ES2841739T3 - Método para la determinación selectiva del factor de crecimiento placental 2 - Google Patents

Abstract

Un metodo para el diagnostico y/o pronostico de preeclampsia, o el riesgo de parto de un recien nacido pequeno para la edad gestacional y/o para el diagnostico del riesgo de parto de un nino con aneuploidia en una mujer embarazada o feto por nacer de dicho sujeto, que comprende (i) determinar el nivel del factor de crecimiento placentario 2 (P1GF-2) en una muestra de un fluido corporal del sujeto, (ii) comparar el nivel determinado en la muestra con un nivel de control derivado de sujetos sin preeclampsia, o el riesgo de parto de un recien nacido pequeno para la edad gestacional, o el riesgo de parto de un nino con aneuploidia; en el que un nivel disminuido en la muestra del sujeto en comparacion con el nivel de control es indicativo de preeclampsia, mayor riesgo de adquirir preeclampsia, mayor riesgo de agravamiento de la preeclampsia, mayor riesgo de parto de un neonato pequeno para la edad gestacional, mayor riesgo de agravamiento del riesgo de parto de un neonato pequeno para la edad gestacional, mayor riesgo de parto de un nino con aneuploidia y/o mayor riesgo de agravamiento del riesgo de parto de un nino con aneuploidia.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para la determinación selectiva del factor de crecimiento placental 2

La presente divulgación está en el campo del diagnóstico clínico. Particularmente, la presente divulgación se refiere a la determinación del nivel de factor de crecimiento placentario 2 (P1GF-2) o fragmentos del mismo en una muestra derivada de un fluido corporal de un paciente.

Al menos 130 millones de mujeres dan a luz cada año en todo el mundo. Aproximadamente el 15 % de ellas experimenta una complicación o enfermedad relacionada con el embarazo. Por ejemplo, la preeclampsia ocurre hasta en el 5 % de todos los embarazos, en el 10 % de los primeros embarazos y en el 20-25 % de las mujeres con antecedentes de hipertensión crónica. Los trastornos hipertensivos en el embarazo pueden provocar morbilidad materna y fetal y siguen siendo una de las principales fuentes de mortalidad materna.

En muchos países, los métodos de cribado para determinar el riesgo de complicaciones prenatales y/o anomalías fetales se han convertido en una rutina para ayudar a tratar y asesorar a las mujeres embarazadas. Por ejemplo, en Europa, los proveedores de atención médica suelen detectar anomalías cromosómicas en el feto utilizando marcadores bioquímicos presentes en la sangre materna. Se ha demostrado que la combinación de la edad materna, los marcadores serológicos proteína A plasmática asociada al embarazo (PAPP-A) y gonadotropina coriónica humana beta libre (beta-hCG) y el marcador de ultrasonido translucidez nucal (NT) del espesor funcionan en la semana 11 - 13 con una tasa de detección del síndrome de Down de aproximadamente 82 a 90 % para una tasa de falsos positivos del 5 % (Malone y otros 2005. NEJM 353 (19): 2001-2010; Bindra y otros 2002. Ultrasound Obstet Gynecol 20: 219-225). Este cribado es útil para identificar a las mujeres que tienen un riesgo suficientemente alto como para justificar más pruebas de diagnóstico, que pueden ser invasivas y conllevar un riesgo para el feto. Sin embargo, este cribado aún no detecta un número significativo de casos de síndrome de Down y otros embarazos que se afectan por aneuploidía y los diagnósticos siguen siendo falsos positivos en un 5 %.

Actualmente, no se han adoptado exámenes de rutina para la detección temprana de preeclampsia utilizando muestras maternas. La búsqueda de biomarcadores no invasivos que puedan predecir el desarrollo o ayudar en la detección de este trastorno del embarazo que amenaza la vida sigue siendo de suma importancia. Si el desarrollo de la preeclampsia se pudiera detectar antes, en muchos casos podrían ser posibles mejores resultados, incluida la reducción de la gravedad e incluso la recuperación. Durante el embarazo, en una etapa temprana o tardía, un método confiable de evaluación del riesgo para desarrollar preeclampsia o la evaluación de la presencia de preeclampsia disminuiría el potencial de resultados negativos para la salud de la mujer embarazada, el bebé o ambos.

Desde hace muchos años se han investigado diferentes marcadores biofísicos y bioquímicos, en base a observaciones fisiopatológicas que se han observado en caso de preeclampsia, como disfunción placentaria, respuesta inflamatoria generalizada, disfunción endotelial y activación del sistema de coagulación (Grill y otros 2009). Reproductive Biology and Endocrinology 7:70). Una técnica de imagen más utilizada para predecir la preeclampsia ha sido la ecografía Doppler uteroplacentaria. La perfusión placentaria alterada se puede evaluar midiendo las proporciones de la forma de onda del flujo o detectando una muesca diastólica de los vasos arqueados uterinos. Sin embargo, se demostró que, tanto en los grupos de pacientes de bajo como de alto riesgo, el valor predictivo no era lo suficientemente alto como para recomendar el cribado de rutina (Conde-Agudelo y otros 2004. Obstet Gynecol 104: 1367-1391).

Actualmente, se reconoce que muchos marcadores biológicos presentes en las muestras maternas están asociados con la preeclampsia. Estos marcadores potenciales incluyen factores angiogénicos (por ejemplo, factor de crecimiento placentario (PlGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), tirosina quinasa 1 similar a aletas solubles (sFlt-1)), endoglina soluble (sEng), selectina-P, ADN fetal libre de células, ADAM12, proteína placentaria 13 (PP-13), Pentraxina 3 (PTX3) y proteína plasmática A asociada al embarazo (PAPP-A) (Grill y otros 2009. Reproductive Biology and Endocrinology 7:70). Actualmente, se sugiere el uso del factor de crecimiento placentario (PlGF) para evaluar el riesgo de que una mujer embarazada desarrolle preeclampsia (Akolekar y otros 2008. Ultrasound Obstet Gynecol 32: 732-739). Aunque PlGF ha recibido cierta aceptación como marcador confiable de preeclampsia, se desea tener marcadores alternativos y adicionales que se caracterizan por una mayor especificidad, sensibilidad y poder predictivo.

Por tanto, existe la necesidad de métodos de cribado precisos para las complicaciones prenatales y/o anomalías fetales.

El factor de crecimiento placentario (PlGF), una glicoproteína angiogénica que es homóloga al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), existe en humanos en al menos cuatro isoformas debido al empalme alternativo de ARNm de la transcripción primaria de PlGF (De Falco, 2012. Exp Mol Med 44: 1 - 9). Estas isoformas se denominan PlGF-1, PlGF-2, PlGF-3 y PlGF-4. El término "PlGF" no discrimina entre las diversas isoformas. La principal diferencia entre las cuatro isoformas es que PlGF-1 y 3 no se unen a heparina y pueden afectar potencialmente a los objetivos de forma paracrina, mientras que PlGF-2 y 4 tienen dominios de unión a heparina adicionales y lo más probable es que funcionen de forma autocrina. Se cree que las principales isoformas son PlGF-1 y PlGF-2. PlGF-1 (SEQ ID NO: 2) contiene 131 aminoácidos (PM = monómero 14,7 kDa, dímero 29,4 kDa). PlGF-2 (SEQ ID NO: 3) comprende la secuencia PlGF-1 y adicionalmente una inserción en el sitio de unión de heparina de 21 aminoácidos (PM = monómero 17,3 kDa, dímero 34,6 kDa). La longitud de la proteína PlGF-2 completa es por tanto de 152 aminoácidos. PlGF-3 (SEQ ID NO: 4) contiene a PlGF-1 y una inserción de 72 aminoácidos cerca del extremo C-terminal (PM = monómero 22,8 kDa, dímero 45,6 kDa). Por tanto, la longitud de la proteína PlGF-3 completa es de 203 aminoácidos. PlGF-4 (SEQ ID NO: 5) contiene a PlGF-3 y la inserción del sitio de unión de heparina de 21 aminoácidos (PM = monómero 26,2 kDa, dímero 52,4 kDa). La longitud del PlGF-4 completa es por tanto de 224 aminoácidos.

PlGF es un regulador crítico de la angiogénesis en diversas condiciones fisiológicas y patológicas. Los mecanismos moleculares exactos por los cuales las diferentes isoformas de PlGF regulan la formación de vasos sanguíneos aún no se comprenden completamente (Fischer y otros 2008. Nat Rev Cancer 8: 942-956). Se ha informado que las respuestas angiogénicas que se inducen por las diversas formas de PlGF son distintas (Hoffmann y otros 2013. J Biol Chem 288: 17976-17989). Se ha demostrado que PlGF-2 pero no PlGF-1 se une específicamente a la heparina a través de un dominio de unión a heparina y esta interacción es crítica para la migración celular, el crecimiento de vasos y la brotación vascular.

En el embarazo, PlGF está implicado en el desarrollo placentario y varios estudios han informado que una concentración de PlGF en suero materno a las 11 0 - 13 6 semanas de gestación se reduce en embarazos con trisomías fetales 21 (síndrome de Down), 18 (síndrome de Edwards) y 13 (síndrome de Patau), en los que posteriormente desarrollan preeclampsia y en los que dan a luz a neonatos pequeños para la edad gestacional (PEG) (Levine y otros 2004. NE^j M 350: 672-683; Zaragoza y otros 2009. Ultrasound Obstet Gynecol 33: 382-386; Pandya y otros 2012. Fetal Diagn Ther 31: 87-93; Akolekar y otros 2008. Ultrasound Obstet Gynecol 32: 732-739; Poon y otros 2008. Prenat Diagn 28: 1110-1115). En todos estos estudios, la principal isoforma medida fue PlGF-1. No hay estudios que informen sobre la concentración sérica materna de PlGF-2 en embarazos normales o patológicos. No se sabe nada acerca de la concentración absoluta de la isoforma PlGF-2 circulante en sangre humana y su relevancia para el diagnóstico de aneuploidía fetal, preeclampsia y PEG en mujeres embarazadas. El documento WO 2010/059952 A1 informa un nivel aumentado de PlGF-2 en muestras de pacientes con preeclampsia en relación con las muestras de control.

Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que el nivel de PlGF-2 disminuye en muestras de sujetos con un trastorno prenatal. Descubrieron que la medición del nivel de la isoforma específica de PlGF-2 (P1GF-2) en una muestra de fluido corporal de una mujer embarazada se podría usar para determinar si una mujer embarazada tiene un mayor riesgo de desarrollar preeclampsia, llevar un feto con aneuploidía fetal y/o un feto pequeño para la edad gestacional ("pequeño para la edad gestacional" (PEG)).

