos se limpiaron en acetona, etanoi y agua purificada de 18.2 Q (20 min en cada líquido) en un baño de ultrasonidos y secados a vacío. Finalmente, todos ios discos de titanio se esterilizaron utilizando radiación UV. Síntesis sol ael v preparación de muestras
Los recubrimientos híbridos de silicio se obtuvieron a través del método sol-gel. Los precursores utilizados fueron: metiltrimetoxisilano (MTMOS), 3-glicidoxipropil- trimetoxisilano (GPTMS), tetraetil-ortosilicato (TEOS) y trietoxivinilsilano (VTES) (Sigma-Aldrich). Se sintetizaron cuatro composiciones diferentes con diferentes porcentajes molares: 70% MTMOS - 30% TEOS (70M30T), 35% MTMOS - 35% GPTMS - 30% TEOS (35M35G30T), 50% MTMOS - 50% GPTMS (50M05G) y 50% VTES - 50% GPTMS (50V50G). Como disolvente se utilizó 2-propanol en una relación en volumen de 1 :1 alcohol/siloxano. La hidrólisis de los alcoxisilanos se llevó a cabo añadiendo la correspondiente cantidad estequiométrica de disolución acuosa acidificada a una velocidad de una gota por segundo. La solución se mantuvo 1 h bajo a agitación y después 1 h en reposo. Las muestras fueron preparadas inmediatamente después de este momento. Los discos de titanio SAE se utilizaron como sustrato. El recubrimiento se obtuvo empleando un dip coater (KSV Instrument-KSV DC). Los discos se sumergieron en la correspondiente solución sol-gel a una velocidad de 60 cm/min, durante 1 min, extraídas a una velocidad de 100 cm/min. Finalmente, las muestras curaron durante 2 h, a una temperatura de 80°C para los recubrimientos 70M30T y 35M35G30T, y a una temperatura de 140 °C para los recubrimientos 50M50G y 50V50G. Caracterización físico-química de los discos de titanio recubiertos.
El ángulo de contacto se midió utilizando un medidor automático de ángulo de contacto (Dataphysics OCA 20). 10 μΙ de agua ultrapura se depositaron en la superficie recubierta sol gel a una velocidad de dosificación de 27,5 μL/s a temperatura ambiente. Los ángulos de contacto se determinaron con el software SCA 20. Se estudiaron 5 discos de cada biomaterial depositando 2 gotas en cada uno de ellos. La topografía superficial de los discos de titanio recubiertos se caracterizó utilizando la microscopía de fuerza atómica (AFM) bajo condiciones secas. Se llevaron a cabo las medidas a un tamaño de escaneo de 60 μητι con una velocidad de escaneo de 1 Hz. Para determinar la rugosidad se utilizó un perfilómetro mecánico Dektack 6M (Veeco). Se ensayaron dos discos recubiertos de cada composición. Se realizaron tres medidas para cada disco, para obtener el valor medio del parámetro Ra. Los recubrimientos fueron estudiados mediante SEM con un equipo Leica-Zeiss bajo vacío. Se aplicó un recubrimiento de platino para hacer las muestras más conductoras para la observación por SEM.
Ensayos in vitro Cultivos celulares
Las células MC3T3-E1 (osteosarcoma ratón) se cultivaron en discos de titanio con recubrimiento sol-gel, a una concentración de1x104 célula/pocilio en medio DMEM (Dulbecco's modified Eagle's médium) con fenol rojo (Gibco-Life Technologies, Grand Island, NY, USA) con 1 % 100x penicilina/estreptomicina (Biowest Inc., USA) and 10 % Fetal Bovine Serum (FBS) (Gibco-Life Technologies, Grand Island, NY, USA). Tras un periodo de incubación de 24 h a 37°C en atmósfera húmeda de 95% y 5% CO2, el medio fue reemplazado por un medio osteogénico compuesto por DMEM con fenol rojo 1x penicilina estreptomicina, 10 % FBS, 1 % ácido ascórbico (5mg mL-1) y 0,21 % β-glicerol fosfato y se incubó de nuevo bajo las mismas condiciones. El medio de cultivo se cambió cada 48 h. En cada placa, se utilizaron, como control de las condiciones de cultivo, células a la misma concentración mencionada anteriormente.
Citotoxicidad
La citotoxicidad del biomaterial se determinó utilizando la norma ISO 10993-5 mediante espectrofotometría, por contacto indirecto del extracto del material con la línea celular. Se empleó el ensayo celular 96-Cell Titter Proliferation Assay (Promega®) con el fin de medir la viabilidad celular después de 24 horas de incubación de las células con el extracto. Se utilizó un control negativo (un pocilio vacío) y un control positivo (látex, conocido por ser tóxico para las células). Un 70% se consideró como el límite por debajo del cual un biomaterial es considerado citotóxico. Actividad de la ALP
La actividad de la ALP (fosfatasa alcalina) se determinó siguiendo el protocolo de conversión de p-nitrofenilfosfato (p-NPP) a p-nitrofenol. Se utilizaron alícuotas de 0.1 mL para llevar a cabo el ensayo. 100 μL de p-NPP (1mg mL-1) en buffer (50 mM glicina; 1mM MgCI2 pH 10,5) se añadieron a 100 μΙ del sobrenadante resultante del lisado. Tras 2 h de incubación en la oscuridad (37°C, 5% C02), se midió la absorbencia espectrofotométricamente en un lector de microplacas a una longitud de onda de 405 nm. La actividad de la ALP se determinó a partir de una curva standard obtenida a partir de diferentes soluciones de p-nitrofenol e hidróxido sódico 0.02 mM. Los resultados se presentaron como mmol de p- nitrofenol hora (mM PNP h-1), y los datos se expresaron como actividad de ALP normalizada para el contenido total de proteínas (Mg μΙ) con el kit de ensayo Pierce BCA (Thermofisher) tras 7 y 14 días.
