JPH07503064A - 抗原の定量的及び定性的特性表示に用いる固相担体と組合せ装置 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 抗原の定量的及び定性的特性表示に用いる固相担体と組合せ装置技術分野 本発明はイムノアッセイに対する固相担体、特に、抗原を結合するだめの活性化 部分を持つ固相担体の利用、及び、特にイムノアッセイにおける利用に適合させ た抗原結合のために活性化した部分を持つ特異な固相担体からなる組合せ装置に 関する。

背景技術 試料中に被検体として存在する抗原を検出する従来の技術の中には種々のイムノ アッセイ法がある。特に、実験室及び臨床上の日常的操作となって来ている幾つ かのイムノアッセイ法には、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッ セイ（ＥＩＡ）、特にその異成分性からｅｎｚｙｍｅ　１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕ ｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ　（ＥＬＩＳＡ）と呼ばれるもの、及び、蛍光 イムノアッセイ（ＦＩＡ）が含まれる。これらイムノアッセイ技法の全体像につ いては、’Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｑｕｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ’、　Ｒ，Ｈ。

Ｂｕｒｄｏｎ　ａｎｄ　Ｐ、Ｈ，ｖａｎ　Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ　（ｅｄｓ。

）、　Ｖｏｌ、６．　ｐａｒｔ　’；ｌ：　’Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ 　ｔｏ　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｓｔａ ｉｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ’、　ｂｙ　Ｔ、Ｃｈａｒｄ、　Ｅｌｓｅｖ ｉｅｒ、　１９８７．　及び、”Ｅｎｚｙｍｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｉｍｍｕｎ ｏａｓｓａｙ’、Ｔ、Ｔ、　Ｎｇｏ　ａｎｒ３　Ｈ，Ｍ、　Ｌｅｎｈｏｆｆ　（ ｅｄｓ。

）、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８５）。

抗原に特異的な抗体との反応を引き起こす抗原、例えば、薬物、ホルモン、ペプ チド、タンパク質あるいは他の生物学的活性因子、及び微生物学的またはウィル ス性抗原のようないかなる抗原も、このようなイムノアッセイによって検出する ことが可能である。

イムノアッセイ法の重要な応用の一つは、ウィルス性抗原、例えば、ヒト免疫不 全症ウィルス（ＨＩ　Ｖ）の検出である。しかしながら、現今、日常的なＨＩＶ の診断は、ウィルス外套膜タンパク質、Ｐ２４あるいはＰＩ３のようなウィルス 粒子の抗原決定基に対してヒト体内で作られた抗体の検出に限られている。抗体 捕捉型イムノアッセイがこの目的に用いられる。同様の免疫診断手段が、肝炎Ｂ 型及びＣ型並びに他のウィルスの感染に対して使用される。しかしながら、患者 由来のサンプル中の特異的抗体の存在は、感染源に対する免疫応答の結果である 。

それ故、抗体生成の開始は、実際の感染後の、いわゆる“窓口期間（ｗｉｎｄｏ ｗ　ｐｅｒｌｏｄ　）　’をおいて遅れて起こる。この期間は、感染へと移行す る潜在的危険を表すものである。ウェスターンプロット解析によって行われる抗 原の直接的検出は、高性能の実験装置を必要とするため高価であり、日常的診断 、例えば、ＨＩＶ陽性検体探索のための血液銀行のスクリーニングには適当では ない。検体中のウィルス抗原を直接検出する簡単な方法は、今までのところ得ら れていない。

一般的に、これまで通常用いられて来たイムノアッセイ法は、洗練された装備の 臨床検査室及び熟練者を必要とするという事実が主な障害となっている。それ故 、安価で、非熟練者にも使用が容易で、しかも感度及び特異性のような高度な検 査性能を維持しているイムノアッセイ法の施行手段がめられている。

ＥＬＩＳＡのような異成分タイプのイムノアッセイにおいては、固相担体が用　 、いられる。検査すべき抗原は、固相担体に、ウシ血清アルブミンのような輸送 タンパク質との複合体として結合するか、あるいは、検体中に存在する抗原を捕 捉する抗原特異的抗体で固相担体を予め被覆しておくことによって結合する。し かしながら、これらの抗原結合操作は、イムノアッセイ法施行の際にステップが 増加することになり、分析に要する時間の延長と潜在的不正確の危険増大をもた らす。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡ投技法、溶液中のマーカー酵素と色素との反応による色調変化測 定に基づくので、感度には限りがある。さらに、ＥＬＩＳＡ法は、着色した溶液 を透過する光の検出に依存するので、光学的に不活性な担体のみが抗原結合に使 用し得る。透明なポリスチレンあるいはポリ塩化ビニール製で、検査すべき検体 を受容する複数の窪み、あるいはウェルを持つ°ミクロタイタープレート”が一 般にこの目的に用いられる。しかしながら、検体のこれら固相担体に対する親和 性には限りがあるので、抗原・抗体複合体が固相担体から剥がれ、その結果、シ グナルが減少することがある。更に、検出成分（抗体、酵素）が担体に非特異的 に結合して、その結果、非特異的反応を起こすことがある。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法の感度を、固相担体の透明性を維持しつつ、その結合特性を改 善することによってＥＬＩ　ＳＡ法の感度を増大する試みは、米国特許第４，９ ３３゜４１０号、４，１１９，５８９号、及び４，２１９．４１８号に記載され ている。

米国特許第４，２１０，４１８は、吸着、イオン結合、捕捉、あるいは更に好適 には共有結合によって抗原を結合する不活性タンパク質で担体を被覆することを 開示している。不活性タンパク質の付着を促進して、吸着を向上するために、担 体表面を溶媒、界面活性剤、酸、あるいは塩基を含む物質で処理してもよい。

イムノアッセイ法に現今用いられている他の担体には、ニトロセルロース、ナイ ロン、及び類似物質で作製された多孔質膜がある。しかしながら、これら疎水性 、多孔質の担体は、滴下された検体を拡散し、抗体ならびに検出系の他の成分と 非特異的に結合するという欠点がある。加えて、その疎水的性状のため洗浄して もこれらの非特異的に結合した物質を効果的に除けない。さらに、このタイプの 担体は、性質上むしろ脆弱で、取扱の障害となり、担体損傷の危険を増大する。

、　このような理由で、この多孔質タイプの担体はイムノアッセイ施行の日常操 作には不向きである。

従って、イムノアッセイ法による容易、迅速、且つ高感度の抗原検査のための手 段を提供することが本発明の目的である。

発明の開示 この目的は、検体中の抗原を検査するイムノアッセイ法において、ポリマー素材 からなり、少なくとも１個の活性化部分を持ち、その露出表面面積の増大によっ て前記活性化部分が提供される固相担体を利用することによって達成される。

本発明のもう１つの態様において、検体中の抗原を検査するイムノアッセイ法を 施行するための組合せ装置が提供される。この装置は、少なくとも１個の活性化 部分を持ち、前記活性化部分はその露出表面面積を増大することによって提供さ れるスティック状の固相担体、及び前記スティック上を滑べることが出来、且つ 、前記活性化部分を少なくとももう１つ持つことの出来るパネルから成っている 。

図の簡単な説明 図１は、本発明の１局面に従ってイムノアッセイ法に使用出来る固相担体の上面 図である。

図２は、図１に示されている固相担体を図１の線２−−２に沿って取った切断図 である。

図３は、本発明に従ってイムノアッセイ法に使用出来るスティック状の固相担体 からなる組合せ装置の透視図である。図３Ａは、組合せ装置の固相担体とパネル 部分を、図３Ｂは、パネル部分の拡大図を、また、図３０は、前記のスティック 収納に使用出来る容器を示す。

本発明の固相１ｕ体は、透明または不透明なポリマー素材から出来ている。好適 には、ポリマー素材は本質的に疎水性で多孔質であり、従って、検査すべき抗原 あるいはイムノアッセイ法に使用される他の反応物の結合を一層容品に制御する ことが出来る。例えば、適当なポリマー素材には、スチレン、エチレン、プロピ レン、ブタジェン、クロロブレン、塩化ビニール、アクリル酸をモノマー単位と して持つポリマー及び共重合体が含まれる。あるいは、素材は、ポリアミド、ポ リカーボネート、ポリエステル、ポリエーテル、ポリエポキシド、フルオロポリ マー、またはポリメラミンタイプのものである。統計的、交互、ブロック、ある いはグラフト共重合体のようないかなるタイプの共重合体も使用出来る。

さらに、ポリマーまたは共重合体の混合物、例えば上述の様な物質が本発明によ れば適切である。

共重合体及びポリマー混合物が好適である、それは、これらの物は、以下にさら に詳細に説明される様に、溶媒によって容易に活性化可能であるからである。

スチレンとブタジェン、あるいはスチレンとクロロブレンの共重合体製のポリマ ー素材、または、ポリスチレンとポリブタジェン、あるいは、ポリスチレンとク ロロブレンのポリマー混合物からなる固相担体の利用は特に好適である。