En la secuencia precursora canónica de PlGF SEQ ID NO: 1 (UniProtKB/Swiss-Prot Accession no. P49763), los aminoácidos 1 a 18 representan la secuencia señal, los aminoácidos 132 a 203 representan un dominio de función desconocida y en los aminoácidos precursores 214 a 234 representan el dominio de unión a heparina. La secuencia de aminoácidos de PlGF-1 se representa por SEQ ID NO: 2. En PlGF-2 (SEQ ID NO: 3), los aminoácidos 124 a 144 representan el dominio de unión a heparina (SEQ ID NO: 6). En PlGF-3 (SEQ ID NO: 4), los aminoácidos 114 a 185 representan un dominio de función desconocida (SEQ ID NO: 7), denominado en la presente descripción "bucle 3". En PlGF-4 (SEQ ID NO: 5), los aminoácidos 114 a 185 representan el bucle 3 y los aminoácidos 196 a 216 el dominio de unión a heparina. A continuación se dan las secuencias de aminoácidos de la familia PlGF y sus parientes; en los precursores, los aminoácidos 1 a 18 representan la secuencia señal (subrayada) ; en los aminoácidos precursores 214 a 234, en PlGF-2 los aminoácidos 124 a 144 y en PlGF-4, los aminoácidos 196 a 216 representan el dominio de unión a heparina (cursiva); en los aminoácidos precursores 132 a 203; en PlGF-3, los aminoácidos 114 a 185 y en PlGF-4, los aminoácidos 114 a 185 representan un dominio de función desconocida (negrita).

Precursores de isoformas de PlGF (PGF) (secuencia canónica) (SEQ ID NO: 1; No. de acceso P49763):

MPVMRLFPCF LQLLAGLALP AVPPQQWALS AGNGSSEVEV VPFQEVWGRS

YCRALERLVD WSEYPSEVE HMFSPSCVSL LRCTGCCGDE NLHCVPVETA

NVTMQLLKIR SGDRPSYVEL TFSQHVRCEC RHSPGRQSPD MPGDFRADAP

SFLPPRRSLP MLFKMEWGCA LTGSQSAVWP SSPVPEEIPR MHPGRNGKKQ

QRKPLREKMK PERRRPKGRG KRRREKQRPT DCHI/CGDAVP RR

PIGF-1 maduro (SEQ ID NO: 2):

LPAVPPQQWA LSAGNGSSEV EWPFQEVWG RSYCRALERL VDWSEYPSE

VEHMFSPSCV SLLRCTGCCG DENLHCVPVE TANVTMQLLK IRSGDRPSYV

ELTFSQHVRC ECRPLREKMK PERCGDAVPR R

PIGF-2 maduro (SEQ ID NO: 3):

LPAVPPQQWA LSAGNGSSEV EWPFQEVWG RSYCRALERL VDWSEYPSE

VEHMFSPSCV SLLRCTGCCG DEDLHCVPVE TANVTMQLLK IRSGDRPSYV

ELTFSQHVRC ECRPLREKMK PERRRPKGRG KRRREKQRPT DCHLCGDAVP

RR PIGF-3 maduro (SEQ ID NO: 4):

LPAVPPQQWA LSAGNGSSEV EWPFQEVWG RSYCRALERL VDWSEYPSE

VEHMFSPSCV SLLRCTGCCG DENLHCVPVE TANVTMQLLK IRSGDRPSYV

ELTFSQHVRC ECRHSPGRQS PDMPGDFRAD APSFLPPRRS LPMLFRMEWG

CALTGSQSAV WPSSPVPEEI PRMHPGRNGK KQQRKPLREK MKPERCGDAV

PRR PIGF-4 maduro (SEQ ID NO: 5):

LPAVPPQQWA LSAGNGSSEV EWPFQEVWG RSYCRALERL VDWSEYPSE

VEHMFSPSCV SLLRCTGCCG DENLHCVPVE TANVTMQLLK IRSGDRPSYV

ELTFSQHVRC ECRHSPGRQS PDMPGDFRAD APSFLPPRRS LPMLFRMEWG

CALTGSQSAV WPSSPVPEEI PRMHPGRNGK KQQRKPLREK MKPERRRPKG

RGKRRREKQR PTDCHLCGDA VPRR

Dominio de unión a heparina (SEQ ID NO: 6)

RRPKGRGKRR REKQRPTDCH L

"Bucle 3" (SEQ ID NO: 7)

HSPGRQSPDM PGDFRADAPS FLPPRRSLPM LFRMEWGCAL TGSQSAVWPS

SPVPEEIPRM HPGRNGKKQQ RK

La invención se refiere a las realizaciones como se definen en las reivindicaciones.

En particular, la presente invención se refiere a un método para el diagnóstico y/o pronóstico de preeclampsia, o el riesgo de parto de un neonato pequeño para la edad gestacional y/o para el diagnóstico del riesgo de parto de un niño con una aneuploidía en una mujer embarazada o el feto no nacido de dicho sujeto, que comprende

(i) determinar el nivel del factor de crecimiento placentario 2 (P1GF-2) en una muestra de un fluido corporal del sujeto,

(ii) comparar el nivel determinado en la muestra con un nivel de control derivado de sujetos sin preeclampsia, o el riesgo de parto de un recién nacido pequeño para la edad gestacional, o el riesgo de parto de un niño con aneuploidía;

en el que un nivel disminuido en la muestra del sujeto en comparación con el nivel de control es indicativo de preeclampsia, mayor riesgo de adquirir preeclampsia, mayor riesgo de agravamiento de la preeclampsia, mayor riesgo de parto de un neonato pequeño para la edad gestacional, mayor riesgo de agravamiento del riesgo de parto de un neonato pequeño para la edad gestacional, mayor riesgo de parto de un niño con aneuploidía y/o mayor riesgo de agravamiento del riesgo de parto de un niño con aneuploidía.

La invención se refiere además a un método para diagnosticar la preeclampsia, o el riesgo de parto de un neonato pequeño para la edad gestacional y/o para diagnosticar el riesgo de parto de un niño con una aneuploidía en una mujer embarazada, en el que el nivel del factor de crecimiento placentario 2 (P1GF-2) se determina en una muestra de un fluido corporal del sujeto que se va a diagnosticar y en el que un nivel de PlGF-2 por debajo de un "múltiplo de la mediana" (MoM) de 0,85 del grupo de control es indicativo de preeclampsia o el riesgo de parto de un neonato pequeño para la edad gestacional y/o para diagnosticar el riesgo de parto de un niño con aneuploidía.

Además, el método de la invención pertenece a un método de inmunoensayo que comprende las etapas de

(a) poner en contacto la muestra con un primer anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno o derivado del mismo específico para PlGF y un segundo anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno o derivado del mismo específico para PlGF-2 en condiciones que permitan la formación de un complejo ternario entre PlGF-2 y los dos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno o derivados de los mismos, y

(b) detectar la unión de los dos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno o derivados de los mismos a PlGF-2.

El método de inmunoensayo de la invención se puede usar en el contexto de método de diagnóstico de la invención. La invención se refiere además a anticuerpos y kits para su uso en los métodos de la invención.

Descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra las curvas de dosis-respuesta para los anticuerpos monoclonales PlGF-2477/E5 y 477/G2. La Figura 2 muestra la curva de dosis-respuesta para el fluoroinmunoensayo tipo sándwich homogéneo de PlGF-2 utilizando la tecnología de Emisión de Criptato Amplificado resuelta en el Tiempo (TRACE) de los ejemplos 2 y 3. Figura 3: Curvas de dosis-respuesta para PlGF-1 y PlGF-2 muestran que el ensayo específico para PlGF-2 no tiene reactividad cruzada para la isoforma PlGF-1 (ejemplo 4).

Figura 4: Determinación de la concentración de P1GF-2 en presencia y ausencia de un péptido de 21 aa que corresponde al sitio de unión a heparina. No hubo inhibición de la señal cuando se añadió el péptido del dominio de unión a heparina específico en el ensayo, por lo tanto, el péptido lineal de 21 aa que corresponde a la SEQ ID NO: 6 no se reconoce por el anticuerpo monoclonal 477/G2.

Descripción detallada

En la presente descripción se divulga un método para el diagnóstico, pronóstico, evaluación de riesgos y/o control de terapia de un trastorno o afección prenatal. El trastorno o afección prenatal puede ser un trastorno o afección materna o un trastorno o afección fetal. El método se basa en la detección específica del nivel de la isoforma 2 de PlGF (P1GF-2) en una muestra materna, es decir, el nivel de PlGF-2 se determina en una muestra de una mujer embarazada. Un nivel de PlGF-2 que se reduce con respecto a un grupo de control es indicativo del trastorno o afecciones prenatales. Por tanto, el método de diagnóstico como se divulga en la presente descripción se puede usar para el diagnóstico, pronóstico, evaluación de riesgo, estratificación de riesgo y/o control de terapia de un trastorno o afección prenatal en la mujer embarazada o en su feto no nacido.

Por tanto, en un aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para el diagnóstico, pronóstico, evaluación del riesgo, estratificación del riesgo y/o control de la terapia de un trastorno o condición prenatal en una mujer embarazada o el feto no nacido de dicho sujeto, que comprende

(i) determinar el nivel de factor de crecimiento placentario 2 (P1GF-2) en una muestra del sujeto,

(ii) comparar el nivel determinado en la muestra con un nivel de control derivado de sujetos sin un trastorno o afección prenatal;

En el que un nivel disminuido en la muestra del sujeto en comparación con el nivel de control es indicativo del trastorno o afección prenatal y/o un mayor riesgo de que el sujeto o feto adquiera el trastorno o afección prenatal y/o un mayor riesgo de agravamiento del trastorno o afección prenatal.