Análisis de los biomarcadores adsorbidos o adheridos sobre la superficie de los biomateriales problema para determinar su compatibilidad
Discos de titanio recubiertos de las diferentes composiciones sol-gel analizadas en los ejemplos incluidos en el presente documento (4 discos de cada biomaterial) fueron incubados en una placa de 24 pocilios por 180 minutos en una atmósfera humedecida (37 °C, 5 % C02), tras haber añadido 2 mL de suero humano (suero de varón, serotipo AB, Sigma-Aldrich). Transcurrido dicho tiempo, se retiró el suero con el objetivo de determinar las proteínas adsorbidas/adheridas a los biomateriales analizados. Para ello, los discos fueron lavados cinco veces con agua bidestilada; tras lo cual se procedió a un último lavado con 100 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI pH 7.0. Tras la realización de dichos lavados, se eliminaros de los discos los marcadores que no estaban bien adheridos. En cambio, las proteínas que seguían adheridas al biomaterial analizado, formando una película sobre dicho biomaterial fueron recolectadas mediante un tratamiento de la superficie del biomaterial con una solución de 4 % SDS 100 mM DTT 0.5M en TEAB (Solución tamponadora de bicarbonato de trietilamonio). Se llevaron a cabo cuatro eluciones para cada uno de los biomateriales analizados y las cuatro eluciones de cada biomaterial se mezclaron para dar una réplica de cada biomaterial, lo cual se repitió otras tres veces hasta obtener un total de cuatro muestras por biomaterial (cuatríplicados). El contenido total de proteínas para cada una de las réplicas fue cuantificado colorimétricamente (Pierce BCA assay kit (Thermofisher®)), siendo el valor representativo 51 mg/mL. Análisis Proteómico
Las muestras eluídas obtenidas anteriormente se resolvieron en un gel de poliacrilamida al 10%, usando un Mini-Protean II electrophoresis cell (Bio-Rad®). Se aplicó un voltaje constante de 150 V durante 45 minutos. El gel fue fijado y teñido con SYPRO Ruby stain (Bio-Rad®) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los geles fueron lavados con agua y cada calle fue cortada en cuatro bandas. Cada banda fue digerida siguiendo un protocolo estándar de digestión (Anitua E. et al., J. Tissue Eng. Regen. Med.; 2015;9:E1-12). Los péptidos resultantes fueron resuspendidos en 0.1% en volumen acido fórmico y analizados en un sistema de cromatografía líquida a escala nano acoplada on-line a espectrometría de masas en tándem (LC-MS). La separación de los péptidos fue realizada en un cromatógrafo nano ACQUITY UPLC (Waters) conectado a un espectrómetro SYNAPT G2S (Waters). Las muestras fueron desaladas en una columna Symmetry 300 C18 UPLC Trap column (5 μm, 180 μm χ 20 mm, Waters) conectada a una columna analítica a BEH130 C18 column (1.7 μm, 75 μητι χ 200 mm, Waters). La columna fue equilibrada en 3% acetonitrilo en ácido fórmico al 0.1%. Los péptidos fueron eluidos a un flujo de 300 nL/min en un gradiente lineal del 3%-50% de acetonitrilo.
El espectrómetro Synapt G2S (Waters) fue utilizado para el análisis de los biomarcadores o proteínas. Todas las adquisiciones fueron realizadas en electro espray de modo positivo. Los datos fueron corregidos con un control interno denominado "lock-spraf usando el valor monoisotópico de la forma doblemente cargada del [Glu1]-fibrinopeptido B. La adquisición de datos fue realizada con alta exactitud de masa y en modo HDDA, la cual permite un incremento de las señales por el uso de la separación por movilidad iónica.
El software Progenesis LC-MS (Nonlinear Dynamics) fue utilizado para el análisis de proteómica diferencial. Los archivos de datos en bruto "raW fueron importados al programa, y una de las muestras fue seleccionada como cromatografía de referencia contra la cual las demás carreras cromatográficas fueron alineadas. Las relaciones de abundancia entre carreras fueron calculadas para cada "valor" a un tiempo de retención determinado. El "peak lis? que contenía los péptidos detectados en todas las muestras fue confrontado mediante el motor de búsqueda Mascot (Matrix Science). La tolerancia para las búsquedas fueron las siguientes: 10 ppm para el precursor, y 0.2 Da para los fragmentos. La carbadometilación en cisteína fue seleccionada como modificación fija, y la oxidación de las metioninas como modificación variable. Las proteínas identificadas con al menos dos péptidos y un FDR (False Discovery Rate) <1% fueron consideradas para su posterior análisis. Finalmente, los datos de proteínas diferencialmente eluídas en cada uno de los biomateriales de análisis fueron incluidos en la base de datos DAVID, una herramienta bioinformática para la anotación, visualización e integración de datos para así obtener la información de los "nodos de proteínas relacionados".
