CN101501499A - 使用与多孔膜偶联的分析物传感分子测定分析物浓度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及测定样品中分析物浓度和/或分析物与分析物传感分子的结合动力学的方法。为此目的，本发明依靠检测分析物与分析物传感分子的相互作用，其中所述分析物传感分子以微阵列形式物理吸附到固体多孔支持物上。在优选的实施方式中，该方法可以重复循环运行。

Description

使用与多孔膜偶联的分析物传感分子测定分析物浓度的方法

发明领域

本发明涉及测定样品中分析物浓度的方法，其依靠检测分析物和分析物传感分子之间的复合物，其中所述分析物传感分子附着到固体多孔支持物上。

本发明还涉及测定分析物与分析物传感分子实时结合动力学的方法，其通过测定分析物与分析物传感分子的结合效率，其中所述分析物传感分子附着到固体多孔支持物上。

发明背景

分子相互作用的检测构成了许多诊断测试以及一般测试程序中的核心要素之一。因此，通常通过检测分析物和分析物传感分子之间的相互作用测定含有多种组分的样品中特异分析物的存在，其中已知所述分析物传感分子仅对该分析物是特异性的。

同时，对高通量测试检验有浓厚的兴趣，其能够平行地检测样品中的多种分析物。

使用所谓的微阵列，这种高通量测试是可能的，所述微阵列是已经在多种化学和生物化学应用中使用的微型检测装置。

最初，开发微阵列技术用于检测特异性核酸-核酸相互作用。核酸比例如蛋白质和抗体要容易处理得多，这个事实解释了优先使用微阵列用于检测基于核酸的相互作用。

然而，同时，已经开发了微阵列格式，其也是针对能够高通量平行测试蛋白质-蛋白质相互作用或者蛋白质-DNA相互作用。

在大多数基于微阵列的测试系统中，通常分析物传感分子(捕获分子)被固定在阵列上的规定位置处，随后将阵列与含有待检测分析物的样品温育。在某些处理步骤之后，通过例如使用荧光标记物显示分析物与各自分析物传感分子之间的相互作用。

通常，微阵列基质使用盖玻片，因为它们能够容易固定核苷酸序列。然而，考虑到蛋白质复杂三维构型的确认以及它们变化的疏水或亲水特征，盖玻片与其他固体基质对于蛋白质固定化不是理想的。通常玻璃载玻片已经被涂覆，以便它们能够固定核酸和/或蛋白质。

此外，分析物传感蛋白质和分析物之间的有效相互作用受到传统的微阵列基质的阻碍，因为结合主要依靠在溶液中扩散到阵列的各自点上。为了解决这些问题，最近开发了所谓的流通式(flow-through)微阵列芯片。

在这种途径中，基于DNA或蛋白质的探针被固定在例如化学修饰的多孔硅晶片上，接着与样品进行温育。由于基质的多孔特征，能够更容易除去多余的样品以及任选的清洗溶液。这种流通式装置的例子被描述在例如国际专利申请WO 03/005013中。

现有技术同样仍然主要描述了检测样品中分析物存在的方法，没有关注例如测定样品中分析物的浓度，或者分析物与分析物传感分子的结合动力学。

发明目的和概述

本发明的一个目的是提供测定待测试的样品中至少一种分析物浓度的方法。

本发明的另一个目的是提供一种方法，其能够测定样品中分析物与分析物传感分子之间的实时结合动力学。

为了达到上述目的，提供了如在独立权利要求1中所限定的检测方法。

根据本发明的一个示范性实施方式，提供了检测至少一种样品中至少一种分析物的方法，该方法包括下列步骤：

a)提供至少一种固体多孔支持物，其上被布置了至少一种分析物传感分子；

b)将所述支持物与至少一种含有至少一种分析物的样品接触；

c)任选地使用溶液清洗所述至少一种支持物，其中所述溶液能够除去与所述支持物和/或所述分析物传感分子非特异性结合的样品组分；

d)检测所述至少一种分析物传感分子与至少一种分析物之间的特异性相互作用；

e)测定所述至少一种样品中所述至少一种分析物的浓度。

在本发明的另一个示范性实施方式中，可以随时间变化测定浓度。在后面的实施方式中，在检测分析物与分析物传感分子之间的特异性相互作用时随时间变化所产生的信号的发展，可以用于测量所述分析物与所述分析物传感分子的实时结合动力学。根据分析物和分析物传感分子的性质，该实施方式能够例如鉴定和辨别化合物库的小分子与基于治疗性蛋白质的靶之间的结合。

在本发明的一个优选实施方式中，固体多孔基质可以是选自包括由例如尼龙、硝酸纤维素、PVDF或聚醚砜所制成的膜的组的膜。

本发明一个特别令人感兴趣的方面涉及一种实施方式，其中前面所提到的步骤b)-d)或者这些步骤中的任何步骤被重复多次。此外，上述方法的这种重复操作具有下列优点：能够比使用之前已知的程序更快和更高可靠性地测定分析物分子的浓度。如果以重复方式将本发明的该实施方式用于测定分析物与分析物传感分子的实时结合动力学，则也具有该优点。

本发明的另一个实施方式涉及使用上述的固体多孔基质进行该方法，其中将大量分析物传感分子以微阵列的形式布置在所述多孔基质上。所述固体多孔基质上已知分析物传感分子的有序配置以及后续与样品的温育能够平行地测定大量不同分析物的浓度，这进一步有助于本发明方法的速度和效率。同样，测定实时动力学也一样。也可以通过重复步骤b)-d)多次以重复的方式-运行本发明的该实施方式。

在本发明的某些实施方式中，分析物传感分子将是基于蛋白质的化合物例如抗体、肽、半抗原、适体、蛋白质或(细胞表面)受体。

在本发明的另一个实施方式中，可以使用与至少一种分析物连接和/或与至少一种分析物传感分子连接的可检测标记物进行该方法，以检测分析物与分析物传感分子之间的相互作用。

如果可检测标记物是例如荧光标记物，则这也会有助于所要求保护的测定样品中分析物的浓度和/或实时结合动力学的方法的容易、效率和速度。

在本发明的一个实施方式中，分析物传感分子可以通过化学连接剂共价连接到支持物上。

附图说明

图1显示印制要求的示意布置图，用于将抗体印制为分析物传感分子。将大量不同的抗体印制在硝酸纤维素膜上。将这些抗体通过物理吸附而吸附到膜上。含有Cy5标记的抗体的点作为内部校准标准，并用于固定网格。

图2显示测量图1所示意描述的微阵列的校准标准。在刚刚印制之后拍照。可以精细调节软件的两个变量以得到最佳的图像，即电流和闪光长度(flash length)。在这种情况中，电流是变化的。在50mA的电流下，低浓度的内部校准是不可见的，这说明输出低信号。然而，当电流提高到127.5mA时，可以见到低浓度的内部校准，这说明该电流是可以使用的。

图3显示在图2所描述的微阵列与含有100nM兔抗小鼠Cy5标记的抗体进行温育的实验的照片。不同的照片代表经膜循环样品(1-8次)之后所获得的信号。

图4涉及与图2和3相同的实验。不同的照片代表在循环5、6、7和8之后的信号。

图5涉及与图2、3和4相同的实验。上图显示在循环8之后没有清洗微阵列所获得的信号。下图显示相同微阵列在使用PBS.7.4，0.05％吐温20清洗后的信号。

图6显示另一个微阵列印制布置图，其在实验2中被用于监控抗原C-反应性蛋白(CRP)与肿瘤坏死因子a(TNFa)的结合。

图7显示在印制捕获抗体之后实验2的微阵列。

图8显示浓度为100nM的所检测抗原CRP的信号强度。循环数指重复施加“新鲜”链霉素标记Cy5。“10+w”代表在最后的循环之后包括清洗步骤。

图9显示没有加入抗原的对照的结果。

图10显示在图8的基础上所计算的信噪比。

图11显示在实验3中所使用的另一个微阵列印制布置图。

图12显示在印制捕获抗体之后实验3的微阵列。

图13显示CRP和标记物Alexa647和Cy5的经标准化的强度。

图14显示TNFa和标记物Alexa647和Cy5的经标准化的强度。

图15显示依赖重复循环的CRP动力学检测。

图16显示依赖重复循环的TNFa动力学检测。

图17显示实验4的检测原理。

图18显示在实验4中使用的另一个微阵列印制布置图。

图19显示实验4的分析物结合经标准化的信号强度。

发明详述

在一个实施方式中，本发明涉及检测至少一种样品中至少一种分析物的方法，该方法包括下列步骤：

a)提供至少一种固体多孔支持物，其上被布置了至少一种分析物传感分子；

b)将所述支持物与至少一种含有至少一种分析物的样品接触；

c)任选地使用溶液清洗所述至少一种支持物，其中所述溶液能够除去与所述支持物和/或所述分析物传感分子非特异性结合的样品组分；

d)检测所述至少一种分析物传感分子与所述至少一种分析物之间的特异性相互作用；

e)测定所述至少一种样品中所述至少一种分析物的浓度。

过去，测定样品中分析物的方法主要针对能够决定是否在样品中存在某种化合物。然而，没有公开下列方法，即：结合到固体多孔支持物上的分析物传感分子与样品接触，以检测分析物传感分子与样品中分析物之间的特异性相互作用，以后续使用指示分析传感分子和分析物之间相互作用的信号，测定样品中分析物的浓度。

可以用于本发明的支持物是固体和多孔的。用于本发明目的术语“多孔”的意思是基质对流体具有充分的可透过性以使流体可以通过所述基质。在优选的实施方式中，基质是多孔的，其能够通过施加低到中度超压而使流体从其通过。

流体可以包括溶液，分散液，悬浮液，乳化液，体液例如血液、血浆、尿等。流体或流体样品还可以包括例如来自海洋、湖泊、河流等的环境样品。

为了使得流体能够通过膜内的孔，为了本发明的目的，术语“多孔”因此通常涉及包含直径为0.1-1μm 0.2-0.8μm、优选0.3-0.7μm和0.4-0.6μm(平均)的孔的基质。特别优选的孔度为0.45μm。

此外，根据本发明，固体多孔基质不仅具有前述功能的孔，而且通常尺寸显示了孔隙度数值即开孔体积和膜材料之间的比例为20-80％之间。

当然，可以用于本发明目的基质是本领域技术人员已知的，本领域技术人员能够理解其中这些基质可以从聚合物材料、天然或人工纤维、硅树脂、过滤材料、膜和其复合材料制成。根据本发明的固体多孔基质不可以是由氧化铝形成。

当然，可以将固体支持物制成各种形状和尺寸，这取决于特定的应用。例子包括平板、薄片、盘、薄膜、线、点等。优选但不是必须的形状是具有平坦的平面例如优选能够通过自动诊断系统处理的膜、过滤器或微孔板。

优选的实施方式将使用多孔膜作为固体支持物。这些膜可以是由尼龙、硝酸纤维素、PVDF或聚醚砜所制成的。

这些膜可以是根据商品名Protran、Ultrabind、Immunodyne、Hybond和Biodyne通过商业渠道获得的。可从Pall得到的由尼龙加固的硝酸纤维素构成的Protran膜是特别优选的。

尺度可以变化，但是在一个实施方式中，厚度在0.1-15mm之间，在0.2-12mm之间，在0.33-11mm之间，在0.4-10mm之间，在1-10mm之间，在4-9mm之间或大约8mm和/或孔度为0.1-1μm，在0.2和0.8μm之间，0.3和0.7μm之间，以及0.4-0.6μm是优选的。如果膜是例如前述带负电荷的尼龙膜之一，则也是可以利用的。

在本发明中可以使用的分析物传感分子是能够以确立功能的方式被布置在固体多孔支持物上，这意味着在被布置在基质上时，分析物传感分子保持特异地与通常被指定为分析物的靶结构相互作用的能力。

如果含有各种分析物的样品与分析物传感分子温育，则优选分析物传感分子将与分析物相互作用，这是特异性的以便并且因此导致能够后续被检测的特异性相互作用。

可以用于本发明目的的分析物传感分子，可以是蛋白质、酶、受体、配体、抗原、半抗原、细胞、细胞片段、小分子、适体和抗体。分析传感分子不可以是核酸。

在优选的实施方式中，本发明的分析物传感分子是基于蛋白质的分析物传感分子。这些优选的分析物传感分子包括蛋白质、受体、抗体等。在一个实施方式中，分析物传感分子是已知与各自抗原分析物特异性结合的抗体。

用作分析物传感分子的抗体可以是任何来源的，包括小鼠、人、大鼠、鸡、绵羊、山羊等，并包括本领域中公知的所有抗体类型例如单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、F(ab)、camel抗体、纳米抗体(nanobodies)等。

其中在Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1988(例如第17页)中可以得到能够使用的不同类型的抗体的纵览。另外，可以使用所有类型的抗体亚类例如前面所提到的IgA、IgE、IgM、IgG、IgD等。关于此内容再次参考Harlow和Lane(见上)。

通过与支持物的共价或非共价连接，可以分析物传感分子布置在任何前述固体多孔支持物的至少一部分之上或其内。

在优选的实施方式中，将抗体喷墨印刷到硝酸纤维素膜上，并使其进行物理吸附。经印刷的膜干燥过夜。优选使用PBS pH7.4中的5％BSA对经印刷的膜在室温下进行封闭1小时，接着进行检验。

支持物和分析物传感分子之间的共价连接意味着形成化学键。为了共价连接的目的，固体多孔支持物可以被官能化，以提供化学官能团，其使得能够在支持物和分析物传感分子之间形成化学连接。

因此，如果例如抗体被用作分析物传感分子，并且应当被共价偶联到膜上，则可以使用提供官能团(例如羧基、氨基、羟基、巯基等)的膜。接着，这些基团可以被直接或者使用连接剂交联到抗体，其中所述连接剂可以是同双功能的或异双功能的。