La divulgación se refiere además a un método para diagnosticar un trastorno o afección prenatal en una mujer embarazada o el feto no nacido de dicho sujeto, en el que el nivel de factor de crecimiento placentario 2 (P1GF-2) se determina en una muestra del sujeto a ser diagnosticado y en el que un nivel de PlGF-2 por debajo de un "múltiplo de la mediana" (MoM) de 0,90, 0,85, 0,80, 0,75 o 0,70 del grupo de control es indicativo del trastorno o afección prenatal. Un múltiplo de la mediana (MoM) es una medida de cuánto se desvía el resultado de una prueba individual de la mediana del grupo de control. MoM se usa comúnmente para informar los resultados de las pruebas de cribado médico, particularmente cuando los resultados de las pruebas individuales son muy variables. Las concentraciones de analitos del cribado prenatal cambian constantemente durante el embarazo. Por ejemplo, las concentraciones de AFP en suero materno aumento en un 15 % por semana durante el momento más favorable para la detección de defectos del tubo neural abierto (15 - 20ma semana de gestación). La conversión de estos valores a un valor mediano específico de la edad gestacional (MoM) normaliza este efecto de la edad gestacional. Por lo tanto, un laboratorio puede obtener primero medidas sobre sueros que se obtuvieron de forma rutinaria, por ejemplo, de 300 a 500 mujeres. Las mediciones se expresan inicialmente en unidades de masa (por ejemplo, ng/ml) o en unidades interaccionales (por ejemplo, Ul/ml). El análisis de regresión logarítmica lineal ponderado se utiliza para calcular una ecuación para determinar los niveles medios del analito en cuestión para cada semana de gestación. Luego, la medición de cada mujer se divide por el valor mediano para la edad gestacional apropiada, lo que resulta en un múltiplo de la mediana (MoM). El valor medio global en una población de mujeres es, por definición, 1,00 MoM. Un "múltiplo de la mediana" indica el factor aplicado a un valor mediano, por ejemplo, 0,90 significa 90 % del valor mediano. Los valores de MoM preferentes son 0,85, 0,80 o 0,75, con más preferencia son 0,80 y 0,75 y con la máxima preferencia es 0,75. Los valores de umbral adecuados se pueden derivar, por ejemplo, de la Tabla 2 a continuación. En el siguiente ejemplo, se discutirán los valores del umbral. Sin embargo, en función de la especificidad y/o sensibilidad deseada o del grupo de control, se pueden usar otros valores umbral. Por ejemplo, un valor por debajo de 122,3 pg/ml (correspondiente a un MoM de 0,83) puede ser indicativo de preeclampsia. Un valor por debajo de 128,7 pg/ml (correspondiente a un MoM de 0,75) puede ser indicativo de pequeño para la edad gestacional. Los valores umbral adecuados para la trisomía 13, trisomía 18 y trisomía 21 son, por ejemplo, 125 pg/ml (correspondiente a un MoM de 0,75), 113 pg/ml (correspondiente a un MoM de 0,81) y 99,6 pg/ml (correspondiente a un MoM de 0,76), respectivamente.

Alternativamente, los "grados de extremado" (DoE) recientemente desarrollados en lugar de MoM se pueden usar para el cálculo del riesgo con marcadores derivados de la sangre (Merz 2007. Ultraschall en Med 28: 270-272; Schmidt y otros 2007. Frauenarzt 48: 1089-1092). El DoE es una relación de la distancia entre el valor de la mediana y el valor real y la distancia entre el valor de la mediana y 5to percentil (cuando el valor medido está por debajo de la mediana) o la distancia entre la mediana y el 95to percentil (cuando el valor medido está por encima de la mediana) (Merz 2007. Ultraschall en Med 28: 270-272; Merz y otros 2007. Ultrasound Obstet Gynecol 30: 542-543). Bajo este supuesto, un DoE es 0 en el valor mediano, 1,0 en el 95to percentil y -1,0 en el 5to percentil. Además, el teorema bayesiano (Schetinin y otros 2007. IEEE Trans Inf Technol Biomed 11: 312-319) se puede utilizar en lugar del concepto matemático de relaciones de probabilidad secuenciales de Palomaki y Haddow (Palomaki y Haddow 1987. Am J Obstet Gynecol 156: 460-463).

El trastorno o afección prenatal puede ser un trastorno o afección de la mujer embarazada o del feto no nacido del sujeto. Por ejemplo, el trastorno o afección prenatal puede ser preeclampsia en la mujer embarazada. El trastorno o afección prenatal también se puede relacionar con resultados adversos del embarazo, como el riesgo de que la mujer dé a luz a un niño "pequeño para la edad gestacional" o que tenga una anomalía como la aneuploidía. Por tanto, el trastorno o afección prenatal del feto puede ser, por ejemplo, "pequeño para la edad gestacional" o aneuploidía.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método de inmunoensayo para la detección de PlGF-2 que se puede usar en el contexto del método de diagnóstico como se proporciona en la presente descripción. El método de inmunoensayo se basa en la detección de P1GF-2 usando un anticuerpo, preferentemente un anticuerpo monoclonal, que sea específico para PlGF-2, es decir, este anticuerpo preferentemente no reacciona de forma cruzada con otros antígenos, particularmente las otras isoformas de PlGF-2. En el inmunoensayo, se puede usar una combinación de dos anticuerpos, por ejemplo, en un formato sándwich (véase más abajo), de los cuales al menos un anticuerpo es específico para PlGF-2: Por ejemplo, un primer anticuerpo es específico para PlGF (no necesariamente para la isoforma 2 pero en cualquier caso capaz de unirse a PlGF-2) y el segundo anticuerpo es específico para PlGF-2. Por lo tanto, la presente divulgación se relaciona con un método de inmunoensayo para la detección del factor de crecimiento placentario 2 (P1GF-2) que comprende las etapas de

(a) poner en contacto una muestra sospechosa que comprende a PlGF-2 con un primer anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno o derivado del mismo específico para PlGF y un segundo anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno o derivado del mismo específico para PlGF-2 en condiciones que permitan la formación de un complejo ternario entre PlGF-2 y los dos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno o derivados de los mismos, y

(b) detectar la unión de los dos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno o derivados de los mismos a PlGF-2.

En lo que sigue, el término "anticuerpo" también comprende fragmentos de unión a antígeno o derivados a no ser que se indique otra cosa. El primer anticuerpo puede ser cualquier anticuerpo específico para PlGF siempre que detecte PlGF-2. Estos anticuerpos están disponibles comercialmente. Por ejemplo, el primer anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal contra PlGF humano. Un anticuerpo de este tipo se puede adquirir, por ejemplo, en R&D Systems Europe Ltd. (Ref. No: AF-264-PB).

En el método de inmunoensayo como se describe en la presente descripción, dicho segundo anticuerpo puede ser específico para un epítopo en la secuencia de PlGF-2 (SEQ ID NO: 3), preferentemente en el dominio de unión a heparina (SEQ ID NO: 6). Sin embargo, es preferente que el segundo anticuerpo se dirija a un epítopo conformacional de PlGF-2 que no está presente en las otras isoformas de PlGF. El segundo anticuerpo es preferentemente un anticuerpo monoclonal.

Como se discutirá en la presente descripción más adelante en más detalle, los anticuerpos (primero y/o segundo) o fragmentos de unión a antígeno o derivados de los mismos del método de inmunoensayo como se describe en la presente descripción, pueden ser, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales o anticuerpos monoclonales preparados por ingeniería genética.

Preferentemente en la presente descripción, dichos primer y segundo anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno o derivados de los mismos son específicos para diferentes epítopos conformacionales y no superpuestos de PlGF-2. El primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o derivado del mismo puede, por ejemplo, ser específico para un epítopo comprendido dentro de la secuencia de SEQ ID NO: 1.

El segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o derivado del mismo puede, por ejemplo, ser producido por una línea celular de hibridoma que se selecciona de la línea celular 477/G2 depositada el 21 de noviembre de 2013 en el Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. (DSMZ; Inhoffenstr.

7B, Braunschweig, Alemania), como DSM ACC3222 y la línea celular 477/E5 depositada el 21 de noviembre de 2013 en el DSMZ como DSM ACC3221, preferentemente en la presente descripción el segundo anticuerpo se produce por la línea celular de hibridoma 477/G2 depositada como DSM ACC3222.

Preferentemente en la presente descripción, el primer anticuerpo es un anticuerpo policlonal anti-PlGF, por ejemplo, el anticuerpo disponible comercialmente proporcionado por R&D Systems Europe Ltd. Abingdon UK bajo la Ref. No.: AF-264-PB. En un aspecto específico, el primer anticuerpo es un anticuerpo policlonal anti-PlGF, por ejemplo, el anticuerpo disponible comercialmente proporcionado por R&D Systems Europe Ltd. Abingdon UK bajo la Ref. No.: AF-264-PB y el segundo anticuerpo es el anticuerpo que se produce por la línea celular de hibridoma 477/G2 depositado como DSM ACC3222.

La unión de los anticuerpos a PlGF-2 tiene lugar en condiciones adecuadas (es decir, que permiten inmunorreacciones, es decir, la unión de los anticuerpos PlGF-2 y la formación de complejos inmunitarios). El experto en la técnica conoce dichas condiciones y se pueden usar formatos estándar de inmunoensayos, por ejemplo, como se describe a continuación. Dichas condiciones estarán preferentemente bajo temperatura, pH y fuerza iónica fisiológicas y pueden tener lugar en medios tales como, por ejemplo, disolución salina tamponada con fosfato (PBS).

Los métodos de detección preferentes comprenden inmunoensayos en varios formatos tales como, por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayos de quimioluminiscencia y fluorescencia, inmunoensayos enzimáticos (EIA), inmunoensayos ligados a enzimas (ELISA), matrices de lechos basados en Luminex, ensayos de micromatrices de proteínas, formatos de ensayo rápido tales como, por ejemplo, ensayos de tira inmunocromatográfica, y monitorización de reacciones seleccionadas/múltiples (SRM/MRM).

Los ensayos pueden ser ensayos homogéneos o heterogéneos, ensayos competitivos y no competitivos. En un aspecto particularmente preferente, el ensayo está en la forma de un ensayo tipo sándwich, que es un inmunoensayo no competitivo, en el que la molécula a detectar y/o cuantificar está unida a un primer anticuerpo y a un segundo anticuerpo. El primer anticuerpo se puede unir a una fase sólida, por ejemplo, una perla, una superficie de un pocillo u otro recipiente, un chip o una tira, y el segundo anticuerpo es un anticuerpo que está marcado, por ejemplo, con un colorante, con un radioisótopo, o un resto reactivo o catalíticamente activo. La cantidad de anticuerpo marcado unido al analito se mide entonces mediante un método apropiado. La composición general y los procedimientos involucrados con los "ensayos tipo sándwich" están bien establecidos y son conocidos por el experto en la técnica (The Immunoassay Handbook, Ed. David Wild, Elsevier LTD, Oxford; 3a ed. (mayo 2005), IS^b N-13: 978-0080445267; Hultschig C y otros, Curr Opin Chem Biol. 2006 feb;10(1):4-10. PMID: 16376134). En un aspecto particularmente preferente, el ensayo comprende dos moléculas de captura, preferentemente anticuerpos que están presentes como dispersiones en una mezcla de reacción líquida, en el que un primer componente de marcaje está unido a la primera molécula de captura, en el que dicho primer componente de marcaje es parte de un sistema de marcaje en base a la amplificación o inactivación con fluorescencia o quimioluminiscencia, y un segundo componente de marcaje de dicho sistema de marcado se une a la segunda molécula de captura, de modo que al unirse ambas moléculas de captura al analito se genera una señal medible que permite la detección de los complejos sándwich formados en la solución que comprende la muestra.

