CN109752554A - 一种牛奶中黄曲霉毒素m1的时间分辨荧光免疫试剂盒 - Google Patents
一种牛奶中黄曲霉毒素m1的时间分辨荧光免疫试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测牛奶中黄曲霉毒素M1的时间荧光分辨荧光免疫分析试剂盒。所述检测黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫分析检测试剂盒是由多孔包被板、缓冲液、黄曲霉毒素M1标准品、黄曲霉毒素M1的抗体冻干品、铕标记的羊抗鼠抗体、洗涤液和增强液所组成。所述检测黄曲霉毒素M1的时间荧光免疫分析试剂盒的检测方法包括下列步骤:(1)免疫原的制备;(2)包被原的制备;(3)单克隆抗体的制备;(4)样品的前处理及检测。本发明检测时间短、平均回收率高、样品前处理简单、能现场操作检测,应用广泛,检测成本低,同时具有检测特异性强,批内和批间差异小、灵敏度高和操作简单快速,且特别适合于大批量样品的检测等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域,具体的说,涉及一种检测牛奶中黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫分析试剂盒。
背景技术
黄曲霉毒素(Aflatoxins,AFT)是真菌的次级代谢产物,主要是由黄曲霉(A.flavus)、寄生曲霉(A. parasiticus)和集蜂曲霉(A. nonius)一些菌株产生的;黄曲霉的产毒能力由于菌株的不同而差异甚大;寄生曲霉的所有菌株都能产生黄曲霉毒素。黄曲霉毒素是一种毒性很强的肝毒素,可引起肝脏的急性或慢性损害,它与乙肝病毒被认为是肝癌的最主要的两大诱因;除损害机体的肝脏以外,黄曲霉毒素对肾脏等其他多种组织器官也能造成严重损害,更为严重的是黄曲霉毒素已被证实具有致癌、致畸、致细胞突变的“三致”作用。黄曲霉毒素广泛存在于花生、玉米、麦类、稻谷等谷物农产品中,在通心粉、调味品、牛奶和食用油等食品中也经常发现,严重危害人、畜、禽类健康。黄曲霉毒素 B1 被公认为是目前致癌力最强的天然物质,1993 年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物。自从 1961 年发现黄曲霉毒素以来,黄曲霉毒素的种类越来越多。目前已分离鉴定出十二种,分别是黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2、M1、M2、B2a、G2a、GM1、R0 和毒醇;从化学结构上看,各种黄曲霉毒素的结构非常相似,都含有一个双呋喃环和氧杂萘邻酮(香豆素),前者为基本毒性结构,后者可能与致癌有关。黄曲霉毒素的毒性比氰化物和砒霜大很多倍。目前已查明,黄曲霉毒素对人和很多种动物都表现出剧烈的毒性,而且具有明显的致癌能力;其中黄曲霉毒素 B1 毒性最大,致癌能力最强,G1、M1 其次,B2、G2 和 M2 较弱。黄曲霉毒素 B1 除致癌外,还能引起突变和导致畸形。黄曲霉毒素 B1 的LD 50 为0.249 mg/kg, 小于 1 mg/kg,属特剧毒物质,其毒性为氰化钾的 10倍、为砒霜的 68 倍。人们发现,黄曲霉毒素 B1 是目前所有已知致癌物中致癌力最强的一种。我国规定鲜乳中黄曲霉毒素 M1 含量不能超过 0.5 μg/kg,而婴幼儿食品及乳粉中的黄曲霉毒素不得检出。
关于黄曲霉毒素的检测方法已经出现了许多的化学检测方法,如气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、薄层层析法、分光光度法、液质联用仪(LC-MS)、气质联用仪(GC-MS)等。化学检测方法存在测试成本高、分析时间长、检测所需样品量大(通常>500 mL)及前处理步骤繁琐等不足,无法在较大范围内系统、全面、快速分析黄曲霉毒素的含量。
而时间分辨荧光免疫分析法(TR-FIA)由于其特异性强、灵敏度高、操作简单、廉价,且特别适于大批量样品的检测等优点而越来越被人们所重视和采用。目前还没有针对黄曲霉毒素M1检测的时间荧光免疫分析法的专利和文献报道。
发明内容
为解决以上技术问题,本发明的目的在于提供一种牛奶中黄曲霉毒素M1残留的检测时间分辨荧光免疫分析试剂盒。
