JPS5870164A - 酵素免疫測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素免疫測定用不溶化試薬の提供を目的とする
。

免疫反応を利用する分析方法のうちイムノアッセイは感
度が極めて優れており、生化学の分析で広く使用されて
いる。この分析方法においては抗原または抗体を標識し
ておくことが必須であるが、その標識手段としてラジオ
アイソトープを利用する方法と酵素を利用する方法に大
別され、前者はラジオイムノアッセイ（以下ＲＩＡと略
記す）後者はエンザイムイムノアッセイ（以下ｍｒＡえ
と略記す）とよばれている。

ＲＩ＾は古くから行なわれており、免疫測定法の主流で
あるけれども、アイソトープを利用するため、最近、特
に多くの制約を受けるようになってきた。

このため、それらの制約をさけた１！ムが近年急速に実
用化されるに至った。

イムノアッセイに関する技術上の重要な問題の一つは不
溶化試薬の作成にある。すなわち、イムノアッセイにお
いては測定すべき物質と免疫反応により特異的に結合す
る抗原または抗体を水に不溶の状態とした不溶化試薬を
用いるが、その性能が分析結果の良否を大きく左右する
。

初期のころは不溶化試薬に用いる担体としてはセルロー
ス、架橋デキズトランなどの天然高分子が用いられてい
た。これらの担体は微粒♀であるため、免疫反応終了後
、測定対象物と特異的に結合した試薬を液より分離する
に際し、通常、遠心分離を必要とし、また、分離した試
薬を十分洗浄することも必要であり、操作に手間のかか
る欠点があった。かかる欠点をさける閾的で適当な寸法
、形状に成形したプラスチックまたはガラスを担体とし
たものや試験管の内面を担体として利用したものなどが
出現するに至った・ そもそも、不溶化試薬の性能が酵素免疫分析法の良否に
大きくかかわりあっていることは公知であるがその性能
の評価方法として、バッタグランド、測定範囲、再現性
等があり、また、分析の良否を決める要因の一つとして
分析のしやすさも無視することができない。

架橋デキストランの如き天然高分子はその物質固有の性
質から免疫反応によらない非特異的吸着（結合）が起り
やすく、パックグランドの増加をもたらす。しかし、こ
の物質は微粒子であるため操作上の欠点があるものの不
溶化試薬の活性が巨視的に均一であるため再現性の点で
有利である。一方、成形された担体は微粒モーご比して
比表面積が小さく担体としての抗原、抗体の担持量が少
なくなったり、その量のバラツキもさけられず、測定範
囲が狭くなったり、ともすると再現性が悪くなる可能性
があった。そのため、抗原な抗体の吸着量を増大させる
ため、担体の表面積を増加させることが望まれる。表面
積を増加させる方法としては先ず、化学的方法の応用が
考えられるが手間かがかりすぎて、実用性にとぼしい。

一方、機械的方法による粗面化により表面積を増加させ
、吸着部位を増加させることも容易に考えられる。しが
しながら、粗面化の程度と分析の精度との関連を検討し
た文献はない。さらに、素材的にみれば担体として合成
高分子の利用が考えられる。

一般に、高分モーζは親水性を持つもの例えばポリアマ
イド、ポリメチルメタアクリレート等と、疎水性を持つ
もの例えば、ポリエチレンポリプロピレン、ポリスチレ
ン等とがある。

これらのうち、親水性高分子は含水率が高く、タンパク
質中のア之ノ基等の極性基部分をよ（吸着する。ところ
で、抗体分子はタンパク質であり、タンパク質は親水性
の部分と疎水性の部分からなり、その内、免疫反率にあ
ずかる活性部位は親水性部分にあると言われている。そ
のため、親水性部分が高分子に吸着されることは免疫反
応にあずかる部分の減少をきたし、その結果として免疫
活性の低下が懸念される。従って、担体としての親水性
ポリマーの利用は好ましくない。一方、疎水性ポリマー
は抗体分子の疎水性基部分との結合が予想されるため／
ル疫反応活性の低下は最小限番こすることがで舎る。

従って、このことからも表面が疎水性であるポリマーが
有利であることが予想される・しかしながら、免疫活性
測定操作を通じて疎水性高分子を担体として使用した場
合、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンは比重が小
さいために免疫反応時、抗体ボールが反応系から浮上し
、そのため反応面積が一定せず、バラツキの大きな原因
となった。更に取扱い面においても反応終了後フォトメ
ーター等により吸光度を測定する場合担体が液から浮上
するとガラスセルに反応液を移しかえる時担体がガラス
セルに移動しかけたりするため、ともすると液こぼれの
原因となる欠点があった。従って、取扱い面からも担体
の比重が重大な要件となることが判った。

また未加工担体は、抗体が結合すると会の吸着面が小さ
く、それがために感度が低く、ともするとバラツキし易
い欠点を有していた。これらの欠点を克服せんとして本
発明者等は鋭意研究の結果本発明を完成したのである。

即ち、本発明は、酵素免疫測定用不溶化試薬において、
測定すべき物質と特異的に結合する抗原または抗体を結
合せる不溶性担体がポリオレフィン系樹脂またはポリオ
レアイン系樹脂を５０哄以上含有し、かつ上記担体の比
重が１．０１〜１．５であり、その表面積が原表面積の
５〜２０００＃ＩＣ粗面化された担体であることを特黴
とする酵素免疫測定用不溶化試薬を提供する。

本発明に詔いて使用しつるポリオレフィン系樹脂として
は高圧法ポリエチレン、中圧法ポリエチレン、低圧法ポ
リエチレン樹脂岬のエチレン単独重合体、エチレンを５
０哄以上含有するエチレンとこれと共重合可能な単量体
との共重体、例えばエチレン−酢酸ビニル共重合体、エ
チレン−塩化ビニル共重合体、エチレン−スチレン共重
合体、エチレン−アクリル酸エチル共重合体、エチレン
−プロピレン共重合体、エチレンとアクリル酸のナトリ
ウム、カリウム等の金属塩との共重合体であるエチレン
−アクリル酸アイオノマー、エチレンの単独重合体の任
意の位置番【他の原子または原子団が置換もしくは付加
されてなる、例えば塩素化ポリエチレン等のポリエチレ
ン系樹脂墨プロピレン５〇−以上含有する。これと共重
合可能な単量体との共重合体、例えばプロピレン−塩化
ビニル共重合体、プロピレン−スチレン共重合体、プロ
ピレン−エチレン共重合体、プロピレン−アクリル酸エ
チル共重合体、プロピレン−酢酸ビニル共重合体、プロ
ピレンの単独重合体の任意の位置に他の原子または原子
団が置換もしくは付加されてナル、例えば塩素化ポリプ
ロピレン等のポリフロピレン系樹脂、ブテン−１の単独
重合体、ブテン−１とこれと共重合可能な他の単量体と
の共重合体、ブテン−１の単独重合体の任意の位置に他
の原子または原子団が置換もしくは付加してなるポリブ
テン系樹脂がある。

本発明において使用しうるポリスチレン系樹脂の例とし
てはスチレンの単独重合体、あるいはα−メチルスチレ
ンの如きスチレン誘導体の単独重合体、スチレン−α−
メチルスチレン共重合体、スチレンまたはスチレン誘導
体とこれと共重合可能な他の単量体との共重合体例えば
スチレン−アクリロニトリル共重合体、スチレン−メチ
ルメタクリレート共重合体、スチレン−ブタジェン−メ
チルメタクリレート共重合体等がある。

また、上述したポリオレフィン系樹脂またはポリスチレ
ン系樹脂にポナメタクリル駿エステル系樹脂、ポリブタ
ジェン系樹脂、ポリエーテル、ポリアセタール、ポリカ
ーボネート等の熱可重性樹脂をブレンドしたものも使用
しうる。

上述した各重合体、共重合体または樹脂ブレンドＫｍい
て、ポリエチレン系樹脂またはポリスチレン系樹脂成分
は５ｏ哄以上となるようｋすればよい。

前述した担体の比重が小さいことｋよる欠点を克服する
ためＫは不溶化試薬が免疫反応時には液中に完全く浸漬
されるξとが必須の要件であり、このためには担体の比
重が１．０１ａ上であることが必要なことが判った。し
かしながらこの比重が１．５より大となると後述する欠
点を有することも判った。

本発明では前述したポリオレフィン系またはポリスチレ
ン系樹脂を担体として使用するがこれらはそのままでは
比重が小さく反応中て浮遊する欠点を有する。このため
比重を大にするため、添加剤例えば酸化チタンを適宜混
合して１担体の比重を上述した１、０１〜１．５に関節
ｔｓとよい、な右比重が１．５より大化なると酸化チタ
ン（添加剤）の量が多くなりすぎ、後述する粗面化にあ
たり、担体自体が脆くなり、欠落したり、また疎水性表
面としての性質が失われたりするので好ましくない。

更に吸着面積の小さいことによる欠点を解決するため、
即ち感度の向上、バラツキの低減を達成するｋは、担体
の表面を粗面化し、その表面積を粗面化前の５〜２００
０倍にするとよいξとが判った。この表面積は可及的に
原表面積より大であればあ゛る程その性能は向上するが
、一般に使用樹脂、にもよるが２０００倍を越えると粗
面化された面から、細片が脱落し、形状維持が困難とな
り、むしろ精度が低下することがあるので好ましくない
。

担体の粗面化−ζは樹脂を任意の形状にし、研磨材（例
えば１００〜３ｏｏメツシユのアルミナ粉末）複合滑剤
を加えてボールミル中テ攪拌して粗面化することがで舎
る。

粗面化する過程で、より均一な粗面化担体を得ようと思
えば、材料の均一性ばかりでなく担体表面の硬さ、もろ
さ等にも大き（依存することが判明した。すなわち、素
材的には疎水性の長所を失なわない程度に疎水性ポリマ
ーを含有することを基本とし、担体の成型性、加工性等
を考慮してポリオレフィン系樹脂またはポリスチレン系
樹脂の含量を検討したところ、ポリオレフィン系樹脂ま
たはポリスチレン系樹脂を５０−以上含有することが必
須であることが判つ九また粗面化工程に奢いて、疎水性
ポリマー単独で粗面化しようとすれば、粗面化で會ない
ことはないが素材的にやわらかく粗面化した部分が脱落
したりして、均一な粗面化担体が得られにくい。逆に、
添加剤（酸化チタン）を過剰に加えることは前述した如
く素材をもろくすることＫなり、良好とは言えなかった
。

また、担体の形状は使用目的に応じて球状、棒状、板状
、チュ、−ブ状等適宜選定できるが均一に粗面化された
担体を得るには球状が最適である・抗原、抗体を担体表
面に吸着させる方法としては公知の方法により、すなわ
ち、水または適当な緩衝液に溶解しｔ詔を、これに担体
を浸漬させて吸着させる方法が最も簡単で応用しうる。

たとえば、０．００５から０．５Ｍの緩衝液に抗原また
は抗体を０．０００２から０．５噂となるように溶解し
、これに均一に粗面化された担体を十分洗浄した後、浸
漬し吸着させる。

吸着に当っては室温（１０℃〜３０℃）付近で２〜４８
時間吸着させるのが適当である。担体を浸漬したまま冷
蔵保存し、使用時、洗浄してもよいが長期保存を目的と
した場合、溶液より分離し、水または適当な緩衝液で洗
浄して不溶化試薬を得ることもで会る。洗浄に当っては
適当なタンパク質たとえば、牛血清アルブミン、カゼイ
ン等を０．０１から５．０襲程度溶解した洗争砿を用い
ても良い。得られた不溶化試薬は同種の洗浄液等に浸漬
して保存したり、凍結乾燥したりして保存することがで
きる。

本発明の不溶化試薬は競合法、サンドインチ法、いずれ
の！ＩＩＡにおいても使用しうる。また、本発明の不溶
化試薬の使用分野は特に制限を受けるものではなく、ハ
プテン、抗原詔よび抗体などの１１１ムに適した測定対
象に用いることができる。例えば、α−フェトタンパク
、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリン１、ガン胎児性抗
原、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンなどの血清タン／マク
質、インスリン、ｖａｎ、成長ホルモンなどの血中ホル
モン、ステロイドホルモン、さらＫはウィルス等の定量
に広く使用できる。

本発明の不溶化試薬は測定に際して取扱いやすく、バッ
クグランドが一少なく、測定範囲が大壷＜、かつ再現性
のすぐれた精度の良い酵素免疫測定法に適している。以
下、本発明の不溶化試薬の製造とその性能について、実
施例を上げて説明する。

表１に示した素材からキャスティング法によりボール（
直径６４　ｍ　）状に成型後、金銅砂、けいそう土、ま
たはアルｔすを使用する機械的研磨法によって、粗面化
ボールを製造した。

表　１　各種スリ付合ボールの性質 実施例　　１　　インスリン測定用不溶化試薬の製造抗
ブタインスリン抗血清（モルモット）より４δ哄飽和硫
安分画後、Ｄ１ムｌ精製したインスリン抗体を０．ＯＩ
Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（生理食塩水入）［”ｐｉｌ
ニア、２］を用い、濃度が１ｄ当り１１ＩＦとなるよう
に溶解した溶液５ｏ−に表面を十分洗浄した表１で作成
した粗面化ポール４００個を浸漬し、室温で８時間静置
した。その後、ボールを液より分離し、牛血清アルブミ
ンを２哄含有する０、ＯＩＭりん酸ナトリウム緩衝液（
生理食塩水入）（ｐＨニア、２）を用いて洗浄した後、
同−緩衝故に保存した。

測定例　１　インスリン分析試験 実施例１で得た不溶化試薬を用いすンドイッチ法１１１
Ａ　Ｋよりインスリンを分析した。

酵素として１０ｖペルオキシダーゼ（西洋ワサビ由来）
を使用し、過よう素架橋法によってｓｑの抗プタインス
Ｃリン抗体にベルオキダーゼを結合させ、ゲルー過（セ
ファデックス。−２００にヨ！　’）　Ｌ、精製した後
、コロジオンバッグで濃縮し、！ｌｌ素標織抗体とした
。抗体への酵素結合方法はピー・ナヵネ等：ザ・ジャー
ナルｅオブ・ヒストヶ文ストリー・アンド・量イトケ主
ストリー、１１１２２巻、第１２号、第１０１１４頁〜
第１０９１頁（１９７４年）に記載されている。

得られた酵素標識抗体は使用直前Ｋｉｄ朧清アルプ之ン
を含有する１０１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（生理食塩
水入）　（ＰＩ：　７．２　）　？２０００倍付近まて
希釈し、使用した。

抗ブタインスリン抗体１５ｑを使用し、ａ１麗酢酸ナト
リウム緩衝波（ｐ”：５．０）中で０．１麗メルガプト
エチルアミンにより還元後、夏。

ｌｉｅ、、　ｏ　＋＋　フェニレンダイマレイミド飽和
溶液を添加することによりマレイミド−インスリン抗体
の複合体を作成し、セファデックスＧ−２５による精製
の後、７５声ｒのβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（大腸菌由
来）と３０℃、２０分間、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐｌｉ
：５．０）中で反応させた後、セファロース６Ｂカラム
により精義し、コロジオンバッグにより濃縮し、酵素標
識抗体とした。

なか、抗体への酵素標識方法はケイ・カドー等：ジャー
ナル・オブ・ザ・バイオケミストリー第７８巻、第４２
３頁〜第４２５頁（１９７５年）に詳細に記載されてい
る。

得られた酵素標識抗体は使用直前に１哄血清アルブミン
を含有する０、ＯＩＭりん酸ナトリウム緩衝液（生理食
塩水入）ＣＰ１７．２）で２０００倍付近まで希釈し使
用した。

（２インスリンの測定方法 試験管（１２ＷφＸ　８０　ｖｍ　）　Ｋ緩衝液−！（
０，０１菖りん酸緩衝液（ｐＨ，７，２）に牛血清アル
ブミンを０．６哄溶解したもの）０．４−および標準イ
ンスリン溶液（５〜３２０メＶ／ｖＩｌ）０．１−を添
加し、よく混合してから、実施例１で作成した不溶化試
［１個を入れ、３７℃で１時間保温する昏保温終了後、
試験管内の反応液を吸引除去し、緩衝液−１ｉｄを加え
て洗浄する。

次に、測定例１の０項で得た酵素標識抗体０．３ｄを加
え、３７℃で２時間保温する。保温終了後、前記と同様
に反応液を吸引除去し、洗浄後、あらかじめ準備した０
、３憾のｏ−フェニレンジアミン・２塩酸塩（１１１０
１を含むりん酸バッファー中（ｐＨ：６．０））０．５
−中にポールのみを移し、室温で１時間反応させる。酵
素反応によって生ずる赤かつ色の色素を４９２鱈で測定
し、酵素活性とした。

（２の測定方法に従って、実施例１にで作成したポール
を使用し、インスリン標準品を測定した。

その結果は表２番ζ検量線を、表３に測定精度を示して
いる。な右、この場合の標識酵素はペルオキシダーゼで
ある。

表２から明らかなように１表面積が高められてないポリ
スチレンポールを使用したものは低濃度側の吸光度変化
が少なく表面積を高められたポリスチレンポールを使用
したものより明らかＫおとっている。

表３から明らかなように、ボールの表面積が小さいと精
度が明らかに悪い。

（褐比重のξとなるボールによるインスリン標準品の測
定 （２）のインスリン測定法に従って、実施例１にで作成
した抗体結合ボールを使用してインスリン標準品を測定
し、精度の検定を行なった。

なお、この場合の標識酵素はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
であり、従って、基質は２ｍＭのＯ−ニトロフェニルー
β−Ｄ−ガラクトシドを使用し、吸光度は４２０ｎ閣で
測定した。

表４から明らかなように、反応液から浮上するポールは
バラツキが大会いことがわかる。また比重調製用として
使用した酸化チタンの量が多くなると精度が悪い。

特許出願人　東洋紡績株式会社 代理人　安　達　光　雄 同　　　　　　安　　　達　　　　　　　智（自発）手
続補正帯 昭和５６年１２月１０日 特許庁長官島田春樹殿 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 １萬箇〜 Ｘ％名称、（３１６）東洋紡績株式会社４、代理人 氏名（５９６９）安達光雄 ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６．１１１１正の内容 （１）明細書第１頁下から第３行〜第２行「イムノアッ
セイ」を「標識イムノアッセイ」と訂正する・（２）同
第５頁末行「抗体ボール」を「担体」と訂正する。

Ｇ）同第６頁第１１行「バラツキし易い」を「バラツキ
易−」と訂正する。

（４同第７頁第１６行〜第１７行「ポリエチレン樹脂；
プ田ピレン５０％以上含有する。これと共重合可能な」
を「ポリエチレン樹脂、プロピレンの単独重合体、プロ
ピレンを５０襲以上含有するこれと共重合可能な」と訂
正する０６）同第８頁第５行〜第６行「ブテン−１とこ
れと共重合可能な」を「ブテン−１を５０％以上含有す
るこれと共重合可能な」と訂正する。

（６）同第９頁１１１６行「ポリエチレン系樹脂」を「
ポリオレアイン系樹脂」と訂正する。

（７）同第１３頁第５行「α−フェトタンパク１」を［
α−７エトプロテイン、」と訂正する・（８）同第１６
頁下から第２行「過よう素架橋法」を「過よう素酸架橋
法」と訂正する０ （９）同第１８頁下から第３行ｒ、ｓＶ／ＩＩｊｌ　＊
　ｒ、ｇＵ／ａｇＪと訂正する・ （１０）同１２０頁の表２の左よ＃）第１欄の頭書中「
（μＶ／ａｄ）Ｊを［（μｖ／ｍ）Ｊと訂正する。

（１１）同第２０頁の表２の下に下記記載を挿入する＠
「測定値ｔｊ４９２ｍｍでの吸光度を示す０」（１り同
第２２頁の表３の頭書中「ｐＶ／ｙｄＪをｒｓＵ／ｙｄ
ｊと訂正する。

α３）同第２２頁の表３の下に下記記載を挿入する。

「測定値は４９２ｎｍでの吸光度を示す０」（１４）同
第２４頁の表４の頭書中「μＶ／ａｌｌをｒｊ４ＶＬｔ
」と訂正する。

以　　上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、酵素免疫測定用不溶化試薬において、掬定すべ舎物
   質と特異的に結合する抗原または抗体を結合させる不溶
   性担体が、ポリオレフィン系樹脂またはポリスチレン系
   樹脂を５０哄以上含有し、かつ上記担体の比重が１．０
   １〜１．５　’ｔ’あり・、その表面積が原表面積の５
   〜２０００＃！ＦＫ粗面化された担体であることを特徴
   とする酵素゛免疫測定用不溶化試薬。 ２　ポリオレフィン系樹脂がポリエチレン右よび／また
   はポリプロピレンである特許請求の範囲第１項記載の試
   薬。