CN114966051B - 一种微流控蛋白质芯片及其制作方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明的实施例提供了一种微流控蛋白质芯片及其制作方法与应用，适配体横跨在微流控通道横面且微流控通道高度小于0.1毫米的设计提高适配体对靶标蛋白的捕获作用；待测样品溶液从微流控通道流过时靶标蛋白与相应的适配体特异性结合；排出样品溶液并加入蛋白质显色液，根据阳性信号位置确定靶标蛋白完成对样品中靶标蛋白的检测。该蛋白质芯片的结构简单、成本低、使用操作方便，能够在POCT领域具有显著的经济意义和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质检测领域，具体的涉及到体外诊断检测及分子诊断检测技术领域，尤其是涉及到一种微流控蛋白质芯片及其制作方法与应用，更具体的说是一种即时检测的多种靶标蛋白的微流控蛋白芯片。
背景技术
生物芯片(biochip)，早期文献中与基因芯片的概念是一致的，随着技术的深入研究，生物芯片广义上是指根据生物分子间特异相互作用的原理，将生化分析过程集成于芯片表面，从而实现对DNA、RNA、多肽、蛋白质以及其他生物成分的高通量快速检测。根据芯片表面固定的探针类型的不同，生物芯片分为基因芯片、蛋白芯片、组织芯片和细胞芯片等。中国生物芯片研究始于1997-1998年间，但发展迅速，2011年，博奥生物研发的遗传性致聋基因芯片上市，这是我国生物芯片产业化道路上第一个自主研制的商业化产品。生物芯片尤其适合在感染性疾病检测、疫情监控、肿瘤标志物检测和药物滥用等多因素筛查中，其中，中低密度生物芯片的探针数目在几十到几千之间，区别于探针几万至上百万的专业性更高、成本更高、操作更复杂的高密度生物芯片，更适合用于采样现场、ICU监护室、手术室、急诊室等现场检测或病人床边的即时检测(point-of-care testing，POCT)领域。
蛋白质芯片可以直接用粗生物样品(血清、尿、体液)进行分析，能够同时快速发现多个生物标记物，能够进行低低丰度蛋白质检测，能够实现高通量的验证，还可以实现相对定量的分析检测，在即时检测POCT领域有广泛的应用前景。但蛋白芯片有以下不足：(1)蛋白检测芯片主要依赖于抗体和其他大分子，建立快速、廉价、高通量的蛋白质表达和纯化方法，高通量制备抗体尤其是规模生产会存在很多实际问题。(2)蛋白质芯片制作需要提供合适的温度和湿度以保持芯片表面蛋白质的稳定性及生物活性，制作要求高。(3)需要解决通用的高灵敏度、高分辨率检测方法，实现成像与数据分析一体化。
自20世纪90年代适配体的概念被提出以来，适配体研究取得调整发展，适配体具有检测限低、高亲和力、强特异性的优势，且易于体外大量合成、重复性好、稳定性高、易于贮存；使得适配体取得广泛应用，包括农药、组织、细胞、病毒、蛋白质、毒素、维生素和过敏原等检测。由于适配体易于标记荧光且活性不受影响，因此易于与多种其他检测技术结合而广泛应用于细胞成像、新药研发、疾病治疗与微生物检测等众多方面。
微流控芯片(microfluidic chip)是当前微全分析系统(Miniaturized TotalAnalysis Systems)发展的热点领域，其装置特征主要是其容纳流体的有效结构(通道、反应室和其它某些功能部件)至少在一个纬度上为微米级尺度。由于微米级的结构，流体在其中显示和产生了与宏观尺度不同的特殊性能。因此发展出独特的分析产生的性能。微流控芯片分析以芯片为操作平台,同时以分析化学为基础,以微机电加工技术为依托,以微管道网络为结构特征,以生命科学为目前主要应用对象，是当前微全分析系统领域发展的重点。它的目标是把整个化验室的功能,包括采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等集成在微芯片上,且可以多次使用。微流控芯片具有液体流动可控、消耗试样和试剂极少、分析速度成十倍上百倍地提高等特点,它可以在几分钟甚至更短的时间内进行上百个样品的同时分析,并且可以在线实现样品的预处理及分析全过程。
当前的蛋白质芯片检测通常常常以无封装的裸芯片为主，使用时一般需要加围栏、加盖片后进行杂交，杂交后还需要清洗与显色，造成蛋白质芯片检测过程较为复杂，达不到方便快捷的POCT使用要求，在一定程度上限制了蛋白质芯片在POCT领域的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种结构简单，操作简单、低成本、适用于蛋白质粗提液检测的微流控蛋白质芯片，通过横跨在微流控通道的适配体设计与微流控通道高度小于0.1毫米的设计提高适配体对靶标蛋白的捕获作用。