本発明に従って用いられる固相担体は、さらに色素、処理補助剤、安定化剤、架 橋試薬、加塑剤、軟化剤、充填材等の様なポリマー素材に通常加えられる添加剤 が含まれる。

本発明に従って用いられる固を目担体は、担体の露出表面面積の増大によって与 えられる少なくとも１個の活性化部分を持つ。この様にして、担体は抗原に対す る収容力及び親和性が改善され、その結果、結合はさらに安定性を増加する。

好適には、固相担体の活性化部分は担体表面を１種あるいはそれ以上の溶媒で処 理することによって提供される。好適な溶媒は、担体表面のポリマーマトリック スを部分的に溶解し、それによってポリマーマトリックスを開放する溶媒である 。これに関連して、ある溶媒は、共重合体あるいはポリマー混合物夫々の１つま たはそれ以上の他の成分よりも、むしろある共重合体またはあるポリマー混合物 の１つあるいはそれ以上の成分を溶解する可能性がある。このような作用を起こ す溶媒あるいは混合溶媒はいかなるものでも適当である。この目的に使用可能な 溶媒には、エーテル、エステル、アルコール、ケトン、アルデヒド、酸、塩基、 オレフィン、脂肪族（鎖状及び環状）炭化水素、芳香族炭化水素、ハロゲン化炭 化水素、および担体のポリマー素材を部分的に溶解する類似の物質が含まれる。

担体表面に適用された場合、溶媒は前記表面を粗くし、接触してくる検体に露出 され、結合に利用される担体の表面積を増大する傾向がある。溶媒はポリマーマ トリックスを分子レベルで開放するものと考えられている。溶媒による過酷な処 理は、担体表面を光の透過に対し不透明にする可能性がある。不透明な担体は、 検出手段として沈降性色素を用いイムノアッセイ法によって抗原を検出する場合 には望ましいこともある。しかしながら、イムノアッセイ法において、蛍光検出 系のような光透過検出系が抗原検査に用いられる場合、溶媒処理を制御して十分 な透明性を得ることも可能である。

溶媒による活性化処理は、担体あるいはその活性化すべき部分を、担体表面を粗 くしてポリマーマトリックスを開放するのに十分な期間、ある溶媒に浸すか、漬 けることによって行うことが出来る。代わりに、溶媒は吹付け、塗布、あるいは 他の方法で担体に適用することも出来る。活性化に要する時間は、使用される特 定の溶媒及びポリマー系によって変わってくる。大抵の適用においては、活性化 は約１分以内に達成される。制限はあるものの、溶媒処理を長くすると結合特性 の向上した基質が得られる傾向がある。

固相担体として用いるのに特に好適なポリマー素材は、活性化作用に対して夫々 相違した変化をする２つ以上の異なったポリマー成分を持つ共重合体またはポリ マー混合物である。これは、ポリマー素材の一つ以上の成分が、ポリマー素材の 他の成分よりも溶媒に溶かされ昌いことを意味する。例えば、溶媒アセトンは、 ポリスチレンを速やかに溶解するが、ブタジェンあるいはクロロプレンはそれ程 容易には溶かさない。従って、スチレンとブタジェン、あるいはスチレンとクロ ロブレンの共重合体、または、ポリスチレンとポリブタジェン、あるいはポリス チレンとポリクロロプレンのポリマー混合物がアセトンで処理される場合、ポリ スチレン成分は容易に溶解する一方、ブタジェンあるいはクロロブレン成分は溶 解しない。この様にして、固相担体は、活性化部分が分子レベルで粗くなるが、 一方、固相担体の内部のみならず表面の非活性化部分も均一性と非多孔性を維持 する。

表１は、幾つかのポリマー素材とこれらの種々の溶媒中におけるそれらの溶解性 を示す。共重合体及びそれらの特徴の一般的記載については、読者はＯ，Ｗ。

Ｗｅｂｓｔｅｒ、　’５ｃｉｅｎｃｅ”、Ｖｏｌ、２５１．　Ｉ）Ｉ）、８８７ −９８　（１９９１）及びＦ、Ｓ、Ｂａｔｅｓ、　”５ｃｉｅｎｃｅ”、Ｖｏｌ 、　２５１．　ｐｐ、８９８−９０５　（１９９１）を参照のこと。両者とも本 願に組込まれ、その一部となっている。

Ｗ−膨潤性 Ｓ−可溶 代わりに、研削、研磨の類いの様な機械的手段によって、あるｔ）は予めサンド ブラストにより粗くした型に担体を注入塑造することによって、本発明１こ使用 する担体の活性化部分の表面を活性化することもまた可能である。

本発明に従って用いられる担体は、ポリマー素材から周知の方法、例え（ｆ、注 入成型、圧縮成型、吹込み成型、押出し成型等によって形成されるが、注入成型 が好適である。

