CN101914156A - 一种检测转基因作物的蛋白质芯片试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可用于转基因产品检测的蛋白质芯片。它是在平面型支撑载体的平面上被覆有修饰材料的膜层，在该膜层的表面以点阵方式排布有供转基因农产品检测用的蛋白质抗体探针，这些蛋白质抗体探针包括：1)Bt cry1Ac/Ab单克隆抗体，2)Bt cry1Ah单克隆抗体，3)植酸酶PHY单克隆抗体，4)抗草甘膦G2-EPSPS多克隆抗体，5)耐盐IrrE多克隆抗体，本发明进一步提供了一种基于抗原抗体反应的可简单快速进行结果判定的转基因作物检测芯片试剂盒，属于检验检疫领域。本发明的优点：1)快速：检测时间仅为1.5-2小时；2)特异：由于采用了蛋白质抗原抗体特异性结合，每种抗体重复点制三次，从而使结果准确性大大提高；3)高通量：本发明能够同时检测5种商业化转基因成分的蛋白质；4)稳定：重复性试验结果显示所建立方法的稳定性良好。

Description

一种检测转基因作物的蛋白质芯片试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及基于转基因成分和蛋白质芯片的一种快速检测转基因作物的方法，尤指在反应中一次并行检测5种商业化转基因成分的蛋白质芯片方法和试剂盒。已有的专利是利用ELISA试纸条方法进行检测，每种成分都需要检测一次，耗费时间，不利于现场快速检测。我们通过选择商品化的转基因成分的蛋白质的抗体，将其作为探针固定于修饰过的支持物上，将待检成分经前处理后加入到芯片矩阵中，再加入标记的抗体，采用激光共聚焦扫描仪对结果进行检测，可一次性直接确定待检的样品中有无需要检测的成分，结果判读直观、明确、快速，而且操作简单、快速。适用于对商业化转基因作物的简单、快速检测，可用于检测机构实验室对于进出口商品的标识复验，转基因育种研究单位对转基因作物田间快速筛查等，属于检验检疫领域。

背景技术

转基因技术使开发农作物新品种的时间大为缩短，研究人员利用转基因技术培育出了抗除草剂、抗干旱、耐盐碱、抗重金属和抗病虫害、营养价值高的品种，这对于提高粮食产量、减少收获后损失以及增加农产品营养价值具有重要作用。随着转基因技术的发展，越来越多的转基因作物新品种被培育出来。多个国家和地区相继批准了转基因作物进入商业化生产，种植面积急剧扩大。然而转基因作物在带来巨大社会和经济效益的同时也存在许多问题，主要集中在转基因食品的安全性及对生态环境的安全性方面。

转基因食品对人类健康及生态环境的潜在影响日益受到人们的普遍关注，转基因食品的安全性不容忽视。世界各国都在加强对转基因食品的管理，美国、欧盟、日本、加拿大都已制定了对转基因食品进行标签标识管理的法规，欧盟(EC)49/2000号条例规定食品中含有超过1％的转基因成分时，必须在标签上做出标识。

为了加强对农业转基因生物的安全管理，保障人体健康，规范转基因产品的销售行为，引导和保护消费者的知情权，2002年中国农业部颁布了《农业转基因生物标识管理办法》，2006年通过了《中华人民共和国农产品质量安全法》，明确规定在中国境内销售列入标识的转基因生物及其产品，必须进行是否含有转基因成分的标识。转基因作物标识管理必须以有效的检测方法为基础。因此，建立针对转基因作物快速检测方法具有十分重要的现实意义。

目前国际上，对转基因产品采取的主要检测方法是建立在核酸水平上的PCR检测，包括竞争PCR(competitive PCR)、实时定量PCR(Real-time PCR)、PCR-ELISA方法；建立在蛋白质水平上的Western印记、酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫试纸条的检测方法。由于这些方法存在操作步骤繁琐，检测时间较长；不适合于现场实时检测和跟踪检测；检测成本过高；对检验人员的知识、操作水平和仪器水平要求过高等不足之处，方法较难普及。

蛋白芯片的技术原理最早由Roger Ekin在上世纪80年代提出，它将大量蛋白质分子按预先设置的排列固定于一种载体表面形成微阵列，根据蛋白质分子间特异性结合的原理，构建微流体生物化学分析系统，以实现对生物分子准确、快速、大信息量的检测，使用5种抗体固定于基片上，可特异性结和需检测的转基因蛋白成分，相比于ELISA及试纸条方法，具有高通量、检测时间更短的特点，因此在转基因检测上明显优于传统方法。

