JPH07503063A - 生体分子検定施行法及び当該方法に使用する固相担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生体分子検定施行法及び当該方法に使用する固相担体技術分野 本発明は一般的にポリマー担体を用いて生体分子検定を施行する方法に関し、特 に結合特性を向上したポリマー担体を用いる検定法を指向する。

背景技術 イムノアッセイは生体試料中に存在する少量の生体分子の検出に用いられるある 種の科学的技法である。これらの技法は特異的タンパクｉｔ（“抗原”）を検出 するために血液検査等の医療診断操作に広く用いられている。従来のイムノアッ セイ法は特定のタンパク質とある抗原との選択的反応に依存している。例えば、 動物が特定の異種抗原に抵抗するために特異的抗体を発現することはよく知られ ている。抗体は高度に特異な化学的配置を持っているので、特定の抗原と選択的 に反応するが他のクンバク質とは反応しない。抗体の抗原との反応（沈降）は、 抗原を結合し、その結果、抗原はさらに処理され、究極的には破壊されあるいは 系から除去される。このような抗体−抗原反応は、動物において周知の免疫応答 を引き起こし、それによって動物は以前にさらされた感染に抵抗すること力咄来 る。

選択的に抗原に結合する抗体のこの能力はまた、生体試料に存在する抗原の検出 に利用すること力咄来る。例えば、患者が特定の疾患に罹っている場合、一つま たはそれ以上の特有の抗原が血中に現れるであろう。その抗原に対する抗体は選 択的に当該抗原に結合するであろう。この効果に依存する通常のタイプのイムノ アッセイは“抗体捕捉アッセイ２である。特定の試料中の抗原を検出するために は、抗原はまず固相担体に付着して固定される。この目的にしばしば用いられる 担体の一つは“ミクロタイタープレートで、これは透明なポリスチレンあるいは ポリ塩化ビニール製のプラスティック板である。プレートは９６個の窪みあるい はウェルをつけて成型され、この中に生物学的試料が検査のために保持される。

試料がプレートのウェルに加えられると試料中の抗原は担体に結合あるいは付着 して固定される。この結合は化学的反応ではなく、むしろポリスチレンマトリッ クスと抗原間の物理的または非共役的相互作用の結果であると考えられている。

抗原が一旦担体に結合すると、その抗原に特異的であることが知られている抗体 を、固定された抗原と反応させ結合させるようにする。ついで、抗原に結合した 抗体を検出することによって間接的に抗原の存在を検出することが可能である。

これは抗体を標工することによって達成される。抗体を標識する一つの方法は放 射活性アイソトープによるもので、これは抗体の分子構造中に取り込まれ、既知 の検出系を用いて検出することが出来る。

他の通常用いられる標識法は第一抗体に第二抗体を結合するものである。この第 二抗体はホースラディツシュ・ペルオキシダーゼのような゛マーカー２酵素に結 合されている。マーカー酵素の存在下に変色する色素を、溶液に加える。このよ うにして、もし、ミクロタイタープレート壁に十分な抗原が結合していると、色 素がマーカー酵素と反応する時に起こる発色により抗原を検出することが可能で ある。

この着色強度を測定することにより、ある範囲内で、どれ位抗原が存在するかを 決定することも可能である。この効果に依存する周知の一つの技法はＥＬＩＳＡ （エリザ）　［Ｅｎｚｙｍｅ　１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｐｔｉｏｎＡ ｓｓａｙ（酵素結合免疫吸容検定法）］である。エリザを用い、存在する抗原量 はミクロタイタープレートのウェル中の色調変化量を“エリザリーダー２として 知られているフォトメーターを用いて測定し決定することが出来る。エリザ技法 の詳細は、Ｅ、Ｍａｃｙら、’Ｅｎｈａｎｃｅｄ　ＥＬＩＳＡ：Ｈｏｗ　ｔ。

ｍｅａｓｕｒｅ　１ｅｓｓ　ｔｈａｎ　１０　ｐｉｃｏｇｒａｍｓ　ｏｆ　ａｓ ｅｐｃｉｆｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　１ｅｓｓ　ｔｈａｎ　８　ｈｏｕｒｓ （１０ピコグラム以下の特定タンパク質を８時間以内に測定する方法）、。

Ｆ、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｂ、　Ｊｏｕｒｎａｌ、Ｖｏｌ、　２、ｐｐ、３００３−００ ９　（１９８８）　、及び、Ｓ、Ｆ、Ｄｅ　Ｓｔ、　Ｇｒｏｔｈ、“Ｔｈｅｅｖ ａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｒ　ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ａｓｓａｙｓ （限定希釈アッセイの評価）＋’　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、。

Ｖｏ　１．　８３．　ｐｐ、８９−９５　（１９８５）ｌ、：記載されており、 両報文ともリファレンスとして本願に組み込まれ本願の一部となっている。

エリザは溶液中の色素とマーカー酵素の反応によって起こる色調変化の測定に依 存するので、その感度には限りがある。抗原の存在量が少ない場合、色調変化は 僅かであり、その結果、変化は測定系のバックグランド“ノイズ中に消失してし まうことがある。ノイズは過剰の抗体またはマーカー酵素が担体壁に直接結合す るときに発生する。色素が添加されると、これらの物質は、存在する抗原量とは 無関係の色調変化を引起こす。さらに、一旦、一定量の色調変化が起こると、そ の後の色調変化は検出が困難となり、より大量の抗原の定量には益々適切でない ものとなる。

