CN1775809A

CN1775809A - 一种Bt Cry1A抗体及其制备方法与专用抗原及应用

Info

Publication number: CN1775809A
Application number: CN 200510130058
Authority: CN
Inventors: 王保民; 俞彩霞; 赵静; 李召虎; 何钟佩; 何素平; 刘威; 邓艾兴
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2005-12-12
Filing date: 2005-12-12
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2025-12-12
Also published as: CN100348616C

Abstract

本发明公开了一种Bt Cry1A抗体及其制备方法与专用抗原及应用，其目的是提供一种Bt Cry1A抗体及其制备方法与专用抗原及其在制备Bt免疫检测试剂盒中的应用。制备Bt Cry1A抗体的专用抗原，是将具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的多肽与载体蛋白联结得到。Bt Cry1A抗体，是用所述专用抗原免疫动物，再从所免疫的动物中分离、纯化血清得到Bt Cry1A抗体。该抗体具有下述优点：1)具有较高的特异性，检测灵敏度可达52.7ng·mL^－1，可用于转Bt植物(如棉花、玉米、水稻、烟草等)中毒蛋白的定性、定量分析；2)制备方法简单，具有工业化生产的可行性。本发明将在转Bt植物的生物检测领域发挥重要作用，具有广阔的市场前景。

Description

一种Bt Cry1A抗体及其制备方法与专用抗原及应用

技术领域

本发明涉及Bt Cry1A抗体及其制备方法与专用抗原及应用，特别是涉及一种BtCry1A抗体及其制备方法与专用抗原及其在制备Bt免疫检测试剂盒中的应用。

背景技术

转Bt植物(棉花、玉米、水稻、烟草)的杀虫机理是由于植物体内表达了毒蛋白。Bt免疫检测试剂盒主要用于大规模准确检测Bt植物毒蛋白的有无及含量的高低，转Bt植物的检测方法主要有三种：(1)生物试法；(2)DNA检测；(3)蛋白的免疫检测。在这三种方法中，生物试法比较繁琐，测定结果变异大，且难以进行横向和纵向的比较。DNA检测只是检测基因，并不代表蛋白水平，对于抗性的高低并无指导意义。免疫检测方法方便、实用、快速、经济。

Bt免疫检测试剂盒已广泛应用于转基因抗虫棉花、玉米种子质量检测，真伪鉴定，食品中转基因成分分析，生物安全性的研究。Bt试剂盒的好坏完全取决于Bt杀虫晶体蛋白Cry1A抗体的好坏。国内外文献报道中的Cry1A抗体，都是通过苏云金芽孢杆菌发酵、提取、纯化的蛋白作为抗原免疫动物得到的。由于蛋白的分离和纯化非常困难，在纯化的过程中不可避免会掺入一些杂蛋白，即使是非常纯化的蛋白，由于多个抗原决定簇的存在，所制备的抗体往往也会有交叉反应，因此抗体的特异性受到影响。为解决抗体的特异性问题，目前国外Bt试剂盒中的Cry1A抗体是通过合成多肽的方法来制备的，但所利用的是何种多肽大多没有公开或者已申请专利。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种用于制备Bt Cry1A抗体的专用抗原。

本发明所提供的制备Bt Cry1A抗体的专用抗原，是将具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的多肽与载体蛋白联结得到。

序列表中的SEQ ID №：1由16个氨基酸残基组成。肽的合成通常用固相合成法，多采用叔丁氧(酰)羰基(t-BOC)化学法和9-氟甲氧羰基(FMOC)化学法。

所述载体蛋白联结于所述多肽的氨基端(N端)。

载体蛋白可为任意一种常用的载体蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)或卵清白蛋白(OVA)等。

将多肽与载体蛋白进行联结的方法也是常规的戊二醛法。

本发明的第二个目的是提供一种Bt Cry1A抗体。

本发明所提供的Bt Cry1A抗体，是用上述专用抗原免疫动物，再从所免疫的动物中分离、纯化血清得到的抗体。

所述用于制备Bt Cry1A抗体的免疫动物可为鸡、兔、鼠、羊或马等常用的免疫动物。

本发明的另一个目的是提供一种Bt Cry1A抗体的制备方法。

本发明所提供的Bt Cry1A抗体的制备方法，包括以下步骤：

1)用上述专用抗原免疫动物；

2)从步骤1)经免疫的动物中分离、纯化血清，得到Bt Cry1A抗体。

在上述制备方法中，步骤3)中用于制备Bt Cry1A抗体的免疫动物可为鸡、兔、鼠、羊或马等常用的免疫动物。

本发明的第四个目的是提供一种Bt免疫检测试剂盒。

本发明所提供的Bt免疫检测试剂盒，其活性成分为上述Bt Cry1A抗体。

在实际应用中，为方便检测，可将阴性血清对照、血清稀释液、洗涤剂、终止剂、显色剂、Bt标样和HRP-羊抗兔IgG抗体等检测试剂也包装入上述试剂盒。

本发明提供了一种Bt Cry1A抗体。该抗体具有下述优点：1)具有较高的特异性，检测灵敏度可达52.7ng.mL^-1，可用于转Bt植物(如棉花、玉米、水稻、烟草等)中毒蛋白的定性、定量分析；2)制备方法简单，具有工业化生产的可行性。本发明将在转Bt植物的生物检测领域发挥重要作用，具有广阔的市场前景。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为Bt Cry1A蛋白浓度标准曲线

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、Bt Cry1A抗体的制备

一、Bt杀虫晶体蛋白Cry1A多肽片断的选择和合成

对GenBank数据库中Bt杀虫晶体蛋白Cry1A(包括Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac)基因(GenBank号分别为：D17518，X54939，U87397)所编码的氨基酸序列进行理化分析，从中选择一段特定的由16个氨基酸残基(序列表中的SEQ ID №：1)组成的多肽片段，用固相合成法进行合成，分子量为1943.14。

二、免疫抗原的制备

将步骤一合成的多肽片段与牛血清白蛋白(BSA)采用戊二醛方法进行联结，具体方法包括以下步骤：

(1)取10mg BSA，完全溶解于5mL 0.01mol/L PBS中，再加入4mg步骤一的合成多肽，使其完全溶解。

(2)缓慢加入5mL 0.2％的戊二醛溶液，与步骤(1)获得的溶液混合，并在室温下，搅拌反应2小时。

(3)加入0.2mL 1M甘氨酸，在室温下搅拌1小时，以终止反应。

(4)将步骤(3)获得的溶液装入透析袋中，用PBS透析4天进行纯化，每天换三次透析液。将透析后得到的多肽-BSA联结物进行分装，经-40℃冷冻后，真空浓缩干燥，保存于-20℃冰箱中。

三、制备Bt Cry1A抗体

免疫动物采用新西兰大耳白兔，兔龄三个月左右，体重2kg以上。以步骤二制备的多肽-BSA的联结物作为抗原，免疫动物，制备Bt Cry1A抗体，免疫方法及剂量为：共免疫注射六次，将抗原用PBS稀释至2mg·mL^-1(以载体蛋白计算)，然后与等体积的福氏完全佐剂(第一次免疫)或福氏不完全佐剂(第二次至第五次免疫)混合后乳化，最后一次用免疫抗原直接免疫，免疫剂量均为1mL/兔。第三次免疫后耳缘静脉取血，检测抗血清效价，检测结果表明抗血清效价达1/50000。最后一次免疫后的第七天颈动脉放血，分离、纯化后得到抗血清，检测抗血清效价，检测结果表明抗血清效价达1/50000，可用于Bt Cry1A含量的检测。

实施例2、Bt Cry1A抗体的鉴定及Bt蛋白浓度标准曲线的建立

用ELISA方法对Bt Cry1A抗体进行鉴定，并绘制出Bt蛋白浓度标准曲线，具体过程包括以下步骤：

(1)包被Bt标准蛋白

将Bt Cry1A标准蛋白用包被缓冲液(1.5g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃，0.2g NaN₃，加1000mL蒸馏水，pH为9.6)稀释成五个浓度，依次为2640，880，293，97，32ng·mL^-1，以包被缓冲液为空白对照(即为0ng·mL^-1)，加入96孔酶标板中，每孔100μl，每个浓度三次重复，于37℃温箱中温育3h。弃去孔内液体，用洗涤液(8.0g NaCl，0.2gKH₂PO₄，2.96g Na₂HPO₄·12H₂O，1mL Tween-20，加1000mL蒸馏水)洗板四次后甩干。

(2)与Bt Cry1A抗体反应

将实施例1制备的Bt Cry1A抗体用样品稀释液(8.0g NaCl，0.2g KH₂PO₄，2.96gNa₂HPO₄·12H₂O，1mL Tween-20，1g明胶，加1000mL蒸馏水，pH为7.5)按1∶500的比例稀释，酶标板每孔中加入100μl，放入37℃温箱中温育30min。弃去孔内液体，用洗涤液洗板四次后甩干。

(3)与酶标二抗反应

将HRP-羊抗兔IgG抗体(sigma公司)用样品稀释液按1∶1000的比例进行稀释，每孔加100μl，放入37℃温箱中温育30min。弃去孔内液体，用洗涤液洗板四次，甩干。

(4)显色

于酶标板每孔中加入100μl邻苯二胺(ortho-phenylene diamine，OPD)溶液，常温下显色，显色充分后用2N硫酸终止反应，用酶标仪测定各孔492nm处的OD值。

检测结果表明实施例1制备的Bt Cry1A抗体可与Bt Cry1A标准蛋白特异反应，依据Bt Cry1A标准蛋白的浓度梯度及其相应的OD值绘制标准曲线，如图1所示(y轴为Bt Cry1A标准蛋白各浓度的自然对数值，x轴为其相应的OD值)，标准曲线的回归方程为：y＝3.9016x+3.185，相关系数R²＝0.982，IC₅₀为169.9ng.mL^-1，检测范围为52.7ng.mL^-1到547.8ng.mL^-1。

实施例3、转Bt棉花杀虫晶体蛋白Cry1A的检测

用ELISA方法对转Bt抗虫棉花中的杀虫晶体蛋白Cry1A进行检测，所用的抗虫棉花品种包括：中41、中45、中29、GK36、GK12、33B，以常规棉中12、中43为对照(中国农科院棉花研究所购买)具体过程包括以下步骤：

(1)称取Bt转基因棉花样品0.3g，加入3mL PBS提取液后充分研磨，提取4h后3000rpm离心10min，取上清液用于分析。

(2)向酶标板每孔中加入步骤(1)获得的上清液100μl，于37℃温箱中温育3h。弃去孔内液体，用洗涤液洗板四次，甩干。

(3)将实施例1制备的Bt Cry1A抗体用样品稀释液按1∶500的比例进行稀释，向酶标板每孔中加入100μl，放入37℃温箱中温育30min。弃去孔内液体，用洗涤液洗板四次后甩干。

(4)将HRP-羊抗兔IgG抗体用样品稀释液按1∶1000的比例进行稀释，向酶标板每孔中加入100μl，置于37℃温箱中温育30min。弃去孔内液体，用洗涤液洗板四次，甩干。

(5)向酶标板每孔中加入100μl OPD溶液，常温下显色，用2N硫酸终止反应，在酶标仪上测定各孔492nm处的OD值。

实验结果显示，转基因棉品种中41，中45，中29，GK36，GK12，33B明显比常规棉品种中12和中43显色深。根据实施例2绘制的Bt Cry1A蛋白浓度标准曲线计算出上述棉花样品中Bt Cry1A蛋白的浓度的，结果如表1所示，表明转基因棉中BtCry1A杀虫晶体蛋白含量明显高于上述两种常规棉品种，与显色结果一致。证明用本发明的Bt Cry1A抗体及ELISA方法能够有效地区别常规棉和抗虫棉，并且能对其中的Bt Cry1A杀虫晶体蛋白含量进行较为准确的测定。

表1常规棉和抗虫棉中Bt毒蛋白含量

品种	常规棉		转基因抗虫棉
品种	常规棉		转基因抗虫棉					毒蛋白含量(ng.mL^-1)	中12	中43	中41	中45	中29	GK36	GK12	33B
0	0	44.6	42.9	29.0	50.3	19.3	52.7		中12	中43	中41	中45	中29	GK36	GK12	33B

序列表

<160>1

<210>1

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

Arg Glu Try Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu Glu Met

1 5 10 15

Claims

1、制备Bt CrylA抗体的专用抗原，是将具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的多肽与载体蛋白联结得到。

2、根据权利要求1所述的专用抗原，其特征在于：所述多肽的合成方法为固相合成法，包括叔丁氧羰基化学法和9-氟甲氧羰基化学法。

3、根据权利要求1所述的专用抗原，其特征在于：所述载体蛋白联结于所述多肽的氨基端。

4、根据权利要求1或2或3所述的专用抗原，其特征在于：所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、蛋白匙孔血蓝蛋白或卵清白蛋白。

5、根据权利要求1或2或3所述的专用抗原，其特征在于：所述将多肽与载体蛋白进行联结的方法为戊二醛法。

6、Bt CrylA抗体，是用权利要求1所述的专用抗原免疫动物，再从所免疫的动物中分离、纯化血清得到的抗体。

7、根据权利要求6所述的Bt CrylA抗体，其特征在于：所述用于制备Bt CrylA抗体的免疫动物为鸡、兔、鼠、羊或马。

8、一种制备权利要求6所述的Bt CrylA抗体的方法，包括以下步骤：

1)用权利要求1所述的专用抗原免疫动物；

2)从步骤1)经免疫的动物中分离、纯化血清，得到Bt CrylA抗体。

9、根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中用于制备Bt CrylA抗体的免疫动物为鸡、兔、鼠、羊或马。

10、Bt免疫检测试剂盒，其活性成分为要求6所述的Bt CrylA抗体。