CN1512180A - 一种蛋白质芯片载体的处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种蛋白质芯片的固相载体，在所述固相载体的表面结合有亲和素－生物素的复合物，其中亲和素—生物素复合物中生物素的数量为亲合素活性单位的0.15－0.4。本发明的蛋白质芯片固相载体可显著降低蛋白质点样点的扩散，并提高检测灵敏度。本发明还提供了所述蛋白质芯片固相载体的制备方法。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质芯片或免疫测定领域，更具体地涉及一种新的蛋白质芯片载体及其处理方法。
背景技术
为提高检测通量与检测效率，近年来发展起来了一种微阵列酶联免疫检测技术，也称为蛋白质芯片技术——它利用的是抗体与抗原结合的特异性即免疫反应来检测样品。
蛋白质芯片构建的简化模型为：选择一种固相载体能够牢固地结合蛋白质分子(抗原或抗体)，这样形成蛋白质的微阵列，即蛋白质芯片。在基片上构建蛋白质微阵列，阵列中的每一个点代表着一个独立的生物化学反应，从而把许许多多的反应集成在一块很小的载体上进行。
根据Rou-Pan huang、Thomas O.joos等资料显示，蛋白质芯片的构建流程如下：
(1)将纯化的蛋白质溶解于缓冲液中，
(2)用高速点样仪把蛋白质点于膜上，
(3)点样仪有针点式和喷点式，点的直径通常为0.2-0.4um，点样量一般不超过100nl；
(4)再将已点样的NC膜用TBS冲洗数次，
(5)然后用牛血清蛋白溶液进行封闭，经室温凉干待用。
检测时首先向芯片上加待测物质溶液，保温以充分反应，冲洗，加酶标反应液，保温以充分反应，冲洗，加检测液，用检测仪检测颜色变化或发光信号。
用以上方法构建的蛋白质微阵列，存在着下列缺点：
(1)灵敏度较低，
(2)本底高，
(3)蛋白质点阵容易在反应过程中扩散，阵特别是当密度较大时，易造成不同点的信号由于距离太近而相互影响。
因此，本领域迫切需要开发新的蛋白质芯片固相载体及其制备方法，该固相载体可显著降低蛋白质点样点的扩散和/或提高检测灵敏度。
发明内容
本发明的目的就是提供一种新的蛋白质芯片固相载体及其制备方法，该固相载体可显著降低蛋白质点样点的扩散和/或提高检测灵敏度。
在本发明的第一方面，提供了一种蛋白质芯片的固相载体，在所述固相载体的表面结合有亲和素-生物素的复合物，其中亲和素-生物素复合物中生物素的数量为亲合素活性单位的0.15-0.4。
在一优选例中，亲和素-生物素复合物中生物素的数量为亲合素活性单位的为1/5-1/3。
在另一优选例中，所述的固相载体选自下组：玻璃片、塑料片、硝酸纤维(NC)膜、PDVF膜。
在另一优选例中，所述的亲和素-生物素的复合物的数量为5-1000ug/cm2。
在另一优选例中，所述的亲和素选自下组：卵白亲和素、链霉亲和素、及其混合物。
在另一优选例中，所述的生物素选自下组：生物素N-羟基丁二酰亚胺酯、长臂生物素或其混合物。
在在本发明的第二方面，提供了制备本发明上述蛋白质芯片固相载体的制备方法，包括步骤：
(a)将一固相载体浸泡于亲和素-生物素复合物的溶液中，其中亲和素—生物素复合物中生物素的数量为亲合素活性单位的0.15-0.4；
(b)用缓冲液洗涤步骤(a)的固相载体；
(c)干燥步骤(b)的固相载体。
在一优选例中，所述的固相载体选自下组：玻璃片、塑料片、硝酸纤维膜、PDVF膜。
在另一优选例中，所述的溶液中亲和素-生物素的复合物的浓度为5-1000ug/ml，较佳地为50-500ug/ml，更佳地为100-500ug/ml。
在另一优选例中，所述的亲和素选自下组：卵白亲和素、链霉亲和素、及其混合物；且所述的生物素选自下组：生物素N-羟基丁二酰亚胺酯、长臂生物素或其混合物。
在另一优选例中，浸泡条件为室温下90-150分钟，或4℃过夜；而且干燥条件为室温凉干或冷冻干燥。
具体实施方式
本发明人经过深入而广泛的研究，发现当蛋白质芯片的固相载体的表面结合有一种特定的亲和素-生物素的复合物时，不仅可显著降低蛋白质点样点的扩散作用，而且可提高检测灵敏度。在此基础上完成了本发明。
本发明的蛋白质芯片固相载体基本上由(a)常规固相载体和(b)结合于固相载体上的本发明特定的亲和素-生物素复合物所构成。
用于本发明特定的亲和素-生物素复合物是一种由一定比例的亲和素和生物素结合而成的复合物。通常，1个分子的亲和素结合4个分子的生物素，形成完全复合的复合物。本发明的复合物是非完全复合的复合物，即每1分子亲和素与小于4个分子的生物素所形成的复合物。较佳的复合物是每1分子亲和素与小于0.6-2个分子的生物素所形成的复合物，更佳地是每1分子亲和素与小于0.8-1.5个分子的生物素所形成的复合物。
另一种表示亲和素-生物素复合物中生物素/亲和素比例的方式是以亲合素活性单位为基准。亲合素活性单位被定义为一定数量亲和素所能结合的生物素的数量。在本发明的复合物中，生物素的数量通常为亲合素活性单位的0.15-0.4，较佳地为1/5-1/3。
可用于本发明的亲和素没有特别限制。代表性的例子包括(但并不限于)：卵白亲和素、链霉亲和素或其混合物等。
