CN105917232A

CN105917232A - 用于选择性确定胎盘生长因子2的方法

Info

Publication number: CN105917232A
Application number: CN201480065790.XA
Authority: CN
Inventors: 盖安·德米尔吉安; 德尔菲娜·埃斯皮纳斯
Original assignee: Cezanne SAS
Current assignee: Cezanne SAS
Priority date: 2013-12-03
Filing date: 2014-12-03
Publication date: 2016-08-31
Anticipated expiration: 2034-12-03
Also published as: WO2015082545A1; US20170003304A1; US11307209B2; CN105917232B; EP3077825B1; EP3077825A1; JP2017507317A; JP6639392B2; ES2841739T3

Abstract

本发明涉及用于在妊娠对象中进行胎盘生长因子2(PlGF‑2)检测的免疫测定方法。此外，本发明涉及所述方法用于对产前病症进行诊断、预后、风险评估和治疗控制的用途，其包括在所述妊娠对象中确定PlGF‑2的水平。

Description

用于选择性确定胎盘生长因子2的方法

技术领域

本发明属于临床诊断领域。特别地，本发明涉及在从患者之体液获得的样品中确定胎盘生长因子2(Placental Growth Factor 2，PIGF-2)或其片段的水平。

背景技术

全世界每年有至少1.3亿女性分娩。其中，约15％经历妊娠相关的并发症或疾病。例如，先兆子痫发生于多至5％的所有妊娠者、10％的首次妊娠者以及20％至25％具有慢性高血压病史的女性中。妊娠期高血压病可导致母体和胎儿发病率，并且其仍然是母体死亡率的主要原因。

在很多国家，用于确定产前并发症和/或胎儿异常之风险的筛选方法已变得常规以帮助治疗和建议妊娠女性。例如，在欧洲，医护人员通常使用母体血液中存在的生化标志物来筛选胎儿中的染色体异常。已证明，母体年龄、血清学标志物妊娠相关的血浆蛋白A(pregnancy associatedplasma potein A，PAPP-A)和游离β人绒毛膜促性腺激素(free-betahuman chorionic gonadotropin，β-hCG)以及超声标志物(ultrasoundmarker)颈半透明度(nuchal translucency，NT)厚度的组合在第11至13周内起作用，其中对唐氏综合征(Down syndrome)的检测率为约82％至90％，假阳性率为5％(Malone等2005.NEJM353(19)：2001-2010； Bindra等2002.Ultrasound Obstet Gynecol 20：219-225)。这样的筛选有助于鉴定具有足够高风险而证明有必要进行进一步的诊断测试的女性，所述测试可以是侵入性的并且为胎儿带来风险。然而，这种筛选仍然不能检测显著数量的唐氏综合征病例以及其他受非整倍性(aneuploidy)影响的妊娠者，并且诊断仍有5％呈假阳性。

目前，还没有常规的筛选用于使用母体样品来早期检测先兆子痫。寻求可预测这一危及生命之妊娠病症的发生或有助于其检测的非侵入性生物标志物仍至关重要。如果可更早检测先兆子痫的发生，在很多情况下可获得更佳的结果，包括严重程度降低以及甚至复原。在妊娠期的早期或晚期阶段，用于发展中先兆子痫或者评估先兆子痫存在的可靠风险评估方法将降低妊娠女性、婴儿或二者之不利健康结果的可能性。

多年来，基于在先兆子痫情况下已注意到的病理生理观察结果，已对不同的生物物理和生物化学标志物进行了研究，例如胎盘功能障碍、广泛性炎性应答、内皮功能障碍和凝血系统活化(Grill等2009.Reproductive Biology and Endocrinology 7：70)。最广泛地用于预测先兆子痫的成像技术是子宫胎盘多普勒超声。胎盘灌注受损可通过测量流量波形比(flowwaveform ratio)或者通过检测子宫弓形血管的舒张期切迹(diastolicnotching)来评估。然而，已表明，在低风险和高风险患者组两者中，预测值均并未足够高以建议常规筛选(Conde-Agudelo等2004.Obstet Gynecol 104：1367-1391)。

目前，认为母体样品中存在的很多生物标志物与先兆子痫有关。这些潜在的标志物包括血管发生因子(例如，胎盘生长因子(PIGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、可溶性fms-样酪氨酸激酶-1(soluble fms-like tyrosine kinase-1，sFlt-1))、可溶性内皮糖蛋白(soluble endoglin，sEng)、P-选择蛋白、无细胞胎儿DNA(cell-freefetal DNA)、ADAM 12、胎盘蛋白13(placental protein 13，PP-13)、正五聚蛋白3(Pentraxin 3，PTX3)和妊娠相关的血浆蛋白A(PAPP-A)(Grill等2009.Reproductive Biology and Endocrinology7：70)。目前，提出将胎盘生长因子(PIGF)用于评估妊娠女性发生先兆子痫的风险(Akolekar等2008.Ultrasound Obstet Gynecol 32：732-739)。尽管PIGF作为先兆子痫的可靠标志物已得到一定程度的认可，但是期望具有以更高特异性、灵敏度和预测力为特征的作为替代和另外的标志物。

因此，需要用于产前并发症和/或胎儿异常的精确筛选方法。

胎盘生长因子(PIGF)(与血管内皮生长因子(VEGF)同源的血管发生糖蛋白)由于PIGF初级转录物的选择性mRNA剪接而在人中以至少4种同工型存在(De Falco，2012.Exp Mol Med44：1-9)。这些同工型命名为PIGF-1、PIGF-2、PIGF-3和PIGF-4。术语“PIGF”在不同同工型之间并无区别。四种同工型之间的主要差异为：PIGF-1和3是非肝素结合的并且可潜在地以旁分泌方式影响靶标，而PIGF-2和4具有额外的肝素结合结构域并且最可能以自分泌方式工作。认为主要的同工型是PIGF-1和PIGF-2。PIGF-1(SEQ ID NO：2)包含131个氨基酸(MW＝单体14.7kDa，二聚体29.4kDa)。PIGF-2(SEQ ID NO：3)包含PIGF-1序列并且额外含有21个氨基酸的肝素结合位点插入片段(MW＝单体17.3kDa，二聚体34.6kDa)。因此，全长PIGF-2蛋白的长度为152个氨基酸。PIGF-3(SEQ ID NO：4)包含PIGF-1并且在C-末端附近包含72个氨基酸的插入片段(MW＝单体22.8kDa，二聚体45.6kDa)。因此，全长PIGF-3蛋白的长度为203个氨基酸。PIGF-4(SEQ ID NO：5)包含PIGF-3和21个氨基酸的肝素结合位点插入片段(MW＝单体26.2kDa，二聚体52.4kDa)。因此，全长PIGF-4蛋白的长度为224个氨基酸。

PIGF在多种生理和病理条件下是血管发生的关键调节物。不同PIGF同工型调节血管形成的确切分子机制尚未完全了解(Fischer等2008.Nat Rev Cancer 8：942-956)。已报道，由不同PIGF形式诱导的血管发生响应是有区别的(Hoffmann等2013.J Biol Chem 288：17976-17989)。已证明，PIGF-2而非PIGF-1通过肝素结合结构域与肝素特异性结合，并且这一相互作用对于细胞迁移、血管生长和血管出芽(vascular sprouting)而言至关重要。