Ensayos in vivo Con el propósito de evaluar la respuesta histológica de los biomateriales o recubrimientos seleccionados ensayados, los implantes recubiertos con dichos biomateriales fueron colocados quirúrgicamente en la tibia de conejos de Nueva Zelanda (Oryctolagus cuniculus). Este modelo de implantación en tibia de conejo está ampliamente descrito en bibliografía para la osteointegración de implantes (Morí H, et al., J. Oral Maxillofac. Surg. 1997;55:351-61). Todos estos estudios se realizaron de acuerdo a los protocolos del Comité Ético de la Universidad de Murcia en España y según las directrices europeas y las condiciones legales reflejadas en el R.D. 223/1988 del 14 de marzo y la Orden del 13 de octubre de 1988 de la ley española sobre la protección de animales utilizados para experimentación y otros propósitos científicos. Concretamente, los conejos se mantuvieron durante 12 horas estabulados en condiciones cíclicas de luz-oscuridad a temperatura ambiente de 20°C y una humedad relativa entre 45 y 65%. Los animales se enjaularon individualmente y alimentaron con una dieta estándar y agua filtrada ad libidum. Los implantes fueron suministrados por llerimplant SL (España) Los implantes eran de conexión interna realizados en titanio grado IV de marca comercial GMI dental implants, 3.75 mm de diámetro y 8 mm de largo modelo Frontier. Se utilizó una cantidad total de 40 de estos implantes, 20 sin recubrir como control y 5 recubiertos con cada uno de los biomateriales mencionados anteriormente para ensayar su compatibilidad. Tanto el control como las muestras de ensayo se implantaron en las mismas condiciones y se compararon los resultados.
Se utilizaron un total de 20 conejos de entre 2.000 y 3.000 g de peso, correspondiente a edades próximas al cierre fisario, indicativo de un volumen óseo adecuado para el estudio. El periodo de implantación del modelo experimental fue de 2 semanas. Se eligió este tiempo con el fin de obtener un proceso de osteointegración completo. Los implantes se insertaron en la región proximal de las tibias izda. y dcha., de manera que cada animal tenía un total de 2 implantes, uno como control y otro como biomaterial problema a ensayar. Los animales se sedaron mediante administración intramuscular (IM) de Hidrocloruro de Clopromazina (10 mg kg). Se les administró profilaxis antibiótica (Amoxicilina) y se les preparó para la intervención. En quirófano se procedió a la inducción anestésica mediante inyección IM de Clorhidrato de Ketamina 50 mg kg (Imalgene®, Merial, Georgia, EEUU), la pauta de mantenimiento fue "a demanda" mediante la administración de 20 mg/kg, vía IM ante el menor signo de agitación del animal. Tras la incisión cutánea de 15 mm se desesperiostizó la tibia y se marcó con una punta de grafito la zona de implantación. Seguidamente se realizó el defecto óseo mediante fresado sucesivo (2,0, 2,8 y 3,2 mm de diámetro), con micromotor de bajas revoluciones e irrigación continua de suero fisiológico. Tras lavar, se implantaron las prótesis radiculares mediante press-fit (colocación mediante presión con la mano). Se procedió al cierre de la herida por planos, limpieza con solución salina y tapado con aposito plástico en spray (Nobecutan, Inibsa Laboratorios, Barcelona, España). Tras transcurrir los distintos periodos de ensayo, los animales fueron eutanasiados mediante inhalación de monóxido de carbono, para extraer los tornillos y estudiar los tejidos circundantes. Cuantificación histológica Las muestras para el examen histológico se procesaron siguiendo la metodología descrita por Peris JL. et al. (Peris JL, et al. Rev. Española Cirugía Osteoartic. 1993;28:231-8). Brevemente, las muestras se embebieron en metacrilato de metilo y por medio de la técnica de corte ΕΞΧΑΚΤ (EXAKT Technologies, Inc., Oklahoma, USA) se consiguieron muestras de 25-30 mm de espesor. Para el examen por microscopía óptica, todas las secciones se tiñeron con una solución de Tricrómico de Gomori. La ROI (Región of Interest) se delimitó con el software ImageJ, expresando el área ocupada por la cápsula fibrosa (FC) en mm2, para n=4. Análisis estadístico
Los datos se analizaron mediante el análisis de varianza de un factor (ANOVA) y la comparación múltiple de Newman-Keuls, si apropiado. Diferencias con p < 0.05 se consideraron estadísticamente significativas.
Ejemplo 1. Síntesis y caracterización físico-química de los biomateriales utilizados como recubrimientos de implantes
Una vez sintetizados los recubrimientos con los biomateriales analizados en la presente invención, se recubrieron los discos de titanio y se procedió al análisis y caracterización físico-química de los mismos. Se han analizado cuatro biomateriales de recubrimiento sol-gel diferentes y homogéneos: 70M30T, 35M35G30T, 50M05G y 50V50G, tal como se puede ver en las micrografías de SEM (Fig.1). La Figura 1 muestra la cobertura parcial de la rugosidad del titanio tratado SAE, proporcionada por los diferentes recubrimientos. El biomaterial 70M30T (Fig.la) muestra un mayor nivel de conservación de la topografía inicial. En las imágenes de AFM se observa claramente que el recubrimiento con el biomaterial 70M30T presenta una mayor rugosidad (Fig.2a). Sin embargo, los recubrimientos con los biomateriales 50M50G y 50V50G muestran una superficie una topografía más suave (Fig.2c y 3d) ya que la irregularidad inicial del sustrato está cubierta mayoritariamente por los recubrimientos. En cambio, el biomaterial 35M35G30T muestra un aspecto intermedio (Fig.2b).