Aún con mayor preferencia, dicho sistema de marcaje comprende criptatos de tierras raras o quelatos de tierras raras en combinación con un colorante de fluorescencia o un colorante de quimioluminiscencia, en particular un colorante del tipo cianina.

Como se describe en la presente descripción, los ensayos basados en fluorescencia comprenden el uso de colorantes, que se pueden seleccionar, por ejemplo, del grupo que comprende FAM (5 o 6-carboxifluoresceína), VIC, NED, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), IRD-700/800, colorantes de cianina, tales como CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, Cy7, xanteno, 6-carboxi-2',4',7',4,7-hexaclorofluoresceína (HEX), TET, 6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetodifluoresceína (JOE), N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 5-carboxirrodamina-6G (R6G5), 6-carboxirrodamina-6G (RG6), rodamina, verde rodamina, rojo rodamina, rodamina 110, colorantes BODIPY, como BODIPY TMR, verde Oregón, coumarinas como umbeliferona, bencimidas, tal como Hoechst 33258; fenantridinas, tales como rojo Texas, amarillo Yakima, Alexa Flúor, PET, bromuro de etidio, colorantes de acridinio, colorantes carbazol, colorantes de fenoxazina, colorantes porfirina, colorantes de polimetina y similares. Como se describe en la presente descripción, los ensayos en base a quimioluminiscencia comprenden el uso de colorantes, en base a los principios físicos descritos para materiales quimioluminiscentes en Kirk-Othmer. Encyclopedia of chemical technology. 4th ed., executive editor, J. I. Kroschwitz; editor, M. Howe-Grant, John Wiley & Sons, 1993, vol. 15, p. 518-562. Los colorantes quimioluminiscentes preferentes son esteres de acridinio. La PlGF-2 se puede detectar, por ejemplo, usando sistemas de inmunoensayo tipo sándwich totalmente automatizados en el instrumento B.R.A.H.M.S k Ry PTOR compact PLUS (Thermo Scientific B.R.A.H.M.S GmbH, Hennigsdorf/Berlín, Alemania). Este analizador de acceso aleatorio emplea la tecnología sensible de Emisión de Criptato Amplificado resuelta en el Tiempo (TRACE), en base a una transferencia no radiactiva entre dos fluoróforos.

En aspectos específicos descritos en la presente descripción, uno de los anticuerpos (por ejemplo, el primer anticuerpo) está marcado y el otro anticuerpo (por ejemplo, el segundo anticuerpo) está unido a una fase sólida o se puede unir selectivamente a una fase sólida. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, es preferente en el contexto de los métodos como se describen en la presente descripción que el primer y el segundo anticuerpo estén presentes dispersos en una mezcla de reacción líquida, y en el que un primer componente de marcaje que es parte de un sistema de marcaje en base a la extinción o amplificación de la fluorescencia o quimioluminiscencia se una al primer anticuerpo, y un segundo componente de marcaje de dicho sistema de marcaje se una al segundo anticuerpo de modo que, después de la unión de ambos anticuerpos a PlGF-2 sea una señal medible que permite la detección de los complejos tipo sándwich resultantes en la disolución de medición que se generó.

Como se menciona en la presente descripción, un "ensayo" o "ensayo de diagnóstico" puede ser de cualquier tipo aplicado en el campo del diagnóstico. Dicho ensayo puede estar basado en la unión de un analito a detectar a una o más sondas de captura con una cierta afinidad. Con respecto a la interacción entre las moléculas de captura y moléculas objetivo o moléculas de interés, la constante de afinidad es preferentemente mayor que 108 M-1.

La "sensibilidad" de un ensayo se refiere a la proporción de positivos reales que se identifican correctamente como tales, es decir, la capacidad de identificar resultados positivos (resultados positivos verdaderos/número de positivos). Por lo tanto, cuanto más bajas son las concentraciones del analito que se pueden detectar con un ensayo, más sensible es el ensayo. La "especificidad" de un ensayo se refiere a la proporción de negativos que se identifican correctamente como tales, es decir, la capacidad de identificar resultados negativos (negativos verdaderos/resultados negativos). Para un anticuerpo, la "especificidad" se define como la capacidad de un sitio de unión a antígeno individual para reaccionar con un único epítopo antigénico. El comportamiento de unión de un anticuerpo también se puede caracterizar en términos de su "afinidad" y su "avidez". La "afinidad" de un anticuerpo es una medida de la fuerza de la reacción entre un único epítopo antigénico y un único sitio de unión al antígeno. La "avidez" de un anticuerpo es una medida de la fuerza general de unión entre un antígeno con muchos epítopos y anticuerpos multivalentes.

La sensibilidad y especificidad de un ensayo de diagnóstico y/o pronóstico dependen de algo más que la "calidad" analítica del ensayo, también dependen de la definición de lo que constituye un resultado anormal. En la práctica, las curvas de Característica Operativa del Receptor (curvas ROC) se calculan típicamente representando el valor de una variable frente a su frecuencia relativa en poblaciones "normales" (es decir, individuos aparentemente sanos que no tienen un trastorno o afección prenatal) y "enfermas". Para cualquier marcador particular, una distribución de los niveles del marcador para sujetos con y sin una enfermedad probablemente se superpondrá. En dichas condiciones, un ensayo no distingue absolutamente lo normal de lo enfermo con una precisión del 100 %, y el área de superposición indica dónde el ensayo no puede distinguir lo normal de lo enfermo. Se selecciona un umbral, por debajo del cual el ensayo se considera anormal y por encima del cual el ensayo se considera normal. El área bajo la curva ROC es una medida de la probabilidad de que la medición percibida permita la identificación correcta de una afección. Las curvas ROC se pueden usar incluso cuando los resultados del ensayo no proporcionan necesariamente un número exacto. Siempre que se puedan clasificar los resultados, se puede crear una curva ROC. Por ejemplo, los resultados de una prueba en muestras "enfermas" se pueden clasificar de acuerdo con el grado (por ejemplo, 1 = bajo, 2 = normal y 3 = alto). Esta clasificación se puede correlacionar con los resultados en la población "normal" y crear una curva ROC. Estos métodos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Hanley y otros 1982. Radiology 143: 29-36. Preferentemente, se selecciona un umbral para proporcionar un área de curva ROC mayor de aproximadamente 0,5, con mayor preferencia mayor de aproximadamente 0,7, aún con mayor preferencia mayor de aproximadamente 0,8, incluso con mayor preferencia mayor de aproximadamente 0,85, y con la máxima preferencia mayor de aproximadamente 0,9. El término "aproximadamente" en este contexto se refiere a /- el 5 % de una medición dada.

El eje horizontal de la curva ROC representa (1-especificidad), que aumenta con la tasa de falsos positivos. El eje vertical de la curva representa la sensibilidad, que aumenta con la tasa de verdaderos positivos. Por lo tanto, para un punto de corte particular seleccionado, se puede determinar el valor de (1-especificidad), y se puede obtener una sensibilidad correspondiente. El área bajo la curva ROC es una medida de la probabilidad de que el nivel del marcador medido permita la identificación correcta de una enfermedad o afección. Por lo tanto, el área bajo la curva ROC se puede usar para determinar la efectividad del ensayo.

En otros aspectos, se usa una razón de probabilidad positiva, razón de probabilidad negativa, razón de probabilidad o razón de riesgo como una medida de la capacidad de un ensayo para predecir el riesgo o diagnosticar un trastorno o afección ("grupo enfermo"). En el caso de una razón de probabilidad positiva, un valor de 1 indica que un resultado positivo es igualmente probable entre los sujetos en los grupos "enfermo" y "control"; un valor mayor de 1 indica que un resultado positivo es más probable en el grupo enfermo; y un valor inferior a 1 indica que un resultado positivo es más probable en el grupo control. En el caso de una razón de probabilidad negativa, un valor de 1 indica que un resultado negativo es igualmente probable entre los sujetos en los grupos "enfermo" y "control"; un valor mayor de 1 indica que un resultado negativo es más probable en el grupo de ensayo; y un valor inferior a 1 indica que un resultado negativo es más probable en el grupo control.

En el caso de una razón de probabilidad, un valor de 1 indica que un resultado positivo es igualmente probable entre los sujetos en los grupos "enfermo" y "control"; un valor mayor de 1 indica que un resultado positivo es más probable en el grupo enfermo; y un valor inferior a 1 indica que un resultado positivo es más probable en el grupo control. En el caso de una razón de riesgo, un valor de 1 indica que el riesgo relativo de un punto final (por ejemplo, muerte) es igual en los grupos "enfermo" y "control"; un valor mayor de 1 indica que el riesgo es mayor en el grupo enfermo; y un valor inferior a 1 indica que el riesgo es mayor en el grupo control.

El experto en la técnica comprenderá que asociar un indicador de diagnóstico o pronóstico, con un diagnóstico o con un riesgo de pronóstico de un resultado clínico futuro es un análisis estadístico. Por ejemplo, un nivel de marcador inferior a X puede indicar que un paciente tiene más probabilidades de padecer un resultado adverso que los pacientes con un nivel mayor o igual a X, según lo determinado por un nivel de significación estadística. Además, un cambio en la concentración del marcador desde los niveles basales puede reflejar el pronóstico del paciente, y el grado de cambio en el nivel del marcador se puede relacionar con la gravedad de los eventos adversos. La significación estadística a menudo se determina comparando dos o más poblaciones y determinando un intervalo de confianza y/o un valor p. Véase, por ejemplo, Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York, 1983. Los intervalos de confianza preferentes de la descripción son el 90 %, 95 %, 97,5 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % y 99,99 %, mientras que los valores p preferentes son 0,1, 0,05, 0,025, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001 y 0,0001.

El término "anticuerpo" generalmente comprende anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales y fragmentos de unión de los mismos, en particular, fragmentos Fc, así como los denominados "anticuerpos de cadena única" (Bird R. E. y otros (1988) Science 242:423-6), chimeric, humanized, in particular CDR-grafted antibodies, and dia or tetrabodies (Holliger P. y otros (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-8). También están comprendidas las proteínas de tipo inmunoglobulina que se seleccionan mediante técnicas que incluyen, por ejemplo, la presentación en fagos para unirse específicamente a la molécula de interés contenida en una muestra. En este contexto, el término "unión específica" se refiere a anticuerpos generados frente a la molécula de interés o un fragmento de la misma. Se considera que un anticuerpo es específico, si su afinidad hacia la molécula de interés o el fragmento que se mencionó de la misma es al menos 50 veces mayor, con mayor preferencia 100 veces mayor, con la máxima preferencia al menos 1000 veces mayor, que hacia otras moléculas comprendidas en una muestra que contiene la molécula de interés. Es bien conocido en la técnica cómo desarrollar y seleccionar anticuerpos con una especificidad dada. Como se indicó anteriormente en la presente descripción, son preferentes los anticuerpos monoclonales. En la presente descripción también se describe un anticuerpo monoclonal que se produce por una línea celular de hibridoma seleccionada de la línea celular 477/G2 depositada como DSM ACC3222 y la línea celular 477/E5 depositada como DSM ACC3221. En la presente descripción también se describe un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo producido por una línea celular de hibridoma seleccionada de la línea celular 477/G2 depositada como DSM ACC3222 y la línea celular 477/E5 depositada como DSM ACC3221.