本发明首次基于以商品化转基因成分和蛋白质芯片技术建立转基因蛋白芯片检测技术应用于转基因作物的检测，提供了针对商业化转基因作物成分的蛋白质芯片、试剂盒和检测方法。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种特异性强、灵敏度高、通量高的检测转基因作物的蛋白质芯片。

本发明的另一个目的是提供快速、准确、便于结果判定的检测转基因作物的检测试剂盒(基于蛋白质芯片)。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

选择以商业化的转基因作物转基因成分的蛋白质作为抗原，以抗原抗体免疫反应为基础，设计相应的抗体成分。

一组检测转基因作物的蛋白质抗体，如下：

1)Bt cry1Ac/Ab单克隆抗体：DC10 DB2

2)Bt cry1Ah单克隆抗体：CB10 DC10

3)植酸酶PHY单克隆抗体：Ab01 Ab02

4)抗草甘膦G2-EPSPS多克隆抗体

5)耐盐IrrE多克隆抗体

其中抗体1)、2)和3)分别为检测转基因成分Bt cry1Ac/Ab、Bt cry1Ah和植酸酶蛋白质的单克隆抗体对，抗体4)和5)为检测转基因成分抗草甘膦G2-EPSPS蛋 白质和耐盐IrrE蛋白质的多克隆抗体；作为二次结合的抗体，使用荧光素标记。

我们采用蛋白芯片检测技术建立了转基因作物检测方法，对反应的各种条件进行了优化，其中包括基片修饰的优化，点样缓冲液的优化，点样浓度的优化，标记二抗使用浓度的优化，荧光素与二抗标记的比例优化，封闭条件的优化。

检测转基因成分的蛋白质芯片设计方案为：4行六列，每点3个重复，点间距为450微米，一张芯片12个点阵。

点阵分布如下表所示

QC	BC
		cry1Ac/Ab单克隆抗体DC10	NC
植酸酶PHY单克隆抗体Ab01	cry1Ah单克隆抗体CB10
		抗草甘膦G2-EPSPS多克隆抗体	耐盐IrrE多克隆抗体

1)抗体来自中国农科院生物技术研究所

2)质量体系控制点(QC)为Cy3标记的BSA

3)空白对照(BC)为点样缓冲液和1×PBS

4)阴性对照(NC)为10mg/ml的BSA溶液

由于基片修饰、点样缓冲液、点样浓度、样品和基片反应条件、封闭液、清洗液以及反应时间对芯片反应后信号强度有一定影响，通过优化，确定了最佳芯片制作体系，见下表。

       表2 建立的芯片制作和反应体系

因素	条件
		基片修饰	环氧
点样缓冲液	40％甘油的PBS
		点样浓度	1-2mg/ml
样品和基片反应条件	真空干燥16h
		封闭液	1％BSA
清洗液	0.1％PBST
		反应时间	1h

6)芯片扫描条件

使用共聚焦激光扫描仪，设置合适的参数。

试剂盒成分有：1)Bt cry1Ac/Ab单克隆抗体，2)Bt cry1Ah单克隆抗体，3)植酸酶PHY单克隆抗体，4)抗草甘膦G2-EPSPS多克隆抗体，5)耐盐IrrE多克隆抗体，6)检测用蛋白质芯片7)荧光素，8)清洗液

本发明的优点：

1)快速：检测时间仅为1.5-2小时；

2)特异：由于采用了蛋白质抗原抗体特异性结合，每种抗体重复点制三次，从而使结果准确性大大提高；

3)高通量：本发明能够同时检测包括：1)Bt cry1Ac/Ab蛋白，2)Bt cry1Ah蛋白，3)植酸酶PHY蛋白，4)抗草甘膦G2-EPSPS蛋白，5)耐盐IrrE蛋白；

4)稳定：重复性试验结果显示所建立方法的稳定性良好。

附图说明

图1是本发明可用于转基因产品检测的蛋白质芯片的一种结构图；

图2是本发明可用于转基因产品检测的蛋白质芯片图1的方阵的阳性图。

图3是本发明可用于转基因产品检测的蛋白质芯片图1的方阵的阴性图。

具体实施方式

本发明可用于转基因产品检测的蛋白质芯片，其结构是在平面型支撑载体的平面上被覆有修饰材料的膜层，在该膜层的表面以点阵方式排布有转基因农产品检测用的外源蛋白质探针。其中所说的该平面型支撑载体，可以采用目前同类技术中已有使用的玻璃片、硅片等材料制成的片状支持基体中的一种。该平面型支撑载体上被覆的修饰材料的膜层，可以为环氧或PSG材料膜层。以点阵方式排布于该膜层表面处的供转基因农产品用的蛋白质探针，可以采用平面附着的方式位于所说的该修饰材料膜层的表面，使用接触式点样方式完成这个目的。