Las medidas con el perfilómetro mecánico (Fig.3) Dektack 6M (Veeco) revelan que el recubrimiento 70M30T presenta un valor Ra significativamente mayor comparando con los biomateriales 35 35T30G, 50M50G y 50V50G. Este resultado puede ser debido a la presencia de GPTMS en los últimos biomateriales que podría finalmente afectar al espesor del recubrimiento y por tanto a la rugosidad. Las medidas del ángulo de contacto (Fig.4) obtenidas con el medidor automático de ángulo de contacto Dataphysics OCA 20 muestran que los recubrimientos con el precursor TEOS (precursor no modificado orgánicamente), 70M30T y 35M35G30T tienen las superficies más hidrofílicas, mientras que 50M50G y 50V50G muestran un mayor ángulo de contacto, probablemente, como resultado del mayor contenido orgánico en sus composiciones. Todas estas variaciones deberían afectar a la respuesta biológica y por lo tanto a la compatibilidad de dichos biomateriales.
Ejemplo 2. Análisis de la compatibilidad de los biomateriales en cultivos in vitro.
Dicho análisis se llevó a cabo en cultivos in vitro de células MC3T3-E1 (osteosarcoma ratón) que se cultivaron en presencia de los discos de titanio recubiertos con los biomateriales analizados en la presente invención, 70M30T, 35M35G30T, 50M50G y 50V50G. Con respecto a la viabilidad celular ninguno de los biomateriales ensayados mostró citotoxicidad (Fig. 5a). Tampoco las medidas de la actividad de la enzima ALP muestran diferencias significativas entre los materiales ensayados (Fig. 5b). No obstante, está claro que mientras la actividad de la ALP del pocilio vacío disminuye entre el día 7 y el día 14, todos los biomateriales e incluso el titanio control parecen aumentar o mantener la diferenciación y los procesos metabólicos de las células osteoblásticas.
Los resultados in vitro ponen de manifiesto que, a priori, todos los materiales analizados en la presente invención serían combatibles y no mostrarían respuesta inflamatoria, ni inmune.
Ejemplo 3. Análisis de la compatibilidad in vivo de los biomateriales de la invención.
Para corroborar si existían una correlación para determinar la compatibilidad de un biomaterial entre los resultados obtenidos in vitro frente a los resultados obtenidos in vivo, los inventores implantaron en la tibia de un modelo animal de conejo los implantes recubiertos con los biomateriales analizados en la presente invención (ver materiales y métodos). La formación de la cápsula fibrosa que rodea el implante está contemplada como una respuesta inmune natural a la presencia del biomaterial. Por tanto, la primera capa de proteínas que se adhiere puede inducir la respuesta inmediata del organismo huésped al biomaterial.
Los resultados han puesto de manifiesto que existe una zona, en las muestras obtenidas de los implantes recubiertos con los biomateriales 50V50G y 50M50G claramente cubierta por tejido conectivo fibroso (FCT) (Fig. 6c y 6d). Dicho tejido fibroso se encuentra entre el biomaterial ( AT) y el nuevo hueso u osteoide (NB) en dichos biomateriales 50V50G y 50 50G (Fig.6c y 6d). Estos resultados ponen de manifiesto que dichos biomateriales no son biocompatibles con el sujeto dado que inducen una respuesta inflamatoria e inmune bastante potente en el sujeto que ha sido implantado con ellos. Analizando el área (mm2) de la cápsula fibrosa (FCT) obtenida en las muestras de los conejos analizados, no se observan diferencias significativas entre el biomaterial 35M35G30T y el 70M30T, mostrándose además que los valores de área de la cápsula fibrosa son muy reducidos para dichos biomateriales, mientras que para el caso de los biomateriales 50M50G y 50V50G los valores de área que muestran son muy altos respecto a los biomateriales 35M35G30T y el 70M30T (Fig. 7). Adicionalmente, y como se observa en dicha Fig. 7, existen diferencias estadísticamente significativas entre la cápsula fibrosa formada por los biomateriales 35M35G30T y el 70M30T respecto a la formada por los biomateriales 50M50G y 50V50G. Estos resultados in vivo ponen de manifiesto que, al contrario de lo observado en los experimentos in vitro, los recubrimientos con los biomateriales 50M50G y 50V50G demostraron no ser compatibles con el sujeto, mientras que los recubrimientos con los biomateriales 35M35G30T y el 70M30T, sí que mostraron resultados positivos en cuanto a compatibilidad. Estos resultados evidencian la mala correlación existente entre los resultados obtenidos in vitro vs in vivo para determinar la compatibilidad de un biomaterial en un sujeto.
Ejemplo 4. Determinación mediante análisis proteómico del perfil de biomarcadores que determinan la compatibilidad de biomateriales. Una vez demostrada la pobre correlación existente entre los resultados in vitro vs in vivo para determinar la compatibilidad de un biomaterial, se procedió a analizar las proteínas, particularmente el patrón peptídico, adherido en la superficie de los biomateriales cultivados in vitro en presencia de suero humano. Dado que la respuesta celular al contacto con el biomaterial depende de la primera capa de proteínas adsorbidas en éste, se pretende establecer una correlación entre el patrón de proteínas detectado y los resultados in vivo obtenidos.