固相担体は、検体中の抗体検査のためのイムノアッセイ法施行に適切な０力１な る形状にも成型すること力呵能である。それ故、固相担体はステイ・ツク状、ス トリップ状、ロッド状、プレート状、ディスク状等に成型されることがある。特 に、多数の検体に対するイムノアッセイを一度に行うためには、使用される固相 担体は、複数の活性化部分を持ち、各活性化部分が個々の検体のア・ソセイ１こ 用０られる。例えば、固相担体が分画区分を持つディスクあるいはプレートの形 を取り、各分画区分は固相担体の活性化部分及び非活性化部分を持つことがある 。

図１．２及び３に示されている１つ、あるいはそれ以上の窪みが検査すべき検体 （サンプル）を受容するのに用いられ、一方、１つ、あるいはそれ以上の他の窪 みが、検体中の夫々の抗原を検査するためのイムノアツセイにおける正の対照と して既知量の抗原を固定するのに使用される。少なくとも１つの窪み力（、負の 対照としてブランク検体のために用いられる。

好適には、固を目担体の活性化部分に相当する前記窪みは、固相担体の非活性化 部分によって隔離されている。これは、例えば、活性化部分を形成するため１こ 夫々の窪みのみを化学的あるいは機械的に処理し、固相担体の残り部分は活性化 処理しないか、あるいは固相担体の全表面を活性化し、固相担体の上表面を研き 、それによって窪みは活性型に残しておくことによって達成される。この処理１ よ、検体が非活性化部分に入れられた場合、検体の拡散防止を助長し、１つの窪 み内の検体に隣接する窪み内の検体が混入することを阻止する。

窪みの深さは普通重要ではないが、抗原検査のイムノアッセイに用いられる検出 系次第である範囲内に選ばれることがある。例えば、検出にグレイレベル走査を 用いると、窪みの壁がその内部に影を投じてグレイレベル解析に干渉するので、 窪みの深さにある制限のあることは、この分野の専門家には理解されよう。この 場合、窪みは深さ約０．００８インチ（０，２ｍｍ）あるいはそれ以下に保ち、 影が検出に干渉しないようにする。当然、この配慮は窪みの直径が増大するにつ れてそれ程重要ではなくなってくる。

同様に、窪みは、望ましいものの、固４０担体の活性化部分提供に必ずしも必要 ではない。それは、固相担体の非活性化部分あるいは研磨表面が、活性化部分に 入れられた検体（サンプル）の拡散に対して十分な防止壁となるからであること は理解されよう。この様にして、検体は固）口担体の活性化部分内で拡散し結合 するが、非活性化部分上では凝集あるいは粒子状となる傾向がある。

図１乃至３は、本発明に従って抗原を検査するイムノアッセイ法施行に極めて適 切な手段である固相担体の例である。

図１及び２には、複数の窪み１２（この例では、総計９６個の窪み）を持ち、検 査すべき各検体が他の検体（サンプル）から物理的に隔離され得る本質的に平坦 なプレート１０の形に成型された固相担体が示されている。

図３は、本発明の好適な１実施態様の図示である。図３Ａには、スティック状固 シ目担体３０及びパネル３１を組立てたものが示されている。パネル３１と同じ くスティック状支持体３０も夫々、前述の様に露出表面積を増大することによっ て備えられた活性化部分３２ａと３２ｂを持つ。前記活性化部分３２ａ及び３２ ｂは窪みの形をしているが、他の形を取ってもよい。パネル３１はスティック３ ０上をスライドすることが出来る。スティック３３に満３１が付けられ、これが パネルを前記の溝に固定して止める役目をする。パネルの溝への固定は、例えば 、パネル内面とスティック表面の間に備えられたビンによって達成することが出 来る。パネル３１は支持体スティック３０から取外し可能であることが望ましい 。

スティックから取外された場合、パネル３１はスティックとは別個に用いられ、 あるいは処理されることが可能である。

この方法によって、窪み３２ｂは、窪み３２から離しておいても、あるいは近付 けて固定してもよい。夫々の窪み内に固定された夫々の検体くサンプル）は個々 に、あるいはまとめて処理されてもよい。

スティック３０には、更にこのスティックを取扱うための端末部３４がある。

その上、パネル３１は、例えば、プラスティックシート、あるいは金属箔の保護 層を備えることがある。保護カバーは、パネルに固定あるいは接着して、パネル ３１の活性化部分３２ｂを確実に密封し覆うことが望ましい。これは、更に、図 ３Ｂのパネル３１の拡大図に図示されている。図３Ｂは、また、パネルがスティ ック上をスライド出来る一方、スティックへの安全な付着を保証するスライディ ングガイドを示している。