本发明的目的之二在于提供一种快速简便地检测牛奶中黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法,用于定量或定性地检测农作物中黄曲霉毒素M1残留量。
本发明目的之一是这样实现的:检测黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫分析试剂盒,其关键在于由多孔包被板、缓冲液、黄曲霉毒素M1标准品溶液、抗黄曲霉毒素M1的抗体冻干品、铕标记的兔抗鼠抗体、洗涤液和增强液体所组成。
本发明目的之二是这样实现的:检测黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法,包括免疫原、包被原和单克隆抗体的制备以及样品前处理及检测,其关键在于:
(1) 免疫原的制备:将半抗原黄曲霉毒素M1与牛血清白蛋白(BSA)偶联,得到免疫原(黄曲霉毒素M1-BSA);
(2) 包被原的制备:将半抗原黄曲霉毒素M1与卵血清白蛋白(OVA)偶联,得到包被原(黄曲霉毒素M1-OVA);
(3) 单克隆抗体的制备:
a. 用步骤(1)的免疫原(黄曲霉毒素M1-BSA)免疫小鼠,通过杂交瘤技术,得到分泌抗黄曲霉毒素M1的单克隆抗体的杂交瘤细胞株;
b. 以体内诱生腹水法大量制备抗体,使用Protein G柱进行纯化,获得抗黄曲霉毒素M1的单克隆抗体IgG;
c. 用步骤(2)的包被原包被96孔包被板;
(4) 样品的前处理及检测:
取包被有包被原(黄曲霉毒素M1-OVA)的多孔包被板,加入50 µL的黄曲霉毒素M1到各自的微孔中,加50 µL以缓冲液稀释的抗黄曲霉毒素M1抗体,25℃~37℃振荡0.5~1小时,洗涤液洗3次,加以缓冲液稀释的100 µL Eu3+ -兔抗鼠抗体,25℃~37℃振荡0.5~1小时,洗涤液洗6次,加200 µL增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps,根据标准曲线计算样品中的黄曲霉毒素M1含量。
上述的固相载体是多孔包被板,采用96孔的多孔包被板作为固相载体。
本发明主要采用时间分辨荧光免疫分析方法来检测黄曲霉毒素M1。采用时间分辨荧光免疫分析法的技术主要有两个方面:第一,特异性单克隆抗体制备,用偶联的免疫原免疫小鼠,通过杂交瘤技术,得到分泌抗黄曲霉毒素M1的单克隆抗体的杂交瘤细胞株;以体内诱生腹水法大量制备抗体,使用Protein G柱进行纯化,获得抗黄曲霉毒素M1的单克隆抗体IgG。第二,Eu3+标记抗体的制备。
本发明测定方法:测定的基础是标记免疫反应。包被有黄曲霉毒素M1-OVA的多孔包被板,加入测试样品到各自的微孔中,再加入抗黄曲霉毒素M1抗体,振荡反应,游离的黄曲霉毒素M1与微孔板上的黄曲霉毒素M1-OVA竞争抗黄曲霉毒素M1抗体,洗涤液洗涤,没有连接的黄曲霉毒素M1抗体在洗涤步骤中被除去。加入Eu3+-兔抗鼠抗体,进行标记免疫反应,再用洗涤液洗涤,反应后没有连接的Eu3+-兔抗鼠抗体在洗涤步骤中被除去。加增强液振荡后,在紫外灯的激发下发射很强的荧光,用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps,荧光强度与样品中的浓度成反比,对照标准曲线即可确定样品中黄曲霉毒素M1的量。
本发明检测方法不需要昂贵的仪器,样品前处理简单、能现场操作检测,应用广泛,该方法灵敏、准确、快速,操作简便、特异性强,适用于大批样品的快速检测。
具体实施方式
实施例
1、免疫原与包被原制备
本发明免疫原(黄曲霉毒素M1-BSA)的合成:准确称取黄曲霉毒素M1324mg溶解在2mLN,N-二甲基甲酰胺中,搅拌下逐滴加入γ-氨基丁酸溶液,搅拌反应3小时,调节反应液pH10左右。离心除掉沉淀物。将上述反应逐滴加入BSA溶液中(320mg BSA溶解于5mL生理盐水),再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)23mg,N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)45.4mg,4℃反应过夜,离心除去沉淀,取上清液用磷酸缓冲液(PBS)透析3天,每6小时更换透析液,将所得产物低压冻干,于-20℃保存备用;
包被原(黄曲霉毒素M1-OVA)的合成:在上述反应中,将BSA换成OVA后,得到反应偶联物黄曲霉毒素M1-OVA,该偶联物作为TR-FIA检测时作为包被原使用。
2、单克隆抗体制备
2.1动物免疫
用步骤1制备的免疫原分别免疫6周龄雌性Balb/c小鼠,每只小鼠的免疫剂量为100µg/0.2mL。首次免疫,用无菌0.01mol/L pH7.4 PBS溶解免疫原(黄曲霉毒素M1-BSA),再与等量弗氏完全佐剂混合,完全乳化,劲背部皮下分2~3点注射;加强免疫,用0.01mol/L pH7.4PBS溶解免疫原与等量弗氏完全佐剂混合,充分乳化,小鼠腹腔注射。每次间隔14~21天,第3次免疫后7~10天开始对免疫小鼠尾静脉采血,收集血清,用ELISA检测小鼠血清效价。末次免疫后间隔4周以上,在细胞融合前3~4天,腹腔注射黄曲霉毒素M1-BSA抗原100µg/0.2mL/只,注射后每天注意观察,保证融合前小鼠状态良好。
2.2单克隆抗体制备
分离免疫小鼠的脾细胞,并进行匀浆制备免疫脾细胞。取1只免疫的Balb/c小鼠,从眼眶放血分离血清作为阴性血清,处死。小鼠用75%酒精浸泡5min,进行整体消毒。将小鼠四肢固定,然后用镊子夹住小鼠下腹部皮肤,剪开一小口,再用镊子撕开皮肤,露出腹膜,换一套镊子和剪刀,在腹部中央腹膜上用剪刀剪开一小口。换一套镊子和剪刀,用剪刀剪开腹膜,露出脾脏,再换一套器械用镊子夹住脾脏,用剪刀将脾脏外膜剪破,然后放入事先灭菌的匀浆器中。加适量基础培养基(RPMI-1640)于匀浆器中,进行研磨,挤压出脾细胞,取出匀浆器的匀浆棒,再补加适量基础培养基(RPMI-1640),静置2min,将上层细胞液吸取后,放入腹腔巨噬细胞离心管中,重复上述操作1次。1200r/min离心10min,除去上清。将108个免疫脾细胞与1~2×107个SP2/0骨髓瘤细胞按照1:10或1:5的比例加入离心管中,进行混匀,然后于1500r/min水平离心10min,弃去上清。将离心管倒扣在灭菌的吸水纸上,把管中液体吸干。用手指或桌面轻轻敲击管底,让沉淀的细胞松动,再把离心管置于37℃水浴锅中。在1min内缓慢将50% PEG 0.8mL滴入离心管中,边加边轻轻用吸管尖搅拌沉淀细胞。再继续搅拌30s后,静置1min,然后慢慢加入事先进行37℃预温的40mL基础培养基(RPMI-1640)。加基础培养基方法为:第1min内逐滴滴入1mL, 第2min内逐滴滴入2mL, 第3min内逐滴滴入3mL, 第4min内逐滴滴入4mL,在每次加培养基时需缓慢加入,并轻轻地搅拌培养基,最后将剩余的RPMI-1640培养基慢慢加入。1000r/min离心5min,除去上清。然后用HAT培养基悬浮混合的细胞,再加入饲养脾细胞。根据需要补加适量的HAT培养基,混合均匀,再将含有饲养细胞的细胞融合液滴加到96孔细胞培养板上,滴加量约为150 µL/孔。将培养板置于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中,进行培养。用建立的间接ELISA筛选阳性细胞克隆。选择强阳性集落生长的孔,用有限稀释法进行克隆。并对其他阳性孔,进行24孔扩大培养,用间接ELISA和间接竞争ELISA对扩大培养孔的上清液进行检测,对间接ELISA和间接竞争ELISA均为阳性孔的细胞进行液氮冷冻保存。通过融合检测,并进行3次亚克隆后获得杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞株经过多次传代、冻存、复苏,杂交瘤细胞分泌抗体稳定。进行杂交瘤细胞染色体的计数,将每株杂交瘤细胞随机选择20个细胞,进行细胞染色体条数的计数,再计算细胞染色体条数的平均值。小鼠脾细胞染色体数为40条,SP2/0细胞的染色体数目平均数为62~68条,而本试验获得的20株杂交瘤细胞染色体数目都在92~103条之间,平均为96.8条。本杂交瘤细胞染色体数目高于两亲本细胞的染色体数目,说明是两种细胞的杂交产物。取细胞株细胞分泌的培养上清液,进行1:10稀释后,用夹心ELISA方法测定抗体亚型,该细胞株分泌的抗体亚型为IgG1。采用辛酸-硫酸铵法对小鼠腹水进行纯化。该单克隆抗体可用于制备时间分辨荧光检测试剂盒。
2.3单克隆抗体的纯化
采用辛酸-硫酸铵法对小鼠腹水进行纯化:取小鼠腹水10mL,加入等体积的巴比妥缓冲液,适量的二氧化硅混合,室温振荡30min。室温静置15min后,取上清于洁净离心管中,4℃,1800r/min离心20min;取上清液18mL,加入36mL 0.06mol/L醋酸钠缓冲液,用HCl调pH值至4.5,充分搅拌下在30min内缓慢加入辛酸297 µL;继续搅拌10min,然后转入4℃冰箱静置2h,4℃,15000r/min离心30min,上清液经0.45µm滤膜过滤后体积为50mL;加入5mL 0.1mol/L的磷酸缓冲液,用NaOH调pH值至7.6,搅拌下缓缓加入硫酸铵至终浓度为0.277g/mL;4℃冰箱静置2h后,4℃,12000r/min离心30min,弃上清;沉淀用5mL 0.1mol/L的磷酸缓冲液重悬,装入透析袋,用5000mL 0.01mol/L pH7.2 PBS缓冲液充分透析后,再用2000 mL蒸馏水透析,最后用3000mL三蒸去离子水透析;然后4℃,12000r/min离心30min,弃沉淀,收集上清液,测蛋白浓度。做SDS-PAGE电泳,鉴定单克隆抗体的纯度。
2.4兔抗鼠IgG抗体的制备
用Balb/C小鼠IgG免疫健康新西兰大白兔,制备高效价的兔抗鼠IgG高免血清,采用饱和硫酸铵沉淀法对血清进行粗提,经G-200过柱后得到高纯度的兔抗鼠IgG。
3.1、制备试剂盒和检测样品
取溶解于50 mmol/L PBS pH7.0的5g/L兔抗鼠抗体1~2mL,经PD-10柱转换缓冲条件,洗脱液为含0.155mmol/L NaCl的50 mmol/L Na2CO3-NaHCO3 pH8.5缓冲液。收集蛋白峰,经紫外吸收分析定量(1.46A280-0.74A260),用上述洗脱液稀释兔抗鼠抗体至2g/L。取500~1000μL稀释后的兔抗鼠抗体加入含0.2~0.4mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)的小瓶中,30℃磁力搅拌反应20小时。反应液经用80mmol/L Tris-HCl pH7.8缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱(1×40cm)层析,A280监测收集蛋白峰,稀释分装备用。
3.2包被板固相抗原制备
将黄曲霉毒素M1-OVA用50mmol/LNa2CO3-NaHCO3 pH9.6缓冲液稀释至1mg/L的包被液,96孔包被板各孔加100 μL,4℃放置过夜。弃去包被液,冲洗三次,加150μL含3g/L OVA的上述缓冲液封闭,4℃放置过夜。弃去封闭液,真空抽干,板条密封后置-20℃冷冻保存。
3.3试剂的配制
(1)黄曲霉毒素M1标准品溶液配制:将黄曲霉毒素M1标准品,稀释成为0ng/mL,0.01ng/mL,0.025ng/mL,0.1ng/mL,0.25ng/mL,1ng/mL,2.5ng/mL,10ng/mL,25ng/mL,100ng/mL系列浓度,稀释液为0.1mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液;
(2)缓冲液:8mmol/L NaCl、0.2% OVA、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、0.1mL/LTweeen-80和0.1%NaN3的50mmol/L Tris-HCl pH7.8;
(3)洗涤液为:14.5mmol/L NaCl、0.2mL/L Tweeen-80和0.2%NaN3的50mmol/L Tris-HCl pH7.8;
(4)增强液的配制:由15μmol β-萘甲酰三氟丙酮、50μmol三正辛基氧化膦和1mL曲拉通X-100加入pH3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液中,再定容至1L配制而成。
3.4试剂盒提供的试剂
基于上述制备的试剂,本发明用于检测黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫分析试剂盒包括如下材料:
(1)96孔酶标板×1块;
(2)黄曲霉毒素M1标准品1mg/mL/瓶;
(3)抗黄曲霉毒素M1抗体冻干品,用时用0.5 mL蒸馏水溶解;
(4)Eu3+-兔抗鼠抗体冻干品,用时用0.5 mL蒸馏水溶解;
(5)增强液:15mL;
(6)10×洗涤液:30mL;
(7)缓冲液:30 mL。