因此，可以激活支持物用于提供与分析物传感分子的化学连接，通过例如使用聚合物涂覆惰性固体多孔基质，其中所述聚合物具有例如酰基氟官能团。其它共价结合化学物质也是可以利用的，而且不限于酐、环氧化物、醛、酰肼、酰基叠氮化物、芳基叠氮化物、重氮化合物、二苯酮、碳化二亚胺、亚氨酯、异硫氰酸酯、NHS酯、CNBr、马来酰亚胺、甲苯磺酸酯、三氟代乙烷磺酰氯(tresyl chloride)、马来酸酐和羰基二咪唑。

在一个实施方式中，碳化二亚胺官能团可以用于建立固体多孔支持物和分析物传感分子例如抗体之间的连接。

为了该目的，带负电荷的尼龙膜例如包含COOH基团的Biodyne C膜，可以被连接剂例如EDAC(N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳化二亚胺盐酸盐)预处理。接着，这种活性中间物与分析物传感分子例如抗体的氨基发生反应。

通过使用低浓度的EDAC可以发生抗体或蛋白质的连接。

典型地，EDAC的这些浓度将在0-25重量％的EDAC之间变化，其中0.5-10重量％、0.5-8重量％、0.5-4重量％、0.5-2重量％、特别1重量％是优选的。

本领域技术人员能够完全了解在将分析物传感分子例如抗体与固体多孔支持物接触时，以及在将分析物传感分子例如抗体与样品接触时所采用的反应条件。典型的反应条件取决于一定的缓冲液、温度、pH条件等。然而，这些条件将取决于样品、分析物和分析物传感分子的类型，以及取决于在分析物传感分子与固体支持物的共价连接情况中所使用的化学官能团，并且通常可以从文献中知道，或者由例如化学交联剂的制造商提供。

在本发明的一个实施方式中，可以使用这样一种支持物进行该方法，该支持物仅包含均匀分布在至少一部分支持物上或其内的一类分析物传感分子。

然而，在本发明特别优选的另一个实施方式中，使用这样一种支持物进行该方法，其中以建立通常被称作“阵列”的支持物样式的空间有序和隔离的模式，将分析物传感分子分布在至少一部分固体支持物基质之上或其内。

通过以阵列的形式，将分析物传感分子布置在支持物上的一个优点是可以将不同类型的分析物传感分子以及地不同的已知方向和分布布置在阵列上。这种方向将允许平行检测样品中的多种分析物。

典型的，这些阵列是由点构成的，点代表特异的分析物传感分子。由于点中分析物传感分子的特性是已知的，所以能够建立复杂的阵列。根据工业标准，阵列格式将具有密度，意味着点的数量范围是10-100000、50-50000、100-10000，或者点的数量是1000、2000、3000、4000、或5000。

当然，本领域技术人员能够完全理解对于阵列的某个点，可以在其上布置固定数目的分析物传感分子。因此，根据本发明可以提供微阵列形式的固体多孔支持物，其中微阵列的点各自包含不同量的分析物传感分子。如果该方法用于测定分析物与分析物传感分子实时动力学行为的结合，则提供其点包含不同量的各种分析物传感分子的微阵列可以是特别感兴趣的(同样参见下面)。

因此，阵列是分析物传感分子的排列，特别是在固体多孔基质上可设定地址的位置上的生物大分子例如多肽和抗体。微阵列，是被微型化的阵列，以便需要最少量的分析物传感分子和样品进行评估。在阵列内，每个阵列分子都是可设定地址的，在阵列表面的至少两个维度内能够被可靠地和始终如一地测定。因此，在有序的阵列中，每个分析物传感分子的位置在被点在阵列表面时，被分配给分析物传感分子，并通常是对应每个位置所提供的钥匙。通常有序的阵列被排列成对称的网格模式，但是样品可以以其他模式进行排列(例如以放射状分布的线或有序的束)。

分析传感分子或“点”的应用形状本质上对于本发明的性质是不重要的。因此，分析物传感分子的微阵列通常是指局部沉积分析物靶向多肽，并且不限于圆形或基本上圆形的区域。例如，本发明的阵列可以使用基本上正方形的多肽区域，以及可以是基本上长方形(例如狭缝印迹应用)或者三角形、椭圆形或不规则的。点本身的尺寸(将整个点围绕于其内的圆形面积的直径)对于本发明是不重要的，尽管通常在0.1mm-0.5mm之间。阵列本身的形状对于本发明也是不重要的，尽管通常是基本平面的，并且整体形状可以是长方形或正方形的。