図３０は、本発明に従い、組合せ装置で好んで用いられる収容器３６を示す。

収容器３６は、スティック３０の貯蔵のために用いられてもよい。この収容器に は、活性化部分に付着した検体を固定するために、パラホルムアルデヒド、ゲル タールアルデヒドの類いの様な固定化剤を入れてもよい。更に、同様な収容器は 、゛　イムノアッセイ法におけるインキュベーション反応を施行するためにも有 用である。スティック３０は収容器３６に適度にはまって、その頭端部３４と漏 出防止ンールと共に１単位を形成する。

図３に示されている様な、この固相担体は、ヒトの唾液あるいは他の粘液性分泌 物由来の検体中に存在する抗原の検査に特に有用である。図３から明らかなよう に、ヒトの唾液由来の検体は、舐めることによって直接窪み３２ａに塗ってもよ い。従って、活性化部３２ａを含むスティックの部分は、舌パネル（楕円型ウェ ル）とし、一方、パネル３１は対照パネルとしてもよい。対照パネルとは、検査 すべき抗原検体で、予め決められた量の抗原を含むもの（正対照として）、ある いは、抗原を含まないブランク検体（負対照として）を受容するパネルのことで ある。舐める段階では、パネル３１は、汚染されないように隔離されるか、ある いは取外される。次いで、対照パネルは溝にはめられて、組合せ装置はイムノア ッセイに使用準備が整う。

舌パネル、スティック３０及びパネル３１、あるいは組合せ装置全体は、イムノ アッセイに使用に先立ち滅菌する方がよい。

図３のスティック及び／またはパネルが、活性化ポリマー素材部分をさらに持つ ことは理解されるであろう。例えば、スティック３０は、検査検体をさらに受容 するための窪みを増加し、パネル３１は、さらに対照あるいはブランク検体を受 容するための窪みを増加することがあり得る。例えば、パネル３１は、正対照の ための窪み１つと、負対照のための窪み１つを持つことがある。

更に、パネル上の満３３、端末部３４、保護カバー３５、及び収容器３６は、組 合せ装置から除外されることがある。これは、これらの手段は、本発明の適用に は必ずしし必要でないからである。

前述の固相担体は、本発明に従い、検体中の抗原の検査技術者には周知のいかな るイムノアッセイにも用いることが出来る。本発明による固相担体の使用はまた 、例えば、第一、及び第二抗体反応の使用、ならびにビオチン／アビジン、ある いはビオチン／ストレプトアビジン増幅系の使用のようなイムノアッセイ検出系 の感度増大に用いられる完全な増幅検出系の完全セットの応用を可能にする。

抗原検出に酵素イムノアッセイを用いる場合、本質的に水に不溶の色素が生成さ れるようになる検出系が望ましい。これら水に不溶の色素は、抗原が存在する担 体表面に沈着する。これによって、肉眼による検査の評価が容易になり、あるい は、グレイレベル走査のような検出系の自動化を可能にする。

適当な酵素／沈降性色素系は、この分野の熟練者には良く知られている。好適な 沈降性色素には、ナフトール−ＡＳ−Ｂ　Ｉリン酸／新フクシン（ＮＡＢＰＮＰ ）、３′３−ジアミノベンジジン、４−クロロ−１−ナフトール、９−アミノ− ９−エチルカルバゾールがある。

勿論、抗原検出のだめの他の周知のイムノアッセイ法もまた本発明の実行に使用 することが出来る。例えば、蛍光イムノアッセイあるいはラジオイムノアツセイ を用いることも可能である。放射性検出法に対しては、オートラジオグラフィー 及びシンチレーション計測が検出目的に使用される。シンチレーション計測に対 しては、固定化放射性検体を運ぶ担体をキシレン、トルエン、ベンゼン等の様な ンンチレーション溶液に溶かすことが出来る。

本発明の実行に当っては、検査すべき抗原が乳化剤の非存在下に固参目担体の活 性化部分に結合して、抗原検出のためのイムノアッセイ法の以後の段階が、界面 活性剤のような乳化剤の存在下に行われることが望ましい。この操作は、抗原の 固相担体への強固な結合を保証するが、イムノアッセイの検出試薬の担体への結 合を大幅に阻害して、バックグランド染色を低減する。適当な乳化剤には、トリ トンＸ−１００（オクチル　フェノキシ　ポリエトキシエタノール）、ツイーン ２０（ポリエチレンソルビタン）　、ＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナトリウム）、非 イオン性、陰イオン性あるいは陽イオン性テンシト、硼酸塩及び石鹸がある。

一旦、抗原検査のイムノアッセイ法において、固相担体の活性化部分に検体（サ ンプル）が適用された後、固相担体への結合を高め、あるいは検体を固定するた めに検体はさらに処理される。これは、担体を紫外線に露出し、あるいは、担体 を固定剤で処理することによって達成される。好適な固定剤は、ホルムアルデヒ ド、ゲルタールアルデヒド、ピクリン酸、及びアクロレイン等の様な検体及び／ あるいはポリマーマトリックス内に化学的架橋を導入するものである。検体の固 定はまた感染性検体が検査される場合にも望ましい。

前記の固相担体は、所望されるいかなる抗原を検査するイムノアッセイ法にも使 用出来る。抗原はモノエピトープ性あるいはポリエピトープ性のこともある。

、１＝ｉなイムノアッセイによって検出されるべき抗原の例には、ペプチド、タ ンパク質、ホルモン、生物アミン、核酸、細胞表面抗原、−殺生物学的因子、薬 物、叉病マーカー、環境由来抗原、細菌、黴、寄生体等の様な微生物由来の抗原 がある。

専門家には、抗原自体が、抗原決定基結合部位を持つので、イムノアッセイ法に よって検出可能な抗原自体となり得ることも理解されよう。

イムノアッセイ法によって抗原検体が検査され得る検体は無限である。更に、所 望すれば、検体を直接固相担体に適用してもよいということは、前記固相担体使 用の明確な利点である。前記の固相担体を使用すると、その結果、イムノアッセ イ検出法において高感度及び低バツクグランドノイズとなるので、精製、分離、 微生物の培養等のような検体の前処理は一般的に不必要である。このことは、さ らに、迅速で容品なイムノアッセイの実行実現に寄与する一方、感度及び特異性 のような抗原のイムノアッセイ検出系の重要な特色を提供する。

しかしながら、特別な場合には、感染性病原体を含む検体の固定段階、あるいは 、もし固相担体が検体成分で飽和されているならば、検体の希釈段階の様な特別 の場合には、監査すべき検体の前処理が適当であろう。

前述のような夫々の抗原成分と担体表面との強力な疎水性相互作用に基づく多種 類の抗原類に対する固相担体の膨大な結合能及び親和性は、結果として、全イム ノアッセイ操作に対して抗原の非常に強固な結合あるいは固定化をもたらす。

従って、イムノアッセイ法の段階、例えば、洗浄段階では、さらに特異的シグナ ルを助長し、また、バックグランドノイズを低減するために厳しい条件が課せら れる。本発明の実行に必ずしも必要ではないが、検体の適用後、担体のａＭ結合 部位を、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリーＬ−リジン、グリシン 等で飽和することがある。

好適には、検体を固相担体に適用後のイムノアッセイ法のすべての段階は、１ム ノアツセイの検出用成分の固相担体への非特異的結合をさらに軽減し、それによ ってバックグランド染色を低減するために、前に説明した様に、乳化剤の存在ド に執り行なわれる。

とりわけ、大集団のヒトの、特に開発途上国における、抗原性マーカーに対する 、あるいは血液銀行のスクリーニングに対する迅速なスクリーニングテストを考 慮すると、検体はヒトの血清由来であることが望ましい。血清由来の検体は、も し、定量分析がめられるならば、検査すべき抗原の定量的特性決定に特に有用で ある。図１及び２に示される支持体型は、このような目的に特に適切である。

他の非常に適当なイムノアッセイ検体の由来源は、人体の分泌物あるいは排泄物 由来の検体、特に唾液、腟あるいは前立腺分泌物、及び涙液の様な特に粘液性分 泌物である。分泌物あるいは排泄物由来の検体、特に唾液由来の検体は、検査す べき抗原の定性的特性決定に好んで用いられる。図３に示される様な組合せ装置 及び支持体は、前にさらに詳しく説明されたように、ヒト唾液に存在する抗原の 定性試験に特によく適合している。

勿論、検体はまた、動物起源のものでもよい。

本発明に基づく固相担体の使用は、ウィルス抗原の検出に特に適切である。特に 、唾液検体は本発明に従って直接使用出来るので、ウィルス感染の診断は、日常 検査で特に吟味し易い。これは、ある種のヒトウィルス由来の抗原性物質は、ま た、他の体液及び組織以外に、ヒトの唾液にも現れるからである。これは、例え ば、肝炎Ｂ型ウィルス（ＨＢ　Ｖ）及び肝炎Ｃ型ウィルス（ＨＣＶ）、ヒトパピ ローマウィルス（ＲＰＶ）、エプスタイン・バールウィルス（ＥＢＶ）、サイト メガロウィルス（ＣＭＶ）の様な肝炎の型ウィルス、及び、最も興味あることに ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）について事実である。