最も重要なのは、エリザは着色溶液を透過する光の検出に依存するので、光の透 過を干渉しない透明な担体のみが抗原の結合に用いることが出来るということで ある。透明な担体が必要となると、エリザ及びそれに類似のアッセイに使用し得 る担体素材の表面特性には種々の制限が加わってくる。そのため、もし、特定の 担体素材が所望される光学的透明性を有しないならば、たとえそれがよりよい抗 原結合特性を有していたとしても、使用することは出来ない。

現在までのところ、エリザの感度増大の試みは、検体を測光的に分析出来るよう に、担体の光学的透明性を減少することなくその結合能を増大することに専念さ れている。表面の化学的立体配置を変えてそれが抗原と化学結合を形成すること を指向する幾つかの試みがある。例えば、Ｏｋｒｏｎｇｌｙに対する米国特許第 ４，９３３，４１０号は、ポリスチレンを溶かさない溶媒中で、ポリスチレン担 体の表面をヒドロキシメチルアミドと反応させることにより、ポリスチレン担体 を活性化することを開示している。この活性化は、ポリスチレン担体の光学的透 明性を維持するため、ポリスチレンを溶解も膨張もしない溶媒中で緩和な条件下 で起こさせるのが望ましい。同様に、米国特許第４，１１９，５８９号は、少く とも２個の２級アミン基を持つ化合物を、その２級アミン基をイミノ−クロリド 基に転換することにより活性化することを開示している。

また、タンパク質を結合する担体の表面にコーティング施すことも提案されて来 ている。例えば、Ｂｒｏｗｎらに対する米国特許第４，２１０，４１８号は、吸 着、イオン結合、捕捉、あるいは更に好適には、共有結合で抗原と結合する不活 性タンパク質による担体のコーティングを開示している。不活性タンパク質の付 着を容品にするため、担体表面を溶媒、界面活性剤、酸、または塩基を含む吸着 増進物質で処理して吸着を向上させてもよい（米国特許第４，２１０．４１８号 、ｃｏｌ、５、Ｉｎｓ、１２−１６参照）。

抗原のような生体分子の固ｔＵｔ体への結合には３つの基本的な要素、即ち、収 容ツバ親和性、及び安定性がある。収容力は、担体の単位表面積力たりに結合し 得る物質の最大量である。親和性は、抗原と担体間の誘引の度合である。安定性 は生体分子と担体間の結合の永続性の度合である。結合の親和性と安定性は、使 用される特定のポリマー素材に固有の特性であると考えられているが、収容力は 活性化法によって増大させることが出来る。

上記の担体活性化法は、結合能増大を企て、担体表面の特性を変えることに焦点 をおいている。しかしながら、結合能の単なる増大は担体がイムノアッセイによ り良好となる保証にはならない。例えば、もし、結合安定性が低いと、結合した 生体分子は生化学的分析の間に剥がれ落ち、分析感度が低減する。同様に、もし 、担体の親和性が低いと、結合はあまりにも遅くなり、分析操作にとって不利で ある。

イムノアッセイに現今用いられている他の担体には、ニトロセルロース、ナイロ ン及び類似素材からなる多孔性膜が使用される。これらの素材は多孔性かつ親水 性であり、それゆえに、水を結合または吸着する傾向がある。このような親水性 素材を使用すると、水（その中に生体分子が運ばれている）を担体中に引き入れ ることにより結合能を増大するものと考えられている。このような担体は、結合 特性は改善されているものの、幾つかの欠点を負っている。第一に、これらの素 材は親水性であるから、このような担体上にプロットされたサンプルは拡散し、 担体表面に残留しない。従って、担体上のフリーな結合部位を飽和することが困 難である。検出に用いられる抗体、色素、及び他の物質はこれらの有効な部位に 結合することが出来、誤った読取りまたはバックグラウンドの染色をもたらす。

また、これらの担体は親水性であるから、洗浄してもこれらの物質を完全あるい は効率的に除去するのは困難である。その結果、存在する特定の生体分子の量を 正確に定量することが一層困難となる。

従って、本発明の目的は、従来法よりもさらに正確な生体分子のアッセイを施行 する方法を提供することにある。

さらに、容易に入手可能で、且つ、比較的高価でない検出装置を用いて施行出来 るアッセイ法を提供することが本発明の目的である。

さらに、水に不溶の色素を用いて生体分子を検出することの出来るアッセイ法を 提供することも本発明の目的である。

さらに、バックグラウンド染色及びその結果として起こるノイズを実質的に低減 し、アッセイの精度及び感度を増大するアッセイ法を提供することも本発明の目 的である。

さらに、困難な作業が集中するステップを最小限にして比較的容品に施行出来る アッセイ法を提供することも本発明の目的である。

さらに、光学的に透明である必要のない固相担体を用いるアッセイ法を提供する ことも本発明の目的である。

さらに、生体分子の存在を検出するために用いる結合能及び親和性を改善した固 相担体を提供することも本発明の目的である。

さらに、親水性でなく、そのため担体への生体分子の結合を注意深く制御するこ とが可能な固）目出体を提供することも本発明の目的である。

さらに、容易に入手可能な安価な素材と比較的単純な工程を用いて調製される固 相担体を提供することも本発明の目的である。

発明の開示 これら及び他の目的は、活性化ポリマー素材を生体分子結合のための固相担体と して用いる生体分子アッセイ施行法を提供することによって達成される。好適な 形態において、この担体は一般的に疎水性、非多孔質高分子素１イで作られ、担 体の露出表面積を増大することによって活性化された領域を持つ。

検出されるべき生体分子は固相担体の活性化領域に結合し、一旦担体に結合した 後検出され、検出は染色反応及びグレイレベル走査によって行なわれるので、透 明な担体使用の必要は除外される。さらに、このような担体の結合特性増大のた め、アッセイの精度と感度は大幅に向上する。

本発明の他の実施態様においては、生体分子結合後、界面活性剤のような乳化剤 が同相Ｊｎ体表面に適用される。この様な乳化剤は、余分な物質が担体に結合す ることを大幅に阻害し、それによってバックグランド反応を著しく軽減してさら に精度と感度を増大する。

別の実施態様において、固相担体は、ポリスチレン及びブタジェンの共重合体の ような共重合体素材で構成されている。このような担体は活性化されることが望 ましい。しかしながら、共重合体製の担体は非活性化条件下でさえ、高い結合特 性を持つことが知られている。

本発明のもう一つの態様は、本発明のアッセイ施行に有用な、特別にデザインさ れた固を目出体である。このような担体はポリマー素材で作られ、検出されるべ き生体分子を結合する活性化領域を持つことが望ましい。さらに好適な形態では 、担体は共重合体で作られ、活性化あるいは非活性化状態のいずれでも使用出来 る。

担体は、所望されるいくつもの形態に成型することが出来、これには実質的に平 らなプレート、反応容器、ビーズまたは顆粒、薄い箔、あるいは繊維状が含まれ る。

本発明の前記の特徴及び利点は、付随する図面と共に以下の詳細な説明を考慮し て容易に理解されるであろう。図について：図の簡単な説明 図１は、本発明の局面に従って作られた固相担体の上面図である。

図２は、図１に示された固相担体の線２−−２における切断面である。

発明の詳細な説明 本発明のアッセイ法は、生体分子、例として挙げると、タンパク質、ペプチド、 ポリペプチド、核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アミノ酸、モノアミン 、多糖、リボ多糖及びその他それらと同種類のものを検出するために計画された ものである。アッセイを施行するため、特別にデザインされた固相担体素材が使 用される。図の１と２は、一般的に本発明に従って作られた固相担体の図解で、 実質的に平らなプレート１０の形に成型されている。プレート１０は、生体分子 を含む生物学的検体を受けるために作られた窪み１２を全部で９６個持っている 。

一般に、本発明の実行に有用な担体は、透明あるいは不透明な固体のポリマー素 材製である。望ましいのは、ポリマー素材が一般的に疎水性で非多孔質であり、 その結果、生体分子及び他の試薬の結合がさらに容易に制御され得ることである 。

例として、適切なポリマー素材には、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリブタ ジェン、ポリ塩化ビニール、ポリアミド、ポリカルボネート、エポキシド、メタ クリル酸、及びポリメラミンの重合体及び共重合体が含まれる。以下に論じる理 由により、スチレン及びブタジェンの共重合体製の担体は、本発明の実施に特に 好適である。

いくつかの理由により、ポリマー素材が疎水性、即ち、防水性であることが特に 望ましい。疎水性素材はより容易に界面活性剤で被覆される。以下により詳しく 論じられるように、担体を界面活性剤で被覆することにより、これは担体表面へ の結合阻害を（例えば、検出試薬の結合を最小限にすること）可能にする。この ようにして界面活性剤の付加あるいは省略によって、生体分子の結合を制御する ことが可能である。疎水性素材の使用は、また、洗浄過程を遥かに効果的にもす る。

担体はポリマー素材から通常の注入式塑造法により成型することが出来る。しか しながら、担体成型の周知の方法以外に、例えば、圧縮成型、吹込み成型、押出 し成型等もまた用いられることがある。しかしながら一般的に、注入塑造された 担体が今までのところ好適であることが分かつている。これは、注入塑造法は担 体表面に“艶消しタイプ′あるいは“粒子状゛仕上げを、特に型が使用前にサン ドブラスト処理されたときに与えるからである。この粒子状表面は、生体分子に 対して利用出来る結合部位をより多く提供し、生体分子を運ぶ溶液の凝集を低減 して結合を昂進すると考えられている。また、研削、研磨等のような他の機械的 手段により担体に粗い表面を与えることも可能である。

担体は活性化された領域を１つまたはそれ以上持つことが望ましい。このような 活性化は、担体の露出表面積を増大し、さらに好適にはポリマーマトリックスを 開放するように工夫されている。このようにして、担体は生体分子に対する収容 力と親和性が改善され、その結果、結合はさらに安定となる。特筆すべきは、こ の結合は担体表面と生体分子間の機械的または物理的結合であり、化学的結合で はないと考えられている。

ポリマー素材は、担体表面を一種またはそれ以上の溶媒で処理して活性化するこ とが望ましい。好適な溶媒は、担体表面のポリマー素材を部分的に溶解、浸食、 あるいは摩蝕し、それによって重合体のマトリックスを開放して、生体分子の結 合に利用出来るようにする物質である。この目的に使用され得る溶媒には、エー テル、アルコール、ケトン、アルデヒド、酸、塩基、オレフィン、鎖状あるいは 環状の炭化水素、ハロゲン化炭化水素、及び担体の構成成分を部分的に溶解する 類似の物質が含まれる。

前述の如く、担体表面を研削、研磨等のような機械的手段により、あるいは担体 を、上述の如く、サンドブラストによってざらざらにした型に注入成型すること により担体表面を活性化することが出来る。このような機械的手段は、分子レベ ルでポリマーマトリックスを変化させるとは考えられていないが、利用出来る担 体表面積を増大し、担体表面上への水溶液の凝集を変化させて結合を改善すると 考えられている。さらに、特に、乳化剤が余分な結合を阻害するために用いられ る場合には、まだ活性化されていない担体を用いることが可能である。

担体表面に適用される場合、溶媒は表面を゛粗くし”、それによって、接触して 来る検体に対して露出され、結合に利用出来る担体表面積を増大する。また、溶 媒はポリマーマトリックスを分子レベルで開放し、それによってさらに結合能を 向上するものと考えられている。

溶媒による過酷な処理は、光の通過に対して担体を不透明にする。不透明な担体 は以前は透明なものに劣ると考えられていたが、光の担体通過能は、以下の説明 の様に、適当な検出系が用いられる場合は重要でないことが見出されている。

固）１担体上に一つあるいはそれ以上の領域を活性化するためには、担体表面を 粗くシ、それによってポリマーマトリックスを開放するのに十分な時間溶媒に漬 けるかまたは浸してもよい。代わりに、溶媒は担体に散布、塗装によって適用し てもよく、あるいは別の方法で担体に適用してもよい。活性化に要する時間は使 用される特定の溶媒及びポリマー系によって異なる。しかしながら、大抵の適用 に対して、活性化は凡そ１分内に達成することが出来る。制限はあるものの、溶 媒処理をさらに長くすると、基質に結合能の増大をもたらす。

固相担体として特に好んで用いられるポリマー素材は、活性化操作によって異な った影響を受ける２つあるいはそれ以上のポリマーの兵長重体である。例えば、 溶媒アセトンは速やかにポリスチレンを溶解するが、ブタジェンはそれ程容易に は溶解しない。従って、ポリスチレンとブタジェンの共重合体（高衝撃ポリスチ レン）をアセトンで処理すると、ポリスチレン成分は容品に溶解するが、ブタジ ェン成分は溶解しない。この操作は、共重合体の粘着性、樹脂様のポリブタジェ ン成分を露出することによって、ポリマー担体の結合性を大幅に向上する結果に なると考えられている。このような共重合体製の担体の総結合能、ならびにその 結合親和性及びその結果生じる結合安定性はこれによって大幅に増大する。共重 合体及びそれらの特性の一般的記述については、読者はＯ，Ｗ、Ｗｅｂｓｔｅ「 、“５ｃｉｅｎｃｅ、”　Ｖｏｌ、２５５．　ｐｐ、８８７−９８　（１９９１ ）ならびにＦ、Ｓ、　Ｂａｔｅａ、’５ｃｉｅｎｃｅ、”　Ｖｏｌ、２５１゜ｐ ｐ、８９８−９０５　（１９９１）を参照のこと、画報文とも本願に参照して組 み込まれ、本願の一部となっている。

また、適切な共重合体製の担体は非活性化状態で生体分子結合に用い得ることも 見出されている。共重合体素材、特に、スチレンとブタジェンの共重合体の特異 な結合特性のために、活性化は望ましいものの、必ずしも必要ではなく、単に、 このような共重合体担体の非活性化表面を結合に用いるだけで適切な結果を得る ことが可能である。さらに、上に列挙したポリマーの共重合体のような他の共重 合体もまたこのようにして用いることも出来る。

本発明の固相担体は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、 アミン、モノアミン、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、多糖、リボ多糖及びこ れらと同種類のものを含む生体分子のアッセイ施行法に使用するために提供され るものである。検出すべき特定の生体分子を含む生物学的物質のサンプルが、固 相担体上の一つあるいはそれ以上の活性化領域に移送される。図１及び２に示さ れている担体において、プレート１０は複数の窪み１２を持つように成型され、 それによって各サンプルは他の検体から物理的に隔離されている。望ましい形式 では、窪み１２は前述の一つあるいはそれ以上の化学的または機械的方法によっ て活性化され、一方、プレートの残余の部分は光沢のある磨かれた表面のままに しておかれる。このようにして、サンプルは活性化された窪み内に拡散し結合す るが、プレート光沢のある高い表面では凝集してビーズ状になる傾向がある。こ れは、サンプルが非活性化領域に入れられた場合、サンプルの拡散を防ぎ、それ によって他の窪み内のサンプルを汚染する恐れを防止する助けとなる。インキュ ベーション期間中、サンプルと担体の活性化領域との接触を保つことによって、 サンプル中の生体分子は担体に結合するようになり、この時点で定性的にまた定 量的に分析出来る。

本発明の好適なアッセイ施行法においては、ポリマーマトリックス内に共有結合 を更に追加することにより、生体分子と担体間の物理的結合を向上することが可 能である。これは、生体分子が担体表面に付着した後、担体を紫外線で照射する ことによって達成することが出来る。紫外線はポリマーの重合を加速することに より、ある種のポリマーの表面を変化させる。このようにして影響を受けるポリ マーには、ポリスチレン、エポキシド、メタクリ酸、及びポリメラミンが含まれ る。紫外線処理に際し、担体表面は部分的に重合し、それによってポリマーの架 橋を昂進し、架橋された担体マトリックス内に結合してた生体分子を埋没あるい は捕捉する。これら共有結合の追加は、生体分子と担体間の結合の安定性を増大 する。ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ピクリン酸、及びアクロレイン による処理のような、ポリマーマトリックス内に架橋結合を増大提供する他の方 法もまた結合安定性向上に用いることができることも理解されよう。

一旦、生体分子が担体の活性化領域に結合したときには、結合した生体分子の存 在と量の検出に種々の手段を用いてよい。タンパク質あるいは酵素のアッセイで は、結合した生体分子は担体の丁度その表面で染色してよい。次いで、染色度は グレイレベル走査で測定することが出来る。免疫酵素アッセイあるいはハイブリ ッド形成技法を用いる場合もまた、プレート表面に水不溶性色素を加えることに よって反応生成物を肉眼で見えるようにすることが出来る。好適な色素には、ナ フトール−ＡＳ−Ｂｌリン酸／新フクシン（ＮＡＢＰＮＰ）　、３″３−ジアミ ノベンジジン、４−クロロ−１−ナフトール、９−アミノ−９−エチルカルバゾ ール、金コロイド、及びこの分野の専門家に周知のその他の物質が含まれる。

本発明の施行において、担体上の生体分子あるいは反応生成物の存在を肉眼で見 えるようにするためには、水に不溶の色素の使用が望ましい。担体が疎水性であ るから、水に不溶の色素は、担体表面に残存する傾向があり、バイアル内の溶液 中への拡散あるいは濾取に抵抗する。このことは、染色反応を生体分子あるいは 反応生成物の近辺に集中することによりアッセイの精度をさらに改善するものと 考えられている。しかしながら、水に不溶の色素が望ましいけれども、適当な水 溶性色素及び他の指示薬もまた用いることが出来る。

特に免疫酵素アッセイ及びハイブリッド形成アッセイ技法を用いる場合、検出に 先立ち、担体上の遊離結合部位を飽和しておくことが望ましく、その様にすれば 、抗原、または他の生体分子の存在を指示するために用いられる検出系がこれら の遊離部位に結合せず、染色反応を起こしたときにバックグラウンド染色を引起 こさない。この目的に用いられる適当な物質は、この分野の専門家には周知のも ので、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）はもちろんのこと、サケ精子ＤＮＡ、ポリ Ｌ−リジン、及びクリシンも含まれる。

さらに本発明の実施態様において、一旦、所望の生体分子が結合したならば、担 体へのそれ以上の結合を実質的に阻止することが望ましい。これを達成するため には、検出に先立ち、余計な結合を実質的に阻害するため、担体を洗剤溶液のよ うな乳化剤でゆすぐことが望ましいということが分かついる。洗剤は一般にポリ マー担体に結合しない。しかしながら、洗剤は水の凝集力を変化させ、その結果 、生体分子、遊離結合部位の飽和に用いられる物質、及びポリマー担体を含め、 存在するすべての基質を水和の層で被覆する。この作用は、検出試薬及び他の生 体分子の担体への結合能を実質的に阻害し、それによってバックグラウンド染色 を低減する。他の乳化剤としては、例えばトリトンＸ１００　（オクチルフェノ キシポリエトキシエタノール）、ツイーン２０（ポリオキシエチレンソルビタン ）、ＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナトリウム）、イオン性及びアニオン性テンシト、 硼酸塩、及び石鹸もまたこの目的に使用出来る。

通常のグレイレベル走査機とソフトウェアを、生体分子及び反応生成物の染色あ るいは標識の強度検出に使用できることが分っている。マツキントラシュ製グレ イレベル走査機（モデル“Ａｂａｔｏｎ　５ＣＩＩ”）をマツキントッシュＩ： Ａ／ＵＳコンピュータならびに“Ａｂａｔｏｎ　ＤＡ”ソフトウェアと同時に用 いて成功が収められている。

定量化は、メリーランド州、ベセスダの国立精神衛生研究所（ＮａｔｔｏｎａＩ 　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｍｅｎｔａｌ　Ｈｅａｌｔｈ、　Ｂｅｔｈｅｓｄ ａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）のＷａｙｎｅ　Ｒｅ５ｐｅｎｄ氏より研究所に無料で分 譲される“Ｉｍａｇｅ　１．３１”ソフトウェアを用いて成功裡に達成されてい る。

また、多数のウェルあるいは窪みを持つ担体のグレイレベル読取り用に特別に設 計されたソフトウェアを提供することも可能である。このようなプログラムは、 予めセットするか、あるいは調節可能の座標を設定し、座標周辺領域（半径、ク ロスへア、または面積による調節が完全に可能な）を特定し、定量化のためその 領域のグレイレベルの読取りをするよう設計されていることが望ましい。また、 このようなプログラムは、１９２フイールドまでの同時走査と定量化が許容され るように完全調節可能な格子スクリーンを備えることが望ましい。プログラムは 、染色法が用いられた場合には担体を直接に読取り、または放射能写真定量法が 用いられた場合にはＸ線フィルムを読取ることが望ましい。

検出におけるグレイレベル使用のために、サンプルの収容に用いられる担体表面 の窪みの深さにある制限を加えることは、この分野の専門家には理解されるであ ろう。それは、窪み壁が窪み内部に影をっけ、それによってグレイレベル解析に 干渉するからである。例えば、図１と２に示されているプレートにおいては、窪 みは深さ約０．００８インチまたはそれ以下にしてあり、その結果、影は走査に 干渉しない。当然のことながら、この配慮は窪みの直径が増大するにつれて、そ れ程重大ではなくなる。

勿論、生体分子を検出する他の周知の方法も本発明の施行に用いられることも理 解されるであろう。例えば、検出口的のため、放射活性検出法、放射活性写真、 シンチレーション測定を用いることも可能である。固定された放射活性検体を保 持する担体は、シンチレーション計測のため、シンチレーション液、キシレン、 トルエン、ベンゼン等に溶解することが出来る。この処置は、トリチウムあるい は炭素１４のような強度の低い放射能を出すアイソトープが使用されると特にヱ ましい。

本発明の固相担体は、イムノアッセイにおける生体分子の検出あるいは結合に用 いるため幾つものを用な形に成型することが出来る。一般に、通常の検出系が使 用出来る様に担体は成型されるべきである。例えば、担体は本質的に平坦な゛レ ート状成型されてもよい。このようなプレートは、検体を分離するため基忙目状 に窪みをつけて、即ち、図１及び２に示されているように、ミクロタイタープレ ート一般型に成型されてよい。同様に、プレートは単に実質的に平坦であるが、 しかしそこに窪みがなくてもよい。このようなプレートは、例えば、この分野の 専門家には周知のハイブリッド形成技術を施行するのに有用である。この場合、 プレートは１つの側を完全に活性化し、他の側は光沢のある不活性表面のままに 残しておき、それによってハイブリッド形成技術を容易にすることが特に望まし い。担体は、また、生体分子を結合あるいは捕捉出来る基質を反応チューブのよ うな管状、あるいはビーズまたは粒子のような形に成型してもよい。担体はまた 、ポリマー基質の薄い箔、あるいは繊維状若しくは糸状に成型してもよい。

特に、担体素材がビーズ、粒子、繊維、糸等に成型される場合、これらはアッセ イに用いる以外に、生体分子の培地の濾過にも利用出来る。

本発明のアッセイ法及び担体には幾つかの重要な利点がある。第一に、染色反応 が、バイアル内の溶液中よりもむしろ丁度固相担体表面で好適に起こるので、本 発明のアッセイは、ＥＬＩＳＡのような通常のイムノアッセイよりも実質的によ り高感度である。第二に、光測計（ＥＬＩＳＡ読取り器）に比べて比較的安価な グレイレベル読取り器を検出に用いてもよい。第三に、検出は光測定に依存する 必要がないので、活性化して結合特性を向上させた不透明担体を用いてもよい。

第四に、担体素材は疎水性であることが望ましいので、洗浄過程は、ニトロセル ロースあるいはナイロン膜を用いる通常のプロット標品よりも効率がよい。最後 に、洗剤の結合阻害作用は、この担体を他の担体系よりも効率のよいものにする 。

以下の特徴的な実施例は、本発明の実施に用いられる方法と物を示すものであり 、本発明に係る実施手段の幾つかを単に例示するために提供されるものである。

例１−タンパク質アッセイ 図１及び２に示されているものに類似の、ポリスチレンとポリブタジェンの注入 成型による共重合体製白色プレートを１０秒間アセトンに浸して活性化した後風 乾する。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、１０ｇ／ｌがらｌｆｇ／ｌの範囲で 連続希釈し、−滴ずつ、各１５μｍを活性化した担体に加える。プレートは高湿 チャンバー内で２時間インキュベートする。過剰の液体は、その後、濾紙に吸取 して除去する。プレートは次いでクマシーブルー（４５％メタノール及び１０％ 酢酸中にツマシーブルー２５０ｍｇ溶解）中で１０分間染色する。その後、プレ ートを水で洗浄して風乾する。染色強度はコンピュータ走査機とグレイレベルプ ログラムによって測定する。結果はヒストグラムの形で示される。この方法の最 低感度レベルは１０　ｐｇ／Ｉの低濃度である。

現性は、普通のタンパクン質アッセイ（例、Ｌｏｗｒｙ法）よりも遥かに単純で 且つ遥かに感度がよい。

例２−酵素アッセイ 測定すべき酵素（例、血清検体中のアルカリ性ホスファターゼ）を含む溶液を一 滴ずつ、例１に記載のような担体で、予め使用に先立ち、１００％イソプロパツ ールを散布してから風乾したものにピペットで加える。検体は高湿チャンバー内 に１時間放置してプレートに結合させる。プレートは、次いでナフトール−ＡＳ −Ｂｌリン酸／新フクシン（ＮＡＢＰＮＰ）溶液に３０分間浸す。染色反応は次 いで２０ｍＭのＥＤＴＡで停止する。プレートは、次いで水で洗浄し、乾燥して 例１のように定量化する。

例３−ペプチドホルモンの免疫酵素的定量標準定量曲線作成のため連続希釈した 合成ペプチド、ならびに検査すべき検体をピペットで（例１の様に）予め１００ ％エタノールに浸して活性化した不透明なポリスチレン製プレートに加える。高 湿チャンバーで２時間結合させた後、過剰の液は吸い取って除去する。プレート 上の遊離結合部位は、プレート全体を５％ＢＳＡに３０分間浸して飽和する。そ の後、プレートを０．０５％トリトンＸ１００含有リン酸緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ） で洗浄する。検出すべきペプチドに対する抗体をＰＢＳで１　：　１０００に希 釈してプレートに２時間適用する。プレートはＰＢＳで再度洗浄した後、第一抗 体の生物種に対する抗体で、且つ、ペルオキシダーゼで標識した第二抗体とイン キュベートする。このインキュベーション段階は室温で３０分を要する。３回洗 浄後、プレートは％　１２ｍｇのジアミノベンジジン、１０μｍの３０％過酸化 水素溶液、及び２００μｌの塩化ニッケル溶液を含み、これらすべてを１００ｍ １のＰＢＳに溶がした溶液を新たに調製し、その中で染色する。染色反応は約１ ０分を要し、自然に停止する。プレートは水で洗浄して乾燥する。次いで、染色 強度は前述の様に走査機を用いて定量する。

類似のイムノアッセイが現今、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）として 行われており、このアッセイは、免疫沈降物及びマーカー酵素がミクロタイター プレート壁に付着し、反応生成物がバイアル内の溶液中で生成されるという事実 により、水沫よりも約１０００倍感度が低い。さらにＥＬＩＳＡを用いる場合、 反応は時間を注意深く調節して非特異的反応を制御するように停止しなければな らない。

例３に記載のような免疫酵素アッセイに対し、本発明は感度に関して重要な改善 を示す。担体は防水性であり、界面活性剤が存在すると基質の結合をほぼ１゜０ ％阻害することが出来、バックグラウンド反応が完全に消失する結果、シグナル 対ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）は良好となる。使用出来る増幅技法の一般的考察につい ては、読者は以下の文献を参照されたい：　Ｊ、Ｄ、　Ｓｅｄｇｗｉｃｋ　ｅｔ 　ａｌ、、”Ａ　５ｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍａｔｉｃｔ ｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｐｅｃ ｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｙ　ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ、　−Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、、　Ｖｏｌ、　５７．　ｐｐ、　３０１−０９（１ ９８３）、Ｓ、Ｆ、　Ｄｅ　Ｓｔ、　Ｇｒｏｔｈ、　’Ｔｈｅ　ｅｖａｌｕａｔ ｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ａｓｓａｙｓ。

“Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、、　Ｖｏｌ、４９．　ｐｐ、　Ｒ１１−Ｒ ２３（１９８２）　、及び、Ｃ，Ｊ、　５ｔａｎｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、。

”Ｅｎｚｙｍｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｃａｎ　ｅｎｈａｎｃｅ　ｂ。

◆ｈ　５ｐｅｅｄ　ａｎｄ　５ｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏａｓ 、ａｙｓ″、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、、　Ｖｏｌ、　８３．　ｐｐ 。

８９−９５　（１９８５）。これらすべては、参考文献として本文中に取込まれ 、その一部となっている。

例４−ｍＲＮＡ決定のためのドツト吸着図１と２に示されているものに類似の滅 菌プレートに、標準物質として合成ＲＮＡを連続希釈したもの、ならびにＲＮＡ 抽出物を付加する。前述のように結合、及びプロッティング後、プレートを１０ ０μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡで飽和する。次いで、プレートを紫外線に１０分 間露出して担体表面上の架橋を促進する。

その後、プレートを、解析すべきＲＮＡ配列に相補的な放射標工された合成オリ ゴヌクレオチドプローブあるいは標識抗原とインキュベートする。７％イブリッ ド形成は高湿チャンバー内、３７℃で１時間で起こる。ノ＼イブリッド形成用の 緩衝液は０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含み、プローブの濃度は５μＭ／ｍｌで ある。

その後、プレートは、使用したプローブの分解温度より５℃低い温度においてＰ ＢＳで洗浄する。次いで、プレートを乾燥し、オートラジオグラフィーのためＸ 線フィルムに露出するか（放射活性プローブが用いられた場合）、あるいは例３ に記載の様に、放射活性を使用せずに標識したプローブの免疫検出のため現像す る。Ｘ線フィルムならびに免疫染色したプレートは前述の如く定量化する。

これまで、ドツトプロットには主としてニトロセルロースあるいはナイロン膜が 使用されて来た。このような担体の不利な点は、これらのものが疎水性で多孔質 であることである。このような担体にプロットされた検体は拡散して担体表面に 滞留しない。そのため、遊離の結合部位を飽和することが困難で、バックグラウ ンド染色が高い結果となる。これは、連鎖的に、Ｓ／Ｎ比が好ましくなく、感度 が低い原因となる。例４に使用されている防水性素材は、洗剤の作用のため殆ど バックグラウンドがない。

本発明は、一定の好適ｔｊ実例について記述されて来たが、この分野の専門家は 、本発明の原則から逸脱することなく本発明の施行に使用し得る構造、配列、部 分、構成分子、素材、行程及び構成成分の種々の改変が可能であることを認識す るであろう。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の７第１１ｊｉｊ）平成　６ 年　４月２０日

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. １．生体分子のアッセイを施行する方法であって以下の事項を含むことを特徴と する： ポリマー素材製の固相担体を提供し、前記固相担体が、当該領域の露出表面面積 を増大することによって活性化された領域を持ち、固相担体の活性化された領域 に検出すべき生体分子を結合して、一旦、固相担体に結合した後、生体分子の存 在を検出することを特徴とする。
2. ２．請求項１に記載の方法であって、前記領域を、ポリマー素材を部分的に溶解 してポリマーマトリックスを解放する溶媒で処理することによって固相担体を活 性化することを特徴とする方法。
3. ３．請求項２に記載の方法であって、溶媒がエーテル、アルコール、ケトン、ア ルデヒド、酸、塩基、オレフィン、鎖状及び環状炭化水素、ならびにハロゲン化 炭化水素を含むグループから選択されることを特徴とする方法。
4. ４．請求項１に記載の方法であって、固相担体が機械的手段で活性化されている ことを特徴とする方法。
5. ５．請求項１に記載の方法であって、ポリマー素材がポリスチレン及びポリ塩化 ビニールから選ばれたグループの一員からなることを特徴とする方法。
6. ６．請求項１に記載の方法であって、ポリマー素材が共重合体であることを特徴 とする方法。
7. ７．請求項６に記載の方法であって、ポリマー素材がスチレンとブタジエンの共 重合体であることを特徴とする方法。
8. ８．請求項１に記載の方法であって、活性化領域が不透明であることを特徴とす る方法。
9. ９．請求項１に記載の方法であって、生体分子が、当該生体分子の存在を指示す るため染色色素を用い、染色強度を測定するためにグレイレベル走査を使用して 検出することを特徴とする方法。
10. １０．請求項１に記載の方法であって、生体分子を本質的に水に不溶の染色色素 を用いて検出することを特徴とする方法。
11. １１．請求項１に記載の方法であって、生体分子が、タンパク質、核酸、アミノ 酸、ペプチド、ポリペプチド、アミン、モノアミン、ヌクレオチド、及びポリヌ クレオチド類から選ばれたグルーブの一員であることを特徴とする方法。
12. １２．請求項１に記載の方法であって、生体分子が担体の活性化領域の表面に供 有結合することを特徴とする方法。
13. １３．請求項１２に記載の方法であって、生体分子を結合している担体の活性化 領域を紫外線に露出することにより当該生体分子を担体の活性化領域に埋没する ことを特徴とする方法。
14. １４．請求項１に記載の方法であって、担体が本質的に平坦なプレートの形に成 型されていることを特徴とする方法。
15. １５．生体分子のアッセイを施行する方法が以下の事項からなることを特徴とす る方法： ポリマー素材製の固相担体を提供して、検出すべき生体分子が前記固相担体に結 合し、 生体分子が固相担体に結合した後、前記固相担体表面に乳化剤を適用して余剰物 質が担体に結合することを本質的に阻害して、一旦、生体分子が固相担体に結合 した後、生体分子の存在を検出することを特徴とする方法。
16. １６．請求項１５に記載の方法であって、ポリマー素材が、ポリプロピレン、ポ リスチレン、ポリ塩化ビニール、ポリアミド、ポリカルボネート、エポキシド、 メタクリル酸、及びポリメラミンから選ばれたグループの一員であることを特徴 とする方法。
17. １７．請求項１５に記載の方法であって、前記ポリマー素材が共重合体であるこ とを特徴とする方法。
18. １８．請求項１７に記載の方法であって、前記ポリマー素材がスチレンとブタジ エンの共重合体であること特徴とする方法。
19. １９．請求項１５に記載の方法であって、前記乳化剤が洗剤であることを特徴と する方法。
20. ２０．請求項１５に記載の方法であって、前記生体分子の存在を指示するために 染色色素を、また、染色強度の測定にグレイレベル走査を用いて生体分子を検出 することを特徴とする方法。
21. ２１．請求項１５に記載の方法であって、前記生体分子がタンパク質、核酸、ア ミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、アミン、モノアミン、ヌクレオチド、及びポ リヌクレオチド類から選ばれたグルーブの一員であることを特徴とする方法。
22. ２２．生体分子のアッセイ施行の方法が、共重合体製の固相担体を提供し、 検出すべき生体分子を前記固相担体に結合して、一旦、前記生体分子が共重合体 固相担体に結合した後、当該生体分子の存在を検出することから成ることを特徴 とする方法。
23. ２３．生体分子のアッセイ施行のための固相担体が、検出すべき生体分子を結合 するための活性化領域を持つポリマー素材であり、前記ポリマー素材が、前記活 性化領域に増大された露出表面積を持ち、一旦、生体分子が上記担体に結合する と、生体分子の存在が検出出来る様に前記ポリマー素材が成型されることを特徴 とする。
24. ２４．請求項２３に記載の固相担体であって、前記活性化領域が、当該領域をポ リマー素材を部分的に溶解する溶媒で処理することにより創製されることを特徴 とする。
25. ２５．請求項２４に記載の固相担体であって、前記溶媒が、エーテル、アルコー ル、ケトン、アルデヒド、酸、塩基、オレフィン、鎖状及び環状炭化水素、なら びにハロゲン化炭化水素類から成るグルーブより選択されることを特徴とする。
26. ２６．請求項２３に記載の固相担体であって、前記活性化領域が機械的手段によ って創製されることを特徴とする。
27. ２７．請求項２３に記載の固相担体であって、前記ポリマー素材が、ポリプロピ レン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニール、ポリアミド、ポリカルボネート、エポ キシド、メタクリル酸、及びポリメラミン類から選ばれたグルーブの一員から成 ることを特徴とする。
28. ２８．請求項２３に記載の固相担体であって、前記ポリマー素材が共重合体であ ることを特徴とする。
29. ２９．請求項２８に記載の固相担体であって、前記ポリマー素材がスチレンとブ タジエンの共重合体であることを特徴とする。
30. ３０．請求項２３に記載の固相担体であって、前記活性化領域が不透明であるこ とを特徴とする。
31. ３１．請求項２３に記載の固相担体であって、前記担体が本質的に平坦なプレー ト状に成型されていることを特徴とする。
32. ３２．請求項３１に記載の固相担体であって、前記担体が本質的に平坦なプレー トに窪みとして成型された複数の活性化領域を含むことを特徴とする。
33. ３３．請求項３１に記載の固相担体であって、前記担体がミクロタイターの形に 成型されていることを特徴とする。
34. ３４．請求項２３に記載の固相担体であって、前記担体が反応容器の形に成型さ れていることを特徴とする。
35. ３５．請求項３４に記載の固相担体であって、前記担体が反応チューブの形に成 型されていることを特徴とする。
36. ３６．請求項２３に記載の固相担体であって、前記担体がポリマー素材のビーズ 状に成型されていることを特徴とする。
37. ３７．請求項２３に記載の固相担体であって、前記担体がポリマー素材の薄い箔 状に成型されていることを特徴とする。
38. ３８．請求項２３に記載の固相担体であって、前記担体がポリマー素材の繊維状 に成型されていることを特徴とする。