CN117463420B - 一种侧向流微流控生物芯片包被方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种侧向流微流控生物芯片包被方法，用于对侧向流微流控生物芯片进行包被，包括至少以下步骤：将带有多个微孔的塑料薄膜贴在基片表面对应检测区、参考区的位置，并赶走塑料薄膜与基片之间的空气；在塑料薄膜对应的微孔上涂布硝酸纤维素膜匀浆；待硝酸纤维素膜匀浆中的成型剂挥发后，硝酸纤维素膜逐步干燥成型；去除塑料薄膜，在45‑65%的湿度条件下，对检测区和参考区进行生物分子的包被；对包被后的基片进行干燥；将基片与含有微流控通道结构的盖片进行键合。本发明预先将检测区和参考区制备硝酸纤维素膜，采用物理吸附的方法，可以有效的减少现有的包被环节，有效保证抗原（抗体）等生物分子的活性。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断及免疫检测技术领域，特别涉及一种侧向流微流控生物芯片包被方法。
背景技术
侧向流免疫微流控芯片是将抗原-抗体特异性结合与微流控芯片技术相融合的一种新兴POCT检测平台。而荧光免疫微流控融合免疫微流控技术和荧光免疫分析的原理，是传统微流控技术基础上的拓展。此项技术特点是以荧光微球标记抗体作为检测探针，整个检测过程被整合至如“信用卡”大小的检测卡中，检测卡中含干燥标记抗体、微米级反应通道、捕获抗体或抗原等，并通过内置的微通道产生毛细作用作为驱动力，完成抗原抗体结合、游离标记物分离，最后通过小型仪器读取信号。
与胶体金免疫层析不同，在侧向流免疫微流控芯片中，抗原-抗体反应是在微米级管道中进行的，而微米级管道是通过生物载片和塑料盖片相互嵌合形成。所述微通道一端与盖片上开设的加样孔连通，另一端与废液收集池连通，微流控基片的微通道内沿样本的流动方向依次设有标记区、1-2个检测区和1个质控区。其中，生物载片上的标记区会预先放置标记抗体或抗原，多个检测区通过生物素-亲合素系统包被特定捕获分子，质控区同样包被能够捕获标记化合物的捕获分子。侧向流免疫微流控芯片继承并发扬胶体金层析技术中简单、快速的特点，同时，采用荧光微球作为标记分子，检测敏感度得到提升，并拓宽应用范围。
在侧向免疫微流控反应中，芯片基片包被是至关重要的，生物芯片采用PMMA作为固相材质，只能采用化学偶联方式包被生物分子，主要采用的是亲和素-生物素化抗原（抗体）模式。但是其包被操作过于复杂，首先需将活化的亲和素包被于芯片的检测区和参考区；其次预先将包被抗原（抗体）用生物素修饰，再利用生物素-亲和素之间具有很高的亲和力，抗原（抗体）分子通过生物素-亲和素间接偶联于检测区和标记区。此过程需要多次温浴、洗涤，且需一定湿度环境，条件苛刻，操作极为复杂，不适合规模化生产等。
此外，在混合抗原包被时，由于含有多种蛋白分子，氨基酸种类不同，采用单一化学偶联方式很难满足不同蛋白质分子的要求，且包被后的生物分子活性很难保证。因此，改进微流控芯片的包被工艺，提高包被效率，简化包被流程是目前荧光免疫微流控规模化生产急需解决的问题。
发明内容
本发明针对现有侧向流微流控芯片包被方法的不足，提供一种侧向流微流控生物芯片包被方法，利用该方法可以简化现有包被工艺，同时适合混合蛋白的包被。
为实现上述目的，本发明的技术方案是这样实现的，一种侧向流微流控生物芯片包被方法，用于对侧向流微流控生物芯片进行包被，所述侧向流微流控生物芯片包括基片及压合于基片上的盖片，基片和盖片围合形成微通道，所述微通道沿液体流动方向依次设置有检测区、参考区；
包括至少以下步骤：
1）将带有多个微孔的塑料薄膜贴在基片表面对应检测区、参考区的位置，并赶走塑料薄膜与基片之间的空气；
2）在塑料薄膜对应的微孔上涂布硝酸纤维素膜匀浆；
3）待硝酸纤维素膜匀浆中的成型剂挥发后，硝酸纤维素膜逐步干燥成型；
4）去除塑料薄膜，在45-65%的湿度条件下，对检测区和参考区进行生物分子的包被；
5）对步骤4）包被后的基片进行干燥；
6）将基片与含有微流控通道结构的盖片进行键合。
在本发明的一些实施方案中，所述基片的材质为经过亲水性处理的聚甲基丙烯酸甲酯。
在本发明的一些实施方案中，所述塑料薄膜为长方形，所述塑料薄膜贴在基片时的长度方向与所述基片的长度方向相同。
在本发明的一些实施方案中，所述微孔沿塑料薄膜长度方向阵列分布，且每个微孔的孔径相同。
在本发明的一些实施方案中，所述微孔沿塑料薄膜宽度方向阵列分布。
在本发明的一些实施方案中，所述微孔的孔径为1mm-1.5mm，所述塑料薄膜的厚度为5μm。
在本发明的一些实施方案中，所述侧向流微流控生物芯片包括基片及压合于基片上的盖片，基片和盖片围合形成微通道，所述微通道一端与盖片上开设的加样孔连通，另一端与废液收集池连通，微流控基片的微通道内沿样本的流动方向依次设有检测区、参考区。
通过上述技术方案得到的一种侧向流微流控生物芯片包被方法，其有益效果是：
（1）简化现有包被工艺
本发明预先将检测区和参考区制备硝酸纤维素膜（NC），采用物理吸附的方法，可以有效的减少现有的包被环节，有效保证抗原（抗体）等生物分子的活性。
（2）适合混合蛋白包被
本技术发明使用NC膜作为固相材料，通过非共价吸附抗原，并且其吸附能力强，如对大多数的抗原（抗体）吸附接近100%，可以很好的保持过敏原的活性。
（3）防止检测点之间液体串流
一般情况下，免疫微流控生物芯片一般采用多指标联测，需要多个检测点且包被不同抗原，且相邻检测点距离很小，点样式液体容易串流。本技术发明使用带有微孔的薄膜涂布NC膜溶液，待干燥成膜后，不同检测点的NC膜是相隔的，且NC膜吸附能力极强，相邻检测点的液体不会发生串流。
附图说明
图1是本发明所述基片的结构示意图；
图2是本发明所述塑料薄膜的结构示意图；
图3是本发明所述侧向流微流控生物芯片包被的步骤图；
图4是本发明的一个实施例中纤维素膜包被区域的阵列图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
本发明总体来说属于免疫检测技术领域，涉及侧向流免疫微流控的生产环节，具体涉及生物芯片固相包被抗原或抗体等生物分子，其核心是将生物芯片的亚克力基质需包被生物分子的区域（检测区和参考区），预先涂布硝酸纤维素膜的溶液，待风干成膜，清洗，再采用物理吸附方式，将抗原或抗体包被在生物分子的区域（检测区和参考区）。
在酶联免疫吸附试验或斑点酶免疫印迹试验时，聚苯乙烯塑料/硝酸纤维素薄膜（NC）均可通过非共价或物理吸附机制结合抗体或蛋白质抗原，并保留原有的免疫活性，同时可塑性强、性质稳定，如NC膜对大多数抗体（抗原）的吸附近100%，而且当样品量微少时（<1μl），吸附也完全。上述固相材料仅仅是作为载体而不参与反应，并且制备方法简单、成本低廉，便于批量的包被，利于操作步骤的标准化。此外，物理吸附方式特点是能最大限度保持生物分子的生物活性。