El análisis proteómico revela una correlación entre la composición de la capa de proteínas adherida en los biomateriales o recubrimientos y su respuesta in vivo. Tras cultivar los discos de titanio con cada uno de los recubrimientos analizados en la presente invención en presencia de suero humano, y aislar los eluidos que comprenden los marcadores adheridos a cada disco (ver materiales y métodos), dichos eluidos se resolvieron en un gel de poliacrilamida al 10% para determinar las diferentes proteínas del suero que habían quedado adheridas a cada biomaterial. La elución de las proteínas obtenidas a partir de los cuatro recubrimientos 70M30T, 35M35G30T, 50M05G y 50V50G se analizó por LC-MS/MS, y se detectaron 171 proteínas diferentes. En base a los resultados obtenidos mediante LC-MS/MS, los materiales se clasificaron en dos grupos de acuerdo con los resultados obtenidos para cada uno de ellos en el modelo in vivo. El primero de los grupos comprende los biomateriales 70M30T y 35M35G30T, que de acuerdo con los resultados in vivo mostró una buena osteointegración o compatibilidad con el sujeto (resultado positivo), mientras que el segundo grupo está formado por los biomateriales 50M50G y 50V50G, que de acuerdo con los resultados in vivo da lugar a la formación de tejido conectivo fibroso alrededor de la zona del implante, por lo que dichos resultados muestran una mala compatibilidad de dichos biomateriales con el sujeto (resultado negativo) (Fig. 7). Para el tratamiento de datos obtenidos mediante LC-MS/MS se utilizó el software Progenesis Ql, con un análisis diferencial (n=4), con el fin de identificar cuáles de esas proteínas son predominantes de forma diferencial entre los distintos biomateriales. Además, se utilizó el "Datábase for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID)" para clasificar las proteínas en relación con sus funciones. La comparación entre los materiales70M30T y 35 35G30T, por un lado, y 50 50G y 50V50G por otro lado, muestra pequeñas diferencias en cuanto al perfil de proteínas adheridas a dichos biomateriales (Tablas 1 y 2). Sin embargo, cuando se comparan los biomateriales o recubrimientos que muestran diferentes resultados in vivo (70M30T y 50M50G, por un lado y 35M35G30T y 50M50G, por otro lado) se detecta un mayor número de proteínas que se observan diferencialmente y significativamente presentes en los biomateriales compatibles respecto a los no compatibles (Tablas 3 y 4).
Tabla 1. Análisis de la presencia de las proteínas estadísticamente predominantes (p<0.05) en los recubrimientos con los biomateriales compatibles 70 30T vs 35 35G30T (método Progenesis) según la presente invención.
C.S.: Puntuación de confianza. Las funciones de clasificación DAVID fueron: (1) respuesta inflamatoria inmune, (2) hidroxilación, (3) coagulación sanguínea, (4) regulación de la apoptosis, (5) unión de metales, (6) fosforilación, (7) unión de carbohidratos, (8) actividad peptidasa, (9) transporte de lípidos y (10) integridad del citoesqueleto.
La Tabla 1 muestra nueve proteínas que se han identificado y que aparecen diferencialmente presentes cuando son comparados los dos biomateriales con resultados positivos in vivo (35M35G30T y 70M30T). De las nueve proteínas identificadas anteriormente, se detectaron seis que mostraron una mayor presencia, estadísticamente significativa en el biomaterial o recubrimiento 35M35G30T, siendo la proteína MYH1 (17.19-veces) la más predominante, y relacionada con la integridad del citoesqueleto. También se encontraron proteínas relacionadas con el sistema inmune (C1QA y FCN2) o con la función de enlace de metales tal como la proteína HBA. Además, se encontraron otras tres proteínas, presentes en gran proporción en el recubrimiento 70M30T: la proteína CLUS que podría tener un papel protector frente al establecimiento de desórdenes inflamatorios crónicos, la FAXII que es capaz de desencadenar la coagulación y la APOA5 que está relacionada con el transporte de lípidos y con la función de unión a carbohidratos.
Por otro lado se llevó a cabo también un estudio comparativo de las proteínas adheridas en los biomateriales con respuesta negativa en el modelo in vivo (50 50G vs 50V50G). Los resultados se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2. Análisis de la presencia de las proteínas estadísticamente predominantes (p<0.05) en los recubrimientos con los biomateriales no compatibles 50M50G vs 50V50G (método Progenesis) según la presente invención.
Figure imgf000033_0001
Sólo tres proteínas fueron detectadas de forma predominante en los biomateriales 50M50G vs 50V50G. Aunque ambos biomateriales tienen composiciones químicas diferentes, presentan una composición del perfil proteico adherido al mismo muy similar. Las proteínas HORN y DSC1 están claramente más presentes en el biomaterial 50V50G, y ambas tienen la función de unión metálica, y la proteína LCN1, con actividad endopeptidasa, se encontraba más presente en biomaterial 50V50G.
Por otro lado, las proteínas detectadas en los biomateriales 70M30T y 35 35G30T (resultados positivos de compatibilidad in vivo) fueron comparadas con las proteínas detectadas en el biomaterial 50M50G (resultado negativo de compatibilidad in vivo). Se identificaron veinte proteínas séricas con presencia diferencial en estos biomateriales (Tabla 3).
Figure imgf000034_0001
Un grupo de quince proteínas se encontraron diferencialmente más absorbidas sobre la superficie del biomaterial 50M50G que en los materiales de respuesta positiva in vivo (70M30T y 35M35G30T). VTNC, APOE y KNG1 , tienen un papel en el metabolismo del hueso y podrían intervenir en el proceso de regeneración de dicho tejido. Además, VTNC podría estar implicada en la cascada de regulación del complemento. Sin embargo, algunas inmunoglobulinas y muchas proteínas relacionadas con el sistema inmune estaban también presentes. De hecho las proteínas CRP, SAMP, C1QB, C1QC, C07, C1S y C4BPA se clasificaron con la base de datos DAVID dentro del grupo relacionado con la respuesta inflamatoria aguda. Todas estas proteínas están implicadas en la activación de la cascada del complemento con la excepción de C4BPA, que es capaz de regular este proceso. Las queratinas, HORN y FILA2 se absorbieron más, diferencialmente, en los recubrimientos 70M30T y 35 35G30T que en 50M50G. Estas proteínas juegan un papel en la integridad del citoesqueleto y tienen actividad peptidasa.
