CN101619318A - 一种抗草甘膦基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗草甘膦基因，该基因的核苷酸序列为以下任意一种：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或者与SEQ ID NO：3相比具有不小于45％的相同性的序列。本发明还公开了上述抗草甘膦基因编码的蛋白质多肽，其氨基酸序列为以下任意一种：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或者与SEQ ID NO：1相比具有不小于45％的相同性的序列。上述抗草甘膦基因的用途是：通过转基因在植物中表达，从而使植物获得抗草甘膦能力。

Description

一种抗草甘膦基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体的说，本发明涉及抗草甘膦基因及其编码的蛋白质。这种基因可以用来在植物中表达而使植物获得对草甘膦的抗性能力，从而可以利用草甘膦选择性地防除杂草。本发明也可以运用在作物的育种、植物细胞培养的筛选。

背景技术

草甘膦是一种非常重要的除草剂，它抑制植物中芳香族氨基酸生物合成中的一种重要的酶，即5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)。草甘膦是一种极广谱的除草剂，对农作物也同样具备杀伤力。因此为了能够在农作物生长时选择性地杀草，农作物需要获得具有抗草甘膦的能力。

草甘膦也能够抑制大部分细菌中芳香族氨基酸的生物合成中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)。但部分细菌的EPSPS已发现对草甘膦具有抗性，并且被分离获得。植物可以通过转基因表达细菌的抗性EPSPS而获得抗草甘膦的能力。农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens sp CP4)和Salmonella typhimurium CT7的EPSPS在植物中表达而获得的抗性已在生产中引用(美国专利453590，4769061，5094945)。但是为了提高转基因农作物的抗性水平和增加抗性基因的多样性，生产应用中仍然需要新的抗草甘膦基因和以此为基础的转基因抗草甘膦植物。

随着DNA序列测定能力的大幅度提高，大量生物的基因组全序列被测定。例如，已经测定的细菌基因组有1515个(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi)。通过分子信息学的方法可以发现其中大部分这些细菌基因组中的EPSPS基因。因此现在已经知道氨基酸序列的EPSPS基因是非常多的。但是，这些众多的EPSPS基因并不能直接提供人们抗草甘膦的基因。相反，尽管已经知道大量EPSPS基因的氨基酸序列，人们仍然缺少抗草甘膦基因，并且一直在继续发掘抗草甘膦基因(如US专利申请：20070300326；20070289035)。这是因为，一种细菌的EPSPS是否抗草甘膦以及抗性的高低，是不能通过EPSPS的氨基酸序列预测的。对于许多基因，包括EPSPS基因，基因组全序列的测定仅仅为这些基因的克隆提供了更加简单的方法而已，它的特别功能和用途仍然需要进一步的发现和研究。本发明首先发现了Deinococcus radiodurans R1的抗草甘膦能力，然后利用其基因组序列的信息克隆了其EPSPS基因，并且进一步在E.coli以及水稻中证明了这个EPSPS基因的抗草甘膦能力及其在发展转基因抗草甘瞵农作物中的用途。

EPSPS基因传统上被分成2类，一类是I型(Class I)，它包括来自大肠杆菌、Salmonellatyphimurium等的EPSPS，另一类是II型(Class II)，它包括来自Agrobacterium tumefacienssp CP4、Achromobacter sp.LBAA和Pseudomonas sp PG2982等。一般认为，II型的EPSPS对草甘膦的抗性比较高。而本发明涉及一种既不属于I型又不属于II型的EPSPS基因，其抗草甘膦能力在本发明阐明以前是不知道的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基因，该基因具有很高的抗草甘膦能力，可以用来产生转基因抗草甘膦植物，也可作为微生物和植物细胞培育中的筛选标记。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种抗草甘膦基因，该基因的核苷酸序列为以下任意一种：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或者与SEQID NO：3相比具有不小于45％的相同性的序列。

本发明还同时提供了上述抗草甘膦基因编码的蛋白质多肽，该蛋白质多肽的氨基酸序列为以下任意一种：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或者与SEQ ID NO：1相比具有不小于45％的相同性的序列。

本发明还同时提供了一种质粒，包含核苷酸序列分子与控制表达的核苷酸序列连接而成的表达框，该核苷酸序列编码上述蛋白质多肽。

本发明还同时提供了一种抗体，其能与上述蛋白质多肽结合。

本发明还同时提供了上述抗草甘膦基因的用途，通过转基因在植物中表达，从而使植物获得抗草甘膦能力。

作为本发明的抗草甘膦基因的用途的改进：植物为水稻、玉米、棉花、小麦、大豆、草坪草或牧草。

本发明所提供的上述核苷酸序列，其编码的蛋白质多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：1的相同性至少在45％以上。氨基酸的相同性可以通过现有的方法获得，例如Karlin和Altschul，1990，Porc.Natl.Acad.Sci.USA 87：3364；Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877.)。

本发明的抗草甘膦基因的核苷酸序列可以有多种不同的变异，包括但不限于：1)利用同一个氨基酸的不同密码子而获得的不同的核苷酸序列，这些序列编码相同活性的蛋白质多肽；  2)通过导入核苷酸序列的变异但是仍然编码具有抗草甘膦能力的蛋白质的核苷酸序列。这种变异可以是随机的变异，也可以是针对性的点变异，还可以是插入或者缺失变异。本领域的一般技术人员就能够通过分子生物学的方法产生上述变异。

利用本发明提供的核苷酸序列，也可以获得具有相同功能的同源基因。一种方法是利用本发明提供的核酸为探针杂交DNA文库获得同源基因，另一种方法是根据本发明提供的核酸序列设计引物通过PCR而克隆同源基因。不仅如此，本领域的技术人员还利用本发明提供的核酸序列和蛋白质序列，通过分子信息学的方法从基因组库中找出高同源性的基因。如利用BLAST(www.ncbi.nih.gov)方法，根据本发明提供的核苷酸序列和蛋白质多肽的氨基酸序列，发现与本发明提供的基因同源性比较高的基因。通常蛋白质多肽的氨基酸序列与本发明的抗草甘膦基因G7至少有45％，55％，65％，75％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％的相同性的蛋白质可能具有抗草甘膦的活性，并且可以通过现在已有的方法进行确定，如利用本发明实施例3的方法。

本发明所提供的质粒包含上述抗草甘膦的核苷酸序列分子，并且功能性地与控制植物中表达的核苷酸序列连接而构成表达框。

本发明所提供的蛋白质多肽，其序列可以是如下的一种：1)SEQ ID NO：1；2)SEQID NO：2；3)与SEQ ID NO：1相比具有不小于45％的相同性的蛋白质多肽。这种蛋白质在植物细胞中能提高细胞的抗草甘膦能力。

本发明还提供了一种利用上述表达蛋白质制备抗体、并且利用抗体检测这种蛋白质的方法。

本发明还提供了一种对植物进行改造的方法：包括利用植物基因转化技术将上述抗草甘膦基因表达框导入植物细胞，再将其分化培育成相应的转基因植株。所获得的植株具有抗草甘膦能力。植物可以是水稻、玉米、棉花、小麦、大豆、草坪草或牧草。这些植物的转基因技术是已经现有的技术。

本发明还提供了利用上述抗草甘膦基因的核苷酸序列分子，在植物转基因细胞培养中作筛选标记。

利用本发明提供的抗草甘膦基因核苷酸序列，可以构建能够在植物中表达的人工基因。同样，根据本发明提供的抗草甘膦蛋白质多肽序列，也可以人工合成核酸序列(Campbell和Gowri，Plant Physiol.92：1-11)，并进一步构建能够在植物中表达的人工基因。能够在植物中表达的人工基因构件包括启动子、带有叶绿体信号肽的抗草甘膦基因和终止子。在植物中表达和产生抗草甘膦能力所需要的启动子、叶绿体信号肽和终止子是已经有的技术。例如，在转化单子叶植物时启动子可以是玉米Ubiqutin-1启动子，或者水稻Actin启动子；而终止子可以是根癌农杆菌终止子(Nos)或者其他终止子；引导抗草甘膦蛋白质进入叶绿体的信号肽可以是Rubisco的亚基的信号肽(de Castro Silva Filho 1996Plant Mol.Biol.30：767-780)、植物EPSPS基因信号肽(Archer 1990 J.Bioenerg.Biomemb.22(b)：789-810)。叶绿体信号肽的DNA片段连接一个在抗草甘膦基因在5’端，并且在一个表达阅读框内。这个表达构件可以通过农杆菌(如Agrobacterium菌株LAB4404)、基因枪方法或则其他方法整合到植物的基因组中获得抗草甘膦转基因植株。植物转化的技术和方法是已知和成熟的。不同植物的转化的方法和步骤有所不同。但是，通常通过农杆菌或基因枪导入植物的未成熟胚、成熟胚、未分化的愈伤组织或原生质体。然后用1到5mM的草甘膦培养基进行筛选培养。再进行分化而获得转化芽，经过生根培养基培养就可以获得可以种植的转基因苗。进一步，抗草甘膦转基因植物可以通过喷施草甘膦筛选。

本发明的又一个方面是提供抗草甘膦基因用来作为植物转基因的筛选标志。上述能够在植物细胞中表达的抗草甘膦人工基因可以与目的基因表达框构建在同一个植物转化质粒的同一个DNA转化片段上。目的基因可以是任何有价值的基因。这个植物转化质粒可以通过基因枪、农杆菌方法或则其他方法导入植物组织，而含有合适浓度的草甘膦(如1-5mM)培养基则可以选择性地杀死没有导入DNA转化片段的植物细胞，从而选择了含有目的基因的植物细胞。

本发明适用于所有植物，包括双子叶和单子叶植物。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是转化水稻的T-DNA载体中的G7表达框结构示意图。表达框由启动子、叶绿体信号肽、抗草甘膦EPSPS，和终止子组成；

图2是4种EPSPS基因的氨基酸序列比较图；

CP4代表：Agrobacterium tumefaciens sp CP4；

Deino R1代表：Deinococcus radiodurans R1；

Pseudomonas代表：Pseudomonas sp PG2982；

Acidbacteria代表：Acidobacteria bacterium Ellin345。

方框显示在II型(Class II)EPSPS氨基酸序列中保守的位点在G7中没有保存。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明的以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在Ausubel编写的John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols in Molecular Biology，和J.Sambrook等编写Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)出版的Molecular Cloning：ALabortory Manual，3rd ED.等文献均有详细的说明。

实施例1、抗草甘膦细菌的抗性测定

Deinococcus radiodurans是一种古老的细菌。为了测定它是否具有抗草甘膦能力，将D.radiodurans接种在含有25mM草甘膦的M 63培养基培养。M 63培养基的配方如下：(每升M63：13.6g KH₂PO₄，2g(NH₄)₂SO₄，0.5mg FeSO₄-7H₂O，2.4mg MgCl₂，10g glucose，10mg Thiamine-HCl和25mg L-Proline，40g琼脂糖，pH7.0)。

由于M63不含芳香族氨基酸，能够在这种培养基上存活和生长的细菌能够在高浓度的草甘膦条件下合成芳香族氨基酸，应该为抗性菌。结果表明D.radiodurans能够在25mM草甘膦的M 63培养基生长，而对照的大肠杆菌(E.coli)则不能在25mM草甘膦条件下生长，但是可以在没有草甘膦的M 63培养基生长。因此D.radiodurans可能包含有抗草甘膦基因。

实施例2、抗性基因的克隆

一种细菌抗草甘膦可能有多种机理。如拥有抗草甘膦的EPSPS基因；拥有能够降解草甘膦的酶；能够限制草甘膦的吸收，或者拥有修饰草甘膦的酶使草甘膦失去活性，等等。D.radiodurans的基因组研究全部测定(Whtie O，Eisen J A，Heidelberg J F，et al.Genomesequence of the radio-resistant bacterium Deinococcus radioduransR1.Science，1999，286：1571-1577)。因此发现其中的抗草甘膦基因可以从基因组中发现可能的抗性基因开始。D.radiodurans包含1个可能的EPSPS基因。但是，一种细菌的EPSPS是否抗草甘膦以及抗性的高低，是不能通过EPSPS的氨基酸序列预测的。特别是本发明涉及的这类新型的EPSPS的抗草甘膦能力更是无法预测。

为了确定D.radiodurans中的EPSPS基因的抗草甘膦能力，这个EPSPS基因通过PCR进行了克隆。PCR的引是：Dein-30：5’TTGACTCCTTCCACCGACATCACAG，Dein-C 5’AGCTCGAGTTA CGCTGTCGCTTCTGCGTACTCGAA。PCR的反应条件是：D.radiodurans基因组DNA为模板，Pfu为DNA聚合酶，经过94℃，40秒，60℃，60秒，72℃，90秒，共30个循环。获得的DNA片段直接克隆到pMD18-T质粒(宝生物工程(大连)有限公司)，获得pMD18-T-G7，然后进行测序。序列测定结果表明，这个片段包含一个ORF及其5’端的片段(SEQ ID No：3)。这个ORF编码一个EPSPS同源蛋白质多肽(SEQ ID No：1)，被命名为G7。

实施例3、G7基因的抗草甘膦性能的测定

对含有pMD18-T-G7(包含G7基因)载体的大肠杆菌的抗草甘膦能力进行了测定。

含有pMD18-T-G7和pMD18-T(空载体，对照)的大肠杆菌首先在LB中培养，当OD₆₀₀达到0.6时，取0.2ml在5000rpm离心1分钟，弃上清。沉淀的细胞经过M63培养液清洗后再离心，然后将沉淀的细胞用含60mM草甘膦的M63培养液(每升M63：13.6gKH₂PO₄，2g(NH₄)₂SO₄，0.5mg FeSO₄-7H₂O，2.4mg MgCl₂，10g glucose，10mgThiamine-HCl和25mg L-Proline，pH7.0)稀释到OD₆₀₀为0.02，然后在37℃培养(摇床250转/分钟)，24小时后，测定OD₆₀₀。含有pMD18-T-G7的克隆的OD₆₀₀是0.84，而含有pMD18-T的对照仅仅为0.05.这个实验重复进行了4次，得到了基本相同的结果。因此，G7使大肠杆菌获得了抗草甘膦的能力。

为了进一步证明G7的抗草甘膦的能力，含有pMD18-T-G7和pMD18-T(对照)的大肠杆菌被分别涂在含有30mM和60mM草甘膦并且同时含有0.2mM IPTG的M63培养基(同实施例1)上，在37℃培养48小时后，pMD18-T(对照)没有发现菌落的生长，而pMD18-T-G7明显在30和60mM草甘膦上均能生长。这进一步说明G7具有抗草甘膦能力。

实施例4、G7的同源基因的表达和抗草甘膦性能测定

与Deinococcus radiodurans R1近缘的细菌Deinococcus geothermalis DSM已经完成全基因组的DNA序列测定。通过序列分析，确定了D.geothermalis中G7的同源基因，被命名为G8，其核苷酸序列为SEQ ID No：4，编码的氨基酸序列为SEQ ID No：2。利用Vector-NTI的氨基酸序列对比分析程序分析，发现G8和G7的氨基酸序列的相同性为82％。由于G7被本发明证明具有抗草甘膦的能力，因此与G7高度同源的基因G8也可能具有抗性。

为了证明G8是否具有高的抗草甘膦能力，由上海生工合成了编码G8蛋白质多肽的人工基因DNA片段(SEQ ID No：6)。这个合成的DNA片段经过BamHI和XhoI酶切后，被克隆到用同样的酶酶切后的pET-28a质粒载体(http://www.emdbiosciences.com/msds/English/69864English.pdf)上，获得了质粒pET-28a-G8syn。这个质粒和pET-28a分别再导入大肠杆菌株BL21 Star(DE3)。

含有pET-28a-G8syn和pET-28a(空载体，对照)的大肠杆菌首先在LB中培养，当OD₆₀₀达到0.6时，取0.2ml在5000rpm离心1分钟，弃上清。沉淀的细胞经过M63培养液清洗后再离心，然后将沉淀的细胞用含50mM草甘膦的M63培养液稀释到OD₆₀₀为0.02，然后在37℃培养(摇床250转/分钟)，24小时后，测定OD₆₀₀。含有pET-28a-G8syn的克隆的OD₆₀₀是1.15，而含有pMD18-T的对照仅仅为0.06。因此，G8使大肠杆菌获得了抗草甘膦的能力。

实施例5、G7在大肠杆菌中表达和抗体的制备。

合成的编码G7的DNA片段(SEQ ID No：5)经过BamHI和XhoI酶切后，克隆到用同样的酶酶切后的pET-28a质粒载体，获得质粒pET-28a-G7syn。这个质粒再导入大肠杆菌株BL21 Star(DE3)。含有质粒pET-28a-G7syn以及对照质粒pET-28a的大肠杆菌在LB细菌培养液中培育，在OD600达到0.5时，添加IPTG到0.5mM，诱导蛋白质的表达。SDS-PAGE分析表明pET-28a-G7syn中有大量的大约45kD的蛋白质积累，而对照pET-28a中没有这种蛋白质的积累，说明G7蛋白质获得了大量的表达。