以下の特異例は、本発明に従う固相担体使用の例示であり、また、発明が実際に 行われる幾つかの方法を単に示すためにのみ提供されるものである。

注入塑形されたポリスチレンとポリブタジェンのポリマー混合換装で、キシレン 処理によって属性化された固相担体のストリップ片が、ヒト唾液中のＨＩＶ抗原 Ｐ　１．７の存在に対するイムノアッセイに用いられた。通常の血液検査により 血清のＨＩＶ反応陽性であると判明している人が空腹状態でストリップ片の活性 化部分を舐めて来た。固を目担体の別の活性化部分には、精製ＨＩＶ表面タンパ ク質Ｐ　１７が正の対照として固ｔＣ＋担体上に固定されていた。固相担体は、 ＰＩ３に対する単クローン抗体を０．９％ＮａＣ１及び１％トリトンＸ−１００ （ＰＢＳＴ緩衝液）を含む０，１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７，２の溶液で５００倍 に希釈したものと室温で４時間インキュベートした。次いで、ストリップ片は、 ＰＢＳＴ緩衝液で洗浄してから、ＰＢＳＴ緩衝液で１００倍に希釈したペルオキ シダーゼと複合した抗マウスＩｇＧで処理した。最後に、検体は、ストリップ片 を０．０３％のＨ２Ｏ２を含む１００ｍ１のＰＢＳＴ中に１２ｍｇのジアミノベ ンジジンを溶かした液で処理して染色した。

正対瞭検体と同じく検体も陽性結果を示し、そうでなければ白色のストリップ片 上に褐色斑点として現れた。

比較例１ 例１に記載の、ヒト唾液中のＨＩＶＰ１７抗原に対するイムノアッセイであるが 、通常のＨＩＶ検査で血〆ｎのＨＩＶ反応陰性であると判明している家系調査の 発端者の唾液由来の検体をストリップ片の活性化部分に適用した。

検体が固定された固相担体の活性化部分は、染色反応後も白色のままであった。

ポリスチレンとポリクロロプレンのポリマー混合物製固相担体で総数９６個の窪 みを持つプレート状に成型された固１０担体を、ヒト血清検体中のＨＩＶ表面抗 原Ｐ２４検出のためのイムノアッセイに使用した。通常の検査により血清のＨ１ ■反応陽性と判明しているいる人々の血清検体、ならびに検体採取時には血清反 応陰性と出たが、その後ある時点で、血清反応陽性に転じてＡＩＤＳ罹患と判明 した人々の血清の外に、通常の検査により血清のＨＩＶ反応陽性と判明している 人々の血清検体を含む回顧解析に適用した。連続希釈したＰ２４が標準検体とな った。

検体の結合は１０分内に達成された。次いで、検体を０．９％ＮａＣ１及び２％ トリトンＸ−１００（ＰＢＳＴ緩衝液）を含むリン酸緩衝食塩水、ｐＨ７，２で 洗浄した。その後、プレートを、Ｐ２４に対する単クローン抗体をＰＢＳＴ緩衝 液で５００倍に希釈したもので４時間処理し、次いでＰＢＳＴ緩衝液で洗浄した 。次いで、検体を、第一抗体の動物種に対する第二抗体（抗マウスＩｇＧ）をペ ルオキシダーゼで標識し、ＰＢＳＴ緩衝液で１００倍に希釈したものと室温で３ ０分間反応させた。ＰＢＳＴ緩衝液で洗ｆｐ後、検体は、固相担体を０．３％の Ｈ２Ｏ２を含むＰＢＳＴ緩衝液１００ｍ１に１２ｍｇのジアミノベンジジンを溶 かした溶液で３分間処理して染色した。最終的に検体は、肉眼観察に基づき定性 的に、あるいは通常のグレイレベル走査系により定量的に評価された。

各血清反応陽性の検体のみならず、あとでＡＩＤＳ罹患の人々から採取した血清 反応陰性の検体も、肉眼観察あるいはグレイレベルひと走査により褐色沈降物と して検出される陽性シグナルを示すことが判明した。Ｐ２４の連続希釈の標準曲 線を定量化に用いた。固相担体の窪みで、陰性検体を固定したものは、バックグ ランド染色が無（、白色のままであった。

例３ 例２と同様に、ヒト血清検体からの肝炎Ｃ型ウィルスのイムノアッセイに固相ｖ １体を使用した。肝炎Ｃ型抗原と反応するため、肝炎Ｃ型特異的抗体をＰＢＳＴ Ｊ衝液で５００倍に希釈して用い、合成参照抗原を連続希釈して標準曲線作成に １“Ｊｊ用した。

