ES2402457B2 - Procedimiento para el diagnóstico de derrame pleural maligno mediante la determinación de la concentración de calprotectina en líquido pleural. - Google Patents

Procedimiento para el diagnóstico de derrame pleural maligno mediante la determinación de la concentración de calprotectina en líquido pleural. Download PDF

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Abstract

La presente invención se refiere al desarrollo y puesta a punto de un procedimiento utilizable para el diagnóstico del derrame pleural maligno, que permita distinguir a aquellos pacientes que presentan derrame pleural derivado de patologías de origen oncológico, de aquellos que sufren derrame pleural cuyo origen no es maligno.

Description

PROCEDIMIENTO PARA EL DIAGNÓSTICO DE DERRAME PLEURAL MALIGNO MEDIANTE LA DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE CALPROTECTINA EN LÍQUIDO PLEURAL
5 1O
La aparición de un derrame pleural de origen maligno es siempre la expresión de una enfermedad avanzada, y el augurio de un mal pronóstico. De ahí que el retraso en el diagnóstico suponga un importante perjuicio para estos pacientes, puesto que normalmente su esperanza de vida es muy baja. Por lo tanto, la capacidad de discriminar rápida y correctamente si el DP es o no maligno sería muy útil tanto para el pronóstico como para el manejo clínico del enfermo. La presente invención se refiere al desarrollo y puesta a punto de un procedimiento utilizable para el diagnóstico del derrame pleural maligno, que permita distinguir a aquellos pacientes con derrame pleural de origen oncológico de aquellos que sufren derrame pleural cuyo origen no es maligno.
SECTOR DE LA TÉCNICA
15
El sector de la técnica al que se refiere la invención se incluye dentro del ámbito sanitario, más concretamente en el área de la oncología clínica.
ESTADO DE LA TÉCNICA
20 25
La patología pleural es muy prevalente, estimándose que afecta a más de 3 mil personas por millón de habitantes/año, y representa el 4-1 O % de las afecciones respiratorias (1). Son múltiples las patologías que pueden afectar a la pleura, siendo las enfermedades cardiovasculares la causa más frecuente de derrame pleural (DP), seguidas del DP infeccioso (paraneumónico y tuberculoso), el neoplásico y el secundario a tromboembolismo pulmonar. Aunque se pueden producir por cualquier tipo de neoplasias, los tumores que con mayor frecuencia producen DP son el carcinoma pulmonar, que supone un tercio de todos los derrames pleurales malignos, el carcinoma de mama y los linfomas (2-3).
El diagnóstico del derrame pleural es un proceso sumamente complejo que incluye diferentes etapas y que los expertos organizan en forma de algoritmo para su
mejor seguimiento (4). Además, generalmente es preciso recurrir a la utilización de
métodos invasivos. Centrándonos en el diagnóstico de malignidad del derrame, el
examen citológico del líquido pleural (LP) es actualmente la forma menos invasiva,
rápida y eficaz para establecerlo. Sin embargo, este método presenta una baja
5
sensibilidad de modo que habitualmente un buen número de pacientes presentan un
diagnóstico dudoso. El porcentaje de DP malignos que se diagnostican mediante
citología oscila entre el 40 y el 87% (siendo la media del 60%). Debido a esta baja
sensibilidad, para confirmar la afectación tumoral de la superficie pleural se hace
necesario el empleo de técnicas más invasivas como la biopsia pleural cerrada o la
1 O
biopsia por toracoscopia (2-7).
Los métodos no invasivos que existen actualmente se basan en la
determinación de los niveles de marcadores en el fluido pleural. En este sentido,
existen numerosos trabajos en los que se estudian diversos marcadores como: CEA,
CA-125, CA-19-9, CYFRA 21-1, Enolasa, la oncoproteina HER-2/neu, etc., que han
15
sido testados a lo largo de los años en pacientes con derrame pleural maligno (8-20).
Por otro lado, en los últimos años se han analizado ~umerosos procedimientos para
intentar mejorar el diagnóstico diferencial de los derrames pleurales incluyendo
técnicas de inmunocitoquímica, análisis cromosómico, técnicas de cultivo de tejidos,
técnicas de citometría, técnicas de imágenes celulares combinadas con
20
inmunocitotoquímica, etc. Sin embargo, la mayoría de estas pruebas no se utilizan en
la práctica clínica debido a su baja sensibilidad y especificidad.
Es de gran interés clínico, por tanto, encontrar buenos marcadores que
permitan el diagnóstico claro y certero, mediante métodos no invasivos y sencillos, de
enfermos con derrame pleural maligno distinguiéndolos de enfermos con derrame
25
pleural de procedencia no maligna. De este modo, se evitaría, por un lado, el retraso
en la aplicación del tratamiento adecuado y, por otro lado, se obviaría la aplicación de
técnicas agresivas en pacientes de diagnóstico dudoso.
El objeto de la presente invención es por lo tanto definir el empleo de la
proteína calprotectina en el fluido pleural como método para diagnosticar pacientes
30