可用于本发明的生物素没有特别限制。代表性的例子包括(但并不限于)：活化生物素，例如生物素N-羟基丁二酰亚胺酯、长臂生物素或其混合物等，
如本文所用，术语“蛋白质芯片固相载体”就是在其上点有蛋白质点样点的基片材料，常见的载体包括：玻璃片、塑料片、硝酸纤维(NC)膜、PDVF膜等，其中特别优选的是NC膜。
本发明还提供了蛋白质芯片固相载体的制备方法。以NC膜为例，其处理方法如下：
首先，在进行蛋白质点样前将NC膜浸泡于亲和素-生物素复合体溶液中，其中其中亲和素-生物素复合物中生物素的数量为亲合素活性单位的0.15-0.4。
接着，用缓冲液(如PBS缓冲液)洗涤数次。
最后，干燥处理(如室温凉干或冷冻干燥)。
亲和素-生物素复合物溶液中，亲和素-生物素复合物的浓度通常为5-1000ug/ml，较佳地为100ug/ml-500ug/ml。亲和素-生物素复合物中生物素所占比例为亲合素活性单位的1/5-1/3。
至于浸泡温度和时间，没有特别限制。通常，在亲和素-生物素复合物溶液中的浸泡时间为室温下90-150分钟或更长，或4℃过夜。
据测试，通过本发明处理NC膜后，再进行蛋白质点样，经抗原抗体反应，最终的样品信号的本底值可下降7-12％，相应的样品最小检出量也可减少8％以上，从而检测灵敏度有了较大提高。
另外，NC膜经过亲合素-生物素复合物处理，蛋白质样点的扩散也有所减小，免疫反应前后样点面积比为1.5倍，而未经过处理的二者面积比为2.2倍以上。换言之，本发明点样点面积仅为对照的50％左右。因此，经过亲和素-生物素处理的NC膜，发光反应后同一孔内不同点之间光信号的相互干扰大大减小了，也预示着可以进一步提高蛋白质芯片的集成度。
作为制备蛋白质芯片或蛋白质微点阵酶联免疫反应载体的NC膜，经过亲和素-生物素复合物处理与未经处理进行比较，因此，本发明可广泛应用于蛋白质芯片或以膜为基片的免疫反应体系。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
本实施例以乙型肝炎抗-HCV、抗-Core、抗-NS3、抗-NS4、抗-NS5等5种抗体的检测为例制备蛋白质芯片。
(a)蛋白质芯片固相载体的制备
选择Whatman公司生产的孔径0.4mm亲水性NC膜，室温下浸泡于100ug/ml、生物素占亲合素活性单位1/4的亲合素—生物素复合物溶液中室温下120分钟，pH 7.8的PBS缓冲液洗涤3次，室温凉干。复合物中所用亲合素为链霉亲合素，生物素为长链生物素。
(b)蛋白质芯片的制备
用高速蛋白质点样仪将丙型肝炎5种抗体的对应5种抗原分别点于上述经亲合素—生物素处理的NC膜上与未经处理的NC膜上，每阵列16(4×4)个样点。再用5％的小牛血清(BSA)封闭，室温凉干待用。
(c)检测
将HCV阳性的血清与上述两种NC膜进行膜反应，两者最终反应结果比较如下：
表1
| 本底值 | 对照处理本底值比 | 信号值 | 差值 | 反应前点样点面积 | 反应后点样点面积 | 反应后对照处理样点面积比 | |
| 对照 | 77.6 | 110/100 | 137.2 | 59.6 | 0.1256 | 0.2889 | 1.53/1.00 |
| 实施例1 | 69.0 | 146.8 | 77.8 | 0.1256 | 0.1884 |
实施例2
重复实施例1的测序，不同点仅在于使用了不同浓度或不同比例的亲和素-生物素复合物、不同的固相载体(详见表2)。
表2
| 固相载体 | 生物素数量为亲合素活性单位的比例 | 复合物浓度(ug/ml) | 反应后对照处理样点面积(实验点样点大小/对照点样点大小) |
| NC | 1/3 | 50 | 70.4％ |
| 100 | 69.5％ | ||
| 300 | 67.2％ | ||
| 1/4 | 50 | 68.5％ | |
| 100 | 65.4％ | ||
| 300 | 64.3％ | ||
| PDVF | 1/3 | 50 | 71.4％ |
| 100 | 69.7％ | ||
| 300 | 67.8％ | ||
| 1/4 | 50 | 69.5％ | |
| 100 | 66.1％ | ||
| 300 | 64.9％ |
此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种蛋白质芯片的固相载体，其特征在于，在所述固相载体的表面结合有亲和素-生物素的复合物，其中亲和素-生物素复合物中生物素的数量为亲合素活性单位的0.15-0.4。
2.如权利要求1所述的固相载体，其特征在于，所述的固相载体选自下组：玻璃片、塑料片、硝酸纤维膜、PDVF膜。
3.如权利要求1所述的固相载体，其特征在于，所述的亲和素-生物素的复合物的数量为5-1000ug/cm2。
4.如权利要求1所述的固相载体，其特征在于，所述的亲和素选自下组：卵白亲和素、链霉亲和素、及其混合物。
5.如权利要求1所述的固相载体，其特征在于，所述的生物素选自下组：生物素N-羟基丁二酰亚胺酯、长臂生物素或其混合物。