为达到上述目的或目的之一，本发明提供了如下技术方案：
一种微流控蛋白质芯片及其制作方法与应用，包括基片与芯片支架，基片与芯片支架组成只有两个开孔的封闭微流控通道用于蛋白质检测；其中，基片为透光的固相片状结构，其朝向芯片支架的一面锚定适配体；基片与芯片支架叠加在一起形成微流控蛋白质芯片，且保证适配体横跨在微流控通道中。
该技术方案保证了只要待测样品中有靶标蛋白，靶标蛋白就能够微流控通道中移动时与适配体结合并固定在适配体上；加入显色液并清洗后，可以用肉眼直接观察或用芯片阅读仪配合内标蛋白进行相对定量分析。
根据本发明的一个优选实施例，适配体按微流控通道布局锚定到基片上以后再与通道支架组合形成微流控通道。
根据本发明的一个优选实施例，通道支架一次注塑成型，一面是微流控通道的凹陷部分，一面是微流控通道的输入孔与排出孔，且通道支架外缘与基片平齐并通过其微流控通道的凹陷部分与基片组合形成微流控通道。
根据本发明的一个优选实施例，微流控通道高度小于0.1毫米。
根据本发明的一个优选实施例，适配体预先按通道布局锚定到基片上，且适配体以长条形锚定在基片上，保证适配体横跨微流控通道截面，有效与样品中靶标蛋白识别与结合。
根据本发明的一个优选实施例，利用荧光染料、银染、荧光探针、蛋白质染色剂进行蛋白质显示，实现肉眼判定或利用阅读仪判定的蛋白质芯片检测结果。
根据本发明的一个优选实施例，蛋白检测只需要蛋白提取液、清洗液、蛋白显色液三种溶液，很容易通过手动或自动方法完成。
根据本发明的一个优选实施例，基片为透光的固相片状结构，既可以保证激发光线能够通过基片照射到基片上锚定的适配体修饰的荧光基团，又能够保证荧光基团激发后形成荧光信号，可以通过透光的基片直接被识别。
根据本发明的实施例，保护一种微流控蛋白质芯片及其制作方法在蛋白质检测领域的应用。
一种基于适配体的蛋白质芯片的制备方法，包括以下步骤：
1)对与靶标蛋白特异结合的适配体进行锚定基团修饰；
2)利用适配体上的锚定基团将适配体按微流控通道特定的位置布局锚定
在基片表面上，且适配体以长条形锚定在基片上，保证适配体横跨微流控通道截面；
3)将基片带有锚定适配体的一面朝向芯片支架，完成基片与芯片支架的组装，基片与芯片支架紧密连接形成蛋白质检测的微流控通道，蛋白质检测微流控通道只在芯片支架上的两个孔完成待测溶液的进出；
4)形成完整的蛋白质检测微流控通道即完成基于适配体的微流控蛋白质芯片的制备。
一种基于适配体的微流控蛋白质芯片的应用，使用时，用蛋白质提取液处理样品，将获取的提取溶液(待测蛋白溶液，即：待测样品)通过芯片支架的输入孔连续输入到微流控通道中并不断从排出孔流出，待测蛋白溶液通过芯片支架上的输入孔进入微流控通道后，靶标蛋白与适配体识别配对并结合在适配体上，清洗后用显色液完成蛋白质显色，即可用肉眼或芯片阅读仪获取检测结果。
本发明的有益效果：
根据本发明所述的一种基于适配体的微流控蛋白质芯片，主要包括基片和芯片支架，基片上固定有适配体的一面朝下置于芯片支架上，围成封闭的蛋白质检测微流控通道，完成一种基于适配体的微流控蛋白质芯片的制作，工艺流程简单，生产效率高，制造成本低。
根据本发明所述的一种基于适配体的微流控蛋白质芯片的检测过程简单便捷，将蛋白质提取液与样品混合后获得的待测蛋白溶液(待测样品)直接输入到基于适配体的蛋白质芯片的蛋白质检测微流控通道中，靶标蛋白遇到相应的适配体就结合在适配体上，不能结合的蛋白从微流控通道中排出；将微流控通道清洗后，加入显色液，使蛋白质能够肉眼可见或可以用阅读仪检测；根据检测目标选择适宜的染色液，并获取检测结果。
检测过程简单快捷，适合于POCT领域需求。
根据本发明所述的一种基于适配体的微流控蛋白质芯片，能够根据内标蛋白的荧光值进行靶标蛋白的相对定量分析。
根据本发明所述的一种基于适配体的微流控蛋白质芯片提高了生物芯片检测的操作简便性，能够实现自动化满足生物芯片进入POCT领域的需求，能够促进微流控蛋白芯片都可以走近使用者，走入千家万户，有效为老百姓服务，扩大了生物芯片技术在大健康产业中的应用范围。
本发明所述一种基于适配体的微流控蛋白质芯片的基片为透光的固相片状结构，既可以保证激发光线能够通过基片照射到基片上锚定的适配体修饰的荧光基团，又能够保证荧光基团激发后形成荧光信号，可以通过透光的基片直接被识别到，免去传统裸生物芯片还需要将围栏、盖片去除后进行荧光信号判读的过程，操作更简便易行。
附图说明
图1为本发明的微流控蛋白质芯片的俯视图；
图2适配体在基片上的锚定示意图(适配体在上表面)；
图3芯片支架示意图(示通孔与内陷凹槽)；
图中，1、芯片支架；2、基片；3、微流控通道；4、适配体；5、输入孔；6、排出孔；7、芯片支架上的凹槽。
具体实施方式
下面结合附图详细描述本发明的示例性的实施例，其中相同或相似的标号表示相同或相似的元件。另外，在下面的详细描述中，为便于解释，阐述了许多具体的细节以提供对本披露实施例的全面理解。然而明显地，一个或多个实施例在没有这些具体细节的情况下也可以被实施。在其他情况下，公知的结构和装置以图示的方式体现以简化附图。
图1至图3图示出了本发明的微流控蛋白质芯片的结构，图1为本发明的微流控蛋白质芯片的俯视图，示意整体结构。根据本发明的总体构思，提供了一种基于适配体的蛋白质芯片，包括芯片支架1和基片2，其中，带有锚定基团的适配体4通过锚定基团以长条形按布局固定在基片2上；将委托加工的芯片支架上与基片连接部分用UV胶涂布，将锚定了适配体的基片的有适配体面朝向芯片支架，定位安装在芯片支架上，UV固定，形成微流控蛋白质芯片，基片2与芯片支架上的凹槽7组合形成微流控通道3，可以通过输入孔5和排出孔6配合完成待测溶液的注入与靶标蛋白与适配体的识别与结合。待测样品溶液经过输入孔5进入到蛋白质检测空间的微流控通道3，靶标蛋白与相应的适配体4进行特异性识别与结合并固定与富含在适配体位置上。
用清洗液清洗微流控通道3，再根据检测目标加入不同的蛋白质显色液，如用肉眼观察可选用考马斯亮蓝染色液、银染染液进行；如用芯片阅读仪检测可用荧光染料、银染染液进行。
在基片上设置内标蛋白的适配体，可以通过蛋白内标完成各种蛋白质的相对定量。整个检测过程仅需要蛋白质提取液一种溶液即可完成样品中蛋白质提取与靶标蛋白检测过程，蛋白质提取液直接输入蛋白质芯片后能够在芯片阅读仪上直接获取样品中相关靶标蛋白的定性信息与相对定量信息；该基于适配体的蛋白质芯片操作简单、成本低，能够满足POCT检测领域需求，具有显著的经济意义和社会效益。
实施例1：一种微流控蛋白质芯片及其制作与应用，具体流程如下：
1)BSA的适配体4的选择：按文献(Microchim Aacta，2018，185(4):241-251.)中BSA适配体序列进行，在适配体的3′端连续腺苷酸的末端设计了氨基锚定基团(氨基)。
2)BSA的适配体4的委托合成：委托汉金开瑞生物工程有限公司进行合成。
3)适配体锚定到基片2上：醛基玻璃基片在北京博奥晶典生物技术有限公司订购(厂家：博奥晶典，类型：玻璃基片，规格：长75mm、宽25mm、厚1mm，)，点样仪(进口设备：GESIMNano-Plotter NP2.1/E)，按位预定位置完成适配体4在基片2上的定位锚定。
4)芯片支架1的制备：委托加工北京三满科技有限公司完成，芯片支架1与基片2组合后之间的空隙为0.1毫米，在芯片支架上设置了输入孔5和排出孔6。
5)将锚定好适配体的基片2与芯片支架1利用UV无影胶完成粘合组装，制备获得微流控蛋白质芯片。
6)将BSA溶解于蛋白质提取液中，终浓度为0.001％，即为待测蛋白溶液，利用注射泵通过输入孔5输入到蛋白质检测空间微流控通道3中，从排出孔6流出，靶标蛋白与相应的适配体4识别与配对结合，完成靶标蛋白在适配体4上富集。
7)将完成样品处理的微流控蛋白质芯片进行清洗，清洗后用荧光染料进行染色(染色液为Biotium公司One-Step LumiteinTMUV Protein Gel Stain,1X；北京分公司)，置于芯片阅读仪中，进行蛋白质芯片检测结果测量。
尽管具体实施方式中示出和描述了本发明所述的实施例为封装的基因芯片，但基于生物芯片领域的普通技术人员而言，可以容易的理解到本发明所述的生物芯片可以应用到蛋白芯片领域。在不脱离本发明公开的原理和发明内容描述的情况下，可以对所述实施例进行变化，本公开的适用范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (2)
1.一种微流控蛋白质芯片，其特征在于，包括：
基片与芯片支架，基片与芯片支架组成只有两个开孔的封闭微流控通道用于蛋白质检测；
其中，基片为透光的固相片状结构，其朝向芯片支架的一面锚定适配体；基片与芯片支架叠加在一起形成微流控蛋白质芯片；
其中，所述适配体通过寡核苷酸链按微流控通道布局以长条形锚定到基片上，且所述适配体横跨在微流控通道中；
其中，所述芯片支架一次注塑成型，一面是微流控通道的凹陷部分，一面是微流控通道的输入孔与排出孔，且芯片支架外缘与基片平齐并通过其微流控通道的凹陷部分与基片组合形成微流控通道；
其中，微流控通道的凹陷部分的高度小于0.1毫米。
2.权利要求1所述的一种微流控蛋白质芯片在蛋白质检测领域的应用。
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