另一方面，包含pET-28a-G7syn的大肠杆菌能够在50mM草甘膦的M63培养基上生长，而包含没有G7基因的pET-28a的大肠杆菌却不能生长，进一步说明了G7具有抗草甘膦的能力。

在大肠杆菌中表达的G7蛋白质经过SDS-PAGE分离后，诱导表达的45kD的蛋白质从分离胶中切出，用来免疫兔子，制备抗体(在浙江中医大学实验动物中心完成)。

实施例6、G7与其他已知抗草甘膦基因的相似性

G7与其他已知抗草甘膦基因相当不同。利用Vector-NTI的氨基酸序列对比程序比较，发现它与已知具有抗草甘膦的农杆菌CP4的EPSPS基因(II型)的氨基酸序列只有26.1％的相同性，与Pseudomonas sp PG2982的(II型)只有27.9％的相同性(美国专利：5633435)，与大肠杆菌的EPSPS基因(I型)只有29.1％相同性。所以，G7既不是I型也不是EPSPS酶。G7不包含II型EPSPS酶的保守区域。例如，G7氨基酸序列中没有“GDKX”位点(图2中第一个框)，没有SAQXK位点(图2中第二个框)，也没有“NXTR”位点(图2中第三个框)，这里X代表各种不同的氨基酸。

实施例7、G7人工基因的合成和转基因抗草甘膦水稻的获得

1)G7表达框的构建

编码G7的合成DNA片段通过一般的分子生物学方法与一个玉米的叶绿体信号肽在5′端融合，形成新的开放阅读框，同时在3′端与一个终止子连接，获得一个带有叶绿体信号肽的编码G7的DNA片段，其5′端有BamHI位点，3′端有KpnI位点(SEQ ID No：7)。玉米的ubiquitin-1启动子(ZmUbi-1)通过从玉米基因组中PCR获得。PCR引物分别是ZmUbiF(GCGAAGCTTGCATGCCTACAGTGCAGCGTGACCCGGTCGTGC，加了HindIII位点--下划线表示)，和ZmUbiR(GTGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCA GAAGTAACACCAAACAACAG，加了BamHI位点--下划线表示)。带有叶绿体信号肽和终止子的G7基因片段(SEQ ID No：7)进一步和玉米的ubiquitin-1启动子通过BamH1连接，获得一个G7的表达框(图1)。这个表达框然后被克隆到pCambia1300的HindIII和KpnI位点之间，获得T-DNA载体pCam-G7。

2)水稻的转化

转基因植物的获得方法是采用现有技术(卢雄斌龚祖埙1998生命科学10：125-131；刘凡等，2003分子植物育种1：108-115)。选取成熟饱满的“秀水110”种子去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。取含目的基因载体pCam-G7的农杆菌划板，挑单菌落接种准备转化用农杆菌。将待转化的愈伤组织放入适当浓度的农杆菌液中(含乙酰丁香酮)，让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养基中，共培养2～3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤，转移到含适当抗生素的筛选培养基上，筛选培养(2mM草甘瞵)两个月(中间继代一次)。把筛选后，生长活力良好的愈伤转移到预分化培养基上培养20天左右，然后将预分化好的愈伤组织移到分化培养基，14小时光照分化发芽。2-3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植于温室，作为鉴定材料。

3)转基因水稻的抗草甘膦能力测定

选择10个不同的转基因水稻株和同品种“秀水110”的非转基因株种植在温室中(温度15-25℃)，在苗高大约10cm时，喷浓度为0.2％(W/V)的草甘膦，40mL/平方米。8天后检查，发现非转基因株全部死亡，而转基因水稻株死亡率为0％，其中8个转基因株系没有任何可见生长抑制，2个株系生长减缓。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

SEQ ID NO：1

Met Ser Asp Ala Leu Pro Ala Thr Phe Asp Val Ile Val His Pro Ala Arg Glu Leu Arg

Gly Glu Leu Arg Ala Gln Pro Ser Lys Asn Tyr Thr Thr Arg Tyr Leu Leu Ala Ala Ala

Leu Ala Glu Gly Glu Thr Arg Val Val Gly Val Ala Thr Ser Glu Asp Ala Glu Ala Met

Leu Arg Cys Leu Arg Asp Trp Gly Ala Gly Val Glu Leu Val Gly Asp Asp Ala Val Ile

Arg Gly Phe Gly Ala Arg Pro Gln Ala Gly Val Thr Leu Asn Pro Gly Asn Ala Gly Ala

Val Ala Arg Phe Leu Met Gly Val Ala Ala Leu Thr Ser Gly Thr Thr Phe Val Thr Asp

Tyr Pro Asp Ser Leu Gly Lys Arg Pro Gln Gly Asp Leu Leu Glu Ala Leu Glu Arg Leu

Gly Ala Trp Val Ser Ser Asn Asp Gly Arg Leu Pro Ile Ser Val Ser Gly Pro Val Arg

Gly Gly Thr Val Glu Val Ser Ala Glu Arg Ser Ser Gln Tyr Ala Ser Ala Leu Met Phe

Leu Gly Pro Leu Leu Pro Asp Gly Leu Glu Leu Arg Leu Thr Gly Asp Ile Lys Ser His

Ala Pro Leu Arg Gln Thr Leu Asp Thr Leu Ser Asp Phe Gly Val Arg Ala Thr Ala Ser

Asp Asp Leu Arg Arg Ile Ser Ile Pro Gly Gly Gln Lys Tyr Arg Pro Gly Arg Val Leu

Val Pro Gly Asp Tyr Pro Gly Ser Ala Ala Ile Leu Thr Ala Ala Ala Leu Leu Pro Gly

Glu Val Arg Leu Ser Asn Leu Arg Glu His Asp Leu Gln Gly Glu Lys Glu Ala Val Asn

Val Leu Arg Glu Met Gly Ala Asp Ile Val Arg Glu Gly Asp Thr Leu Thr Val Arg Gly

Gly Arg Pro Leu His Ala Val Thr Arg Asp Gly Asp Ser Phe Thr Asp Ala Val Gln Ala

Leu Thr Ala Ala Ala Ala Phe Ala Glu Gly Asp Thr Thr Trp Glu Asn Val Ala Thr Leu

Arg Leu Lys Glu Cys Asp Arg Ile Ser Asp Thr Arg Ala Glu Leu Glu Arg Leu Gly Leu

Arg Ala Arg Glu Thr Ala Asp Ser Leu Ser Val Thr Gly Ser Ala His Leu Ala Gly Gly

Ile Thr Ala Asp Gly His Gly Asp His Arg Met Ile Met Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu

Arg Ala Asp Ala Pro Leu Arg Ile Thr Gly Ala His His Ile Arg Lys Ser Tyr Pro Gln

Phe Phe Ala His Leu Glu Ala Leu Gly Ala Arg Phe Glu Tyr Ala Glu Ala Thr Ala

SEQ ID NO：2

Met Thr Asp Gly Leu Pro Glu Arg Phe Asp Val Leu Val His Pro Val Ser Glu Leu Arg

Gly Glu Leu Arg Ala Gln Pro Ser Lys Asn Tyr Thr Thr Arg Tyr Leu Leu Ala Ala Ala

Leu Ala Glu Gly Glu Thr Arg Val Val Gly Ala Ala Thr Ser Glu Asp Ala Glu Ala Leu

Ile Arg Cys Leu Arg Ala Trp Gly Ala Asp Val Asp Arg Val Gly Glu Asp Val Val Val

Arg Gly Phe Gly Ala His Pro Arg Ala Gly Met Thr Leu Asn Pro Gly Asn Ala Gly Ala

Val Ala Arg Phe Leu Met Gly Val Ala Ala Leu Thr Thr Asp Thr Thr Phe Val Thr Asp

Tyr Ser Glu Ser Leu Gly Arg Arg Pro Gln Gly Asp Leu Leu Ala Ala Leu Glu Arg Leu

Gly Ala Arg Val Ser Ser Arg Asn Gly Gln Leu Pro Val Thr Leu Ser Gly Pro Val Arg

Gly Gly Arg Val Glu Val Ser Ala Gln Arg Ser Ser Gln Tyr Ala Ser Ala Leu Met Phe

Leu Gly Pro Leu Leu Pro Asp Gly Leu Asp Leu Arg Leu Thr Gly Glu Ile Lys Ser His

Ala Pro Leu Arg Gln Thr Leu Asp Thr Leu Ala Ala Phe Gly Leu Gln Ala Arg Ala Ser

Ala Asp Leu Thr Arg Ile Thr Ile Pro Gly Gly Gln Ala Tyr Arg Pro Gly Arg Val Leu

Val Pro Gly Asp Tyr Pro Gly Ser Ala Ala Leu Leu Val Ala Ala Ala Leu Leu Pro Gly

Glu Val Thr Val Thr Asn Leu Arg Glu Gly Asp Leu Gln Gly Glu Arg Glu Ala Leu Asn

Val Leu Arg Ala Met Gly Ala Asp Leu Val Arg Glu Gly Asp Arg Val Thr Val Arg Gly

Gly Arg Pro Leu His Ala Val Thr Arg Asp Gly Asp Ser Phe Thr Asp Ala Val Gln Ala

Leu Thr Ala Ala Ala Ala Phe Ala Arg Gly Thr Thr Thr Trp Glu Asn Val Ala Thr Leu

Arg Leu Lys Glu Cys Asp Arg Ile Ser Asp Thr Arg Arg Glu Leu Glu Arg Leu Gly Leu

Thr Ala Thr Glu Thr Ala Asp Ser Leu Ser Ile Thr Gly Ala Asp Arg Ile Pro Gly Asp

Leu Thr Ala Asp Gly His Gly Asp His Arg Met Ile Met Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu

Arg Ala Glu Ala Pro Leu Arg Ile Thr Gly Ala His His Ile Arg Lys Ser Tyr Pro Leu

Phe Phe Arg His Leu Glu Glu Leu Gly Ala His Phe Glu Tyr Leu Pro Thr Asp Ala Ala

SEQ ID NO：3

1    TTGACTCCTT CCACCGACAT CACAGACAGC CCCGCTGCGC TCCCGGGCGG CGCCCTCTAC

61   CCTGTCCGCA TGTCCGACGC CCTGCCCGCC ACCTTCGATG TCATCGTTCA CCCGGCGCGG

121  GAGCTGCGCG GCGAGTTGCG GGCGCAGCCG AGCAAGAACT ACACGACGCG CTATCTGCTC

181  GCCGCCGCAC TCGCCGAGGG CGAAACCCGC GTGGTGGGCG TGGCGACGAG CGAGGATGCC

241  GAGGCGATGC TGCGATGTCT GCGCGACTGG GGTGCGGGCG TGGAACTCGT CGGCGACGAC

301  GCCGTGATTC GCGGCTTCGG GGCGCGGCCC CAGGCGGGCG TCACCCTCAA CCCCGGCAAC

361  GCGGGGGCGG TGGCCCGCTT CCTGATGGGC GTGGCGGCGC TGACGAGCGG CACAACTTTC

421  GTCACCGATT ACCCCGACTC GCTCGGCAAG CGGCCCCAGG GGGATTTGCT CGAAGCCCTG

481  GAGCGGCTGG GGGCGTGGGT GAGCAGCAAC GACGGACGCC TCCCTATCTC TGTCTCCGGC

541  CCGGTGCGCG GCGGCACCGT CGAAGTCAGC GCCGAGCGCA GCAGCCAGTA CGCCTCCGCG

601   CTGATGTTCC TGGGGCCACT GCTGCCGGAT GGCCTGGAAC TGCGGCTGAC CGGCGACATC

661   AAGAGCCACG CCCCGCTGCG GCAAACGCTC GACACGCTGT CCGACTTCGG CGTGCGGGCC

721   ACGGCGAGCG ACGACCTGCG GCGCATTTCC ATTCCCGGCG GGCAAAAGTA TCGGCCCGGA

781   CGGGTGCTGG TGCCCGGCGA CTACCCCGGC TCGGCGGCGA TTCTGACGGC GGCGGCCCTT

841   TTGCCCGGCG AGGTGCGGCT CTCCAACCTG CGCGAACACG ACCTGCAAGG CGAAAAGGAG

901   GCGGTGAACG TGCTGCGCGA GATGGGCGCC GACATCGTGC GGGAGGGCGA CACCCTGACG

961   GTGCGCGGGG GCCGCCCGCT GCACGCGGTG ACGCGCGACG GCGACAGCTT CACCGATGCG

1021  GTGCAGGCCC TCACCGCCGC TGCCGCCTTC GCGGAGGGCG ACACGACCTG GGAAAATGTC

1081  GCCACCCTGC GCCTCAAGGA GTGCGACCGC ATCAGCGACA CCCGCGCCGA GCTGGAGCGG

1141  CTGGGCCTGC GCGCCCGCGA AACGGCGGAC AGCCTCAGCG TGACGGGTAG CGCCCACCTT

1201  GCCGGGGGCA TCACCGCCGA CGGGCACGGC GACCACCGCA TGATCATGCT GCTGACCCTG

1261  CTGGGGCTGC GGGCCGACGC GCCGCTTCGA ATTACCGGGG CGCACCACAT CCGCAAGAGC

1321  TATCCGCAGT TTTTCGCCCA TCTGGAAGCG CTGGGGGCGC GGTTCGAGTA CGCAGAAGCG

1381  ACAGCGTAA

SEQ ID NO：4

1    ATGACCGACG GCCTGCCCGA GCGTTTCGAT GTTCTCGTCC ATCCAGTGTC TGAACTCCGG

61   GGCGAACTGC GCGCGCAGCC CAGCAAGAAC TACACCACCC GCTACCTTCT GGCTGCCGCG

121  CTGGCGGAGG GGGAAACGCG GGTGGTGGGC GCGGCGACCA GCGAGGATGC CGAGGCCCTG

181  ATTCGCTGCC TGCGTGCCTG GGGTGCGGAC GTCGACCGGG TGGGCGAAGA CGTGGTGGTG

241  CGTGGGTTCG GGGCACACCC CCGAGCGGGC ATGACCCTGA ATCCCGGCAA TGCGGGGGCG

301  GTCGCGCGCT TCTTGATGGG TGTAGCGGCC CTGACGACGG ACACGACCTT TGTGACCGAC

361  TACAGCGAGT CGCTGGGCCG GCGGCCCCAG GGCGACCTGC TCGCAGCACT AGAACGCCTC

421  GGTGCGCGGG TGAGCAGCCG CAACGGACAG CTGCCGGTCA CGCTCAGCGG CCCGGTGCGG

481  GGAGGACGGG TGGAGGTGTC GGCCCAGAGG TCGAGCCAGT ACGCGAGCGC CCTGATGTTC

541  CTGGGGCCAC TGTTGCCGGA CGGCCTCGAC CTGCGGCTAA CTGGCGAGAT CAAGAGCCAC

601  GCGCCGCTGC GGCAGACGCT CGACACGCTG GCCGCGTTCG GCCTTCAGGC CAGGGCCAGC

661  GCTGACCTCA CGCGCATCAC CATTCCGGGC GGACAAGCGT ACCGGCCAGG CCGCGTGCTG

721  GTGCCGGGTG ACTATCCAGG CAGCGCCGCC CTGCTGGTTG CCGCCGCCCT GCTGCCCGGT

781  GAGGTGACGG TAACAAACCT GCGCGAAGGC GATCTCCAGG GCGAGCGCGA GGCCCTGAAC

841   GTGCTGCGCG CGATGGGGGC GGACCTCGTG CGGGAGGGTG ACCGGGTGAC GGTGCGCGGG

901   GGGCGACCCC TCCACGCCGT GACCCGCGAC GGGGACAGCT TCACCGACGC GGTGCAGGCC

961   CTCACCGCTG CCGCCGCCTT TGCTCGGGGC ACCACGACCT GGGAGAACGT GGCCACCCTG

1021  CGCCTCAAGG AATGCGACCG CATCAGTGAC ACCCGCCGCG AGCTGGAGCG GCTGGGCCTG

1081  ACCGCCACAG AGACGGCCGA CAGCCTGAGC ATCACCGGCG CGGACCGCAT CCCTGGAGAC

1141  CTCACCGCCG ACGGCCACGG TGACCACCGC ATGATTATGC TGCTGACGCT GCTGGGGCTG

1201  CGGGCCGAGG CGCCCCTACG CATCACGGGC GCGCACCACA TTCGCAAGAG CTATCCGCTG

1261  TTTTTCCGCC ACCTCGAGGA GCTGGGGGCG CATTTTGAGT ATCTGCCGAC GGACGCGGCC

1321  TGA

SEQ ID NO：5

1     CTCGAGAACA ATGGGATCCG ACGTGATCGT GCATCCAGCT CGCGAACTCC GCGGCGAGCT

61    TCGCGCTCAG CCATCCAAGA ACTACACCAC TCGCTACCTC CTCGCCGCTG CCCTCGCTGA

121   GGGCGAGACC CGCGTGGTGG GCGTGGCTAC CTCTGAGGAC GCCGAGGCCA TGCTCCGCTG

181   CCTCCGCGAC TGGGGCGCTG GCGTGGAGCT TGTGGGCGAT GACGCCGTGA TCCGCGGTTT

241   CGGCGCTCGC CCACAGGCCG GTGTGACCCT CAACCCAGGC AACGCTGGCG CAGTGGCCCG

301   CTTCCTCATG GGCGTGGCCG CTCTCACCTC TGGCACCACT TTCGTGACCG ACTACCCGGA

361   CTCCCTCGGC AAGCGCCCTC AGGGCGACCT CCTTGAGGCC CTCGAACGCC TCGGTGCCTG

421   GGTGTCCTCC AACGACGGTC GCCTCCCGAT CTCCGTGTCC GGCCCAGTGC GCGGTGGCAC

481   CGTGGAGGTG TCCGCCGAGC GCTCCTCCCA GTACGCCTCC GCCCTCATGT TCCTCGGCCC

541   TCTCCTCCCG GACGGACTCG AACTCCGCCT CACCGGCGAC ATCAAGTCCC ACGCTCCGCT

601   CCGCCAGACA CTCGACACCC TCTCTGACTT CGGCGTGCGC GCCACTGCCT CCGACGACCT

661   CCGCCGCATC TCCATCCCGG GTGGCCAGAA GTACCGCCCA GGCCGCGTGC TCGTGCCGGG

721   CGACTACCCG GGCTCCGCTG CCATCCTCAC CGCCGCTGCC CTCCTCCCAG GCGAGGTGCG

781   CCTCTCTAAC CTCCGCGAGC ACGACCTCCA GGGCGAGAAG GAGGCCGTGA ACGTGCTCCG

841   CGAGATGGGC GCTGACATCG TGCGCGAGGG CGATACCCTC ACCGTGCGCG GTGGCCGCCC

901   TCTCCACGCC GTGACTCGCG ACGGCGATTC CTTCACCGAC GCCGTGCAAG CCCTCACCGC

961   CGCTGCTGCC TTCGCCGAGG GCGACACCAC CTGGGAGAAC GTGGCCACTC TCCGCCTCAA

1021  GGAGTGCGAC CGCATCTCTG ACACCCGCGC TGAGCTTGAG CGCCTCGGCC TCCGCGCACG

1081  CGAGACCGCC GACTCTCTCT CCGTGACTGG CTCTGCTCAC CTCGCTGGTG GCATCACCGC

1141  CGACGGCCAC GGCGACCACC GCATGATCAT GCTCCTCACC CTCCTCGGCC TCCGCGCAGA

1201  CGCTCCACTC CGCATCACCG GCGCACACCA CATCCGCAAG TCCTACCCTC AGTTCTTCGC

1261  TCACCTCGAA GCCCTCGGCG CTCGCTTCGA GTACGCTGAG GCCACCGCCT AATAGGAGCT

1321  CGAG

SEQ ID NO：6

1     CTCGAGAACA ATGGGATCCA CCGACGGCCT CCCAGAGCGC TTCGACGTGC TCGTGCACCC

61    TGTGTCCGAA CTCCGCGGTG AGCTTCGCGC ACAGCCGTCC AAGAACTACA CCACTCGCTA

121   CCTCCTCGCC GCTGCCCTCG CAGAGGGCGA GACTCGCGTG GTGGGAGCAG CCACCTCCGA

181   GGACGCTGAG GCCCTCATCC GCTGCCTCCG CGCCTGGGGT GCAGACGTGG ACCGAGTGGG

241   CGAGGACGTG GTGGTGCGCG GTTTCGGCGC CCACCCTCGC GCTGGCATGA CCCTCAACCC

301   AGGCAACGCC GGTGCCGTGG CACGCTTCCT CATGGGCGTG GCTGCCCTCA CCACTGACAC

361   CACATTCGTG ACCGACTACT CCGAGTCCCT CGGCCGTCGC CCTCAGGGCG ACCTCCTCGC

421   TGCCCTTGAG CGCCTCGGTG CTCGCGTGTC CTCTCGCAAC GGCCAGCTCC CGGTGACCCT

481   CTCCGGTCCT GTGCGCGGCG GACGCGTGGA GGTGTCCGCA CAGCGCTCCT CTCAGTACGC

541   TTCCGCTCTC ATGTTCCTCG GCCCTCTCCT CCCGGACGGC CTCGACCTCC GCCTCACCGG

601   TGAGATCAAG TCTCACGCTC CGCTCCGCCA GACCCTCGAC ACCCTCGCTG CCTTCGGCCT

661   CCAGGCACGC GCTTCCGCCG ACCTCACCCG CATCACCATC CCGGGTGGCC AGGCCTACCG

721   CCCTGGACGC GTGCTCGTGC CTGGCGACTA CCCGGGCTCC GCTGCCCTCC TCGTGGCTGC

781   CGCACTCCTC CCGGGTGAGG TGACCGTGAC CAACCTCCGC GAGGGCGACC TCCAGGGCGA

841   GCGCGAGGCA CTCAACGTGC TCCGCGCCAT GGGCGCCGAC CTCGTGCGCG AGGGCGACCG

901   CGTGACCGTG CGTGGCGGTC GCCCTCTCCA CGCCGTGACA CGCGACGGCG ACTCCTTCAC

961   CGACGCCGTG CAGGCCCTCA CCGCAGCTGC CGCCTTCGCT CGCGGAACCA CAACCTGGGA

1021  GAACGTGGCC ACCCTCCGCC TCAAGGAGTG CGACCGCATC TCCGACACCC GTCGCGAGCT

1081  TGAGCGCCTC GGCCTCACCG CTACCGAGAC AGCCGACTCC CTCTCCATCA CCGGAGCCGA

1141  CCGCATCCCT GGCGACCTCA CCGCCGATGG CCATGGCGAC CACCGCATGA TCATGCTCCT

1201  TACCCTCCTC GGCCTCCGCG CTGAGGCACC GCTCCGCATC ACCGGTGCCC ACCACATCCG

1261  CAAGTCCTAC CCGCTCTTCT TCCGCCACCT CGAAGAGCTT GGAGCCCACT TCGAGTACCT

1321  CCCGACCGAC GCTGCCTAAT AGGAGCTCGA G

SEQ ID NO：7

1     GGATCCACCA TGGCCACCGC CGCCGCCGCG TCTACCGCGC TCACTGGCGC CACTACCGCT

61    GCGCCCAAGG CGAGGCGCCG GGCGCACCTC CTGGCCACCC GCCGCGCCCT CGCCGCGCCC

121   ATCAGGTGCT CAGCGGCGTC ACCCGCCATG CCGATGGCTC CCCCGGCCAC CCCGCTCCGG

181   CCGTGGGGCC CCACCGATCC CCGCAAGGGA TCTGACGTGA TCGTGCATCC AGCTCGCGAA

241   CTCCGCGGCG AGCTTCGCGC TCAGCCATCC AAGAACTACA CCACTCGCTA CCTCCTCGCC

301   GCTGCCCTCG CTGAGGGCGA GACCCGCGTG GTGGGCGTGG CTACCTCTGA GGACGCCGAG

361   GCCATGCTCC GCTGCCTCCG CGACTGGGGC GCTGGCGTGG AGCTTGTGGG CGATGACGCC

421   GTGATCCGCG GTTTCGGCGC TCGCCCACAG GCCGGTGTGA CCCTCAACCC AGGCAACGCT

481   GGCGCAGTGG CCCGCTTCCT CATGGGCGTG GCCGCTCTCA CCTCTGGCAC CACTTTCGTG

541   ACCGACTACC CGGACTCCCT CGGCAAGCGC CCTCAGGGCG ACCTCCTTGA GGCCCTCGAA

601   CGCCTCGGTG CCTGGGTGTC CTCCAACGAC GGTCGCCTCC CGATCTCCGT GTCCGGCCCA

661   GTGCGCGGTG GCACCGTGGA GGTGTCCGCC GAGCGCTCCT CCCAGTACGC CTCCGCCCTC

721   ATGTTCCTCG GCCCTCTCCT CCCGGACGGA CTCGAACTCC GCCTCACCGG CGACATCAAG

781   TCCCACGCTC CGCTCCGCCA GACACTCGAC ACCCTCTCTG ACTTCGGCGT GCGCGCCACT

841   GCCTCCGACG ACCTCCGCCG CATCTCCATC CCGGGTGGCC AGAAGTACCG CCCAGGCCGC

901   GTGCTCGTGC CGGGCGACTA CCCGGGCTCC GCTGCCATCC TCACCGCCGC TGCCCTCCTC

961   CCAGGCGAGG TGCGCCTCTC TAACCTCCGC GAGCACGACC TCCAGGGCGA GAAGGAGGCC

1021  GTGAACGTGC TCCGCGAGAT GGGCGCTGAC ATCGTGCGCG AGGGCGATAC CCTCACCGTG

1081  CGCGGTGGCC GCCCTCTCCA CGCCGTGACT CGCGACGGCG ATTCCTTCAC CGACGCCGTG

1141  CAAGCCCTCA CCGCCGCTGC TGCCTTCGCC GAGGGCGACA CCACCTGGGA GAACGTGGCC

1201  ACTCTCCGCC TCAAGGAGTG CGACCGCATC TCTGACACCC GCGCTGAGCT TGAGCGCCTC

1261  GGCCTCCGCG CACGCGAGAC CGCCGACTCT CTCTCCGTGA CTGGCTCTGC TCACCTCGCT

1321  GGTGGCATCA CCGCCGACGG CCACGGCGAC CACCGCATGA TCATGCTCCT CACCCTCCTC

1381  GGCCTCCGCG CAGACGCTCC ACTCCGCATC ACCGGCGCAC ACCACATCCG CAAGTCCTAC

1441  CCTCAGTTCT TCGCTCACCT CGAAGCCCTC GGCGCTCGCT TCGAGTACGC TGAGGCCACC

1501  GCCTAATAGG AGCTCCAAGA TCTGTTGTAC AAAAACCAGC AACTCACTGC ACTGCACTTC

1561  ACTTCACTTC ACTGTATGAA TAAAAGTCTG GTGTCTGGTT CCTGATCGAT GACTGACTAC

1621  TCCACTTTGT GCAGAACTTA GTATGTATTT GTATTTGTAA AATACTTCTA TCAATAAAAT

1681  TTCTAATTCC TAAAACCAAA ATCCAGTGGG TACC

Claims (6)

1、一种抗草甘膦基因，其特征是：该基因的核苷酸序列为以下任意一种：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或者与SEQ ID NO：3相比具有不小于45％的相同性的序列。

2、根据权利要求1所述抗草甘膦基因编码的蛋白质多肽，其特征是：所述蛋白质多肽的氨基酸序列为以下任意一种：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或者与SEQ ID NO：1相比具有不小于45％的相同性的序列。

3、一种质粒，其特征是：包含核苷酸序列分子与控制表达的核苷酸序列连接而成的表达框，所述核苷酸序列编码权利要求2所述的蛋白质多肽。

4、一种抗体，其特征是：能与权利要求2所述的蛋白质多肽结合。

5、如权利要求1所述抗草甘膦基因的用途，其特征是：通过转基因在植物中表达，从而使植物获得抗草甘膦能力。

6、根据权利要求3所述的抗草甘膦基因的用途，其特征是：所述植物为水稻、玉米、棉花、小麦、大豆、草坪草或牧草。

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