6.一种权利要求1所述的蛋白质芯片固相载体的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(a)将一固相载体浸泡于亲和素-生物素复合物的溶液中，其中亲和素-生物素复合物中生物素的数量为亲合素活性单位的0.15-0.4；
(b)用缓冲液洗涤步骤(a)的固相载体；
(c)干燥步骤(b)的固相载体。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的固相载体选自下组：玻璃片、塑料片、硝酸纤维膜、PDVF膜。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的溶液中亲和素-生物素的复合物的浓度为5-1000ug/ml。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的亲和素选自下组：卵白亲和素、链霉亲和素、及其混合物；且所述的生物素选自下组：生物素N-羟基丁二酰亚胺酯、长臂生物素或其混合物。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，浸泡条件为室温下90-150分钟，或4℃过夜；而且干燥条件为室温凉干或冷冻干燥。
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Legal Events
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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Assignee: Shanghai Yulong Biotech Co.,Ltd. Assignor: Mu Haidong Contract fulfillment period: 2008.8.8 to 2013.8.8 Contract record no.: 2008310000195 Denomination of invention: Protein chip carrier processing method Granted publication date: 20070919 License type: Exclusive license Record date: 20081021 |
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| LIC | Patent licence contract for exploitation submitted for record |
Free format text: EXCLUSIVE LICENSE; TIME LIMIT OF IMPLEMENTING CONTACT: 2008.8.8 TO 2013.8.8; CHANGE OF CONTRACT Name of requester: SHANGHAI YULONG BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO., LTD. Effective date: 20081021 |
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| EC01 | Cancellation of recordation of patent licensing contract |
Assignee: Shanghai Yulong Biotech Co.,Ltd. Assignor: Mu Haidong Contract record no.: 2008310000195 Date of cancellation: 20130823 |
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| LICC | Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20040714 Assignee: Shanghai Yulong Biotech Co.,Ltd. Assignor: Mu Haidong Contract record no.: 2014310000010 Denomination of invention: Protein chip carrier processing method Granted publication date: 20070919 License type: Exclusive License Record date: 20140121 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20070919 Termination date: 20211227 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |