CN101710117A - 一种恩诺沙星的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

一种检测恩诺沙星的试剂盒及其检测方法，属于时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术领域，用于对动物源性食品、血液、尿液及饲料中恩诺沙星(ENR)含量的检测。本发明配制的试剂盒，采用TRFIA检测ENR，测定的基础是标记免疫反应。微孔板包被有ENR-载体蛋白，加入ENR标准或样品，再加入ENR抗体。游离的ENR与微孔板上的ENR-载体蛋白竞争ENR抗体，没有连接的ENR抗体被洗涤除去，加入Eu³⁺-羊抗兔抗体，标记免疫反应后没有连接的Eu³⁺-羊抗兔抗体被洗涤除去。加增强液后，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的ENR浓度成反比，对照标准曲线即可确定被测样品中ENR的含量。本发明提供的检测ENR试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高，可以达到0.01ng/mL以上。

Description

一种恩诺沙星的检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测恩诺沙星(Enrofloxacin，ENR)的检测试剂盒及其检测方法，属于时间分辨荧光免疫分析(Time resolvedfluoroisnmunoassay，TRFIA)技术领域，用于动物源性食品、血液、尿液及饲料中恩诺沙星药物残留量的检测。

背景技术

恩诺沙星(Enrofloxacin，ENR)是人工合成喹诺酮类抗菌药，因其高效广谱、耐药菌少、在动物体内吸收快、分布广、生物利用度高、代谢快，是一种低毒、低蓄积药物，与其他抗菌药无交叉耐药性而被广泛应用于畜禽和水产养殖中感染性疾病的防治。恩诺沙星在畜禽养殖和水产养殖业中广泛应用，会随畜禽的排泄物进入土壤和水体环境，形成耐药菌，对生态环境造成影响。恩诺沙星虽然其毒性不强，但是人使用过量后，可引起机体肠胃道反应、致幼年动物关节病变。依据联合国粮农组织(FAO)及世界卫生组织(WHO)之评估，恩诺沙星对人体ADI值(每日安全摄取量)为2kg体重，以60kg成人计算，即每人每日安全摄取量为120g/d。近年来，国内外有关食用动物和人类的耐喹诺酮菌株的发病率及种类的报道日渐上升，由于这类药易诱发细菌耐药性，有兽药残留动物源性食品被人类长期食用会出现蓄积中毒，从而可引起人畜关节软骨病、光敏反应、肝肾毒性及导致淋巴细胞染色体变异的基因毒性，及可引起人肌腱破裂。它作为一种人畜共用药，药物残留通过食物链对人体健康危害更大，不利于该类药物对人类疾病的治疗。因此世界各国十分重视此类药在动物性食品中的残留问题，加强了氟喹诺酮类药物监管力度。欧盟、美国、日本、中国等均对动物源性食品中环丙沙星最高残留限量都作了禁用或限用的规定。

目前检测动物源性食品中恩诺沙星残留的主要方法有微生物法、四平板法、荧光法、高效液相色谱法(HPLC)、液质联用法(LC-MS)、毛细管电泳法和酶联免疫吸附法(ELISA)等。常用的恩诺沙星检测方法是色谱检测法和免疫学检测法。色谱检测法灵敏、准确，需要昂贵的仪器和专门的工作人员，而且样品处理较烦琐，其应用受到一定的限制，尤其是在基层大规模筛选和现场检测中更加突出。免疫学检测法灵敏、特异、快速、简便，克服了以上的不足，适合大规模筛选。

时间分辨荧光免疫分析检测技术是近来发展迅速的高灵敏检测手段。TRFIA其原理是利用具有双功能基团结构的螯合剂，其一端和镧系元素结合，另一端和抗体(抗原)上的自由氨基连接，制成Eu³⁺标记抗体(抗原)，它与待测样品中的抗原(抗体)结合成免疫复合物。理想情况下，测定复合物中镧系元素的荧光强度就能确定样品中抗原的含量，但实际上这种复合物的荧光强度相当弱，只有再加入一种增强溶液(Enhancement solution)，使镧系元素从复合物中解离下来，并与增强液中所含的β-奈甲酰三氟丙酮(β-NTA)重新形成微胶囊，在紫外光的激发下发射很强的荧光，增强效果上百万倍。用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，即可确定样品中抗原的量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种恩诺沙星试剂盒及检测方法，用于定性或定量地检测物源性食品、血液、尿液及饲料中恩诺沙星的残留量；检测时间短、平均回收率高、批内、批间误差小，并具有简便、快速、准确的特点。

本发明的技术方案：该检测恩诺沙星的试剂盒是由1、多孔包被板，2、缓冲液，3、恩诺沙星标准溶液，4、恩诺沙星的抗体，5、铕标记的羊抗兔抗体，6、洗涤液，7、增强液所组成。

本发明主要采用时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)来检测ENR。采用TRFIA的技术主要有两个方面：第一，特异性多克隆抗体的制备，利用抗原免疫家兔，获得含有抗体的血清，经过生化提纯分离免疫球蛋白；第二，Eu³⁺标记抗体的制备。

测定方法为：测定的基础是标记免疫反应。包被有ENR-载体蛋白的微孔板，加入ENR标准溶液或样品处理液到各自的微孔中、再加入ENR抗体，振荡反应，游离的ENR与微孔板上的ENR-载体蛋白竞争ENR抗体，洗涤液洗涤，没有连接的ENR抗体在洗涤步骤中被除去。加入Eu³⁺-羊抗兔抗体，进行标记免疫反应，再用洗涤液洗涤，反应后没有连接的Eu³⁺-羊抗兔抗体在洗涤步骤中被除去。加增强液振荡后，在紫外光的激发下发射很强的荧光，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的浓度成反比，对照标准曲线即可确定样品中ENR的量。

本发明的有益效果：该试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高，可以达到0.01ng/mL以上。

附图说明

图1：检测恩诺沙星检测试剂盒示意图。1、多孔包被板，2、缓冲液，3、恩诺沙星标准溶液，4、恩诺沙星的抗体，5、铕标记的羊抗兔抗体，6、洗涤液，7、增强液。

图2：ENR-TRFIA标准曲线图。

具体实施方式

实施例1：制备试剂盒和动物源性食品检测

免疫抗原的制备：

本发明所述的人工免疫抗原为将恩诺沙星(ENR)采用混合酸酐法与大分子载体蛋白结合，以合成的ENR-BSA作为免疫抗原进行动物免疫。

载体蛋白采用牛血清白蛋白(BSA)。称取30mg～300mg牛血清白蛋白，溶解于50％二氧六环水溶液6mL～10mL中，调pH值为9～10，为A液；称取10mg～40mg ENR，溶于2mL二氧六环中，置4℃10min，依次加入三正丁胺20μL和氯甲酸异丁酯10μL，于4℃搅拌30min，作为B液。将A液在4℃滴入B液，搅拌过夜。将反应液对蒸馏水透析72小时，期间换蒸馏水5次。或萄聚糖凝胶G50(Sephadex G50)柱提纯，以0.05mol/L pH8.0碳酸盐缓冲溶液洗脱。收集透析纯化液或第1峰的柱洗脱液，分装保存于-20℃作免疫原用。

恩诺沙星多克隆抗体的制备：

将上述合成的恩诺沙星-牛血清白蛋白结合物(ENR-BSA)作免疫抗原，采用皮内或皮下多点注射方式，接种1kg～1.5kg雄性新西兰兔；每隔4周免疫1次，第一次免疫时，在免疫原中加等量福氏完全佐剂混匀制成乳剂，以后免疫均加等量福氏不完全佐剂；自第二次免疫开始，每次免疫后8～10天采血测试抗血清效价。观察抗血清效价增长情况，达满意效价时取全血，分离血清。

抗血清经过3次硫酸铵沉淀后，再用层析柱分离纯化，对磷酸盐缓冲溶液透析。吸取抗血清10mL，平衡至室温，加入等量的0.01mol/LpH7.8磷酸盐缓冲溶液，充分混匀，加入20mL饱和硫酸铵溶液(以浓氨水调至pH7.8)，摇匀，4℃静止1小时后，以5000转/分钟离心5分钟，去上清液。沉淀物用20mL 0.01mol/L pH7.8磷酸盐缓冲溶液溶解，然后加入10mL饱和硫酸铵溶液(pH7.8)，摇匀，4℃静止30分钟后，以5000转/分钟离心5分钟，去上清液。重复盐析两次。最终以2mL0.01mol/L pH7.8磷酸盐缓冲溶液溶解免疫球蛋白IgG沉淀物，装入透析袋，对2000mL 0.01mol/L pH7.2磷酸盐缓冲溶液透析12小时。将上述透析液，加入到约25克湿重的纤维素DEAE-52(取纤维素DEAE-52干粉10克，用500mL 0.01mol/L pH8.0的磷酸盐缓冲溶液浸泡过夜，抽滤)中，4℃平衡1小时，每10分钟搅拌一次，倾入布氏漏斗中，用pH8.0的0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液洗滤。收集滤液，再对0.01mol/L pH7.4磷酸盐缓冲溶液透析12小时，最后加入适量甘油-18℃保存。

Eu³⁺-羊抗兔抗体的制备：

取溶解于50mmol/L PBS pH7.0的5g/L羊抗兔抗体1mL～2mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.15mol/L NaCl的50mmol/LNa₂CO₃-NaHCO₃ pH8.5缓冲液。收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量(1.46A₂₈₀-0.74A₂₆₀)，用上述洗脱液稀释羊抗兔抗体至2g/L。取500μL～1000μL稀释后的羊抗兔抗体加入含0.2mg～0.4mg的Eu³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu³⁺-DTTA)的小瓶中，30℃磁力搅拌反应20小时。反应液经用80mmol/L Tris-HCl pH7.8缓冲液平衡的S epharoseCL-6B柱(1×40cm)层析，A₂₈₀监测收集蛋白峰，稀释分装备用。

固相抗原包被板制备：

将恩诺沙星-卵清白蛋白结合物(ENR-OVA)用50mmol/LNa₂CO₃-NaHCO₃ pH9.6缓冲液稀释至10mg/L的包被液，96(或48)孔微孔板各孔加100μL，4℃放置过夜。弃去包被液，冲洗三次，加150μL含3g/L OVA的上述缓冲液封闭，4℃放置过夜。弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存。

试剂的配制：

(1)恩诺沙星(ENR)标准溶液：(0ng/mL，0.1ng/mL，1ng/mL，10ng/mL，100ng/mL，1000ng/mL)，从ENR纯品中稀释得到，稀释液为0.1mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液。

(2)缓冲液：8mmol/L NaCl、0.2％OVA、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、0.1mL/L Tween-80和0.1％NaN₃的Tris-HCl pH7.8。

(3)洗涤液：14.5mmol/L NaCl、0.2mL/L Tween-80和0.2％NaN₃的50mmol/L Tris-HCl pH7.8。

(4)增强液的配制：1L pH3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15μmol β-萘甲酰三氟丙酮(β-NTA)，50μmol三正辛基氧化膦(TOPO)，1mL曲拉通X-100(Triton X-100)。

试剂盒提供的试剂：

每一个盒中的试剂足够进行96个测量，盒中的材料如下：

(1)1×96孔板(8条×12孔，可以拆分为单孔)包被有DES-OVA。

(2)6×ENR标准液，1.0mL/瓶，标准液浓度为：0ng/mL，0.1ng/mL，1ng/mL，10ng/mL，100ng/mL，1000ng/mL。

(3)1×ENR抗体。

(4)1×Eu³⁺-羊抗兔抗体冻干品，用时0.5mL蒸馏水溶解。

(5)1×增强液：15mL。

(6)1×洗涤液：30mL，用时以蒸馏水1∶25稀释。

(7)1×缓冲液：30mL。

实验室应自备的试剂：

(1)蒸馏水或去离子水；

(2)乙腈；

(3)二氯甲烷；

(4)正己烷；

(5)氢氧化钠溶液：0.1mol/L；

(6)乙腈-0.1mol/L氢氧化钠溶液：取无水乙腈84mL加入0.1mol/L氢氧化钠溶液16mL混合均匀；

(7)磷酸盐缓冲工作液：pH7.2，取1.45g磷酸氢二钠(含12个结晶水)、0.1g磷酸二氢钾(无水)、8.0g氯化钠，溶解于水中并定溶至1000mL。

测定之前注意事项：

(1)使用之前将所有试剂回升至室温(18℃～30℃)。

(2)使用之后立即将所有试剂放回2℃～8℃。

(3)如果样品量大，建议使用多通道移液器。

(4)在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖子盖住微孔。

(5)取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放进原锡箔袋中，并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2℃～8℃。

具体检测步骤如下：

称取猪肉试样3.0g(精确至0.01g)，置于50mL离心管中，加入乙腈-0.1mol/LNaOH溶液9mL，充分混合10min，4000r/min以上、15℃离心10min，取上清液3mL，加入0.02mol/L PB缓冲液3mL，加入二氯甲烷8mL，充分混合10min，4000r/min以上、15℃离心10min，去除上清液，取下层有机相4mL至干燥容器中，50℃氮气吹干，用缓冲工作液1mL溶解干燥的残留物，加入正己烷1mL混合2min，4000r/min以上、15℃离心5min，轻吸掉上层和中间部分液体，取下层液50μL用于分析。

取ENR-OVA板条，加入50μL的ENR标准或处理好的样品处里液到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头，加缓冲液1∶20稀释的ENR抗体50μL，25℃振荡1小时，洗涤液洗三次，加缓冲液1∶20稀释的Eu³⁺-羊抗兔抗体100μL，25℃振荡1小时，用洗涤液洗六次，加200μL增强液振荡5分钟后测量。从标准曲线计算样品中的ENR含量，见表1和图2，该例样品溶液中ENR浓度为0.23ng/mL。

表1

实施实例2制备试剂盒

ENR-BSA抗原制备：

称取12mg ENR、40mg N-羟基琥珀酰胺(NHS)、35mg碳二亚胺(EDC)溶于N，N′-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌24h，制成A液；称取50mg BSA溶于3mL 0.01mol/mL pH7.4 PBS中，制成B液。将A液逐滴加入B液，边加边搅拌，室温反应3h，将反应液蒸馏水中透析72小时，期间换蒸馏水5次。或经萄聚糖凝胶G50(S ephadex G50)柱提纯，以0.05mol/L pH8.0碳酸盐缓冲溶液洗脱。收集透析纯化液或第1峰的柱洗脱液，分装保存于-20℃作免疫原用。

多克隆恩诺沙星抗体的制备：与实施例1相同，略。

Eu³⁺-羊抗兔抗体的制备：与实施例1相同，略。

固相抗原包被板制备：与实施例1相同。

试剂的配制：与实施例1相同。

试剂盒提供的试剂：与实施例1相同。

实验室应自备的试剂：与实施例1相同。

测定之前注意事项：同实施例1。

具体检测步骤：同实施例1。

实施实例3

试剂盒提供的试剂与实施例1相同，用于检测蜂蜜样品。

实验室应自备的试剂：

(1)0.02mol/L的PB缓冲液：称取Na₂HPO₄·12H₂O 5.16g、NaH₂PO₄0.87g至容量瓶中，加水溶解并定容至1L；

(2)二氯甲烷溶液；

(3)0.02mol/L的PB缓冲液：称取Na₂HPO₄·12H₂O 5.16g、NaH₂PO₄0.87g至容量瓶中，加水溶解并定容至1L；

(4)磷酸盐缓冲工作液：pH7.2，取1.45g磷酸氢二钠(含12个结晶水)、0.1g磷酸二氢钾(无水)、8.0g氯化钠，溶解于水中并定溶至1000mL。

测定之前注意事项：同实施例1。

具体检测步骤如下：

准确称取1.0g±0.01g蜂蜜试样于50mL离心管中，加入0.02mol/L的PB缓冲液2mL，震荡至蜂蜜全部溶解，加入二氯甲烷8mL，震荡提取5min，4000r/min以上离心5min，轻吸掉上层液，取下层有机相至干燥容器中，50℃氮气吹干，用缓冲工作液1mL溶解干燥的残留物，再用缓冲液工作液按比例稀释，取50μL用于分析。