La divulgación se refiere además a un kit para la detección de PlGF-2 que comprende

(i) un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o derivado del mismo que es específico para PlGF; y (ii) un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o derivado del mismo que es específico para PlGF-2. Por ejemplo, (i) el primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o derivado del mismo es específico para un epítopo comprendido dentro de la secuencia de SEQ ID NO: 1; y/o (ii) el segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o derivado del mismo es específico para un epítopo estructural de PlGF-2. Preferentemente, el primer anticuerpo del kit es un anticuerpo policlonal anti-PlGF, por ejemplo, el anticuerpo disponible comercialmente proporcionado por R&D Systems Europe Ltd. Abingdon UK bajo la Ref. No.: AF-264-PB. En un aspecto específico del kit, el primer anticuerpo es un anticuerpo policlonal anti-PlGF, por ejemplo, el anticuerpo disponible comercialmente proporcionado por R&D Systems Europe Ltd. Abingdon Reino Unido con la Ref. No.: AF-264-PB y el segundo anticuerpo es el anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma 477/G2 depositado como DSM ACC3222.

En un aspecto del kit, el segundo anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que es producido por una línea celular de hibridoma seleccionada de la línea celular 477/G2 depositada como ^d S^m ACC3222 y la línea celular 477/E5 depositada como DSM ACC3221, preferentemente el anticuerpo monoclonal que es producido por una línea celular de hibridoma seleccionada de la línea celular 477/G2 depositada como DSM ACC3222.

En la presente descripción también se proporciona una línea celular de hibridoma seleccionada de la línea celular 477/G2 depositada como DSM ACC3222 y la línea celular 477/E5 depositada como DSM ACC3221.

En la presente descripción además se proporciona el uso de un kit como se describe en la presente descripción en un formato de inmunoensayo de tipo sándwich para la detección y/o cuantificación de PlGF-2 o un fragmento de la misma en una muestra biológica de un fluido corporal. Dicho fragmento, al menos comprende una secuencia que abarca los dos epítopos contra los cuales se dirigen los dos anticuerpos, por ejemplo, el kit se puede usar para la detección y/o cuantificación de PlGF-2 total.

El término "muestra" es preferentemente una muestra biológica. "Muestra", tal y como se usa en la presente descripción se puede referir, por ejemplo, a una muestra de fluido o tejido corporal que se obtiene para el propósito de diagnóstico, pronóstico o evaluación de un sujeto de interés, tal como un paciente. Un "paciente", o "sujeto" para los propósitos de la presente memoria incluye tanto humanos como otros animales, particularmente mamíferos, y otros organismos. Por lo tanto, los métodos son aplicables tanto a diagnósticos humanos como a aplicaciones veterinarias. En un aspecto preferente, el paciente es un mamífero, y en el aspecto más preferente, el paciente o sujeto es un ser humano.

Preferentemente, en la presente descripción, la muestra es una muestra de un fluido o un tejido corporal de una mujer embarazada. Es preferente una muestra de fluido corporal. Las muestras de ensayo preferentes incluyen sangre, suero, plasma, fluido cerebroespinal, orina, saliva, esputo y efusiones pleurales. Además, un experto en la técnica se daría cuenta de que algunas muestras de ensayo se analizarían más fácilmente después de un procedimiento de fraccionamiento o purificación, por ejemplo, separación de sangre completa en componentes de suero o plasma.

Por lo tanto, en un aspecto preferente descrito en la presente descripción, la muestra se selecciona del grupo que consiste en una muestra de sangre, de suero, de plasma, de fluido cefalorraquídeo, de saliva y de orina o un extracto de cualquiera de las muestras mencionadas anteriormente. Preferentemente, la muestra es una muestra de sangre, lo más preferentemente una muestra de suero o una muestra de plasma. Las muestras de suero son las muestras más preferentes como se describe en la presente descripción.

"Plasma", como se usa en la presente descripción, es el sobrenadante virtualmente libre de células de sangre que contiene anticoagulante obtenido después de la centrifugación. Los anticoagulantes ejemplares incluyen compuestos de unión a iones de calcio tales como EDTA o citrato e inhibidores de trombina tales como heparinatos o hirudina. El plasma libre de células se puede obtener por centrifugación de la sangre anticoagulada (por ejemplo, sangre citrada, con EDTA o heparinizada) durante al menos 15 minutos de 2.000 a 3.000 g.

"Suero" es la fracción líquida de la sangre completa que se recoge después de que se deja coagular la sangre. Cuando la sangre se coagula (sangre coagulada) se centrifuga, se puede obtener suero como sobrenadante. No contiene fibrinógeno, aunque quedan algunos factores de coagulación.

Cuando sea apropiado, puede ser necesario homogeneizar la muestra o extraerla con un disolvente antes de su uso como se describe en la presente descripción con el fin de obtener una muestra líquida. Una muestra líquida puede ser una disolución o suspensión. Las muestras líquidas se pueden someter a uno o más pretratamientos antes de su uso como se describe en la presente descripción. Dichos pretratamientos incluyen, pero no están limitados a, dilución, filtración, centrifugación, concentración, sedimentación, precipitación, diálisis. Los pretratamientos también pueden incluir la adición de sustancias químicas o bioquímicas a la disolución, tales como ácidos, bases, tampones, sales, disolventes, colorantes reactivos, detergentes, emulsionantes, quelantes.

El método de la divulgación se refiere además a la determinación del nivel de PlGF-2 en una muestra para diagnóstico o pronóstico o evaluación de riesgos o cribado para afecciones médicas.

En un aspecto adicional como se describe en la presente descripción, el método de acuerdo con la divulgación se puede usar para detectar PlGF-2 total para diagnóstico o pronóstico o evaluación de riesgo o cribado de trastornos prenatales que comprenden las etapas de

(i) proporcionar una muestra de un fluido corporal de un sujeto,

(ii) determinar la cantidad de P1GF-2 en dicha muestra de sujetos,

(iii) comparar la cantidad de PlGF-2 con una muestra de referencia, en el que una disminución de la muestra de referencia indica la presencia de un trastorno prenatal.

Por lo tanto, el inmunoensayo, anticuerpo o kit de la divulgación se puede usar para el diagnóstico, pronóstico, evaluación de riesgos, estratificación de riesgos, y/o control de la terapia de un trastorno o afección en un sujeto. En el contexto de la presente divulgación, el trastorno o afección es preferentemente un trastorno o afección prenatal en una mujer embarazada o en un feto. Como se describe en la presente descripción, el trastorno o afección prenatal en la mujer embarazada se selecciona preferentemente entre preeclampsia o el riesgo de parto de un niño con aneuploidía o el riesgo de parto de un recién nacido pequeño para la edad gestacional.

Como se describe en la presente descripción, dicho sujeto puede estar en el primer, segundo o tercer trimestre del embarazo. Preferentemente, el sujeto se encuentra en el primer trimestre del embarazo. Sin embargo, el sujeto también puede estar en el segundo trimestre. El sujeto también puede estar en el tercer trimestre. En particular en el caso de preeclampsia o pequeños para la edad gestacional, el sujeto puede estar en el 1er, 2do o 3er trimestre del embarazo, preferentemente el 1er trimestre.

Como se describe en la presente descripción, se pueden determinar otros parámetros decisivos además del nivel de PlGF-2. Por ejemplo, la información relativa a la edad, el peso y/o el índice de masa corporal (IMC) se puede utilizar adicionalmente para el diagnóstico. Otros parámetros incluyen la presencia o presencia anterior de otras enfermedades o afecciones en el sujeto. Además, se pueden determinar otros biomarcadores relevantes en el sujeto, por ejemplo, en la misma muestra que se usa para el método que se proporciona en la presente descripción. Por tanto, en algunos aspectos se determina en la muestra al menos un parámetro adicional relevante para el diagnóstico. Por lo tanto, PlGF-2 puede ser parte de un panel de marcadores que se usaron en los métodos de diagnóstico o pronóstico como se proporciona en la presente descripción. Por ejemplo, cuando el trastorno o afección es preeclampsia, el parámetro adicional puede ser uno o más seleccionados del grupo que consiste en PAPP-A, marcadores de ultrasonido (índice pulsátil, muesca diastólica), presión arterial media, PlGF, sFlt, antecedentes maternos, endoglina soluble (sEng), inhibina A, activina A, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), gonadotropina coriónica humana (hCG) y ADN fetal libre de células. Por ejemplo, cuando el trastorno o afección es aneuploidía, el parámetro adicional puede ser uno o más seleccionados del grupo que consiste en PAPP-A, hCG beta libre, translucidez nucal, edad materna, AFP, PlGF, hueso nasal fetal, diámetro biparietal/proporción de hueso nasal, hCG, inhibina A, estriol 3 no conjugado (uE3) y ADN fetal libre de células. Por ejemplo, cuando el trastorno o afección es "pequeño para la edad gestacional", el parámetro adicional puede ser uno o más seleccionados del grupo que consiste en PAPP-A, antecedentes maternos, PlGF, sFlt, AFP, hCG beta libre, hCG, inhibina-A, activina A, sEng, altura sínfisis-fondo uterino (SFH), biometría fetal (longitud del fémur (FL), perímetro cefálico (HC), diámetro biparietal (DBP), circunferencia abdominal (AC)) y marcadores ecográficos (Índice pulsátil, Doppler de arteria umbilical, Doppler de arteria cerebral media, Doppler de conducto venoso). Para el diagnóstico diferencial, además del nivel de PlGF-2, se pueden utilizar otros marcadores e información.

El término "biomarcador" (marcador biológico) se refiere a parámetros biológicos medibles y cuantificables (por ejemplo, concentración enzimática específica, concentración hormonal específica, distribución del fenotipo del gen específico en una población, presencia de sustancias biológicas) que sirven como índices para evaluaciones relacionadas con la salud y la fisiología, tales como riesgo de enfermedad, trastornos psiquiátricos, exposición ambiental y sus efectos, diagnóstico de enfermedades, procesos metabólicos, abuso de sustancias, embarazo, desarrollo de líneas celulares, estudios epidemiológicos, etcétera. Además, un biomarcador se define como una característica que se mide objetivamente y se evalúa como un indicador de procesos biológicos normales, procesos patogénicos o respuestas farmacológicas a una intervención terapéutica. Un biomarcador se puede medir en una muestra biológica (como un análisis de sangre, orina o tejido), puede ser un registro obtenido de una persona (presión arterial, ^eC^g o Holter), o puede ser un análisis de imagenología (ultrasonidos Doppler uteroplacentario, o translucencia nucal (Conde-Agudelo y otros 2004. Obstet Gynecol 104: 1367-1391: Bindra y otros 2002. Ultrasound Obstet Gynecol 20: 219-225)). Los biomarcadores pueden indicar una variedad de características de salud o enfermedad, lo que incluye el nivel o tipo de exposición a un factor ambiental, susceptibilidad genética, respuestas genéticas a exposiciones, biomarcadores de enfermedad subclínica o clínica, o indicadores de la respuesta a la terapia. Por lo tanto, una forma simplista de pensar en los biomarcadores es como indicadores del rasgo de la enfermedad (factor de riesgo o biomarcador de riesgo), estado de la enfermedad (preclínica o clínica) o tasa de la enfermedad (progresión). Por consiguiente, los biomarcadores se pueden clasificar como biomarcadores antecedentes (que identifican el riesgo de desarrollar una enfermedad), biomarcadores de cribado (cribado de enfermedad subclínica), biomarcadores de diagnóstico (que reconocen la enfermedad manifiesta), biomarcadores de estadificación (que clasifican la gravedad de la enfermedad) o biomarcadores de pronóstico (que predicen del curso futuro de la enfermedad, lo que incluye la recurrencia y la respuesta a la terapia, y la monitorización de la eficacia de la terapia). Los biomarcadores también pueden servir como puntos finales sustitutos. Un punto final sustituto es aquel que se puede usar como un resultado en ensayos clínicos para evaluar la seguridad y la efectividad de las terapias en lugar de la medición del verdadero resultado de interés. El principio subyacente es que las alteraciones en el punto final sustituto siguen de cerca los cambios en el resultado de interés. Los puntos finales sustitutos tienen la ventaja de que se pueden recolectar en un marco de tiempo más corto y con menos gastos que los puntos finales tales como la morbilidad y la mortalidad, que requieren grandes ensayos clínicos para su evaluación. Los valores adicionales de los puntos finales sustitutos incluyen el hecho de que están más cerca de la exposición/intervención de interés y pueden ser más fáciles de relacionar causalmente que los eventos clínicos más distantes. Una desventaja importante de los puntos finales sustitutos es que si el resultado clínico de interés está influenciado por numerosos factores (además del punto final sustituto), la confusión residual puede reducir la validez del punto final sustituto. Se ha sugerido que la validez de un punto final sustituto es mayor si puede explicar al menos el 50 % del efecto de una exposición o intervención en el resultado de interés. Por ejemplo, un biomarcador puede ser una proteína, péptido o una molécula de ácido nucleico.

Como se describe en la presente descripción, los trastornos prenatales se relacionan preferentemente con preeclampsia, pequeños para la edad gestacional y aneuploidías que incluyen trisomía 13, trisomía 18 y trisomía 21.

Como se describe en la presente descripción, la medición del PlGF-2 total se lleva a cabo dentro del primer trimestre (1ra a 13ra semana de embarazo), segundo trimestre (14ta a 26ta semana de embarazo) o tercer trimestre (27ma a 40ma semana de embarazo).

Dentro del ámbito que se describe en la presente descripción, se entiende que PlGF-2 significa PlGF-2 humano de acuerdo con SEQ ID NO: 3. Estos polipéptidos como se describen en la presente descripción también pueden tener modificaciones postraduccionales tales como glicolización, labio (o) idización o derivatización.

Dentro del alcance tal como se describe en la presente descripción, se entiende que PlGF-2 total significa PlGF-2 y PlGF-2 libres unidos a complejos multiméricos, que pueden comprender, por ejemplo, el complejo de PlGF-2 homodimérico y el complejo de PlGF-2/VEGF-A heterodimérico.

En un aspecto adicional descrito en la presente descripción, el pronóstico o la estratificación del riesgo se relaciona con un inicio temprano (entre las 20 y 34 semanas de gestación) o un inicio tardío (después de las 34 semanas de gestación) de la preeclampsia.

En otro aspecto descrito en la presente descripción, se determinan adicionalmente marcadores adicionales seleccionados del grupo sFlt-1, PlGF, VEGF, PP-13, ADAM12, P-Selectina, ADN fetal libre de células, PTX3, PAPP-A, visfatina, inhibina A, activina A, gonadotropina coriónica humana (hCG), beta-hCG, alfa-fetoproteína (AFP), metaloproteinasa-9 (MMP-9), marcadores de ultrasonido (índice de pulsatilidad de la arteria uterina y/o muesca diastólica) así como presión arterial.

En un aspecto preferente de la divulgación, dichos marcadores adicionales se seleccionan del grupo que comprende sFlt-1, PlGF, PAPP-A, índice de pulsatilidad de la arteria uterina y presión sanguínea.

El término "sujeto", como se usa en la presente descripción, se refiere a un organismo femenino vivo humano o no humano. Preferentemente en la presente descripción, el sujeto es un sujeto humano que está embarazada dentro del primer al tercer trimestre, preferentemente en el primer o segundo trimestre y más preferentemente dentro del primer trimestre del embarazo. Por ejemplo, el sujeto está en la semana 11-13 de gestación. Un "feto" en la presente descripción se refiere a un mamífero en desarrollo después de la etapa embrionaria y antes del nacimiento. En los humanos, la etapa fetal comienza al principio de la novena semana de gestación.

El término "muestra" como se usa en la presente descripción se refiere a una muestra como se describió anteriormente.

El término "muestra de referencia" se refiere a una muestra que se obtiene de un sujeto o grupo de sujetos que no tienen una enfermedad o trastorno, y que no desarrollan la enfermedad o trastorno. Dicho sujeto o grupo de sujetos representa el mismo género y especie que el sujeto que se está probando. El "nivel de control" se deriva de una o más "muestras de referencia" y preferentemente se deriva de sujetos sin un trastorno o afección prenatal. Se prefiere en la presente descripción que el "grupo de control" sea del mismo trimestre de embarazo que el sujeto o incluso de la misma edad gestacional (por ejemplo, en términos de semanas de gestación). Por ejemplo, cuando el sujeto está en la semana 11-13 de gestación, el grupo de control también puede ser de la semana 11-13 de gestación.

"Diagnóstico" como se usa en la presente descripción se refiere al reconocimiento y la detección (temprana) de una enfermedad o afección clínica en un sujeto y también puede comprender un diagnóstico diferencial. Además, la evaluación de la gravedad de una enfermedad o afección clínica puede abarcar, en ciertos aspectos, el término "diagnóstico".

"Pronóstico" se refiere a la predicción de un resultado o un riesgo específico para un sujeto que padece una enfermedad o afección clínica particular. Esto puede incluir una estimación de la posibilidad de recuperación o la posibilidad de un resultado adverso para dicho sujeto.

Como se usa en la presente descripción, el término "estratificación de riesgos" se refiere a la agrupación de sujetos en diferentes grupos de riesgo de acuerdo con su pronóstico adicional. La estratificación de riesgos también se refiere a la estratificación para aplicar medidas preventivas y/o terapéuticas.

El término control de la terapia como se usa en la presente descripción se refiere a la monitorización y/o ajuste de un tratamiento terapéutico de dicho paciente.

El término "cribado" como se usa en la presente descripción se refiere a un proceso de inspección de una población, usando un marcador o marcadores específicos y niveles de corte de cribado definidos, para identificar a los individuos de la población con mayor riesgo para un trastorno particular. El cribado es aplicable a una población; el diagnóstico se aplica a nivel del paciente individual.

El término "preeclampsia" incluye un trastorno hipertensivo de múltiples sistemas de mujeres embarazadas, que se caracteriza por hipertensión y proteinuria. Los síntomas más comunes de la preeclampsia son hipertensión arterial, aumento de proteínas en la orina e hinchazón o edema de manos y cara. En ciertos aspectos que se describen en la presente descripción, la preeclampsia se define como hipertensión (presión arterial sistólica y diastólica > 140 y 90 mm Hg, respectivamente) y proteinuria (excreción de proteínas > 300 mg en una recolección de orina de 24 h, o tira reactiva > 2+).

La aneuploidía es un número anormal de cromosomas y es un tipo de anomalía cromosómica. Un cromosoma extra o faltante es una causa común de trastornos genéticos (defectos de nacimiento). La aneuploidía ocurre durante la división celular cuando los cromosomas no se separan adecuadamente entre las dos células. La aneuploidía incluye, por ejemplo, las trisomías fetales 21 (síndrome de Down), 18 (síndrome de Edwards) y 13 (síndrome de Patau). Pequeño para la edad gestacional se refiere a un feto con restricción de crecimiento que no ha alcanzado su tamaño potencial determinado. El peso fetal está por debajo del percentil 10 para la edad gestacional.

Los siguientes ejemplos y figuras se utilizan para una explicación más detallada de la descripción.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generación de anticuerpos

Anticuerpo policlonal

El anticuerpo policlonal dirigido contra PlGF humano se adquirió comercialmente en (R&D Systems Europe Ltd. Abingdon Reino Unido; Ref. No: AF-264-PB).

Desarrollo de anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales contra PlGF -2 se generaron mediante procedimientos estándar (Harlow E, Lane D. Antibodies - A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Lane 1985. Journal of Immunology Methods 81:223-228). Para la generación de anticuerpos anti-PlGF-2 humano, se inmunizaron ratones BALB/c hembras de 8 semanas de edad con 50 pg de PlGF-2 recombinante humano (R&D Systems Europe Ltd. Abingdon UK) disuelto en tampón de fosfato de sodio 11 mmol/L (pH 7,2) que contiene 140 mmol/L de NaCl. Se administraron posteriores inyecciones de refuerzo de inmunógeno en intervalos de 4 semanas. La fusión se realizó con células de mieloma de ratón SP2/0 (SP2/0-Ag 14) 3 meses después de la inmunización inicial. Los clones 477/G2 y 477/E5 se detectaron mediante ELISA con PlGF-2 humano recombinante inmovilizado. Los anticuerpos se purificaron mediante cromatografía de afinidad de flujo rápido de proteína A (GE Healthcare Life Sciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La selección del anticuerpo monoclonal se basó en la señal obtenida para el reconocimiento del PlGF-2 recombinante (SEQ ID NO: 3). Las dos curvas de respuesta a la dosis se muestran en la Figura 1. La mejor señal se obtuvo utilizando el clon 477/G2.

Marcaje de los anticuerpos

En el ensayo, el anticuerpo policlonal anti-PlGF humano (R&D Systems Europe Ltd. Abingdon Reino Unido) y el anticuerpo monoclonal anti-PlGF-2 humano se acoplaron a Lumi4®-Tb (Lumiphore, Inc., Richmond, Canadá) y a cianina 5,5 (GE Healthcare UK Limited), respectivamente. Las reacciones de acoplamiento se realizaron de acuerdo con los protocolos de acoplamiento prescritos por el fabricante.

Ejemplo 2: Desarrollo de un ensayo de PlGF-2 utilizando anticuerpos monoclonales y policlonales

Se desarrolló un fluoroinmunoensayo de tipo sándwich homogéneo que usa la tecnología de Emisión de Criptato Amplificado resuelta en el Tiempo (TRACE) (Mathis. 1993. Clin Chem 39(9): 1953-9) para la detección de PlGF-2. La solución madre de anticuerpo conjugado Lumi4®-Tb y la solución de anticuerpo conjugado con cianina 5,5 se diluyeron a 0,125 pg/ml y 5 pg/ml con tampón de ensayo (100 mmol/L de fosfato de sodio pH 7, 0,375 % de proteasa libre de albúmina sérica bovina, 0,25 mg/ml de IgG de ratón, 0,25 mg/ml de IgG bovina, 0,25 mg/ml de IgG de cabra), respectivamente, antes de su uso. El PlGF-2 humano recombinante se diluyó en plasma humano normal desfibrinado tratado con calor para dar patrones de PlGF-2. El inmunoensayo se realizó mediante la incubación de 70 pl de muestra/estándar, 40 pl de disolución de anticuerpo conjugado de cianina 5,5 y 40 pl de disolución de anticuerpo conjugado Lumi4®-Tb a 37 °C en el instrumento PLUS compacto B.R.A.H.M.S K^rYPTOR (Thermo Fisher Scientific B.R.A.H.M.S GmbH, Hennigsdorf/Berlín, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El tiempo de reacción del ensayo fue de 29 min. La fluorescencia específica (RFU) se midió mediante la medición simultánea a doble longitud de onda a 707 y 620 nm usando un instrumento B.R.A.H.M.S KRYPTOR.

Ejemplo 3: Curva de dosis-respuesta del ensayo con el clon 477/G2

Se podría crear una curva dosis-respuesta utilizando el PlGF-2 recombinante (SEQ ID NO: 3) como material estándar en el inmunoensayo monoclonal como se describió anteriormente. En la Figura 2 se muestra una curva típica de dosis-respuesta.

Ejemplo 4: Especificidad de reconocimiento de la isoforma P1GF-2 mediante el ensayo

Los estándares comerciales de PlGF-1 y PlGF-2 se midieron usando el ensayo específico de PlGF-2. La Figura 3 muestra que el ensayo específico para PlGF-2 no tiene reactividad cruzada con la isoforma PlGF-1, por lo que este método detecta solo la isoforma PlGF-2 específica.

Ejemplo 5: Reconocimiento de un epítopo conformacional en la isoforma PlGF-2

El PlGF-2 recombinante se ensayó usando el ensayo PlGF-2 específico. Se prepararon muestras que contienen 10 |jg/ml del péptido de 21 aa específico para el dominio de unión a heparina de P1GF-2 (SEQ iD NO: 6). Se ha utilizado una alta concentración del péptido de 21 aa (1 x 106 veces mayor en comparación con el PlGF-2 recombinante) para inhibir el reconocimiento del PlGF-2 recombinante mediante el ensayo. No hubo inhibición de la señal cuando se añadió el péptido del dominio de unión a heparina específico en el ensayo (Figura 4), por lo que el péptido lineal de 21 aa correspondiente a la SEQ ID NO: 6 no fue reconocido por el anticuerpo monoclonal 477/G2. Este anticuerpo reconoció un epítopo conformacional en la isoforma PlGF-2.

Ejemplo 6: PlGF-2 en trastornos prenatales:

Población de estudio

Para determinar si PlGF-2 es un marcador útil para embarazos patológicos, se utilizó el fluoroinmunoensayo tipo sándwich homogéneo para PlGF-2 descrito anteriormente para evaluar a PlGF-2 en muestras de suero de 295 mujeres que tuvieron embarazos normales, 15 embarazos afectados por trisomía 21, 10 trisomía 18, 10 trisomía 13, 30 embarazos que posteriormente desarrollaron EP que requirió parto antes de las 34 semanas y 30 casos que dieron a luz a recién nacidos pequeños para la edad gestacional (PEG). El ensayo de PlGF-2 específico se calibró con PlGF-2 humano recombinante.

Se tomaron muestras del primer trimestre en la visita de rutina al hospital. Todas las mujeres embarazadas firmaron un formulario de consentimiento aprobado por el Comité de Ética del King's College Hospital.

Mediciones

PlGF-2 se puede detectar usando sistemas de inmunoensayo tipo sándwich totalmente automatizados en el instrumento B.R.A.H.M.S KRYPTOR compact PLUS (Thermo Scientific B.R.A.H.M.S GmbH, Hennigsdorf/Berlín, Alemania). Este analizador de acceso aleatorio emplea la tecnología de Emisión de Criptato Amplificado resuelta en el Tiempo (TRACE), en base a una transferencia no radiactiva entre dos fluoróforos. El ensayo automatizado para la detección de PlGF-2 se basa esencialmente en el ensayo de fluorescencia tipo sándwich utilizando un anticuerpo policlonal disponible comercialmente (R&D Systems Europe Ltd. Abingdon Reino Unido; Ref. No: AF-264-PB) y un nuevo anticuerpo monoclonal se une específicamente a PlGF-2 y se describe anteriormente. El ensayo de PlGF-2 específico se calibró con PlGF-2 humano recombinante. El ensayo BRAHMS PlGF-2 KRYPTOR tenía un rango de medición de 15 a 14. 461 pg/ml (Figura 2). La variación del ensayo de PlGF-2 se determinó para las muestras de control en 26 corridas con 2 repeticiones. La curva de calibración de la primera ejecución se utilizó como curva de referencia durante un período de 7 días. El límite de detección fue de 15 pg/ml y el límite de cuantificación (sensibilidad funcional) fue < 42 pg/ml. Las variaciones intraensayo e interensayo fueron de 8,8 % y 9,4 %, respectivamente a una concentración de PlGF-2 de 100 pg/ml, 2,3 % y 2,9 % a 505 pg/ml, 1,3 % y 2,4 % a 1.018 pg/ml.

Para determinar el riesgo de anomalía cromosómica en el feto, se midieron los siguientes parámetros en muestras de mujeres embarazadas tomadas durante el primer trimestre: i) PAPP-A, hCG beta libre, ii) PAPP-A, hCG beta libre, PlGF, iii) PAPP-A, hCG beta libre, PlGF, PlGF-2. La tasa de detección y la tasa de falsos positivos se determinaron mediante un algoritmo que combina estos biomarcadores.

Para el análisis de evaluación de riesgo del desarrollo de preeclampsia en gestantes se midieron los siguientes parámetros en muestras de dichos sujetos tomadas durante el primer trimestre: i) PAPP-A, PI, MAP, ii) PAPP-A, PI, MAP y PlGF iii) PAPP-A, PI, MAP, PlGF y PlGF-2. La tasa de detección y la tasa de falsos positivos se determinaron mediante un algoritmo que combina estos biomarcadores.

Análisis estadístico

Los algoritmos matemáticos para determinar el riesgo de aneuploidía fetal se calculan determinando las medianas para la población normal y la respectiva población de aneuploidía fetal. PAPP-A, hCG beta libre, PlGF y PlGF-2 se expresan en múltiplos de la mediana (MoM) para estandarizar los hallazgos. Un riesgo previo (expresado como probabilidades) se deriva de la prevalencia materna específica por edad y se multiplica por una razón de probabilidad (LR) de las distribuciones logarítmicas gaussianas de marcadores bioquímicos en embarazos afectados y no afectados. Para combinaciones de PAPP-A, hCG beta libre, PlGF y PlGF-2, se determinaron los coeficientes de correlación entre los valores de logaritmo de MoM en embarazos afectados y no afectados.

El proceso estadístico para realizar la estimación del riesgo se calcula determinando las medianas para los embarazos no afectados y los embarazos preeclámsicos. Para cada marcador bioquímico y biofísico se calcula un MoM. A continuación, se realiza un análisis gaussiano multivariado para determinar las razones de probabilidad. Para la determinación del riesgo de preeclampsia, el riesgo anterior se basó en el riesgo de la población general. Se aplicó la prueba U de Mann-Whitney para determinar la significación de las diferencias en los valores medianos de MoM en cada grupo de resultados con respecto a los de los controles.

Resultados

Las características de los pacientes se muestran en la Tabla 1. La mediana MoM de PlGF-2 en comparación con las muestras de control fue significativamente menor en muestras de mujeres con preeclampsia (p = 0,001), en muestras de mujeres del grupo PEG (p < 0,0001), en muestras de mujeres del grupo de trisomía 21 (p = 0,005), en muestras de mujeres del grupo de trisomía 18 (p = 0,001) y en muestras de mujeres del grupo de trisomía 13 (p = 0,004) (Tabla 2).

El análisis multiparamétrico para la evaluación del riesgo de trisomía 21 para el corte de riesgo 1 en 250 mostró (Tabla 3) que la determinación de la proteína plasmática A asociada al embarazo (PAPP-A), hCG beta libre, PlGF y PlGF-2 se caracterizó por la tasa falso positivo menor del 4,8 % en comparación con el FPR después de la medición de PAPP-A, hCG beta libre (FPR: 9,6 %) o después de la medición de PAPP-A, hCG beta libre y PlGF (FPR: 9,6 %). El análisis multiparamétrico para la evaluación del riesgo de trisomía 13 para el corte de riesgo 1 en 250 mostró (Tabla 4) que la determinación de la proteína plasmática A asociada al embarazo (PAPP-A), hCG beta libre, PlGF y PlGF-2 se caracterizó por la tasa de detección más alta del 100 % en comparación con la DR después de la medición de PAPP-A, hCG beta libre (DR: 90 %) o después de la medición de PAPP-A, hCG beta libre y PlGF (DR: 90 %).