微阵列的制备是指不同组分析物传感分子以大约0.05mm-大约10mm之间或更多，优选大约0.1mm-1mm之间的点与点之间(中心与中心间隔)排列。

可以用于本发明的阵列仪(Arrayer)也称为阵列点样仪(array spotter)是目前可以从不同公司获得的。根据不同点样技术，它们可以被分成接触式和非接触式(喷墨)阵列仪。接触式阵列仪包括Affymetrix，AmershamPharmacia，BioRobotics和GeneMachine所制造的，例如使用笔头在笔头接触基质时分配样品。Packard Bioscience(目前是Perkin Elmer)所制造的BioChip Arrayer代表的非接触式阵列仪采用压电晶体控制头在基质之上大约400μm分配预先吸取的样品。

本发明使用阵列的实施方式的优点是可以开发微型支持物平台，其能够使用较小的尺寸样品和反应体积，这实现了规模经济并节省时间。另外，这些分析仪能够达到与传统微阵列模式相当或更大的灵敏度。

为本发明目的，术语“分析物”涉及被前述分析物传感分子所特异识别的分子。因此，分析物可以选自包括蛋白质、抗原、半抗原、小分子、脂质等所组成的组。最优选的，分析物是蛋白质或各种蛋白质的组合。

如上所述，将固体多孔支持物与至少一种样品接触可以通过将含有分析物的样品与固体支持物在典型的温度和条件下进行温育，其中在所述支持物上优选被以微阵列的形式布置分析物传感分子。

正如上面所提出的，期望人们任选地使用溶液清洗支持物，该溶液能够除去未与支持物和/或分析物传感分子特异性结合的样品组分。

公知的是，在分析物例如蛋白质检测过程中，待测试的样品组分与检测装置可能发生非特异性结合。这种非特异性结合可能发生于支持物和/或分析物传感分子。在本发明的一个实施方式中，人们可以通过在将检测装置与样品接触后，使用所谓用于除去非特异性结合组分的清洗溶液除去非特异性结合的组分，而解决这种非特异性结合。

此外，本发明的发明人发现在本发明的一个实施方式中，期望使用能够降低和/或除去和/或防止与支持物和/或分析物传感分子非特异性结合的溶液或液体处理支持物。通常将这类溶液或液体称作封闭溶液。

能够降低和/或防止样品组分与前述支持物组分非特异性结合的封闭组分通常依赖支持物和/或分析物传感分子的性质和量。

封闭组分可以包括去污剂例如SDS、TritonX 100、TritonX 80、NP-40、吐温-80、吐温20等。在另一个实施方式中，封闭溶液的封闭组分可以是BSA、FSA、HSA、酪蛋白或Fc尾。当然，也可以使用上述封闭剂的组合。

后者封闭组分即BSA、HAS、FSA，特别是酪蛋白是优选的。

通常，以溶液或液体例如封闭缓冲液的形式施加封闭溶液。例如封闭缓冲液的其他封闭组分可以是盐、酸等，这依赖具体的应用。典型的封闭缓冲液将是PBS pH7.4，其含有任何前述组分浓度为1重量％、2重量％、3重量％、4重量％、5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10重量％，最高达到15％或20重量％的BSA、FSA、HAS或酪蛋白。

如果组分例如酪蛋白、BSA、HAS被用作封闭溶液中的组分时，通常它们的浓度将在1％和15％之间，2％和10％之间，优选5％和10％之间。这些浓度是以重量百分比表示的。

封闭的时间点可以不同。因此，在分析物传感分子例如抗体结合支持物之前，支持物例如膜可以被预先封闭。支持物也可以在分析物传感分子已经偶联或布置在膜上之后被封闭。优选期望如果分析物传感抗体被吸附到膜例如上述尼龙膜上。

在将样品和检测装置接触使得样品中的至少一种分析物与支持物上的分析物传感分子特异性相互反应之后，可以任选地包括上述所谓的清洗步骤，该步骤的目的是除去和/或降低分析物样品的非特异性结合组分，所述组分与基质和/或分析物传感分子非特异性结合。在该清洗步骤之后，或者如果省去清洗步骤，将发生对分析物传感分子和至少一种样品的分析物之间特异性相互作用的检测。

上面对步骤d)已经提出在使支持物与样品接触后，分析物传感分子和分析物之间的特异性相互作用将可以被检测。

有各种手段检测样品中分析物与分析物传感分子之间的特异性相互作用。其例子是作为分析物传感分子的抗体和样品的组分例如蛋白质或被抗体特异性识别的典型化学化合物之间相互作用。然而，这些解释并不以任何方式被本发明的这些示范性实施方式所限制。

检测分析物传感分子例如抗体与分析物之间的相互作用，可以通过使用可检测标记物修饰分析物而发生。使用可检测标记物修饰分析物可以发生在检测装置和样品接触之前，检测装置和样品接触的过程中，或者在分析物传感分子和分析物之间已经发生特异性相互作用之后。

通过使用例如荧光组分例如Cy5、Cy3、Texas Red、FITC、Attodye、Cydye、Alexa647等、放射性基团等的修饰，可以使用可检测标记物对分析物进行修饰。如果分析物传感分子例如抗体和例如Cy5标记的分析物之间发生相互作用，则任何其他标记的样品组分可以被清洗步骤除去，并且可以根据与分析物传感分子的相互作用，检测样品中特异性分析物的存在，例如通过分析物传感分子与在检测装置上所保留的分析物之间的相互作用所产生的荧光信号。

其他的方法例如诱导银染色可以用于检测。其他可检测标记物依赖产生染色的酶反应，例如辣根过氧化酶可以与样品中的分析物偶联，之后，通过提供相应的底物可以启动反应，引发在被辣根过氧化酶修饰的分析物与分析物传感分子之间相互作用的位置的染色。

这些酶连接物还可以含有碱性磷酸酶或化学发光物系统。也可以被称作报告分子的可检测标记物的其它例子包括但不限于染料、化学发光化合物、金属复合物、磁性颗粒、生物素、半抗原、射频发射器和放射性发光化合物。

也可以使用其它检测分析物和分析物传感分子之间相互作用的方法。例如，如果分析物传感分子是抗体，则分析物可以从样品中特异性地结合该抗体。接着，如果使用清洗步骤用于除去任何未结合或非特异性结合的所施加样品组分，则可以加入其它对于分析物的另一部分也具有特异性的抗体。该抗体可以例如被连接到可检测标记物。这种可检测标记物可以是荧光标记物例如Cy5；然而，这种标记物也可以使例如已知序列的寡聚核苷酸。如果在所谓二抗与通过捕获抗体被保持在支持物上的分析物相互作用之后，该寡聚核苷酸被用于聚合酶链式反应(PCR)，则可以检测在样品中分析物的存在。这种所谓的免疫PCR是非常敏感的，并且能够用于可靠地检测溶液中微量的分析物。上述检测方法依赖第二分析物传感分子例如抗体，也被称作“三明治式检验”。本领域技术人员非常了解这种检验。

在另一个优选的途径中，第二(检测抗体)偶联到例如生物素上。在进一步的步骤中，分析物传感分子-分析物-二抗复合物与链霉素标记物的可检测标记物例如荧光标记物接触。接着，荧光标记物可以通过链霉素与生物素标记的二抗相互作用。

当然可能存在该途径的其它替代。例如，分析物传感分子例如捕获抗体可以通过喷膜印刷机被印制在多孔膜上。随后，可以对所印制的膜进行封闭使得非特异性结合最小化。接着，含有例如作为分析物的靶蛋白的样品在该情况中将被直接标记。标记可以是荧光团、金珠、酶或半抗原例如上面所述的。使用下面所描述的流通配置，标记的样品将被抽吸通过膜数次，以使得抗体-抗原结合。通过额外任选的清洗步骤，将除去过多的标记。

在另一个实施方式中，使用喷膜印刷机将可以是靶蛋白的分析物印制在多孔膜上。封闭所印制的膜以使非特异性结合最小化。接着将也含有靶蛋白的样品与多种任选被标记的能结合分析物的抗体混合。标记可以是例如荧光团。任选地，接着进行清洗步骤，以从膜上除去非特异性结合的抗体或标记。同样，任选地，可以进行与靶向所结合抗体的第二标记抗体的温育步骤。前述任选的替代也可以进行组合。抗原-抗体1或抗原-抗体1-抗体2结合将接着通过检测设置而显示，例如该检测设置能够检测荧光信号，并使用校准标准进行对复合物的定量(参见下面)。后者实施方式实际上是竞争检验。输入样品中高浓度的靶蛋白将在膜上提供低信号。此外，第一捕获抗体的量需要被仔细优化以便与样品中靶蛋白的量相比不会过剩。

当然，分析物传感分子和分析物之间的特异性相互作用也可以不使用标记物而检测，即所谓的“无标记”检测。例如，这可以使用Biacore系统完成。

如上所述，如果分析物传感分子被以阵列格式布置在支持物上，则根据本发明的方法可以被用于实现在一种或者多种样品中平行处理样品和平行检测多种分析物。因为每个检测点可以对应不同的对某种分析物特异性的分析物传感分子，因此在固体多孔支持物与样品温育并以上述方式处理之后，从这类检测点产生的信号将指示在样品中存在分析物。

在根据本发明的方法最后步骤e)中，测定样品中分析物的浓度。

浓度的测定主要依赖在如上对步骤d)中所描述的检测分析物传感分子和分析物之间特异性相互作用所产生的信号。

典型地，首先将之上被布置分析物传感分子的支持物与样品接触，其中样品包含能够特异性结合支持物上分析物传感分子的分析物，其中分析物传感分子的浓度是已知的。通过使用具有已知但不同浓度的该特异性分析物，以及例如使用具有不同量分析物传感分子的微阵列以及例如偶联到分析物的荧光标记，可以建立所谓的校准或标准曲线，在该曲线中一定的荧光信号强度与样品中已知的分析物浓度相关联。