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的解释说明，可以理解的是，本发明并不限于描述的具体实施方式。
如图所示，一种侧向流微流控生物芯片包被方法，用于对侧向流微流控生物芯片进行包被，所述侧向流微流控生物芯片包括基片及压合于基片上的盖片，基片和盖片围合形成微通道，所述微通道沿液体流动方向依次设置有检测区、参考区；
包括至少以下步骤：
1）将带有多个微孔的塑料薄膜贴在基片表面对应检测区、参考区的位置，并赶走塑料薄膜与基片之间的空气；
2）在塑料薄膜对应的微孔上涂布硝酸纤维素膜匀浆；硝酸纤维素膜匀浆为市售常用化学试剂，具体为在硝酸纤维素粒子溶解形成的混浆内，加入一定比例的表面活性剂/高分子聚合物/盐离子/成型剂等溶解的缓冲体系的试剂，最后形成的膜的性质。
3）待硝酸纤维素膜匀浆中的成型剂挥发后，硝酸纤维素膜逐步干燥成型；
4）去除塑料薄膜，在45-65%的湿度条件下，对检测区和参考区进行生物分子的包被；
5）对步骤4）包被后的基片进行干燥；
6）将基片与含有微流控通道结构的盖片进行键合。
所述基片的材质为亲水性处理的聚甲基丙烯酸甲酯PMMA，PMMA俗称有机玻璃，其具有良好的化学稳定性和耐热性，而PMMA的静态表面接触角在80°以上，亲水性不佳，为了使微通道内的液体能自发流动，需对PMMA表面进行亲水性处理。
所述塑料薄膜为长方形，所述塑料薄膜贴在基片时的长度方向与所述基片的长度方向相同。
所述微孔沿塑料薄膜长度方向阵列分布，且每个微孔的孔径相同。
所述微孔沿塑料薄膜宽度方向阵列分布。
所述微孔的孔径为1mm-1.5mm，所述塑料薄膜的厚度为5μm。
所述侧向流微流控生物芯片包括基片及压合于基片上的盖片，基片和盖片围合形成微通道，所述微通道一端与盖片上开设的加样孔连通，另一端与废液收集池连通，微流控基片的微通道内沿样本的流动方向依次设有检测区、参考区。
实施例
（1）基片
基片采用聚甲基丙烯酸甲酯PMMA，而PMMA的静态表面接触角在80°以上，亲水性不佳，为了使微通道内的液体能自发流动，需对PMMA表面进行改性处理，大致过程如下：首先使用CO2将PMMA材料切割成所需大小的实验基片（如长75 cm, 宽25 cm），并利用超声清洗波将其表面清洗干净，之后将其置于等离子体处理器3 min。
硝酸纤维素膜匀浆
将0.02g水滑石，20gN,N-二甲基乙酰胺,3g的硝酸纤维素粒子倒入反应装置中进行搅拌，搅拌时间大于4h，此过程室温进行，再将0.2g丙酮、5g聚砜、2g聚乙烯吡咯烷酮加入继续搅拌，时间24～36h，温度60℃，观察反应装置中固形物的含量，直至完全溶解,然后将配置好的NC膜液放入干燥的环境中，静置脱泡。
（3）装置结构
PMMA基片与带微孔的塑料薄膜的结构如图1-2所示
（4）具体操作
具体操作如图3所示
A 贴膜：将带有12个微孔（微孔分布呈两行，6列，共12个微孔）的塑料薄膜贴在PMMA基片表面上的检测区和参考区，微孔孔径：1mm，膜厚度：5μm，并赶走塑料薄膜与PMMA基片之间的空气。
B 涂布：将硝酸纤维素膜匀浆分别到涂布检测区和参考区的微孔内。
C 成膜：匀浆内的成型剂聚砜挥发后，膜逐步干燥成型。
D 去除薄膜：除去贴在PMMA基片上的塑料薄膜，则PMMA基片上可见由硝酸纤维素膜组成的2x6包被区域阵列。其中，包被阵列的前5列对应检测区，最后一列对应参考区，并按序编号（如图4所示，检测区依次编号为T1-T10，参考区编号为R1,R2）。
E 抗原包被：如表1所示，控制湿度在45%条件下，采用点样仪器（如喷涂系统）将5种吸入性过敏原（屋尘螨，粉尘螨，艾蒿，葎草，豚草）分别包被于T1-T5，将5种食入性过敏原（鸡蛋，牛奶，大豆，花生，小麦）分别包被于T6-T10（可根据地域差异，选择不同的吸入与食入性过敏原组合）。此外，采用点样仪器（如喷涂系统）于参考区（R1,R2)包被纯化人IgE。
表1 检测区与参考区包被
F 干燥
G 键合：将基片与含有微流控通道结构的盖片进行键合，至此微流控芯片制备完成。
（5）检测
将改进前的微流控芯片（即生物分子以化学偶联方式固定于生物基片表面）平放在实验台上，然后将35 μl稀释血清样本加入样本孔，反应5 min后，用分析仪判读T区与R区信号值。计算R1与R2的平均值R，最终结果以T/R方式表示。
同样的，将改进后的微流控芯片（即生物分子以物理吸附方式固定于生物基片表面）平放在实验台上，然后将35 μl稀释血清样本加入样本孔，反应5 min后，用分析仪判读T区与R区信号值。计算R1与R2的平均值R，最终结果以T/R方式表示。
（6）结果
如表2所示，用改进前芯片检测S1样本时，结果显示此患者血清中存在屋尘螨sIgE抗体与鸡蛋sIgE抗体；而用改进后的芯片检测时，除了上述两种sIgE抗体外，还存在粉尘螨sIgE抗体，表明粉尘螨抗原以化学偶联方式固定于芯片表面时，会影响其活性，从而导致假阴性结果。
表2 检测结果
上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种侧向流微流控生物芯片包被方法，用于对侧向流微流控生物芯片进行包被，所述侧向流微流控生物芯片包括基片及压合于基片上的盖片，基片和盖片围合形成微通道，所述微通道沿液体流动方向依次设置有检测区、参考区；
其特征在于，包括至少以下步骤：
1）将带有多个微孔的塑料薄膜贴在基片表面对应检测区、参考区的位置，并赶走塑料薄膜与基片之间的空气；
2）在塑料薄膜对应的微孔上涂布硝酸纤维素膜匀浆；
3）待硝酸纤维素膜匀浆中的成型剂挥发后，硝酸纤维素膜逐步干燥成型；
4）去除塑料薄膜，在45-65%的湿度条件下，对检测区和参考区进行生物分子的包被；
5）对步骤4）包被后的基片进行干燥；
6）将基片与含有微流控通道结构的盖片进行键合。
2.根据权利要求1所述的一种侧向流微流控生物芯片包被方法，其特征在于，所述基片的材质为经过亲水性处理的聚甲基丙烯酸甲酯。
3.根据权利要求1所述的一种侧向流微流控生物芯片包被方法，其特征在于，所述塑料薄膜为长方形，所述塑料薄膜贴在基片时的长度方向与所述基片的长度方向相同。
4.根据权利要求3所述的一种侧向流微流控生物芯片包被方法，其特征在于，所述微孔沿塑料薄膜长度方向阵列分布，且每个微孔的孔径相同。
5.根据权利要求4所述的一种侧向流微流控生物芯片包被方法，其特征在于，所述微孔沿塑料薄膜宽度方向阵列分布。
6.根据权利要求1-5任一项所述的一种侧向流微流控生物芯片包被方法，其特征在于，所述微孔的孔径为1mm-1.5mm，所述塑料薄膜的厚度为5μm。
7.根据权利要求1所述的一种侧向流微流控生物芯片包被方法，其特征在于，所述侧向流微流控生物芯片包括基片及压合于基片上的盖片，基片和盖片围合形成微通道，所述微通道一端与盖片上开设的加样孔连通，另一端与废液收集池连通，微流控基片的微通道内沿样本的流动方向依次设有检测区、参考区。
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