ここでもまた、陽性検体は褐色沈降物によって容易に検出されたが、陰性検体は バックグランド染色を示さなかった。

前記の例から明らかな様に、本発明に従って固相担体を使用すると、安価な検出 系を使い、実行容易なイムノアッセイの適用が可能となる。これらの特性は、多 数の検体中の抗原のスクリーニングにおける迅速操作の必要条件であり、発展途 上国における適用に対する、また未熟練者のための自製検査としての可能性を使 用される同相担体の特性は、イムノアッセイに対し高検出感度を保評する。

最も注目すべきは、本発明に従って固相担体を使用すると、ウィルス感染者の免 疫応答に基づく通常適用される日常的診断系では、ただ陰性結果のみを与える潜 伏期間でさえ、ウィルス性抗原の信頼のおける検出を可能にすることである。

へ− 一 匡 ｈｆｉ正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の７第１項）平成　６年 　４月２０日

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．検体中の抗原を検査するイムノアッセイ法において、ポリマー素材製で、少 なくとも一個の活性化部分を持ち、前記活性化部分が露出表面面積を増大するこ とにとによって提供される固相担体を利用することを特徴とする。
2. ２．請求項１の記載に従う利用であって、ポリマー素材がポリマーあるいはポリ マー混合物であることを特徴とする。
3. ３．請求項２の記載に従う利用であって、前記ポリマー素材がスチレンとブタジ エン、あるいはスチレンとクロロプレンの共重合体またはポリスチレンとポリブ タジエン、あるいはポリスチレンとポリクロロブレンのポリマー混合物であるこ とを特徴とする。
4. ４．請求項１乃至３のいずれかの記載に従う利用であって、担体の前記部分が溶 媒によって活性化されていることを特徴とする。
5. ５．請求項４の記載に従う利用であって、前記溶媒がエーテル、エステル、アル コール、ケトン、アルデヒド、酸、塩基、オレフィン、脂肪族あるいは芳香族炭 化水素、及びハロゲン化炭化水素からなるグループから選択されることを特徴と する。
6. ６．請求項１乃至５のいずれかの記載に従う利用であって、固相担体が更に少な くとも１個の非活性化部分を持ち、前記活性化部分及び非活性化部分が固相担体 の区画区分を形成することを特徴とする。
7. ７．請求項１乃至６のいずれかの記載に従う利用であって、固相担体がスティッ ク、プレート、あるいはディスクの形をしていることを特徴とする。
8. ８．請求項１乃至７のいずれかの記載に従う利用であって、固相担体が窪みの形 をした活性化部分を持つことを特徴とする。
9. ９．前述の請求項のいずれかの記載に従う利用であって、前記抗原がウイルス性 抗原であることを特徴とする。
10. １０．前述の請求項のいずれかの記載に従う利用であって、前記検体がヒトある いは動物の血清であることを特徴とする。
11. １１．請求項１乃至９のいずれかの記載に従う利用であって、前記検体がヒトあ るいは動物の体の分泌物または排泄物由来の検体であることを特徴とする。
12. １２．請求項１１に記載に従う利用であって、前記分泌物が唾液、腟または前立 腺分泌物、あるいは涙液であることを特徴とする。
13. １３．請求項１０乃至１２のいずれかの記載に従う利用であって、前記検体が固 相担体に直接適用されることを特徴とする。
14. １４．検体中の抗原を検査するイムノアッセイ法施行のための組合せ装置が、ス ティック状の固相担体が少なくとも１個の活性化部分を持ち、前記活性化部分は 、その露出表面面積を増大することによって提供され、また、スティック上を滑 ることが出来、少なくとももう１つの前記活性化部分を少なくとももう１つ持つ パネルから成ることを特徴とする。
15. １５．請求項１４の記載に従う組合せ装置であって、スティックが前記パネルを 取り付ける溝を持つことを特徴とする。
16. １６．請求項１４あるいは１５の記載に従う組合せ装置であって、前記パネルが 前記支持体から取り外し可能であることを特徴とする。
17. １７．請求項１４乃至１６のいずれかの記載に従う紐合せ装置であって、パネル がフイルムで被覆されていることを特徴とする。
18. １８．請求項１４乃至１７のいずれかの記載に従う組合せ装置であって、さらに 、スティックを収納するための収納器を持つことを特徴とする。
19. １９．請求項１８の記載に従う組合せ装置であって、前記収納器が検体固定のた めの固定剤を含むことを特徴とする。