CN116106539A - 一种免疫微流控的多重抗原包被试剂盒及其方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于体外诊断与免疫检测技术领域，提出一种免疫微流控的多重抗原包被试剂盒，包括载体，所述载体上沿样本流动方向依次设置有标记区、检测区，所述检测区设置有放置荧光微球的微孔，所述微孔的数量为多个，所述微孔沿样本流动方向呈微阵列分布，所述荧光微球上包被有抗原，所述荧光微球的数量为多个，多个荧光微球为同一种荧光色素，且每个荧光微球的荧光色素含量不同，不同荧光色素含量的荧光微球分别包被不同的抗原，经激光照射后，荧光微球能发出同一荧光色泽但荧光强度不同的荧光，依次能够区分不同标号的荧光微球，进而区分不同的包被抗原，比起传统的多重包被方式使用的分散包被，包被过程更加集中且操作更简单。

Description

一种免疫微流控的多重抗原包被试剂盒及其方法、应用

技术领域

本发明属于体外诊断和免疫检测技术领域，特别涉及一种免疫微流控的多重抗原包被试剂盒及其方法、应用。

背景技术

免疫微流控是将特异的抗原抗体反应与微流控芯片技术相结合的一种新兴开放式检测技术平台，近年来在临床检验工作中被广泛应用，荧光免疫微流控融合免疫微流控技术和荧光免疫分析的原理，是在传统微流控技术基础上的拓展，该技术特点是用荧光微球标记抗体作为检测探针，整个检测过程被整合至如“信用卡”大小的检测卡中，检测卡中含干燥标记抗体、微米级反应通道、捕获抗体或抗原等，并通过内置的微通道产生毛细作用作为驱动力，完成抗原抗体结合、游离标记物分离，最后通过小型仪器读取信号。其中一种实施方式是在微芯片的特定位置分别包被针对不同待测物的配对抗体或抗原，随后将微芯片固定在微通道的检测区，采用不同标记物如不同种类的荧光素标记检测抗体，完成反应后由信号检测系统量化信号值，可实现多个指标的并行检测。

过敏原筛查是过敏性疾病诊断、预防和治疗的重要环节，血清过敏原sIgE抗体检测已成为临床上应用最为广泛的过敏性疾病辅助诊断的方法，临床上对于疑似过敏患者的诊断主要分为两个阶段：第一阶段是对待检者进行几十种常见过敏原的系统性筛查，第二阶段是有针对性的进行单一过敏原的检测，前者称为过敏原初筛试验，主要对多种过敏原联合检测，以明确致使患者出现过敏反应的具体过敏原种类；后者主要用于诊断后病情监测及治疗效果评估。近年来，随着精准医学及精准医疗时代的到来，通过检测患者体内sIgE水平明确过敏原的种类，可以指导和制定出适合每位患者的精准个体化预防和治疗方案，以期达到治疗效益最大化和医疗资源配置最优化，因此体外过敏原检测迫切需要多重检测技术，也就是每个反应可以同时检测多个指标，而免疫微流控可以对生物分子进行高通量、多重检测，因此是过敏原联合检测的备选技术之一。

现有的多重检测主要是通过微阵列技术实现，应用于微流控芯片平台可显著提高微流控的分析效率。该技术是在固相支持材料表面将各种不同的探针（针对不同待测物的配对抗原或抗体）固定成阵列，捕获待测标本中的靶物质，然后借助标记手段（荧光或化学发光）将结果可视化，最后通过仪器扫描结果并拍摄，根据阵列上可视化点的位置及荧光强度获取待测物信息。但该方法本身存在一些技术缺陷：例如应用于过敏原筛查时，阵列中每个点代表一种过敏原，在点样前，需预先设置阵列中每个点代表的具体过敏原种类，之后将相应过敏原固定在相应位置即可。但由于常见过敏原种类繁多，一块微小芯片上需至少容纳10-20种过敏原，手工操作极其复杂且容易造成定位错误，多重包被实施较为困难；点样过程中由于人为原因，易出现不同位点之间的点样错误。

发明内容

本发明针对现有免疫微流控的多重抗原包被方法的不足，提供一种免疫微流控的多重抗原包被试剂盒及其方法、应用，利用该方法制成的芯片，减少了使用时操作的复杂性，提高了包被环节的工作效率。

为实现上述目的，本发明的技术方案是这样实现的，一种免疫微流控的多重抗原包被试剂盒，包括载体，所述载体上沿样本流动方向依次设置有标记区、检测区，所述检测区设置有放置荧光微球的微孔，所述微孔的数量为多个，所述微孔沿样本流动方向呈微阵列分布，所述荧光微球上包被有抗原，所述荧光微球的数量为多个，多个荧光微球为同一种荧光色素，且每个荧光微球的荧光色素含量不同，不同荧光色素含量的荧光微球分别包被不同的抗原。

在本发明的一些实施方案中，所述载体为微流控芯片，所述微流控芯片包括微流控基片及压合于微流控基片上的微流控盖片，基片和盖片围合形成微通道，所述微通道一端与盖片上开设的加样孔连通，另一端与废液收集池连通，微流控基片的微通道内沿样本的流动方向依次设有标记区、检测区。

在本发明的一些实施方案中，所述基片上设置有薄片，所述薄片的厚度为荧光抗原微球粒径的1/5，所述微孔为所述薄片上设置的通孔，所述通孔的数量为多个，多个通孔之间按微阵列分布。

在本发明的一些实施方案中，所述微孔为基片表面设置的凹槽，所述凹槽深度为荧光微球粒径的1/5，所述凹槽上沿直经为荧光抗原微球粒径的1/3~4/5之间。

另一方面，本发明还提供了一种利用上述任意一个技术方案中的试剂盒的免疫微流控的多重抗原包被方法，包括至少以下步骤：

1）采用一定粒径的荧光微球作为包被载体，荧光微球提前以化学偶联方式包被特定抗原，经分离/封闭，质检，制备合格的荧光抗原微球；

2）制作多个带有同一种荧光色素包被不同抗原的荧光抗原微球，且每个包被不同抗原的荧光微球的荧光色素含量不同；

3）经激光照射后，荧光抗原微球能发出同一荧光色泽但荧光强度不同的荧光，依次区分不同的荧光抗原微球并进行标号，进而区分不同的包被抗原；

4）将预先包被的荧光抗原微球取出，每种荧光抗原微球为1个球体，通过试剂盒的载体上预留的微孔，将每个荧光抗原微球随机放入芯片阵点即可，并将荧光抗原微球固定在载体上。

另一方面，本发明还提供了一种利用上述免疫微流控的多重抗原包被方法在抗体检测试剂盒中的应用，包括如下步骤：

在载体上先后加入待测样品和荧光报告分子标记的二抗与检测区的荧光抗原微球反应，样品中的待测抗体能够与荧光抗原微球和荧光报告分子标记的二抗特异性结合，使包被抗原的荧光微球携带上荧光报告分子，随后对荧光抗原微球进行检测和结果分析，其中一种激光可将微球分类，进而区分包被抗原种类，另一种激光可确定微球上结合的报告荧光分子的数量，从而确定微球上结合的目的分子的数量。

通过上述技术方案得到的一种应用于蛋白质抗原的试剂盒及方法，其有益效果是：

1、分散包被变集中包被：本发明采用集中的预包被方式，提前以化学偶联方式将特定抗原（或过敏原）包被于相应荧光编码微球，之后将不同抗原微球随机放入芯片预留孔位即可，比起传统的多重包被方式使用的分散包被（每个芯片均需要将不同抗原或过敏原依次固定于芯片的特定位置组成阵列），包被过程更加集中且操作更简单。

2、准确定位变随机入位：本发明采用随机入位的方式，在芯片抗原包被过程中，只需将预先包被的抗原微球随机放入芯片预留孔位即可，通过检测微球自身荧光信号即可区分微球种类，进而区分包被抗原种类，比起传统免疫微流控的微阵列芯片的准确定位（传统免疫微流控的微阵列芯片中每个点代表一种抗原，在包被前，需预先设置阵列中每个点代表的具体抗原种类，之后需通过准确定位方式将特定抗原固定在相应位置），操作更加简单，提高了工作效率。

本技术发明采用集中的预包被方式，以荧光微球作为包被载体，提前以化学偶联方式包被特定抗原，由于目前抗原包被微球的技术较成熟，且制备好的抗原微球易通过流式进行质检，因此可以确保各微球之间的均一性，进而保证各芯片间包被的均一性。

附图说明

图1是根据本发明的一个技术方案提出的免疫微流控的多重抗原包被试剂盒的基片结构；

图2是应用图1中试剂盒中检测区用于微球固定的结构；

图3是应用图2中试剂盒中荧光抗原微球随机进入检测区后的结构；

图4是根据本发明的一个技术方案提出的过敏原sIgE抗体检测试剂盒的结构；

图5是应用图4中试剂盒加入待测样品的检测过程；

图6是应用图4中的试剂盒的检测结果。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

本发明总体来说涉及体外诊断（IVD）技术领域，采用集中预包被的方式制作抗原微球，微球自身荧光信号用于区分微球或包被抗原种类，而标记二抗的荧光信号，只有存在抗原-抗体反应时才能出现，通过两个荧光信号的结合判断检测结果。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的解释说明，可以理解的是，本发明并不限于描述的具体实施方式。