取ENR-OVA板条，加入50μL的ENR标准或处理好的样品处里液到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头，加缓冲液1∶20稀释的ENR抗体50μL，25℃振荡1小时，洗涤液洗三次，加缓冲液1∶20稀释的EU³⁺-羊抗兔抗体100μL，25℃振荡1小时，用洗涤液洗六次，加200μL增强液振荡5分钟后测量。从标准曲线计算样品中的ENR含量，见表2和图2，该例样品溶液中ENR浓度为0.17ng/mL。

表2

Claims (8)

1.一种检测恩诺沙星的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒，其特征是由多孔包被板(1)，缓冲液(2)，恩诺沙星标准溶液(3)，恩诺沙星的抗体(4)，铕标记的羊抗兔抗体(5)，洗涤液(6)和增强液(7)所组成。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中的包被板(1)包被固相抗原，用50mmol/L pH9.6Na₂CO₃-NaHCO₃的缓冲液将ENR-OVA稀释至10mg/L做为包被液，96或48孔微孔板各孔加100μL，4℃放置过夜，弃去包被液，冲洗三次，加150μL含3g/L OVA的上述缓冲液封闭，4℃放置过夜，弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-18℃冷冻保存。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中的恩诺沙星标准溶液(3)，从ENR纯品中稀释得到，稀释液为0.1mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液，共6瓶，ENR浓度分别为：0ng/mL，0.1ng/mL，1ng/mL，10ng/mL，100ng/mL，1000ng/mL。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中的恩诺沙星的抗体(4)，用弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂1.2mL混合2mg ENR-BSA，用匀浆器混合2小时，制得油包水抗原乳化剂，取600μL制备好的油包水抗原乳化剂，在新西兰大白兔和BALB/c小白鼠身上多位点地进行皮下注射，在免疫3～4次后，可进行鉴定，血清和腹水合格后稀释、分装、冻干备用。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中的铕标记的羊抗兔抗体(5)，将购得的羊抗兔抗体，经PD-10柱转换缓冲条件至pH9.0，收集蛋白峰，取已转换的羊抗兔抗体加入Eu³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸，反应过夜，反应液经柱层析，收集蛋白峰，稀释、分装备用。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中的铕标记的羊抗兔抗体(5)，取溶解于50mmol/L PBS pH7.0的5g/L羊抗兔抗体1mL～2mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/L NaCl的50mmol/LNa₂CO₃-NaHCO₃pH8.5～9.0缓冲液，收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量，用上述洗脱液稀释羊抗兔抗体至2g/L，取500μL～1000μL稀释后的羊抗兔抗体加入含0.2mg～0.4mg的Eu³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸的小瓶中，28℃～30℃磁力搅拌反应16小时，反应液经用80mmol/L Tris-HCl pH7.8缓冲液平衡的Sephadex-G50柱(1×40cm)层析，收集蛋白峰，稀释、分装备用。

7.一种用权利要求1所述的试剂盒检测恩诺沙星的方法，其特征是取包被有ENR-OVA的微孔包被板，加入ENR标准或处理好的样品到各自的微孔中，再加入ENR抗体，振荡反应，洗涤液洗涤，加铕标记的羊抗兔抗体，进行标记免疫反应，洗涤液洗涤，加增强液振荡后测量荧光强度cps，对照标准曲线计算样品中的ENR含量。

8.根据权利要求8所述的检测恩诺沙星的方法，其操作为：取包被有ENR-OVA的微孔包被板，加入50μL的ENR标准或处理好的样品到各自的微孔中，加50μL以缓冲液(2)作稀释剂，1∶20稀释ENR抗体，25℃～37℃振荡0.5～1小时，洗涤液洗三次，加以缓冲液(2)1∶20稀释的100μL Eu³⁺-羊抗兔抗体，25℃～37℃振荡0.5～1小时，用洗涤液洗六次，加200μL增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，从标准曲线计算样品中的ENR含量。

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