在妊娠期，PIGF参与胎盘发育，并且数项研究已报道在具有胎儿21三体(唐氏综合征)、18三体(爱德华兹综合征(Edwards Syndrome))和13三体(帕陶综合征(Patau Syndrom))的妊娠者中，在随后发生先兆子痫的妊娠者中并且在分娩小于胎龄的(small for gestational age，SGA)新生儿的妊娠者中，母体血清PIGF浓度在妊娠的11⁺⁰至13⁺⁶周降低(Levine等2004.NEJM 350：672-683；Zarasoza等2009.Ultrasound Obstet Gynecol 33：382-386；Pandya等2012.Fetal Diagn Ther 31：87-93； Akolekar等2008.Ultrasound Obstet Gynecol 32：732-739；Poon等2008. Prenat Diagn 28：1110-1115)。在所有这些研究中，主要测量的同工型为PIGF-1。关于正常或病理性妊娠者中PIGF-2的母体血清浓度，仍没有研究报道。对于人血液中循环PIGF-2同工型的绝对浓度及其用于在妊娠女性中诊断胎儿非整倍性、先兆子痫和SGA的相关性，仍一无所知。WO2010/059952A1报道，相对于对照样品，在先兆子痫患者的样品中PIGF-2的水平提高。

本发明人已出人意料地发现，在具有产前病症之对象的样品中PIGF-2的水平降低。他们已发现，在来自妊娠女性的体液样品中测量特异性PIGF-2同工型(PIGF-2)的水平可用于确定妊娠女性发生先兆子痫，怀有具有胎儿非整倍性的胎儿和/或小于胎龄的胎儿(“小于胎龄儿”(SGA))的风险是否提高。

在规范PIGF前体序列SEQ ID NO：1(UniProfKB/Swiss-Prot登录号P49763)中，1至18位氨基酸代表信号序列，132至203位氨基酸代表功能未知的结构域，并且在该前体中，214至234位氨基酸代表肝素结合结构域。PIGF-1的氨基酸序列由SEQ ID NO：2表示。在PIGF-2(SEQ IDNO：3)中，124至144位氨基酸代表肝素结合结构域(SEQ ID NO：6)。在PLGF-3(SEQ ID NO：4)中，114至185位氨基酸代表功能未知的结构域(SEQ ID NO：7)，在此将其称为“环3”。在PIGF-4(SEQ ID NO：5)中，114至185位氨基酸代表环3并且196至216位氨基酸代表肝素结合结构域。在下文，给出了PIGF家族的氨基酸序列及相关氨基酸序列；在前体中，1至18位氨基酸代表信号序列(以下划线标出)；前体中的214至234位氨基酸、PIGF-2中的124至144位氨基酸和PIGF-4中的196至216位氨基酸代表肝素结合结构域(斜体)；前体中的132至203位氨基酸、PLGF-3中的114至185位氨基酸和PIGF-4中的114至185位氨基酸代表功能未知的结构域(粗体)。

PLGF(PGF)同工型的前体(规范序列)(SEQ ID NO：1；登录号P49763)：

成熟PIGF-1(SEQ ID NO：2)：

成熟PIGF-2(SEQ ID NO：3)：

成熟PIGF-3(SEQ ID NO：4)：

成熟PIGF-4(SEQ ID NO：5)：

肝素结合结构域(SEQ ID NO：6)

RRPKGRGKRR REKQRPTDCH L

“环3”(SEQ ID NO：7)

HSPGRQSPDM PGDFRADAPS FLPPRRSLPM LFRMEWGCAL TGSQSAVWPS

SPVPEEIPRM HPGRNGKKQQ RK

发明内容

本发明涉及用于在妊娠雌性对象或所述对象的未出生胎儿中对产前病症或状况进行诊断、预后、风险评估、风险分级和/或治疗控制的方法，其包括：

(i)在来自所述对象的样品中确定胎盘生长因子2(PIGF-2)的水平，

(ii)将所述样品中所测定的水平与由无产前病症或状况之对象获得的对照水平进行比较；

其中与对照水平相比，来自所述对象之样品中的水平降低指示产前病症或状况和/或所述对象或胎儿获得产前病症或状况的风险提高和/或产前病症或状况加重的风险提高。

本发明还涉及用于在妊娠雌性对象或所述对象的未出生胎儿中诊断产前病症或状况的方法，其中在来自待诊断对象的样品中确定胎盘生长因子2(PIGF-2)的水平，并且其中PIGF-2的水平低于0.90、0.85、0.80、0.75或0.70“中位数倍数”(multiple of the median，MoM)指示产前病症或状况。

此外，本发明涉及用于检测胎盘生长因子2(PIGF-2)的免疫测定方法，其包括以下步骤：

(a)在以下条件下使怀疑含有PIGF-2的样品与PIGF特异性的第一抗体或者其抗原结合片段或衍生物接触并且与PIGF-2特异性的第二抗体或者其抗原结合片段或衍生物接触，所述条件允许在PIGF-2和这两种抗体或者其抗原结合片段或衍生物之间形成三元复合物，以及

(b)检测这两种抗体或者其抗原结合片段或衍生物与PIGF-2的结合。

本发明的免疫测定方法可用于本发明之诊断方法的情形。本发明还涉及用于本发明方法的抗体和试剂盒。

附图说明

图1示出了单克隆PIGF-2抗体477/E5和477/G2的剂量响应曲线。

图2示出了实施例2和3之使用时间分辨放大穴状化合物发射(TimeResolved Amplified Cryptate Emission，TRACE)技术的PIGF-2均相夹心荧光免疫测定(homogenous sandwich fiuoroimmunoassay)的剂量响应曲线。

图3：PIGF-1和PIGF-2的剂量响应曲线示出针对PIGF-2的特异性测定对于PIGF-1同工型没有交叉反应性(实施例4)。

图4：在对应于肝素结合位点之21-aa肽存在或不存在下的PIGF-2浓度的确定。当在测定中添加特异性肝素结合结构域肽时，对信号没有抑制，因此单克隆抗体477/G2不识别对应于SEQ ID NO：6的线性21aa肽。

发明详述

本发明提供了用于对产前病症或状况进行诊断、预后、风险评估和/或治疗控制的方法。所述产前病症或状况可以是母体病症或状况或者胎儿病症或状况。所述方法基于特异性地检测母体样品中PIGF同工型2(PIGF-2)的水平，即在妊娠雌性对象的样品中确定PIGF-2水平。PIGF-2水平相对于对照组降低指示产前病症或状况。因此，本发明的诊断方法可用于在妊娠雌性对象中或者在其未出生的胎儿中对产前病症或状况进行诊断、预后、风险评估、风险分级和/或治疗控制。

因此，在一个方面，本发明涉及用于在妊娠雌性对象或所述对象的未出生胎儿中对产前病症或状况进行诊断、预后、风险评估、风险分级和/或治疗控制的方法，其包括：

本发明还涉及用于在妊娠雌性对象或所述对象的未出生胎儿中诊断产前病症或状况的方法，其中在来自待诊断对象的样品中确定胎盘生长因子2(PIGF-2)的水平，并且其中PIGF-2的水平低于对照组之0.90、0.85、0.80、0.75或0.70“中位数倍数”(MoM)指示产前病症或状况。中位数倍数(MoM)是单独测试结果偏离对照组之中位数的程度的量度。MoM通常用于报道医学筛选测试的结果，特别是当单独测试的结果高度可变时。产前筛选分析物的浓度在整个妊娠期间不断改变。例如，母体血清中的AFP浓度在用于检测开放性神经管缺陷的最有利时间期间(妊娠第15至20周)每周提高约15％。将这些数值转化为胎龄特异性的中值(MoM)使这一胎龄效应归一化。因此，实验室可首先从例如300至500位女性常规获得的血清获得测量值。测量结果初始以质量单位(例如，ng/ml)或国际单位(例如，IU/ml)表示。使用加权对数线性回归分析(weightedlog-linear regression analysis)来计算方程以确定所讨论分析物在每个妊娠周的中位数水平。然后，将每位女性的测量结果除以合适胎龄的中值，得到中位数倍数(MoM)。根据定义，女性群体中的整体中值为1.00MoM。“中位数倍数”指应用于中值的因子，例如0.90意指中值的90％。优选的MoM值为0.85、0.80或0.75，更优选的为0.80和0.75，并且最优选的为0.75。合适的阈值可例如由下表2得出。在下文，将对示例性的阈值进行讨论。然而，基于期望的特异性和/或灵敏度或者对照组，还可使用其他阈值。例如，低于122.3pg/ml(对应于0.83的MoM)的值可指示先兆子痫。低于128.7pg/ml(对应于0.75的MoM)的值可指示小于胎龄儿。用于13三体、18三体和21三体的合适阈值分别为例如125pg/ml(对应于0.75的MoM)、113pg/ml(对应于0.81的MoM)和99.6pg/ml(对应于0.76的MoM)。

作为替代地，可使用新开发的“极端度”(degree of extremeness，DoE)代替MoM用于血液来源的标志物的风险计算(Merz 2007.Ultraschall in Med 28：270-272；Schmidt等2007.Frauenarzt 48：1089-1092)。DoE是中值和实际值之间的距离与中值和第五百分位数之间的距离(当测量指低于中位数时)或中位数与第95百分位数之间的距离(当测量值高于中位数时)的比(Merz 2007.Ultraschall in Med28：270-272；Merz等2007. Ultrasound Obstet Gynecol30：542-543)。在该假设下，在中值时DoE为0，在第95百分位数时DoE为1.0，并且在第5百分位数时DoE为-1.0。另外，可使用贝叶斯定理(Bayesian theorem)(Schetinin等2007.IEEE Trans Inf Technol Biomed 11：312-319)代替Palomaki和Haddow的序贯似然比(sequential likelihood ratio)的数学概念(Palomaki和Haddow 1987.Am J Obstet Gynecol 156：460-463)。

所述产前病症或状况可以是妊娠雌性对象或该对象的未出生胎儿的病症或状况。例如，所述产前病症或状况可以是妊娠雌性对象中的先兆子痫。所述产前病症或状况还可涉及不利的妊娠结果，例如雌性对象分娩“小于胎龄儿”或具有异常(例如非整倍性)的孩子的风险。因此，胎儿的产前病症或状况可以是例如“小于胎龄儿”或非整倍性。

在另一方面，本发明涉及用于检测PIGF-2的免疫测定方法，其可用于本发明的诊断方法的情形。所述免疫测定方法基于使用PIGF-2特异性的抗体(优选单克隆抗体)检测PIGF-2，即该抗体优选地不与其他抗原，特别是PIGF-2的其他同工型交叉反应。在该免疫测定中，可使用两种抗体的组合，例如以夹心形式(参见下文)，其中至少一种抗体对PIGF-2具有特异性。例如，第一抗体对PIGF具有特异性(不一定对同工型2具有特异性但是在任何情况下均能够与PIGF-2结合)，而第二抗体对PIGF-2具有特异性。因此，本发明涉及用于检测胎盘生长因子2(PIGF-2)的免疫测定方法，其包括以下步骤：

在下文，除非另外说明，否则术语“抗体”还包括抗原结合片段或衍生物。第一抗体可以是PIGF特异性的任何抗体，只要其检测PIGF-2即可。这样的抗体可商购获得。例如，第一抗体可以是针对人PIGF的多克隆抗体。这样的抗体可从例如R&D Systems Europe Ltd.(参考号：AF-264-PB)购买。

在根据本发明的免疫测定方法中，所述第二抗体可对PIGF-2序列(SEQ ID NO：3)中，优选肝素结合结构域(SEQ ID NO：6)中的表位具有特异性。然而，优选地第二抗体针对其他PIGF同工型中不存在的PIGF-2的构象表位。第二抗体优选地是单克隆抗体。

如下文将更详细讨论的，本文中所述的免疫测定方法的(第一和/或第二)抗体或者其抗原结合片段或衍生物可以是例如多克隆抗体、单克隆抗体或遗传工程化单克隆抗体。

优选地在本文中，所述第一和第二抗体或者其抗原结合片段或衍生物对PIGF-2的非重叠的不同构象表位具有特异性。

第一抗体或者其抗原结合片段或衍生物可例如对SEQ ID NO：1的序列内包含的表位具有特异性。

第二抗体或者其抗原结合片段或衍生物可例如通过选自以下的杂交瘤细胞系产生：于2013年11月21日以DSM ACC3222保藏在德国微生物菌种保藏中心Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ；Inhoffenstr.7B，Braunschweig，Germany)的细胞系477/G2，和于2013年11月21日以DSM ACC3221保藏在DSMZ的细胞系477/E5，优选地在本文中第二抗体通过以DSM ACC3222保藏的杂交瘤细胞系477/G2产生。

优选地在本文中，第一抗体是多克隆的抗PIGF抗体，例如由R&DSystems Europe Ltd.Abingdon UK以参考号：AF-264-PB提供的可商购抗体。在一个具体实施方案中，第一抗体是多克隆的抗PIGF抗体，例如由R&D Systems Europe Ltd.Abingdon UK以参考号：AF-264-PB提供的可商购抗体，而第二抗体是通过以DSM ACC3222保藏的杂交瘤细胞系477/G2产生的抗体。

抗体与PIGF-2的结合发生于合适的条件下(即，允许免疫反应，即抗体与PIGF-2结合形成免疫复合物)。这样的条件是技术人员已知的并且可使用例如如下文所述的免疫测定的标准形式。这样的条件将优选地处于生理温度、pH和离子强度之下，并且可发生于介质例如，如磷酸缓冲盐水(PBS)中。

优选的检测方法包括多种形式的免疫测定，例如，如放射免疫测定(radioimmunoassay，RIA)、化学发光-和荧光-免疫测定、酶免疫测定(enzyme immunoassay，EIA)、酶联免疫测定(Enzyme-linkedimmunoassay，ELISA)、基于Luminex的珠阵列、蛋白质微阵列测定、快速测试形式(例如，如免疫层析条测试)、和选择/多重反应监测(Selected/Multiple reaction monitoring，SRM/MRM)。

所述测定可以是均相或异相测定、竞争性或非竞争性测定。在一个特别优选的实施方案中，所述测定是夹心测定的形式，其是一种非竞争性免疫测定，其中待检测和/或量化的分子与第一抗体结合并且与第二抗体结合。第一抗体可结合于固相，例如珠，孔或其他容器的表面，芯片或条，而第二抗体是例如经染料、放射性同位素或者反应性或催化活性部分标记的抗体。然后，通过合适的方法测量与分析物结合的经标记抗体的量。有关“夹心测定”的一般性组合物和程序是公认的并且为技术人员所知(The Immunoassay Handbook Ed.David Wild，Elsevier LTD，Oxford；第3版 (2005年5月)，ISBN-13：978-0080445267；Hultschis C等，Curr Opin Chem Biol.2006年2月；10(l)：4-10.PMID：16376134，其通过引用并入本文)。

在一个特别优选的实施方案中，所述测定包含两种捕获分子，优选抗体，这二者在液体反应混合物中均作为分散体存在，其中第一标记组分与第一捕获分子连接，其中所述第一标记组分是基于荧光-或者化学发光-猝灭或放大的标记系统的一部分，所述标记系统的第二标记组分与第二捕获分子连接，以使得在这两种捕获分子与分析物结合之后，产生可测量的信号，这允许在包含样品的溶液中检测所形成的夹心复合物。

甚至更优选地，所述标记系统包含与荧光或化学发光染料特别是花菁型染料组合的稀土穴状化合物(cryptate)或稀土螯合物。

在本发明的情形下，基于荧光的测定包括使用染料，其可例如选自包括以下的组：FAM(5-或6-羧基荧光素)、VIC、NED、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、IRD-700/800、花菁染料(例如，CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7)、Xanthen、6-羧基-2’，4’，7’，4，7-六氯荧光素(HEX)、TET、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素(JOE)、N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5)、6-羧基罗丹明-6G(RG6)、罗丹明、罗丹明绿、罗丹明红、罗丹明110、BODIPY染料(例如，BODIPY TMR)、俄勒冈绿(Oregon Green)、香豆素类(例如，伞形酮)、苯甲亚胺(Benzimide)(例如Hoechst 33258)；菲啶类，例如德克萨斯红、Yakima Yellow、Alexa Fluor、PET、溴化乙锭、吖啶染料、咔唑染料、吩嗪染料、卟啉染料、聚甲炔染料，等。

在本发明的情形下，基于化学发光的测定包括基于Kirk-Othmer， Encyclopedia of chemical technology，第4版，执行编辑，J.I.Kroschwitz；编辑，M.Howe-Grant，John Wiley&Sons，1993，第15卷，第518-562页中针对化学发光材料所述的物理原理来使用染料，其包括第551至562页的引用内容在内通过引用并入本文。优选的化学发光染料是吖啶酯类。PIGF-2可例如使用全自动化夹心免疫测定系统在B.R.A.H.M.SKRYPTOR紧凑型PLUS设备(Thermo Scientific B.R.A.H.M.S GmbH，Hennigsdorf/Berlin，Germany)上进行检测。这种随机存取分析仪采用基于两种荧光团之间的非放射性迁移的灵敏性时间分辨放大穴状化合物发射(TRACE)技术。

在本发明的一些具体实施方案中，一种抗体(例如，第一抗体)是经标记的，而另一种抗体(例如，第二抗体)与固相结合或者可选择性地与固相结合。然而，如上所述，优选地在本发明方法的背景下，第一和第二抗体以分散于液体反应混合物中的方式存在，并且其中第一标记组分与第一抗体结合，所述第一标记组分是基于荧光或者化学发光消失或放大的标记系统的一部分，并且所述标记系统的第二标记组分与第二抗体结合，以使得在这两种抗体与待检测的PIGF-2结合之后，产生允许在测量溶液中检测所得夹心复合物的可测量信号。

本文中提及的“测定”或“诊断测定”可以是应用于诊断领域中的任何类型。这样的测定可基于待检测分析物以一定亲和力与一种或更多种捕获探针结合。考虑到捕获分子与靶分子或目标分子之间的相互作用，亲和常数优选地大于10⁸M^-1。

测定的“灵敏度”涉及本身正确鉴定的真实阳性的比例，即鉴定阳性结果的能力(真阳性阳性结果/阳性数)。因此，用测定可检测的分析物的浓度越低，该测定的灵敏度越高。测定的“特异性”涉及本身正确鉴定的阴性的比例，即鉴定阴性结果的能力(真阴性/阴性结果)。对于抗体而言，“特异性”定义为单个抗原结合位点与仅一种抗原表位反应的能力。抗体的结合特性还可在其“亲和力(affinity)”及其“亲合力(avidity)”方面进行表征。抗体的“亲和力”是单一抗原表位和单个抗原结合位点之间的反应强度的量度。抗体的“亲合力”是具有很多表位的抗原和多价抗体之间的整体结合强度的量度。

诊断和/或预后测试的灵敏度和特异性不仅仅取决于该测试的分析“质量”，而且其还取决于什么构成了异常结果的限定。实际上，接受者操作特征曲线(Receiver Operating Characteristic curve，ROC曲线)通常通过绘制“正常”(即，不具有产前病症或状况的明显健康个体)和“患病”群体中变量值相对其相对频率来计算。对于任何具体的标志物而言，患有疾病和未患疾病之对象的标志物水平的分布将可能重叠。在这样的条件下，测试并非绝对100％准确地使正常与患病区别开，并且重叠区域指示该测试不能区别正常与患病的区域。选择这样的阈值，低于该阈值时认为测试异常而高于该阈值时认为测试正常。ROC曲线下面积是所认为测量将允许正确鉴定状况的概率的量度。甚至在测试结果不一定给出准确数时也可使用ROC曲线。只要可对结果进行排序，就可以生成ROC曲线。例如，可根据程度对“患病”样品的测试结果进行排序(例如，例如1＝低、2＝正常和3＝高)。这一排序可与“正常”群体中的结果相关联，并且生成ROC曲线。这些方法是本领域中公知的。参见，例如，Hanley等 1982.Radiology 143：29-36。优选地，选择提供以下ROC曲线面积的阈值：大于约0.5、更优选大于约0.7、仍更优选大于约0.8、甚至更优选大于约0.85并且最优选大于约0.9。在这一情形下，术语“约”指给定测量结果的+/-5％。

ROC曲线的横轴代表(1-特异性)，其随假阳性的比率而增加。该曲线的纵轴代表灵敏度，其随真阳性的比率而增加。因此，对于选定的具体截止值而言，可确定(1-特异性)的值，并且可获得对应的灵敏度。ROC曲线下面积是所测量标志物水平将允许正确地鉴定疾病或状况的概率的量度。因此，ROC曲线下面积可用于确定测试的有效性。

在另一些实施方案中，使用阳性似然比(positive likelihood ratio)、阴性似然比(negative likelihood ratio)、比值比(odds ratio)或风险比(hazard ratio)作为测试预测风险或者诊断病症或状况(“患病组”)的能力的量度。在阳性似然比的情况下，1的值指示阳性结果在“患病”和“对照”两组中的对象之间同等可能；大于1的值指示阳性结果更可能在患病组中；并且小于1的值指示阳性结果更可能在对照组中。在阴性似然比的情况下，1的值指示阴性结果在“患病”和“对照”两组中的对象之间同等可能；大于1的值指示阴性结果更可能在测试组中；并且小于1的值指示阳性结果更可能在对照组中。

在比值比的情况下，1的值指示阳性结果在“患病”和“对照”两组中的对象之间同等可能；大于1的值指示阳性结果更可能在患病组中；并且小于1的值指示阳性结果更可能在对照组中。

在风险比的情况下，1的值指示终点(例如，死亡)的相对风险在“患病”和“对照”两组中相等；大于1的值指示患病组中的风险更大；并且小于1的值指示对照组中的风险更大。

技术人员将了解，将诊断或预后指标与诊断或未来临床结果的预后风险联系起来是一种统计学分析。例如，如通过统计学显著性水平所确定的，与水平大于或等于X的患者相比，低于X的标志物水平可预示患者更可能遭受不良结果。另外地，标志物浓度相对于基线水平的变化可反映患者的预后，并且标志物水平的变化程度可与不良事件的严重程度相关。通常通过比较两个或更多个群体并确定置信区间和/或p值来确定统计学显著性。参见，例如，Dowdy and Wearden，Statistics for Research，John Wiley&Sons，New York，1983。本发明的优选置信区间为90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％和99.99％，而优选的p值为0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001和0.0001。

术语“抗体”一般包括单克隆抗体和多克隆抗体及其结合片段(特别是Fc片段)以及所谓的“单链抗体”(Bird R.E.第(1988)Science 242：423-6)、嵌合抗体、人源化抗体(特别是CDR接枝抗体)，和二抗体或四抗体(Holliser P.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-8)。还包括通过技术(包括例如噬菌体展示)选择的与样品中包含的目标分子特异性结合的免疫球蛋白样蛋白。在这一情形下，术语“特异性结合”指针对目标分子或其片段而产生的抗体。如果抗体对目标分子或其前述片段的亲和力至少优选地50倍、更优选地100倍、最优选地至少1000倍高于对包含该目标分子之样品中含有的其他分子的亲和力，则认为该抗体是特异性的。如何制备抗体并选择具有给定特异性的抗体在本领域中是公知的。如上文所述，优选的是单克隆抗体。

本发明还涉及通过选自以下的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体：以DSM ACC3222保藏的细胞系477/G2和以DSM ACC3221保藏的细胞系477/E5。本发明还涉及与通过选自以下之杂交瘤细胞系产生的抗体结合相同表位的抗体：以DSM ACC3222保藏的细胞系477/G2和以DSMACC3221保藏的细胞系477/E5。

本发明还涉及用于检测PIGF-2的试剂盒，其包含：

(i)对PIGF具有特异性的第一抗体或者其抗原结合片段或衍生物；和

(ii)对PIGF-2具有特异性的第二抗体或者其抗原结合片段或衍生物。

例如，(i)第一抗体或者其抗原结合片段或衍生物对SEQ ID NO：1序列内包含的表位具有特异性；和/或(ii)第二抗体或者其抗原结合片段或衍生物对PIGF-2的结构表位具有特异性。优选地，所述试剂盒的第一抗体是多克隆抗PIGF抗体，例如由R&D Systems Europe Ltd.Abingdon UK以参考号：AF-264-PB提供的可商购抗体。在所述试剂盒的一个具体实施方案中，第一抗体是多克隆抗PIGF抗体，例如由R&D Systems EuropeLtd.Abingdon UK以参考号：AF-264-PB提供的可商购抗体，而第二抗体是通过以DSMACC3222保藏的杂交瘤细胞系477/G2产生的抗体。

在所述试剂盒的一个实施方案中，第二抗体是通过选自以下的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体：以DSM ACC3222保藏的细胞系477/G2和以DSM ACC3221保藏的细胞系477/E5，优选是通过选自以DSM ACC3222保藏之细胞系477/G2的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体。

本发明还提供了杂交瘤细胞系，其选自以DSMACC3222保藏的细胞系477/G2和以DSM ACC3221保藏的细胞系477/E5。

本发明例如还涉及根据本发明的试剂盒在夹心免疫测定形式中的用途，所述夹心免疫测定形式用于在来自体液的生物样品中检测和/或量化PIGF-2或其片段。这样的片段至少包含跨越所述两种抗体所针对的两个表位的序列，例如，所述试剂盒可用于检测和/或量化总PIGF-2。

术语“样品”优选是生物样品。本文中使用的“样品”可例如指出于对目标对象(例如患者)进行诊断、预后或评价的目的而获得的体液或组织样品。出于本发明的目的，“患者”或“对象”包括人和其他动物(特别是哺乳动物)二者，以及其他生物体。因此，所述方法适用于人诊断和兽医应用两方面。在一个优选实施方案中，所述患者是哺乳动物，在最优选的实施方案中，所述患者或对象是人。

优选地在本文中，所述样品是妊娠雌性对象的体液或组织样品。优选的是体液样品。优选的测试样品包括血液、血清、血浆、脑脊液、尿、唾液、痰和胸腔积液。另外，本领域技术人员会意识到，一些测试样品在分级或纯化操作(例如将全血分离成血清或血浆组分)之后将更容易进行分析。因此，在本发明的一个优选实施方案中，所述样品选自包括以下的组：血液样品、血清样品、血浆样品、脑脊液样品、唾液样品和尿样品或前述任意样品的提取物。优选地，所述样品是血液样品，更优选血清样品或血浆样品。在本发明的情形下，最优选的样品是血清样品。

在本发明的情形下，“血浆”为在离心之后获得的含抗凝剂血液的基本无细胞上清液。示例性的抗凝剂包括钙离子结合化合物(例如EDTA或柠檬酸盐)和凝血酶抑制剂(例如肝素盐类或水蛭素)。无细胞血浆可通过在2000至3000g下离心抗凝化的血液(例如，柠檬酸化、EDTA或肝素化血液)至少15分钟获得。

“血清”为在使血液凝结之后收集的全血的液体级分。当离心凝固的血液(凝结的血液)时，可以以上清液获得血清。其不包含血纤维蛋白原，但是一些凝血因子保留下来。

适当时，需要在用于本发明之前均化样品或者用溶剂萃取样品以获得液体样品。在此，液体样品可以是溶液或混悬液。可在用于本发明之前对液体样品进行一次或更多次预处理。这样的预处理包括但不限于稀释、过滤、离心、浓缩、沉降、沉淀、透析。预处理还可包括向溶液添加化学或生化物质，例如酸、碱、缓冲液、盐、溶剂、反应性染料、去污剂、乳化剂、螯合剂。

本发明的方法还涉及确定样品中PIGF-2的水平以用于对医学状况进行诊断或预后或风险评估或筛选。

在本发明的另一个实施方案中，根据本发明的方法可用于检测总PIGF-2以对产前病症进行诊断或预后或风险评估或筛选，其包括以下步骤：

(i)提供对象的体液样品，

(ii)确定所述对象样品中PIGF-2的量，

(iii)将PIGF-2的量与参照样品进行比较，其中相对于参照样品的降低指示存在产前病症。

因此，本发明的免疫测定、抗体或试剂盒可用于在对象中对病症或状况进行诊断、预后、风险评估、风险分级和/或治疗控制。

在本发明的情形下，所述病症或状况优选为妊娠雌性对象中或胎儿中的产前病症或状况。在本发明的情形下，妊娠雌性对象中的产前病症或状况优选地选自先兆子痫或分娩具有非整倍性之孩子的风险或分娩小于胎龄的新生儿的风险。

在本发明的情形下，所述对象可处于妊娠首三个月、妊娠中三个月或妊娠末三个月。优选地，所述对象处于妊娠首三个月。然而，所述对象还可处于中三个月。所述对象还可处于末三个月。特别地，在先兆子痫或小于胎龄儿的情况下，所述对象可处于妊娠首三个月、妊娠中三个月或妊娠末三个月，优选首三个月。

在本发明的诊断和预后方法的情形下，除PLGF-2水平之外，还可确定其他的决定参数。例如，可额外使用有关年龄、体重和/或体重指数(bodymass index，BMI)的信息来进行诊断。其他参数包括对象中存在或此前存在其他疾病或状况。此外，可在该对象中(例如用于本发明方法的同一样品中)确定其他相关的生物标志物。因此，在一些实施方案中，在样品中确定至少一个与诊断相关的其他参数。因此，PIGF-2可以是本发明的诊断和预后方法中使用的标志物组的一部分。例如，当所述病症或状况是先兆子痫时，其他参数可以是选自以下的一种或更多种：PAPP-A、超声标志物(搏动指数、舒张期切迹)、平均动脉压、PIGF、sFlt、母体病史(maternal history)、可溶性内皮糖蛋白(sEng)、抑制素A、激活素A、血管内皮生长因子(VEGF)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)和无细胞胎儿DNA。例如，当所述病症或状况是非整倍性时，其他参数可以是选自以下的一种或更多种：PAPP-A、游离的βhCG、颈半透明度、母体年龄、AFP、PIGF、胎儿鼻骨、双顶径/鼻骨比、hCG、抑制素A、非缀合雌三醇3(unconiugated estriol 3，uE3)和无细胞胎儿DNA。例如，当所述病症或状况是“小于胎龄儿”时，其他参数可以是选自以下的一种或更多种：PAPP-A、母体病史、PIGF、sFlt、AFP、游离的βhCG、hCG、抑制素A、激活素A、sEng、耻骨联合-宫底高度(symphysis-fundal height，SFH)、胎儿生物计量(股骨长度(femur length，FL)、头围(headcircumference，HC)、双顶径(biparietal diameter，BPD)、腹围(abdominalcircumference，AC))和超声标志物(搏动指数、脐动脉多普勒、大脑中动脉多普勒、静脉导管多普勒)。对于区别诊断而言，除PIGF-2水平之外，还可使用其他标志物和信息。

术语“生物标志物”(生物学标志物)指可测量和可量化的生物学参数(例如，特定酶浓度、特定激素浓度、群体中的特定基因表型分布、生物物质的存在)，其充当用于以下健康和生理相关评估的指标，例如疾病风险、精神障碍、环境暴露及其影响、疾病诊断、代谢过程、物质滥用、妊娠、细胞系发育、流行病学研究等。此外，生物标志物定义为作为正常生物过程、致病过程或针对治疗介入之药理学响应的指标客观测量并且评价的特征。可在生物样品上测量生物标志物(作为血液、尿或组织测试)，生物标志物可为从个人获得的记录(血压、ECG或Holter)或者生物标志物可为成像测试(子宫胎盘多普勒超声，或颈半透明度(Conde-Agudelo 等2004.Obstet Gynecol104：1367-1391；Bindra等2002.Ultrasound Obstet Gynecol20：219-225))。生物标志物可指示多种健康或疾病特征，包括暴露于环境因素的水平或类型、遗传易感性、针对暴露的遗传响应、亚临床或临床疾病的生物标志物，或治疗响应的指示。因此，考虑生物标志物的简单化方式是作为疾病特征(风险因素或风险生物标志物)、疾病状态(临床前或临床)、或疾病速率(进程)的指标。相应地，可将生物标志物分类为前驱生物标志物(鉴定发生疾病的风险)、筛选性生物标志物(筛选亚临床疾病)、诊断性生物标志物(识别明显疾病)、分期性生物标志物(对疾病严重程度进行分类)或预后生物标志物(预测未来疾病过程(包括复发和对治疗的响应)和监测治疗的效力)。生物标志物还可充当替代终点(surrogate end point)。替代终点是这样的终点，其可替代真实目标结果的测量结果用作临床试验中的结果来评价治疗的安全性和有效性。基本原理是替代终点的改变密切追随着目标结果的变化。替代终点的优势在于：与需要大型临床试验进行评价的终点例如发病率和死亡率相比，它们可在更短的时间段内并且以更低的成本收集。替代终点的另外价值包括以下事实：与较远的临床事件相比，其更接近目标暴露/介入并且可更易于因果相关。替代终点的重要劣势是如果目标临床结果受多种因素(除替代终点之外)的影响，则残余混杂可降低替代终点的有效性。已提出，如果替代终点可解释暴露或介入对目标结果的至少50％作用，则其具有较大的有效性。例如，生物标志物可以是蛋白质、肽或核酸分子。

在本发明的范围内，产前病症优选地涉及先兆子痫、小于胎龄儿和非整倍性(包括13三体、18三体和21三体)。

在本发明的一个实施方案中，总PIGF-2的测量在首三个月(妊娠第1至13周)、中三个月(妊娠第14至26周)或末三个月(妊娠第27至40周)内进行。

在本发明的范围内，PIGF-2理解为意指根据SEQ ID NO：3的人PIGF-2。根据本发明的这些多肽还可具有翻译后修饰，例如糖基化(glycolization)、脂化或衍生化。

在本发明的范围内，总PIGF-2理解为意指游离PIGF-2和结合成多聚复合物的PIGF-2，其可包含例如均二聚体PIGF-2复合物和异二聚体PIGF-2/VEGF-A复合物。

在本发明的另一个实施方案中，预后或风险分级涉及先兆子痫的早期发作(妊娠20至34周)或晚期发作(妊娠34周之后)。

在本发明的另一个实施方案中，额外地确定选自以下的其他标志物：sFlt-1、PIGF、VEGF、PP-13、ADAM 12、P-选择蛋白、无细胞胎儿DNA、PTX3、PAPP-A、内脏脂肪素(visfatin)、抑制素A、激活素A、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、β-hCG、甲胎蛋白(AFP)、金属蛋白酶-9(MMP-9)、超声标志物(子宫动脉搏动指数和/或舒张期切迹)以及血压。

在本发明的一个优选实施方案中，所述其他标志物选自包括以下的组：sFlt-1、PIGF、PAPP-A、子宫动脉搏动指数和血压。

本文中使用的术语“对象”指活的人或非人雌性生物体。优选地在本文中，所述对象是处于首三个月至末三个月的妊娠人对象，优选地其处于妊娠首三个月或中三个月，并且更优选地处于妊娠首三个月。例如，所述对象处于妊娠第11至13周。本文中的“胎儿”指在胚胎期之后和出生之前的发育中哺乳动物。在人中，胎儿期开始于妊娠第9周初。

本文中使用的术语“样品”指上文所述的样品。

术语“参照样品”指由未患疾病或病症和未发生疾病或病症的对象或对象组获得的样品。所述对象或对象组表现与受试对象相同的性别和物种。“对照水平”由一份或更多份“参照样品”获得并且优选地由不具有产前病症或状况的对象获得。在本文中，优选地“对照组”与所述对象来自相同的妊娠三月期，或者甚至来自相同胎龄(例如，就妊娠周而言)。例如，当所述对象处于妊娠第11至13周时，对照组也可来自妊娠第11至13周。

在本发明的情形下，“诊断”涉及在对象中识别和(早期)检测疾病或临床状况，并且还可包括区别诊断。在某些实施方案中，术语“诊断”还可涵盖评估疾病或临床状况的严重程度。

“预后”涉及预测对象遭受特定疾病或临床状况的结果或特定风险。这可包括估计所述对象的恢复可能性或不利结果的可能性。

在本发明中，术语“风险分级”涉及根据对象的进一步预后将对象分组成不同的风险组。风险分级还涉及针对应用预防和/或治疗措施进行分级。

在本发明的情形下，术语治疗控制指监测和/或调整所述患者的治疗性处理。

在本发明的情形下，术语“筛选”指对群体进行调查的过程，其使用一种或更多种特定标志物和限定的筛选截止水平来在群体中鉴定处于特定病症之较高风险中的个体。筛选适用于群体；诊断应用于个体患者水平。

术语“先兆子痫”包括妊娠女性的高血压性多系统病症，其以高血压和蛋白尿为特征。先兆子痫的最常见症状是高血压、尿中蛋白质增加以及手和面部肿胀或水肿。在本发明的某些实施方案中，先兆子痫限定为高血压(收缩压和舒张压分别≥140和90mm Hg)和蛋白尿(在24小时尿收集物中的蛋白质分泌≥300mg，或纤维素试纸(dipstick)≥2+)。

非整倍性是染色体的数目异常，并且是一种类型的染色体异常。染色体多余或缺失是遗传病症(出生缺陷)的常见原因。非整倍性发生于细胞分裂期间，此时染色体未在两个细胞之间正确分离。非整倍性包括例如胎儿21三体(唐氏综合征)、18三体(爱德华兹综合征)和13三体(帕陶综合征)。

小于胎龄儿指未达到其确定的潜在大小之生长受限的胎儿。胎儿体重低于胎龄的第10百分位数。

以下实施例和附图用于对本发明进行更详细的解释，但并非将本发明限制于所述实施例和附图。

本文中引用的所有专利和非专利参考文献均在此通过引用整体并入。

实施例

实施例1：抗体的产生

多克隆抗体

针对人PIGF的多克隆抗体从(R&D Systems Europe Ltd.AbingdonUK；参考号：AF-264-PB)商购。

单克隆抗体的开发

针对PIGF-2的单克隆抗体通过标准程序(Harlow E，Lane D. Antibodies-A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor：Cold Spring Harbor Laboratory，1988；Lane 1985.Journal of Immunology Methods 81：223-228)产生。对于抗人PLGF-2抗体的产生，用50μg人重组PIGF-2(R&D Systems Europe Ltd.Abingdon UK)免疫8周龄的雌性BALB/c小鼠，所述人重组PIGF-2溶解于含有140mmol/L NaCl的11mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.2)中。以4周的时间间隔施用免疫原的后续加强注射。在初次免疫后3个月，与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0-Ag 14)进行融合。通过ELISA用固定化的重组人PIGF-2筛选到克隆477/G2和477/E5。通过蛋白A Fast Flow亲和色谱法(GE Healthcare Life Sciences)根据生产商的说明纯化抗体。

对单克隆抗体的选择基于识别重组PIGF-2(SEQ ID NO：3)获得的信号。两条剂量响应曲线示于图1中。使用克隆477/G2获得最佳信号。

抗体的标记

在该测定中，使多克隆抗人PIGF抗体(R&D Systems Europe Ltd.Abingdon UK)和单克隆抗人PIGF-2抗体分别与(Lumiphore，Inc.，Richmond，Canada)和花菁5.5(GE Healthcare UK Limited)偶联。偶联反应根据生产商的规定偶联方案来进行。

实施例2：使用单克隆和多克隆抗体之PIGF-2测定的开发

开发了使用时间分辨放大穴状化合物发射(TRACE)技术的均相夹心荧光免疫测定(Mathis.1993.Clin Chem 39(9)：1953-9)来检测PIGF-2。

在使用之前，将储液缀合的抗体和花菁5.5缀合的抗体溶液用测定缓冲液(100mmol/L磷酸钠pH 7、0.375％无蛋白酶牛血清白蛋白、0.25mg/mL小鼠IgG、0.25mg/mL牛IgG、0.25mg/mL山羊IgG)分别以0.125μg/mL和5μg/mL进行稀释。将重组人PIGF-2在经热处理的去纤维蛋白的正常人血浆中稀释以得到PIGF-2标准物。如下进行免疫测定：根据生产商的说明，在B.R.A.H.M.S KRYPTOR紧凑型PLUS设备(Thermo Scientific B.R.A.H.M.S GmbH，Hennigsdorf/Berlin，Germany)上于37℃下孵育70μL样品/校准物、40μL花#5.5缀合的抗体溶液和40μL缀合的抗体溶液。该测定的反应时间为29分钟。使用B.R.A.H.M.S KRYPTOR紧凑型PLUS设备通过在707和620nm下进行同时双波长测量来测量特异性荧光(RFU)。

实施例3：用克隆477/G2测定的剂量响应曲线

剂量响应曲线可通过在上述单克隆免疫测定中使用重组PIGF-2(SEQ ID NO：3)作为标准材料来产生。典型的剂量响应曲线示于图2中。

实施例4：通过该测定识别PIGF-2同工型的特异性

使用特异性PIGF-2测定来测量商购的PIGF-1和PIGF-2标准物。图3显示，针对PIGF-2的特异性测定与PIGF-1同工型无交叉反应性，因此该方法仅检测特异性的PIGF-2同工型。

实施例5：PIGF-2同工型上的构象表位的识别

使用特异性PIGF-2测定来测定重组PIGF-2。制备样品以包含10μg/mL对PIGF-2之肝素结合结构域(SEQ ID NO：6)具有特异性的21aa肽。使用高浓度的21aa肽(与重组PIGF-2相比高1x10⁶倍)以抑制该测定识别重组PIGF-2。当在该测定中添加特异性肝素结合结构域肽时，对信号无抑制(图4)，因此单克隆抗体477/G2不识别对应于SEQ ID NO：6的线性21aa肽。该抗体识别PIGF-2同工型上的构象表位。

实施例6：产前病症中的PIGF-2

研究群体

为了确定PIGF-2是否是病理性妊娠者的可用标志物，使用上述针对PIGF-2的均相夹心荧光免疫测定在来自以下的血清样品中评价PIGF-2：295位经历正常妊娠的女性、15位受21三体影响的妊娠者、10位受18三体影响的妊娠者、10位受13三体影响的妊娠者、30位随后发生PE之需要在34周前分娩的妊娠者和30个分娩小于胎龄的(SGA)新生儿的病例。用重组人PIGF-2校准特异性PIGF-2测定。

在例行的首三个月医院就诊时取得样品。所有的妊娠女性均签署了由国王学院医院伦理委员会(King′s College Hospital Ethics Committee)批准的同意书。

测量

使用全自动化夹心免疫测定系统在B.R.A.H.M.S KRYPTOR紧凑型PLUS设备(Thermo Scientific B.R.A.H.M.S GmbH，Hennigsdorf/Berlin，Germany)上检测PIGF-2。这种随机存取分析仪采用基于两种荧光团之间的非放射性迁移的灵敏性时间分辨放大穴状化合物发射(TRACE)技术。用于检测PIGF-2的自动化测定基本上基于夹心荧光测定，其使用可商购的多克隆抗体(R&D Systems Europe Ltd.Abingdon UK；参考号：AF-264-PB)和与PIGF-2特异性结合并且在上文有所描述的新单克隆单体。用重组人PIGF-2校准特异性PIGF-2测定。B.R.A.H.M.S PIGF-2KRYPTOR测定的测量范围为15至14 461pg/mL(图2)。PIGF-2测定的变异针对对照样品来确定，进行26轮(run)，重复两次。在7天时间期间，使用第一轮的校准曲线作为参照曲线。检测界限为15pg/mL，而量化界限(功能灵敏度)为＜42pg/mL。测定内和测定间变异在100pg/mL的PIGF-2浓度下分别为8.8％和9.4％，在505pg/mL下分别为2.3％和2.9％，在1018pg/mL下分别为1.3％和2.4％。

对于确定胎儿中染色体异常的风险，在于首三个月期间从妊娠女性取得的样品中测量以下参数：i)PAPP-A、游离βhCG；ii)PAPP-A、游离βhCG、PIGF；iii)PAPP-A、游离βhCG、PIGF、PIGF-2。使用合并这些生物标志物的算法来确定检测率和假阳性率。

对于妊娠女性中发生先兆子痫的风险评估分析，在于首三个月期间从所述对象取得的样品中测量以下参数：i)PAPP-A、PI、MAP；ii)PAPP-A、PI、MAP和PIGF；iii)PAPP-A、PI、MAP、PIGF和PIGF-2。使用合并这些生物标志物的算法来确定检测率和假阳性率。

统计学分析

通过确定正常群体和相应胎儿非整倍性群体的中位数来计算确定胎儿非整倍性之风险的数学算法。将PAPP-A、游离βhCG、PIGF和PIGF-2以中位数倍数(MoM)表示从而使研究结果标准化。现有风险(prior risk)(表示为比值)由母体年龄特异性的患病率推导出，并将其乘以来自受影响和未受影响妊娠者中生化标志物的对数高斯分布的似然比(likelihoodratio，LR)。对于PAPP-A、游离βhCG、PIGF和PIGF-2的组合，确定受影响和未受影响妊娠者中log MoM值之间的相关系数。

用于进行风险评估的统计学过程通过确定未受影响妊娠者和先兆子痫妊娠者的中位数来计算。对于各个生化和生物物理标志物，计算MoM。然后，进行多变量高斯分析以确定似然比。对于先兆子痫风险确定，现有风险基于一般群体的风险。

应用Mann-Whitney U检验以确定各个结果组相对于对照的中位数MoM值的差异显著性。

结果

患者的特征示于表1中。与对照样品相比，PIGF-2的中位数MoM在以下女性的样品中显著更低：患有先兆子痫的女性(p＝0.001)、SGA组的女性(p＜0.0001)、21三体组的女性(p＝0.005)、18三体组的女性(p＝0.001)和13三体组的女性((p＝0.004)(表2)。

用于对21三体进行风险评估的多参数分析(风险截止值250分之一)显示(表3)：与在测量PAPP-A、游离βhCG(FPR：9.6％)之后或者在测量PAPP-A、游离βhCG和PIGF(FPR：9.6％)之后的FPR相比，妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)、游离βhCG、PlGF和PIGF-2的确定以4.8％的最低假阳性率为特征。

用于对13三体进行风险评估的多参数分析(风险截止值250分之一)显示(表4)：与在测量PAPP-A、游离βhCG(DR：90％)之后或者在测量PAPP-A、游离βhCG和PIGF(DR：90％)之后的DR相比，妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)、游离βhCG、PIGF和PIGF-2的确定以100％的最高检测率为特征。

用于对先兆子痫进行风险评估的多参数分析显示(表5)：与在测量PAPP-A、PI、MAP(DR：55％)之后或者在测量PAPP-A、PI、MAP和PIGF(DR：77％)之后的检测率相比，妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)、搏动指数(PI)、平均动脉压(MAP)、PIGF和PIGF-2的确定以82％的最高检测率为特征。

实施例7：末三个月的SGA和先兆子痫患者中的PIGF-2

如实施例6中所述确定处于妊娠末三个月的先兆子痫和小于胎龄儿 (SGA)患者的PIGF-2水平。患者的特征示于表6中。与对照样品相比，PIGF-2的中位数MoM在处于妊娠末三个月之患有先兆子痫女性的样品(p＜0.0001)中和SGA组女性的样品(p＜0.0001)中显著更低(表7)。

附表

表1：研究群体的特征

表2：各个不利结果组与对照之胎盘生长因子2的中位数倍数(MoM)值的中位数(四分位距)比较。通过具有事后Bonferroni校正的Mann-Whitney U检验进行结果组之间的比较；经调整的显著性水平P＜0.01＊。

表3：使用多参数分析用不同算法对非整倍性进行风险评估的检测率(DR)和假阳性率(FPR)。针对21三体的经验结果：

表4：使用多参数分析用不同算法对非整倍性进行风险评估的检测率(DR)和假阳性率(FPR)。针对13三体的经验结果：

表5：使用多参数分析用不同算法对先兆子痫进行风险评估的检测率(DR)和假阳性率(FPR)。

表6：研究群体的特征

值以中位数(IQR＝四分位距)或数字(％)表示。

表7：各个不利结果组与对照在末三个月之胎盘生长因子2的中位数倍数(MoM)值的中位数(四分位距)比较。通过Mann-Whitney U检验进行结果组之间的比较；经调整的显著性水平P＜0.01＊。

Claims

1.用于在妊娠雌性对象或所述对象的未出生胎儿中对产前病症或状况进行诊断、预后、风险评估、风险分级和/或治疗控制的方法，其包括：

(i)在来自所述对象之样品中确定胎盘生长因子2(PlGF-2)的水平，

其中与所述对照水平相比，来自所述对象之样品中的水平降低指示所述产前病症或状况和/或所述对象或胎儿获得所述产前病症或状况的风险提高和/或所述产前病症或状况加重的风险提高。

2.用于在妊娠雌性对象或所述对象的未出生胎儿中诊断产前病症或状况的方法，其中在来自待诊断对象的样品中确定胎盘生长因子2(PlGF-2)的水平，并且其中PlGF-2的水平低于对照组之0.85“中位数倍数”(MoM)指示所述产前病症或状况。

3.用于检测胎盘生长因子2(PlGF-2)的免疫测定方法，其包括以下步骤：

(a)在以下条件下使怀疑含有PlGF-2的样品与PlGF特异性的第一抗体或者其抗原结合片段或衍生物接触并且与PlGF-2特异性的第二抗体或者其抗原结合片段或衍生物接触，所述条件允许在PlGF-2和这两种抗体或者其抗原结合片段或衍生物之间形成三元复合物，以及

(b)检测所述两种抗体或者其抗原结合片段或衍生物与PlGF-2的结合。

4.根据权利要求3所述的免疫测定方法，其中所述第一和第二抗体或者其抗原结合片段或衍生物对非重叠的不同构象表位具有特异性。

5.根据权利要求4所述的免疫测定方法，其中所述第二抗体或者其抗原结合片段或衍生物对PlGF-2的构象表位具有特异性。

6.根据权利要求3至5中任一项所述的免疫测定方法，其中所述抗体或者其抗原结合片段或衍生物为多克隆抗体、单克隆抗体或遗传工程化单克隆抗体。

7.根据权利要求6所述的免疫测定方法，其中所述第二抗体或者其抗原结合片段或衍生物通过选自以下的杂交瘤细胞系产生：以DSMACC3222保藏的细胞477/G2和以DSM ACC3221保藏的细胞系477/E5。

8.根据权利要求3至6中任一项所述的免疫测定方法，其中所述样品从对象的体液或组织获得，例如选自血液、血清、血浆和尿的体液。

9.根据权利要求3至8中任一项所述的免疫测定方法，其特征在于，所述抗体中的一种是经标记的而另一种抗体与固相结合或者可以选择性地与固相结合。

10.根据权利要求3至8中任一项所述的免疫测定方法，其中所述第一和第二抗体以分散于液体反应混合物中的方式存在，并且其中第一标记组分与所述第一抗体结合，所述第一标记组分为基于荧光或者化学发光消失或放大的标记系统的一部分，并且所述标记系统的第二标记组分与所述第二抗体结合，以使得在这两种抗体与待检测的PlGF-2结合之后，产生允许在测量溶液中检测所得夹心复合物的可测量信号。

11.根据权利要求10所述的免疫测定方法，其特征在于，所述标记系统包含与荧光或化学发光染料特别是花菁型荧光或化学发光染料组合的稀土穴状化合物或螯合物。

12.单克隆抗体，其通过选自以下的杂交瘤细胞系产生：以DSMACC3222保藏的细胞系477/G2和以DSM ACC3221保藏的细胞系477/E5。

13.抗体，其与权利要求12所述的抗体结合相同的表位。

14.用于检测PlGF-2的试剂盒，其包含：

(i)对PlGF具有特异性的第一抗体或者其抗原结合片段或衍生物；和

(ii)对PlGF-2具有特异性的第二抗体或者其抗原结合片段或衍生物。

15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中

(i)所述第一抗体或者其抗原结合片段或衍生物对SEQ ID NO：1序列内包含的表位具有特异性；和/或

(ii)所述第二抗体或者其抗原结合片段或衍生物对PlGF-2的结构表位具有特异性。

16.根据权利要求14或15所述的试剂盒，其中所述第二抗体是根据权利要求12或12所述的抗体。

17.根据权利要求3至11中任一项所述的免疫测定方法、根据权利要求12或13所述的抗体或者根据权利要求14或15所述的试剂盒用于在对象中对病症或状况进行诊断、预后、风险评估、风险分级和/或治疗控制的用途。

18.根据权利要求17所述的用途，其中所述病症或状况是妊娠雌性对象中或胎儿中的产前病症或状况。

19.根据权利要求1或2所述的方法或者根据权利要求18所述的用途，其中所述妊娠雌性对象中的所述产前病症或状况选自先兆子痫或分娩具有非整倍性之孩子的风险或分娩小于胎龄的新生儿的风险。

20.根据权利要求1、2或19中任一项所述的方法或者根据权利要求19所述的用途，其中所述对象处于妊娠的首三个月。

21.根据权利要求1、2或19至20中任一项所述的方法或者根据权利要求19至20中任一项所述的用途，其中在所述样品中确定与诊断先兆子痫相关的至少一个其他参数，任选地其中：

(a)所述病症或状况是先兆子痫并且所述其他先兆子痫参数是选自以下的一种或更多种：PAPP-A、超声标志物(搏动指数、舒张期切迹)、平均动脉压、PlGF、sFlt、母体病史、可溶性内皮糖蛋白(sEng)、抑制素A、激活素A、血管内皮生长因子(VEGF)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、和无细胞胎儿DNA，

(b)所述病症或状况是非整倍性并且所述其他参数是选自以下的一种或更多种：PAPP-A、游离βhCG、颈半透明度、母体年龄、AFP、PlGF、胎儿鼻骨、双顶径/鼻骨比、hCG、抑制素A、非缀合雌三醇3(uE3)、和无细胞胎儿DNA，或者

(c)所述病症或状况是小于胎龄儿并且所述其他参数是选自以下的一种或更多种：PAPP-A、母体病史、PlGF、sFlt、AFP、游离βhCG、hCG、抑制素A、激活素A、sEng、耻骨联合-宫底高度(SFH)、胎儿生物计量(股骨长度(FL)、头围(HC)、双顶径(BPD)、腹围(AC))和超声标志物(搏动指数、脐动脉多普勒、大脑中动脉多普勒、静脉导管多普勒)。

22.杂交瘤细胞系，其选自以DSM ACC3222保藏的细胞系477/G2和以DSM ACC3221保藏的细胞系477/E5。