如图1所示的可用于转基因农产品检测的基因芯片中，在常用的玻片、硅片的平面型支撑载体的平面上，被覆有膜层材料，该膜层材料可以为环氧或PSG材料膜层中的一种。在该膜层的表面上以平面附着的点阵方式排布有供多种转基因植物进行判断用的蛋白质探针，这些探针包括1)Bt cry1Ac/Ab单克隆抗体，2)Bt cry1Ah单克隆抗体，3)植酸酶PHY单克隆抗体，4)抗草甘膦G2-EPSPS多克隆抗体，5)耐盐IrrE多克隆抗体。该点阵方式排布是每个外源蛋白质探针集中于该材料膜层表面处的一个区域内的形式。

图2所示的可用于转基因农产品检测的蛋白质芯片的结构是图1的一个矩阵的结构 放大图，每个外源蛋白质探针平行3个点，以取得准确的结果。

具体制备方法

(一)可用于转基因产品检测的蛋白质芯片的制备

将预先制备好的转基因成分蛋白质的抗体稀释成合适的浓度，按照实验要求将各种浓度的抗体和对照以及质量控制液按顺序排列于384孔板中，用于蛋白质芯片的点制；这些抗体和对照包括1)Bt cry1Ac/Ab单克隆抗体，2)Bt cry1Ah单克隆抗体，3)植酸酶PHY单克隆抗体，4)抗草甘膦G2-EPSPS多克隆抗体，5)耐盐IrrE多克隆抗体，6)质量控制点(QC)，7)空白对照(BC)，8)阴性对照点(NC)，该5个抗体均使用标准抗体制备方法制得。蛋白质芯片由arrayer(博奥生物芯片公司，中国)机器手，使用直径为0.4mm的针点制，蛋白质芯片载体为环氧基修饰的玻片，每张芯片上有12个重复的一级矩阵，每个矩阵为4×6的二级点阵，每个样品点在二级阵中平行三次重复以验证试验的重复性。

(二)抗原抗体反应及信号检测

将检测用蛋白质芯片置于芯片反应盒中，盒下部小孔中滴加数滴蒸馏水，提供湿盒反应环境；将抗原蛋白质稀释到适合的浓度，每阵加30μl抗原蛋白质，湿盒中室温反应30分钟；清洗液(PBST)震荡清洗5分钟，室温1500rpm离心甩干；将标记好的抗体每阵加30μl，湿盒中室温反应30分钟，清洗液(PBST)震荡清洗5分钟，室温1500rpm离心甩干；激光共聚焦扫描仪扫描，参数设置laserpower-PMT-90-600/700，进行信号检测。

Claims (3)

1.一组基于蛋白质芯片的检测转基因作物的抗体成分如下：

1)Bt cry1Ac/Ab单克隆抗体DC10，2)Bt cry1Ah单克隆抗体CB10，3)植酸酶PHY单克隆抗体Ab01，4)抗草甘膦G2-EPSPS多克隆抗体，5)耐盐IrrE多克隆抗体

其中抗体1)、2)和3)分别为检测转基因成分Bt cry1Ac/Ab、Bt cry1Ah和植酸酶蛋白质的单克隆抗体，抗体4)和5)为检测转基因成分抗草甘膦G2-EPSPS蛋白质和耐盐IrrE蛋白质的多克隆抗体。

2.一种基于蛋白质芯片可简单快速进行结果判定的转基因作物检测试剂盒，由以下组分组成：

1)Bt cry1Ac/Ab单克隆抗体

2)Bt cry1Ah单克隆抗体

3)植酸酶PHY单克隆抗体

4)抗草甘膦G2-EPSPS多克隆抗体

5)耐盐IrrE多克隆抗体

6)检测用蛋白质芯片

7)荧光素

8)阴性对照：稀释液；

9)蛋白质芯片

3.根据权利要求2所述的转基因作物检测试剂盒，其特征在于：所述检测抗体名称为：

1)Bt cry1Ac/Ab单克隆抗体DB2

2)Bt cry1Ah单克隆抗体DC10

3)植酸酶PHY单克隆抗体Ab02

4)抗草甘膦G2-EPSPS多克隆抗体

5)耐盐IrrE多克隆抗体

其中抗体1)、2)和3)分别为检测转基因成分Bt cry1Ac/Ab、Bt cry1Ah和植酸酶蛋白质的单克隆抗体，抗体4)和5)为检测转基因成分抗草甘膦G2-EPSPS蛋白质和耐盐IrrE蛋白质的多克隆抗体。

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