Los resultados proteómicos de los biomateriales o recubrimientos 70M30T y 35 35G30T (resultado positivo de compatibilidad in vivo), se compararon con las proteínas adsorbidas y detectadas en el biomaterial o recubrimiento 50V50G (resultado negativo de compatibilidad in vivo). La Tabla 4 presenta las dieciséis proteínas que fueron identificadas con presencia diferencial, entre ellas quince estaban con mayor presencia en el biomaterial o recubrimiento 50V50G.
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Salvo la vitronectina (VTNC), todas las proteínas características del biomaterial o recubrimiento 50M50V están directamente implicadas en la respuesta inmune, pertenecen al grupo de proteínas DAVID relacionado con la respuesta inflamatoria aguda (CRP, C05, SAMP, C1QB, IC1, CFAH, C07, C1S, C03, C1R y C1QC). Se puede destacar, que la mayoría de las proteínas de este grupo están envueltas en la activación de la cascada del complemento, con la excepción de CFAH, que es una importante proteína reguladora/represora de la activación de la ruta alternativa del complemento. Con respecto a las proteínas más diferencialmente presentes sobre los biomateriales o recubrimientos de resultado positivo in vivo, la proteína SPB3 fue la única detectada. Dicha proteína SPB3 posee actividad endopeptidasa.
Hay que destacar que fue detectada una mayor presencia con diferencia significativa de las proteínas relacionadas con la respuesta inmune/inflamatoria adheridas a la superficie de los biomateriales 50V50G y 50M50G, comparando con los otros dos biomateriales, 70M30T y 35M35G30T.
La Tabla 5 muestra las proteínas que están adheridas de forma estadísticamente significativa al mismo tiempo en los biomateriales 50M50G y 50V50G (no compatibilidad mostrada en el modelo in vivo), respecto a los recubrimientos 35 35G30T y 70M30T (compatibilidad mostrada en el modelo in vivo).
Tabla 5. Proteínas adheridas diferencialmente al mismo tiempo en 50M50G y 50V50G con respecto a los recubrimientos sol-gel 35M35G30T y 50V50G (método Progenesis). ANOVA (p-valor < 0.05).
Figure imgf000037_0001
En la Tabla 5 se observan nueve proteínas, de las cuales seis de ellas están relacionadas con el sistema inmune. Estas proteínas del sistema inmune se identifican como CRP, SAMP, C1QB, C1QC, C1S, LAC2, KV402, VTNC y C07. Tal como se ha mencionado antes, todas ellas están implicadas en el proceso de respuesta inflamatoria aguda. Notablemente, CRP está particularmente más presente en los materiales de peor respuesta in vivo y su papel en la cascada del complemento es bien conocido, se trata de un activador de la ruta clásica.
Los resultados descritos hasta ahora establecen que las proteínas relacionadas con el proceso de la cascada del complemento activación/inhibición están diferencialmente más presentes en los biomateriales o recubrimientos 50M50G y 50V50G (de peor comportamiento in vivo). Aunque las proteínas con propiedades inhibidoras del complemento como la VTNC, están predominantemente adheridas en los recubrimientos 50M50G y 50V50G, ambos inducen la formación de un tejido conectivo o fibroso denso cuando se ensayan in vivo. La explicación a esta cuestión podría estar relacionada con la relación de proteínas inhibidoras/ activadoras presentes en cada superficie. Así, en la Tabla 6 se pueden ver como los biomateriales 70M30T y 35M35G30T, muestran una mayor proporción de las proteínas inhibidoras del complemento con respecto a otros biomateriales.
Tabla 6. Relación (ratio) de biomarcadores inhibidores/activadores del sistema del complemento detectadas y adheridas en los biomateriales 70M30T, 35M35G30T, 50 50G y 50V50G.
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La Tabla 6 muestra las relaciones de proteínas inhibitorias del sistema inmune absorbidas (C4BPA, CFAH y VTNC) y las proteínas activadoras absorbidas (CRP y SAMP), seleccionadas por estar más diferencialmente adheridas en los diferentes materiales. Se puede ver que los biomateriales 70M30T y 35M35G30T muestran los mayores valores de los ratio proteínas inhibidoras del complemento absorbidas vs proteínas activadoras del complemento, comparando con los otros biomateriales con mal comportamiento in vivo. Como conclusión, los resultados mostrados en la presente invención ponen de manifiesto la existencia de un perfil peptídico específico y concreto de proteínas que quedan adheridas al biomaterial analizado una vez éste previamente se ha puesto en contacto con una muestra de suero de un sujeto, dónde la identificación y cuantificación de dicho patrón peptídico es capaz de determinar la compatibilidad de dicho biomaterial in vivo.

Claims

REIVINDICACIONES 1 . Método in vitro para predecir y/o pronosticar la compatibilidad de un biomaterial en una muestra biológica aislada obtenida de un sujeto, que comprende las siguientes etapas:
a. Incubar el biomaterial con la muestra biológica aislada,
b. Determinar y cuantificar la presencia conjunta de los marcadores adheridos al biomaterial que se seleccionan de la lista que consiste en: proteína C reactiva (CRP), componente amiloide P sérico (SAMP), subunidad C del subcomponente C1q del complemento (C1QC), subunidad B del subcomponente C1q del complemento (C1QB), componente C7 del complemento (C07), subcomponente C1 s del complemento (C1 S), vitronectina (VTN), inmunoglobulina Lambda-2 región cadena C (LAC2) e inmunoglobulina Kappa variable 4-1 (KV402).
c. Comparar el valor obtenido en la etapa (b) con un valor de referencia obtenido de un biomaterial de referencia,
en donde un valor de al menos dos veces superior para cada uno de los marcadores respecto al valor de referencia obtenido para el biomaterial de referencia, es indicativo de que el biomaterial no es compatible con el sujeto.
2. El método según la reivindicación 1 donde el marcador CRP comprende la SEQ ID NO: 1 , el marcador SAMP comprende la SEQ ID NO: 2, el marcador C1QC comprende la SEQ ID NO: 3, el marcador C1QB comprende la SEQ ID NO: 4, el marcador C07 comprende la SEQ ID NO: 5, el marcador C1S comprende la SEQ ID NO: 6, el marcador VTN comprende la SEQ ID NO: 7, el marcador LAC2 comprende la SEQ ID NO: 8 y el marcador KV402 comprende la SEQ ID NO: 9.
3. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde la etapa b) comprende además la determinación y cuantificación de al menos uno de los marcadores seleccionados de la lista que consiste en: cadena alfa de la proteína de unión a C4b (C4BPA), kininógeno-1 (KNG1), complemento C5 (C05), inhibidor de la proteasa plasmática C1 (IC1 ), factor H del complemento (CFAH), componente C3 del complemento (C03), subcomponente C1 r del complemento (C1 R), ficolina-2, Lectina de unión a mañosa serin proteasa 1 (MASP-1), y/o cualquier combinación de los mismos.
4. El método según la reivindicación 3 donde el marcador C4BPA comprende la SEQ ID NO: 10, el marcador KNG1 comprende la SEQ ID NO: 11 , el marcador C05 comprende la SEQ ID NO: 12, el marcador IC1 comprende la SEQ ID NO: 13, el marcador CFAH comprende la SEQ ID NO: 14, el marcador C03 comprende la SEQ ID NO: 15, el marcador C1 R comprende la SEQ ID NO: 16, el marcador Ficolina-2 comprende la SEQ ID NO: 17 y el marcador MASP-1 comprende la SEQ ID NO: 18.
5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado por que comprende la determinación y cuantificación del conjunto de marcadores seleccionados de la lista que consiste en CRP que comprende la SEQ ID NO: 1 , SA P que comprende la SEQ ID NO: 2, C1 QC que comprende la SEQ ID NO: 3, C1 QB que comprende la SEQ ID NO: 4, C07 que comprende la SEQ ID NO: 5, C1 S que comprende la SEQ ID NO: 6, VTN que comprende la SEQ ID NO: 7, LAC2 que comprende la SEQ ID NO: 8, KV402 que comprende la SEQ ID NO: 9, C4BPA que comprende la SEQ ID NO: 10, KNG1 que comprende la SEQ ID NO: 1 1 , C05 que comprende la SEQ ID NO: 12, IC1 que comprende la SEQ ID NO: 13, CFAH que comprende la SEQ ID NO: 14, C03 que comprende la SEQ ID NO: 15, C1 R que comprende la SEQ ID NO: 16, Ficolina-2 que comprende la SEQ ID NO: 17 y MASP-1 que comprende la SEQ ID NO: 18.
6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la etapa (b) se lleva a cabo mediante cualquiera de las metodologías seleccionadas del grupo que comprende: espectroscopia de masas, inmunohistoquímica, ELISA y sus variantes, inmunofluorescencia, inmunocitoquímica e inmunoprecipitación.
7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde la etapa (b) se lleva a cabo mediante ELISA.
8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde la muestra biológica aislada se selecciona de la lista que consiste en: sangre, suero y plasma sanguíneo.
9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la muestra biológica aislada es suero.
10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde el sujeto es un mamífero.
11. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde el sujeto es un humano.
12. Uso in vitro de la determinación y cuantificación de la presencia conjunta de los marcadores que se seleccionan de la lista que consiste en: CRP, SAMP, C1 QC, C1 QB, C07, C1 S, VTN, LAC2 y KV402. para predecir y/o pronosticar la compatibilidad de un biomaterial médico en una muestra biológica aislada obtenida de un sujeto.
13. Uso in vitro según la reivindicación 12 donde el marcador CRP comprende la SEQ ID NO: 1 , el marcador SAMP comprende la SEQ ID NO: 2, el marcador C1QC comprende la SEQ ID NO: 3, el marcador C1QB comprende la SEQ ID NO: 4, el marcador C07 comprende la SEQ ID NO: 5, el marcador C1S comprende la SEQ ID NO: 6, el marcador VTN comprende la SEQ ID NO: 7, el marcador LAC2 comprende la SEQ ID NO: 8 y el marcador KV402 comprende la SEQ ID NO: 9.
14. Uso in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 13 que además comprende la determinación y cuantificación de la presencia de al menos un marcador seleccionado de la lista que consiste en: C4BPA, KNG1 , C05, IC1 , CFAH, 03, C1 R, Ficolina-2, MASP-1 y/o cualquier combinación de los mismos.