在作为实际测量的第二步骤中，采用含有浓度未知的分析物的样品。如上所述的根据本发明的方法处理这些样品，例如如果分析物也被与已经用于建立校准曲线相同强度的荧光标记物所标记，则记录荧光信号。接着，通过与前述的校准曲线进行比较，将这种荧光信号与样品的浓度进行关联。

当然，本领域技术人员能够知道荧光信号会发生饱和效应，例如如果将样品与支持物接触，其中样品含有比支持物上可以利用于相互作用的分析物传感分子多的分析物。在这些情况中，将逐步对分析物样品进行稀释，直到达到获得非饱和荧光信号的状态。

测定样品中分析物浓度的其它实施方式是本领域技术人员已知的。

例如，如果将化学反应或酶反应用于检测分析物和分析物传感分子之间的相互作用，也可以通过比色反应，并用分析物浓度已知的样品建立校准或标准曲线。之后，根据如上所述本发明的方法可以进行，并从所获得的比色值计算浓度。本领域技术人员还会了解，需要确保只有这些被考虑的比色信号还没有达到饱和水平。

上面所述用于测定样品中分析物浓度的方法的优点之一是样品与多孔支持物结合。因为支持物是多孔的，样品可以通过支持物，这能够快速和有效地除去所有非特异性结合的样品组分，导致一旦检测分析物与分析物传感分子之间特异性相互作用时，信噪音比整体增强。

此外，使用多孔膜能够得到有利和优选的本发明实施方式，即通过重复步骤b)-d)多次而以重复模式进行上述方法。

优选，步骤b)-d)被重复至少2、3、4、5、6、7、8、9、10次，最高达到30次。特别优选的循环次数是大约8-12个循环。通过例如在循环中经所述固体多孔支持物抽吸样品，可以促进重复接触，任选地清洗和检测分析物传感分子和分析物之间的相互作用。也可以通过抽吸之外还采用真空，或者采用真空替代抽吸，来促进循环。当然，本领域技术人员知道如何改造孔径用于不断地经所述支持物抽吸样品，例如如果包括清洗步骤的话。例如，这可以通过使用能够被阀门切换到不同来源(例如样品和清洗缓冲液源)的管线完成。

在检测分析物传感分子与分析物之间的相互作用时，重复将样品施加到支持物上引起显著增强的信噪比。在以至少20秒，至少30秒，至少40秒，至少50秒，至少60秒，至少2分钟，至少3分钟或至少5分钟的接触或温育时间打断重复循环时，这是尤其正确的。可以采用上面所限定的循环次数。重复应用样品可以包括重复加入新鲜的样品和/或已经经膜通过一次的样品即首次通过的“流通物”

术语“重复循环”可以不仅指一起重复所有步骤b)-d)。代替的是，术语“重复循环”也可以指任何这些步骤b)-d)或者甚至其子步骤。例如，替代经多孔膜多次循环样品的是，也可以只重复施加，即循环经膜的清洗溶液。

类似地，可以在支持物上重复循环可检测标记物。例如，这可以是优选的情况，如果链霉素标记的荧光标记物被用于检测生物素标记的二抗。

当然，也可以使用前述循环的步骤即循环样品、清洗溶液和/或检测标记物的组合。

不希望囿于理论，采取重复循环优选被前述温育时间所中断，会提高在检测分析物传感分子和分析物之间的相互作用时的信噪比，因为重复分析物和分析物传感分子之间反应的开和关会导致样品非特异性结合组分的有效除去，并有利于特异性相互作用的选择压力。

此外，样品与支持物的重复接触似乎是下列事实的原因：与不进行重复循环而只包括一次温育和任选的清洗步骤的情况相比，有效检测所需的整体温育时间被显著降低。

因此，本发明在以上述重复模式进行时，具有下列优点：时间例如检测抗体和抗原之间免疫反应所需要的时间可以比传统的持续时间降低，传统上可以持续最高达到3.5小时，例如没有进行膜上温育的话最低达到15分钟。如果包括温育步骤的话，5个抽吸循环的总检验时间可以是大约45分钟。可以通过各种使用抽吸和/或真空手段的手段，完成根据本发明方法的重复操作，其中抽吸和/或真空手段是优选的，因为他们能够允许样品和任选的清洗溶液可控和稳定地在固体支持物上流动和通过。