El análisis multiparamétrico para la evaluación del riesgo de preeclampsia mostró (Tabla 5) que la determinación de la proteína plasmática A (PAPP-A) asociada al embarazo, el índice pulsátil (PI), la presión arterial media (MAP), PlGF y PlGF-2 se caracterizó por la mayor tasa de detección del 82 % en comparación con la tasa de detección después de la medición de P^a P^p-A, PI, M^a P (DR: 55 %) o después de la medición de PAPP-A, PI, MAP y PlGF (DR: 77 %).

Ejemplo 7: PlGF-2 en pacientes PEG y la preeclampsia, 3er trimestre:

Se determinaron los niveles de PlGF-2 de preeclampsia y pacientes pequeños para la edad gestacional (SGA) en el 3er trimestre del embarazo como se describe en el Ejemplo 6. Las características de los pacientes se muestran en la Tabla 6. La mediana MoM de P1GF-2 en comparación con las muestras de control fue significativamente inferior en muestras de mujeres con preeclampsia (p < 0,0001) y en muestras de mujeres del grupo SGA (p < 0,0001) en el 3er trimestre del embarazo (Tabla 7).

Tablas

T l 1: r rí i l l i n i.

Tabla 2: Comparación de la mediana (rango intercuartílico) de los valores múltiples de la mediana (MoM) del factor de crecimiento placentario 2 de cada grupo de resultados adversos con los controles. Comparación entre grupos de resultados mediante la prueba U de Mann-Whitney con corrección de Bonferroni post hoc; Nivel de i nifi ni P < 1 *.

Tabla 3: Tasa de detección (DR) y tasas de falsos positivos (FPR) para la evaluación del riesgo de aneuploidías m i n nlii mli r m ri n if r n l rim . R l m íri r l ri mí 21

Tabla 4: Tasa de detección (DR) y tasas de falsos positivos (FPR) para la evaluación del riesgo de aneuploidías

Tabla 5: Tasa de detección (DR) y tasas de falsos positivos (FPR) para la evaluación del riesgo de

T l : r rí i l l in i.

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Un método para el diagnóstico y/o pronóstico de preeclampsia, o el riesgo de parto de un recién nacido pequeño para la edad gestacional y/o para el diagnóstico del riesgo de parto de un niño con aneuploidía en una mujer embarazada o feto por nacer de dicho sujeto, que comprende

(i) determinar el nivel del factor de crecimiento placentario 2 (P1GF-2) en una muestra de un fluido corporal del sujeto,

(ii) comparar el nivel determinado en la muestra con un nivel de control derivado de sujetos sin preeclampsia, o el riesgo de parto de un recién nacido pequeño para la edad gestacional, o el riesgo de parto de un niño con aneuploidía;

en el que un nivel disminuido en la muestra del sujeto en comparación con el nivel de control es indicativo de preeclampsia, mayor riesgo de adquirir preeclampsia, mayor riesgo de agravamiento de la preeclampsia, mayor riesgo de parto de un neonato pequeño para la edad gestacional, mayor riesgo de agravamiento del riesgo de parto de un neonato pequeño para la edad gestacional, mayor riesgo de parto de un niño con aneuploidía y/o mayor riesgo de agravamiento del riesgo de parto de un niño con aneuploidía.

2. Un método para diagnosticar la preeclampsia o el riesgo de parto de un neonato pequeño para la edad gestacional y/o para diagnosticar el riesgo de parto de un niño con una aneuploidía en una mujer embarazada, en el que el nivel del factor de crecimiento placentario 2 (P1GF- 2) se determina en una muestra de un fluido corporal del sujeto que se va a diagnosticar y en la que un nivel de P1GF-2 por debajo de un "múltiplo de la mediana" (MoM) de 0,85 del grupo de control es indicativo de preeclampsia, o el riesgo de parto de un neonato pequeño para la edad gestacional y/o para diagnosticar el riesgo de parto de un niño con aneuploidía.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el método es un método de inmunoensayo que comprende las etapas de

(a) poner en contacto la muestra con un primer anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno o derivado del mismo específico para PlGF y un segundo anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno o derivado del mismo específico para PlGF-2 en condiciones que permitan la formación de un complejo ternario entre PlGF-2 y los dos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno o derivados de los mismos, y

(b) detectar la unión de los dos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno o derivados de los mismos a PlGF-2.

4. El método de inmunoensayo de la reivindicación 3, en el que dichos primeros y segundos anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos o derivados de los mismos son específicos para diferentes epítopos conformacionales y no superpuestos.

5. El método de inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o derivado del mismo es específico para un epítopo conformacional de PlGF-2.

6. El método de inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno o derivados de los mismos son anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales o anticuerpos monoclonales preparados por ingeniería genética.

7. El método de inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o derivado del mismo se produce por una línea celular de hibridoma seleccionada entre la célula 477/G2 depositada como DSM ACC3222 y la línea celular 477/E5 depositada como DSM ACC3221.

8. El método de inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que la muestra es un fluido corporal seleccionado de sangre, suero y plasma.

9. El método de inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, caracterizada porque uno de los anticuerpos está marcado y el otro anticuerpo está unido a una fase sólida o se puede unir selectivamente a una fase sólida.

10. El método de inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, en el que el primer y el segundo anticuerpo están presentes dispersos en una mezcla de reacción líquida, y en el que un primer componente de marcaje que es parte de un sistema de marcaje basado en la extinción o amplificación de la fluorescencia o quimioluminiscencia está unido al primer anticuerpo, y un segundo componente de marcaje de dicho sistema de marcaje está unido al segundo anticuerpo de manera que, tras la unión de ambos anticuerpos a PlGF-2 que se va a detectar, se genera una señal medible que permite la detección de los complejos tipo sándwich resultantes en la disolución de medición.

11. El método de inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque el sistema de mareaje comprende criptatos o quelatos de tierras raras en combinación con un colorante fluorescente o quimioluminiscente, en particular del tipo cianina.

12. El uso in vitro de un anticuerpo monoclonal para el diagnóstico y/o pronóstico de preeclampsia, o el riesgo de parto de un neonato pequeño para la edad gestacional y/o para el diagnóstico del riesgo de parto de un niño con aneuploidía en una mujer embarazada de acuerdo con el método de la reivindicación 1 o para diagnosticar preeclampsia, o el riesgo de parto de un neonato pequeño para la edad gestacional y/o para diagnosticar el riesgo de parto de un niño con una aneuploidía en una mujer embarazada de acuerdo con el método de la reivindicación 2, que se produce por una línea celular de hibridoma seleccionada de la línea celular 477/G2 depositada como DSM ACC3222 y la línea celular 477/E5 depositada como DSM ACC3221.

13. El uso in vitro de un kit para el diagnóstico y/o pronóstico de preeclampsia, o el riesgo de parto de un neonato pequeño para la edad gestacional y/o para el diagnóstico del riesgo de parto de un niño con aneuploidía en una mujer embarazada de acuerdo con el método de la reivindicación 1 o para diagnosticar preeclampsia, o el riesgo de parto de un neonato pequeño para la edad gestacional y/o para diagnosticar el riesgo de parto de un niño con una aneuploidía en una mujer embarazada de acuerdo con el método de reivindicación 2, que comprende

(i) un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o derivado del mismo que es específico para PlGF; y

(ii) un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o derivado del mismo que es específico para PlGF-2, en el que el segundo anticuerpo es el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12.

14. El uso del método de inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11, el uso del anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12 o el uso del kit de acuerdo con la reivindicación 13 para el diagnóstico y/o pronóstico de preeclampsia, o el riesgo de parto de un neonato pequeño para la edad gestacional y/o para el diagnóstico del riesgo de parto de un niño con aneuploidía en una mujer embarazada, en el que un nivel disminuido en una muestra de un fluido corporal del sujeto en comparación con un nivel de control derivado de sujetos sin preeclampsia, o el riesgo de parto de un neonato pequeño para la edad gestacional o el riesgo de parto de un niño con aneuploidía en una mujer embarazada es indicativo de preeclampsia, mayor riesgo de adquirir preeclampsia, mayor riesgo de agravamiento de preeclampsia, mayor riesgo de parto de un neonato pequeño para la edad gestacional, mayor riesgo de agravamiento del riesgo de parto de un neonato pequeño para la edad gestacional, mayor riesgo de parto de un niño con aneuploidía y/o mayor riesgo de agravamiento del riesgo de parto de un niño con aneuploidía.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o el uso de la reivindicación 14, en el que dicho sujeto se encuentra en el primer trimestre de embarazo.

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 o 15, en el que al menos un parámetro adicional relevante para el diagnóstico de preeclampsia se determina en la muestra, opcionalmente en el que

(a) el trastorno o afección es preeclampsia y el parámetro adicional preeclampsia es uno o más seleccionados del grupo que consiste en PAPP-A, marcadores de ultrasonido (índice pulsátil, muesca diastólica), presión arterial media, PlGF, sFlt, antecedentes maternos, endoglina soluble (sEng), inhibina A, activina A, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), gonadotropina coriónica humana (hCG) y ADN fetal libre de células,

(b) el trastorno o afección es aneuploidía y el parámetro adicional es uno o más seleccionados del grupo que consiste en PAPP-A, hCG beta libre, translucidez nucal, edad materna, AFP, PlGF, hueso nasal fetal, relación diámetro biparietal/hueso nasal, hCG, inhibina A, estriol 3 no conjugado (uE3) y ADN fetal libre de células, o

(c) el trastorno o afección es pequeño para la edad gestacional y el parámetro adicional es uno o más seleccionados del grupo que consiste en PAPP-A, antecedentes maternos, PlGF, sFlt, AFP, hCG beta libre, hCG, inhibina-A, activina A, sEng, altura sínfisis-fondo uterino (SFH), biometría fetal (longitud del fémur (FL), perímetro cefálico (HC), diámetro biparietal (DBP), circunferencia abdominal (AC)) y marcadores ecográficos (índice pulsátil, Doppler de arteria umbilical, Doppler de arteria cerebral, Doppler de ductus venoso).

17. El uso in vitro de una línea celular de hibridoma para el diagnóstico y/o pronóstico de preeclampsia, o el riesgo de parto de un neonato pequeño para la edad gestacional y/o para el diagnóstico del riesgo de parto de un niño con aneuploidía en una mujer embarazada de acuerdo con el método de la reivindicación 1 o para diagnosticar preeclampsia, o el riesgo de parto de un neonato pequeño para la edad gestacional y/o para diagnosticar el riesgo de parto de un niño con una aneuploidía en una mujer embarazada de acuerdo con el método de la reivindicación 2, seleccionado de la línea celular 477/G2 depositada como DSM ACC3222 y la línea celular 477/E5 depositada como DSM ACC3221.