如图1-3所示，一种免疫微流控的多重抗原包被试剂盒，包括载体，所述载体上沿样本流动方向依次设置有标记区、检测区，所述检测区设置有放置荧光微球的微孔，所述微孔的数量为多个，所述微孔沿样本流动方向呈微阵列分布，所述荧光微球上包被有抗原，所述荧光微球的数量为多个，多个荧光微球为同一种荧光色素，且每个荧光微球的荧光色素含量不同，不同荧光色素含量的荧光微球分别包被不同的抗原。

所述载体可以选用依靠毛细管力驱动样本流动的微流控芯片或其他移动控制器驱动的样本流动的芯片，还可选用常见的检测试纸条（包括上样垫、标记垫、层析垫和吸样垫）。

在本发明的一些实施方案中，所述载体为微流控芯片，所述微流控芯片包括微流控基片及压合于微流控基片上的微流控盖片，基片和盖片围合形成微通道，所述微通道一端与盖片上开设的加样孔连通，另一端与废液收集池连通，微流控基片的微通道内沿样本的流动方向依次设有标记区、检测区。

在本发明的一些实施方案中，所述基片上设置有薄片，所述薄片的厚度为荧光微球粒径的1/5，所述微孔为所述薄片上设置的通孔，所述通孔的数量为多个，多个通孔之间按微阵列分布。

在本发明的一些实施方案中，所述微孔为基片表面设置的凹槽，所述凹槽深度为荧光抗原微球粒径的1/5，所述凹槽上沿直经为荧光抗原微球粒径的1/3~4/5之间。

另一方面，本发明还提供了一种利用上述任意一个技术方案中的试剂盒的免疫微流控的多重抗原包被方法，包括至少以下步骤：

1）采用一定粒径的荧光微球作为包被载体，荧光微球提前以化学偶联方式包被特定抗原，经分离/封闭，质检，制备合格的荧光抗原微球；

2）制作多个带有同一种荧光色素包被不同抗原的荧光抗原微球，且每个包被不同抗原的荧光微球的荧光色素含量不同；

3）经激光照射后，荧光抗原微球能发出同一荧光色泽但荧光强度不同的荧光，依次区分不同的荧光抗原微球并进行标号，进而区分不同的包被抗原;

4）将预先包被的荧光抗原微球取出，每种荧光抗原微球为1个球体，通过试剂盒的载体上预留的微孔，将每个荧光抗原微球随机放入芯片阵点即可，并将荧光抗原微球固定在载体上。

另一方面，本发明还提供了一种利用上述免疫微流控的多重抗原包被方法在抗体检测试剂盒中的应用，包括如下步骤：

在载体上先后加入待测样品和荧光报告分子标记的二抗与检测区的荧光抗原微球反应，样品中的待测抗体能够与荧光抗原微球和荧光报告分子标记的二抗特异性结合，使包被抗原的荧光微球携带上荧光报告分子，随后对荧光抗原微球进行检测和结果分析,其中一种激光可将微球分类，进而区分包被抗原种类；另一种激光可确定微球上结合的报告荧光分子的数量，从而确定微球上结合的目的分子的数量（即定量）。因此，通过两种激光的检测，即可完成对反应的实时、定量分析。

实施例

图3-图6显示的是应用本发明中的其中一个技术方案检测过敏原sIgE抗体检测试剂盒的检测过程。

本技术发明使用可视化荧光微球，微球直径为50μm。所谓“可视化”解释为：荧光微球置于荧光显微镜下，通过观察荧光强度和荧光色泽进行鉴别区分。为了区分微球的种类，微球制造过程中掺入了红色和橙色两种荧光染料，这两种荧光染料各有10种不同荧光强度的区分，在理论上可组合出100种不同的颜色，选择能够明显区分的12种颜色制备微球，不同颜色的微球在红色激光的激发下产生的荧光强度和色泽各不相同，之后将这12种微球依次编号（编号为Q1，Q2........Q12），用于后续实验。

如下表所示，将上述12种荧光微球作为载体，采用常规包被方式，将5种吸入性过敏原（屋尘螨，粉尘螨，艾蒿，葎草，豚草）分别包被于荧光微球Q2-Q6表面，5种食入性过敏原（鸡蛋，牛奶，花生，大豆，蟹）分别包被于荧光微球Q7-Q11表面（可根据地域差异，选择不同的吸入与食入性过敏原组合）。此外，Q1为裸球，作为阴性对照；Q12表面包被鼠抗人IgE，作为阳性对照。最后，使用封闭剂对微球表面其它位点进行封闭，以防止非特异性吸附。

将预先包被的抗原微球取出，每种微球1个球体，之后按芯片检测区预留微孔，将微球随机放入芯片阵点即可，并将微球固定稳妥。其中，阵列为3×4形式，即三行，每行四列。除检测区以外，芯片上还有加样区，标记区，废液收集区。加样区含有预先干燥的样本缓冲液，标记区为PE标记羊抗人IgE抗体，为干燥试剂。

在检测时，在样本孔中加入一定体积的待测样本，样本首先与样本缓冲液充分作用，降低血液样本中的基质干扰；伴随液流将预干燥的PE标记羊抗人IgE抗体充分溶解，若待检标本中含有特异性IgE（sIgE），则形成sIgE-PE标记羊抗人IgE的免疫复合物，随后免疫复合物流经检测区时，与荧光微球表面相应的过敏原结合，最后剩余样本收集在废液区。

反应结束后，检测仪内的红色激光可将微球分类，进而区分包被抗原种类；绿色激光可确定微球上结合的sIgE的数量。

上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种免疫微流控的多重抗原包被试剂盒，包括载体，其特征在于，所述载体上沿样本流动方向依次设置有标记区、检测区，所述检测区设置有放置荧光微球的微孔，所述微孔的数量为多个，所述微孔沿样本流动方向呈微阵列分布，所述荧光微球上包被有抗原，所述荧光微球的数量为多个，多个荧光微球为同一种荧光色素，且每个荧光微球的荧光色素含量不同，不同荧光色素含量的荧光微球分别包被不同的抗原。

2.根据权利要求1所述的一种免疫微流控的多重抗原包被试剂盒，其特征在于，所述载体为微流控芯片，所述微流控芯片包括微流控基片及压合于微流控基片上的微流控盖片，基片和盖片围合形成微通道，所述微通道一端与盖片上开设的加样孔连通，另一端与废液收集池连通，微流控基片的微通道内沿样本的流动方向依次设有标记区、检测区。

3.根据权利要求2所述的一种免疫微流控的多重抗原包被试剂盒，其特征在于，所述基片上设置有薄片，所述薄片的厚度为荧光抗原微球粒径的1/5，所述微孔为所述薄片上设置的通孔，所述通孔的数量为多个，多个通孔之间按微阵列分布。

4.根据权利要求2所述的一种免疫微流控的多重抗原包被试剂盒，其特征在于，所述微孔为基片表面设置的凹槽，所述凹槽深度为荧光抗原微球粒径的1/5，所述凹槽上沿直径为荧光微球粒径的1/3~4/5之间。

5.一种免疫微流控的多重抗原包被方法，其特征在于，应用如权利要求1-4任一项的试剂盒，包括至少以下步骤：

1）采用一定粒径的荧光微球作为包被载体，荧光微球提前以化学偶联方式包被特定抗原，经分离/封闭，质检，制备合格的荧光抗原微球；

2）制作多个带有同一种荧光色素包被不同抗原的荧光抗原微球，且每个包被不同抗原的荧光微球的荧光色素含量不同；

3）经激光照射后，荧光抗原微球能发出同一荧光色泽但荧光强度不同的荧光，依次区分不同的荧光抗原微球并进行标号，进而区分不同的包被抗原；

4）将预先包被的荧光抗原微球取出，每种荧光抗原微球为1个球体，通过试剂盒的载体上预留的微孔，将每个荧光抗原微球随机放入芯片阵点，并将荧光抗原微球固定在载体上。

6.一种根据权利要求5的方法在抗体检测试剂盒中的应用，其特征在于，包括如下步骤：

在载体上先后加入待测样品和荧光报告分子标记的二抗与检测区的荧光抗原微球反应，样品中的待测抗体能够与荧光抗原微球和荧光报告分子标记的二抗特异性结合，使包被抗原的荧光微球携带上荧光报告分子，随后对荧光抗原微球进行检测和结果分析，其中一种激光能够将微球分类，进而区分包被抗原种类，另一种激光能够确定微球上结合的报告荧光分子的数量，从而确定微球上结合的目的分子的数量。

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