3.5测定之前注意事项:
A.使用之前将所有试剂回升至室温(18-30℃);
B.使用之后立即将所有试剂放回2-8℃;
C.如果样品量大建议使用多通道移液器;
D.在所有恒温孵育过程中,避免光线照射,用盖子盖住微孔;
E.取出需用数量的微孔板及框架,将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封, 保存于2-8℃。
3.6具体检测步骤如下:
取黄曲霉毒素M1-OVA板条,加入50 µL的黄曲霉毒素M1到各自的微孔中,加50 µL以缓冲液稀释的抗黄曲霉毒素M1抗体,25℃~37℃振荡0.5~1小时,洗涤液洗3次,加以缓冲液稀释的100 µL Eu3+ -兔抗鼠抗体,25℃~37℃振荡0.5~1小时,洗涤液洗6次,加200 µL增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps,从标准曲线计算样品中的黄曲霉毒素M1含量。
3.7按下列步骤制备试剂盒和检测牛奶样品:
(1)制备试剂盒同实施例;
(2)具体检测步骤如下:
取黄曲霉毒素M1-OVA板条,加入50 µL的黄曲霉毒素M1到各自的微孔中,加50 µL以缓冲液稀释的抗黄曲霉毒素M1抗体,25℃~37℃振荡0.5~1小时,洗涤液洗3次,加以缓冲液稀释的100 µL Eu3+ -兔抗鼠抗体,25℃~37℃振荡0.5~1小时,洗涤液洗6次,加200 µL增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps,根据标准曲线计算样品中的黄曲霉毒素M1含量。
Claims (6)
1.一种检测牛奶中黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫分析试剂盒,其特征在于:由多孔包被板,缓冲液,黄曲霉毒素M1标准品,黄曲霉毒素M1的抗体冻干品,铕标记的羊抗鼠抗体,洗涤液和增强液所组成。
2.一种根据权利要求1所述检测黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫分析试剂盒,包括免疫原、包被原和单克隆抗体的制备以及样品前处理,其特征在于:
(1) 将黄曲霉毒素M1与牛血清白蛋白偶联,得到免疫原;
(2) 将黄曲霉毒素M1与卵血清蛋白偶联,得到包被原;
(3) 用步骤(1)的免疫原免疫小鼠,通过杂交瘤技术,得到分泌抗黄曲霉毒素M1的单克隆抗体的杂交瘤细胞株;
(4) 以体内诱生腹水法大量制备抗体,使用Protein G柱进行纯化,获得抗黄曲霉毒素M1的单克隆抗体
(5) 用步骤(2)的包被原包被固相载体;
(6) 将动物组织先经过酸解提取后,再过MAX柱净化,最后加入衍生试剂和催化剂进行处理,得到待测产物;
(7) 将步骤(6)的待检物进行测量荧光强度cps,对照标准曲线计算样品中的黄曲霉毒素M1黄曲霉毒素M1含量。
3.根据权利要求1所述检测黄曲霉毒素M1的时间荧光免疫分析法试剂盒,其特征在于:所述的固相载体是多孔包被板,采用96孔的多微孔包被板作为固相载体。
4.根据权利要求1所述检测黄曲霉毒素M1的时间荧光分辨免疫分析法试剂盒,其特征在于:所述的衍生试剂是丁胺。
5.根据权利要求1所述检测黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒,其特征在于:所述的催化剂是腈基磷酸二乙酯。
6.根据权利要求1所述检测黄曲霉毒素M1的时间荧光免疫分析法试剂盒,其特征在于:所述步骤(6)和(7)具体为取包被有黄曲霉毒素M1-OVA的微孔包被板,加入50 µL处理好的样品到各自的微孔中,加入50 µL以缓冲液稀释的黄曲霉毒素M1抗体,25~37℃振荡0.5~1小时,洗涤液洗三次,加以缓冲液稀释的100 µL Eu3+-羊抗鼠抗体,25~37℃振荡0.5~1小时,洗涤液洗六次,加200 µL增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps,从标准曲线计算样品中的黄曲霉毒素M1含量。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20190514 |
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