que presentan derrame pleural de origen maligno, diferenciándolos de aquellos
pacientes que tienen derrame pleural benigno.
La elección de esta proteína se basa en resultados previos de nuestro grupo de
5
investigación obtenidos en estudios de proteómica realizados en líquido pleural (21). En ese trabajo se comparó el proteoma (separado mediante electroforesis bidimensional) del derrame pleural de pacientes con tuberculosis y el de pacientes con derrame pleural de origen maligno ( adenocarcinoma de pulmón). Tras el análisis de la expresión de las proteínas en uno y otro caso se observó que la proteína calprotectina se expresaba en cantidades mucho más bajas en los pacientes con cáncer.
1 O
No existen en la literatura trabajos en los que se compare el nivel de expresión de calprotectina entre derrames benignos y malignos, por lo que el método de diagnóstico que se propone, basado en la determinación de los niveles de calprotectina, es completamente novedoso.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
15
La presente invención pretende proteger la utilización de la medida de concentración en líquido pleural de la proteína calprotectina como método para distinguir derrames pleurales de origen maligno de aquellos de origen benigno, empleando para ello una metodología específica. Que ayudará y orientará al clínico acerca del diagnóstico de los pacientes.
20 25
En este procedimiento se utiliza una técnica sencilla, rápida, fiable y económica que consiste en la determinación mediante el método ELISA de tipo sándwich, de la concentración de la proteína calprotectina en el fluido pleural de pacientes que han sufrido un derrame pleural. Por otro lado, el reducido coste económico de este procedimiento y la facilidad de su adquisición, realización e implantación aseguran su utilización en la rutina clínica. Además, la realización de esta prueba tan solo implica la extracción de una pequeña muestra de líquido pleural durante una revisión.
30
Hay que considerar que este procedimiento ayudaría a reducir el gasto sanitario al permitir preseleccionar a los potenciales pacientes oncológicos y evitar así la aplicación generalizada y masiva de pruebas más costosas y traumáticas. Además, la rapidez en el diagnóstico del DPM redundaría en una mayor supervivencia de los pacientes.
5
Durante la valoración de los niveles de calprotectina de los pacientes analizados, los inventores del procedimiento objeto de esta patente, hemos demostrado que las concentraciones de calprotectina son diferentes en pacientes con derrame pleural derivado de patologías malignas que en aquellos que presentaban derrame pleural originado por patologías benignas. Los pacientes que presentaban derrame pleural derivado de patologías benignas presentaban concentraciones de calprotectina superiores a los detectados en patologías malignas (Benignas 2.627,1 ± 2.182,1 ng/mL vs Malignos 257,2 ± 134,4 ng/mL).
1O
De acuerdo con lo anterior, la información obtenida con la valoración de la calprotectina permite determinar el diagnóstico de cada paciente, disminuyendo se los gastos sanitarios. Además, el reducido coste económico de este procedimiento junto con su fácil realización avala su viabilidad.
DESCRIPCIÓN DE UN MODO DE REALIZACIÓN
15 20
El procedimiento consiste en la determinación de la concentración de la proteína calprotectina en pacientes con derrame pleural, atendidos y diagnosticados desde abril de 2007 hasta diciembre de 2010, en el Servicio de Bronconeumología del Complejo Hospitalario Universitario de Vigo (CHUVI). La determinación de la etiología del derrame pleural se basó en los criterios descritos por la Sociedad Española de Neumología y Cirugía Torácica (7) y la British Thoracic Society, en su guía de 2010 (6).
El procedimiento que proponemos comienza con la obtención de 1 O mL de fluido pleural de pacientes diagnosticados de derrame pleural. En función de ese diagnóstico los pacientes se dividieron en dos grupos:
25
pacientes con derrame pleural de origen maligno (DPM). De los cuales teníamos un grupo heterogéneo de pacientes que padecían cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de mama, mesotelioma, cáncer microcítico, linfoma, adenocarcinoma gástrico, carcinoma ovárico, neoplasia epitelial de origen tímico, y colangiocarcinoma.
pacientes con derrame pleural de origen benigno (DPB). De los cuales
teníamos también un grupo heterogéneo compuesto por pacientes que
presentaban derrame de tipo tuberculoso, derrame de tipo neumóníco, derrame
de tipo idiopático, derrame reactivo, y derrame de diversos orígenes.
5
Para medir la concentración de calprotectina, el fluido pleural obtenido
mediante toracocentesis (extracción de una cantidad variable de líquido pleural) en
cada paciente, fue centrifugado a 800g durante 15 min y congelado en alícuotas a -
20°C hasta su utilización. La concentración de calprotectina se midió en muestras de
fluido pleural convenientemente diluido y empleando un kit comercial de
1 O
inmunoensayo ELISA tipo sándwich de la casa HyCult Biotechnology (U den, The
Netherlands), que proporciona placas de 96 pocillos con un anticuerpo específico anti
calprotectina fijado a los pocillos y todos los reactivos necesarios.
Siguiendo el protocolo descrito por la casa comercial, las muestras de fluido
pleural y los patrones se diluyen en Assay diluent. 100 J.!L de muestra diluida se
15
añaden a los pocillos y se incuban a temperatura ambiente durante 1h. Esto permite
que la calprotectina presente en la muestra se una a su anticuerpo específico. A
continuación, los pocillos se lavan aplicando 200 J.!L de Wash buffer en cada uno de
ellos, repitiendo el proceso de lavado 3 veces. Posteriormente, se añaden 100 J.!L de
otro anticuerpo que reconoce la proteína calprotectina y que está marcado con biotina,
20
dejando un tiempo de incubación de 1h para que se efectúe la unión. Al igual que en el
paso anterior, después de la incubación se lavan los pocillos 3 veces con 200 J.!L de
Wash buffer. Posteriormente, se añaden 100 J.!L de estreptavidina conjugada con
peroxidasa y se incuban durante 1h, para permitir la formación del complejo biotina
estreptavidina, realizando seguidamente 4 lavados con 200 J.!L de Wash buffer.
25
Finalmente, se añaden 100 J.!L del sustrato de la enzima peroxidasa para producir la
aparición de un producto coloreado. La reacción se incuba 25 minutos a temperatura
ambiente y se para mediante la adición de Stop solution, midiendo la absorbancia a
450 nm en un lector de placas de ELISA.
Para calcular la concentración de calprotectina en cada muestra se elabora una
30
curva patrón con los datos de absorbancia obtenidos de los patrones de
concentraciones conocidas de calprotectina.
En nuestro estudio, la concentración en pacientes con DPM expresada como
5
media ± desviación estándar fue de 257,2 ± 134,4 ng/mL, mientras que en pacientes con DPB fue de 2.627,1 ± 2.182,1 ng/mL. Por lo tanto, se observa una disminución en los niveles de calprotectina en pacientes con DPM. La diferencia observada entre la concentración en DPM y DPB es estadísticamente significativa (p=O,OOO) aplicando a los datos el test de la U de Mann-Whitney.
1O
Con los datos obtenidos se elaboró una curva ROC (Receiving Operating Curve) y se determinó la sensibilidad de la prueba, definida como la capacidad para identificar correctamente a aquellos pacientes que presentan la patología, y la especificidad, definida como la capacidad de la prueba para identificar correctamente a aquellos que no presentan la patología (22). En nuestro estudio, utilizando como punto de corte 736,4 ng/mL de calprotectina, todos los pacientes con DPM tenían una concentración igual o inferior de calprotectina medida en derrame pleural (es decir, sensibilidad del100%), siendo la especificidad del 83,15 %.
15
Como el interés de la prueba es diagnosticar a los pacientes con DPM y en estos se había observado una disminución de los niveles de calprotectina, consideramos que la prueba es positiva cuando los niveles de calprotectina sean iguales o inferiores al punto de corte elegido y la prueba será negativa cuando la concentración sea superior a dicho punto de corte.
20
Por lo tanto, si consideramos un grupo de pacientes con DP de origen desconocido y se determina la concentración de calprotectina en el fluido pleural, se puede decir:
25
-Que de los pacientes que den un resultado positivo en la prueba se diagnosticarían correctamente el 100% de los pacientes con DP. No obstante, un 16,85 % de sujetos con DP no maligno se clasificarían también dentro de este grupo (falsos positivos).
-Cuando la prueba resulte negativa (es decir, cuando se obtenga una concentración de calprotectina superior al punto de corte), querrá decir que todos esos pacientes no padecen una enfermedad oncológica (verdaderos
negativos) y que el DP que sufren tiene origen en una enfermedad de tipo benigno, por lo que se pueden evitar pruebas agresivas para su confirmación.
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15

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1) Procedimiento para el diagnóstico de derrame pleural maligno mediante la determinación de la concentración de calprotectina en líquido pleural que comprende los siguientes pasos: a) Obtención de muestras de 1 OmL de fluido pleural de pacientes diagnosticados de derrame pleural, centrifugación de la muestra a 800g durante 15 min y posterior congelación en alícuotas a -20°C hasta su utilización. b) Determinación de la concentración de calprotectina empleando el ensayo ELISA tipo sándwich de la casa HyCult Biotechnology y 100 J.l.L de muestra diluida, siguiendo el protocolo descrito por la casa comercial. e) Comparación de la concentración de
    1O calprotectina obtenida para cada una de las muestras para así poder realizar el diagnóstico de los pacientes en función de los parámetros descritos en esta patente (punto de corte para pacientes malignos :S 736,4 ng/mL).
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