15. Uso in vitro según la reivindicación 14 donde el marcador C4BPA comprende la SEQ ID NO: 10, el marcador KNG1 comprende la SEQ ID NO: 1 1 , el marcador C05 comprende la SEQ ID NO: 12, el marcador IC1 comprende la SEQ ID NO: 13, el marcador CFAH comprende la SEQ ID NO: 14, el marcador C03 comprende la SEQ ID NO: 15, el marcador C1 R comprende la SEQ ID NO: 16, el marcador Ficolina-2 comprende la SEQ ID NO: 17 y el marcador MASP-1 comprende la SEQ ID NO: 18.
16. Uso in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 caracterizado por que comprende la determinación de la presencia conjunta de los marcadores seleccionados de la lista que consiste en: CRP que comprende la SEQ ID NO: 1 , SAMP que comprende la SEQ ID NO: 2, C1 QC que comprende la SEQ ID NO: 3, C1 QB que comprende la SEQ ID NO: 4, C07 que comprende la SEQ ID NO: 5, C1 S que comprende la SEQ ID NO: 6, VTN que comprende la SEQ ID NO: 7, LAC2 que comprende la SEQ ID NO: 8, KV402 que comprende la SEQ ID NO: 9, C4BPA que comprende la SEQ ID NO: 10, KNG1 que comprende la SEQ ID NO: 1 1 , C05 que comprende la SEQ ID NO: 12, IC1 que comprende la SEQ ID NO: 13, CFAH que comprende la SEQ ID NO: 14, C03 que comprende la SEQ ID NO: 15, C1 R que comprende la SEQ ID NO: 16, Ficolina-2 que comprende la SEQ ID NO: 17 y MASP-1 que comprende la SEQ ID NO: 18.
17. Uso in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16 donde la muestra biológica aislada se selecciona de la lista que consiste en: sangre, suero y plasma sanguíneo.
18. Uso in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, donde la muestra biológica aislada es suero.
19. Uso in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 18, donde el sujeto es un mamífero.
20. Uso in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 19, donde el sujeto es un humano.
21. Kit para predecir y/o pronosticar la compatibilidad de un biomaterial que comprende los anticuerpos, los reactivos, o cualquier combinación de los anteriores, capaces de detectar y cuantificar la presencia de los marcadores que se seleccionan de la lista que consiste en: CRP, SAMP, C1 QC, C1QB, C07, C1S, VTN, LAC2 y KV402.
22. Kit según la reivindicación 21 caracterizado por que el marcador CRP comprende la SEQ ID NO: 1 , el marcador SAMP comprende la SEQ ID NO: 2, el marcador C1 QC comprende la SEQ ID NO: 3, el marcador C1QB comprende la SEQ ID NO: 4, el marcador C07 comprende la SEQ ID NO: 5, el marcador C1 S comprende la SEQ ID NO: 6, el marcador VTN comprende la SEQ ID NO: 7, el marcador LAC2 comprende la SEQ ID NO: 8 y el marcador KV402 comprende la SEQ ID NO: 9.
23. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 22 caracterizado por que además comprende los anticuerpos, los reactivos, o cualquier combinación de los anteriores, capaces de detectar y cuantificar la presencia de al menos uno de los marcadores seleccionados de la lista que consiste en: C4BPA, KNG1 , C05, IC1 , CFAH, C03, C1 R, Ficolian-2, MASP-1 , y/o cualquier combinación de los mismos.
24. Kit según la reivindicación 23 donde el marcador C4BPA comprende la SEQ ID NO: 10, el marcador KNG1 comprende la SEQ ID NO: 11 , el marcador C05 comprende la SEQ ID NO: 12, el marcador IC1 comprende la SEQ ID NO: 13, el marcador CFAH comprende la SEQ ID NO: 14, el marcador C03 comprende la SEQ ID NO: 15, el marcador C1 R comprende la SEQ ID NO: 16, el marcador Ficolina-2 comprende la SEQ ID NO: 17 y el marcador MASP-1 comprende la SEQ ID NO: 18.
25. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24 caracterizado por que comprende los anticuerpos, los reactivos, o cualquier combinación de los anteriores, capaces de detectar y cuantificar la presencia conjunta de los marcadores que se selecciona de la lista que consiste en: CRP que comprende la SEQ ID NO: 1 , SAMP que comprende la SEQ ID NO: 2, C1 QC que comprende la SEQ ID NO: 3, C1QB que comprende la SEQ ID NO: 4, C07 que comprende la SEQ ID NO: 5, C1S que comprende la SEQ ID NO: 6, VTN que comprende la SEQ ID NO: 7, LAC2 que comprende la SEQ ID NO: 8, KV402 que comprende la SEQ ID NO: 9, C4BPA que comprende la SEQ ID NO: 10, KNG1 que comprende la SEQ ID NO: 11 , C05 que comprende la SEQ ID NO: 12, IC1 que comprende la SEQ ID NO: 13, CFAH que comprende la SEQ ID NO: 14, C03 que comprende la SEQ ID NO: 15, C1 R que comprende la SEQ ID NO: 16, Ficolina-2 que comprende la SEQ ID NO: 17 y MASP-1 que comprende la SEQ ID NO: 18.
26. Uso in vitro del kit según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25 para predecir y/o pronosticar la compatibilidad de un biomaterial en contacto con una muestra biológica aislada de un sujeto.
27. Uso in vitro según la reivindicación 26 donde la muestra biológica aislada se selecciona de la lista que consiste en: sangre, suero y plasma sanguíneo.
28. Uso según la reivindicación 27, donde la muestra biológica aislada es suero.
29. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, donde el sujeto es un mamífero.
30. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 2, donde el sujeto es un humano.
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