本发明的另一个实施方式涉及随时间变化测定样品中分析物的浓度的情况。

随时间变化测定所结合的成分能够检测分析物与其分析物传感分子结合的实时动力学。当测定分析物与分析物传感分子的实时结合动力学时，能够将信号转化成分析物的浓度。根据结合曲线的类型，需要知道结合速度常数，解离速度常数以及分析物传感分子密度(即分析物传感分子的数目/表面面积)。可以分别测定结合和解离常数。可以从所布置的浓度和体积以及点的直径测定捕获分子的密度。或者，在与已知浓度的分析物分子温育时，可以测定结合或解离速度常数。为了检测特异性的相互作用，也需要依赖前述的可检测标记物例如荧光分子。

一旦已经建立了反映分析物与分析物传感分子结合动力学的结合曲线，含有未知浓度的分析物的样品可以与固体支持物接触，并也可以监控随时间变化的分析物和分析物传感分子之间的特异性相互作用。通过利用已经从不同但已知浓度的样品获得的各种标准曲线，测定未知浓度的样品的曲线形状，可以估计不仅分析物与分析物传感分子结合的结合动力学参数，而且还可以估计样品中分析物的浓度。

并且如果步骤b)-d)或这些步骤中的任何步骤被重复多次，则分析物与分析物传感分子之间实时结合动力学的测定可以被显著改进，并且减少了检测所需的时间。在本文中，参照如上所述根据本发明的方法的重复操作。当然，方法的重复操作可以被如上所述的温育和接触时间所打断。

本发明有多种有用的应用。因此，上述的方法可以用于免疫反应，这可以检测例如在血液样品中的某些抗原。因此，上述方法可以用于诊断目的。上述方法特别的优点是不仅能够检测样品中某种分析物的存在，而且可以在相对短时间内测定其浓度。

而且，上述方法可以用于测定分析物与分析物传感分子的实时结合动力学。因此，上述方法可以不仅用于检测例如化合物库中能够与治疗上感兴趣目标如细胞受体相互作用的小分子化合物，而且能够用于测定小分子与其靶蛋白之间相互作用的结合动力学。

因此，本发明可以用于利用从不同来源例如环境来源、血液、淋巴等获得样品测定样品内分析物的存在和浓度。

额外地和/或可替代地，通过依赖本发明涉及测定分析物传感分子和分析物分子之间相互作用的实时动力学的实施方式，本发明的方法可以用于测定样品中分析物的存在，以及与分析物传感分子的结合行为。

在本发明可替代的实施方式中，检测至少一种样品中至少一种分析物的方法包括步骤：

a)提供至少一种固体多孔支持物，其上被布置了至少一种分析物传感分子；

b)将所述支持物与至少一种含有至少一种分析物的样品接触；

c)任选地使用溶液清洗所述至少一种支持物，其中所述溶液能够除去与所述支持物和/或所述分析物传感分子非特异性结合的样品组分；

d)检测所述至少一种分析物传感分子与至少一种分析物之间的特异性相互作用；

e)测定所述至少一种样品中所述至少一种分析物的浓度。

如上所述，如果例如步骤b)-d)(或者这些步骤中的任何步骤)被再次重复多次，以及如果任选的温育时间被保持充分短，则样品中存在的分析物可能不会立即与过剩存在的分析物传感分子完全反应。

在这种情况中，即如果以重复模式操作该方法，则可以记录在每个循环之后检测分析物和分析物传感分子特异性相互作用的随时间变化的信号。在经过重复循环之后，由于越来越多的分析物结合到分析物传感分子上，因此将观察到信号强度的提高，一旦分析物与分析物传感分子的结合达到饱和，则这将达到保持水平。如果现在以这种重复模式进行该方法，并且采用均具有不同已知浓度特异性分析物的不同样品，可以计算校准或标准曲线，这反映不同量的分析物与分析物传感分子随时间变化的结合动力学。

如果现在使用含有未知浓度样品的样品在相同的条件下重复该方法，即相同的重复循环次数以及任选的温育和清洗时间，也会获得信号相对于时间的曲线，这反映随着时间的变化，分析物与分析物传感分子的结合行为。因此，可以监控样品内未知浓度的分析物的结合动力学，并可以同时测定分析物的浓度。

下面根据某些实验实施例举例说明本发明。然而这些实施例不以任何方法用于限制本发明的范围，而是为了通过其某些示范性实施方式举例说明本发明。

实验

实验1

制备印制抗体的膜

为了获得微阵列格式的固体多孔支持物，使用硝酸纤维素膜。使用喷膜印刷机在该膜上布置不同的抗体。

在图1中，显示了所获得微阵列的示意图。含有荧光标记如Cy5的抗体将在适当激发之后产生荧光信号，而与是否结合分析物无关。这些分析物传感分子用于确定微阵列的边缘和拐角，并且用于提供测量所得到的荧光的检测装置校准的内标。

在微阵列上检测分析物

后面，接着使用在PBS pH7.4中无蛋白酶的5重量％BSA对前述的微阵列封闭过夜。随后，拍摄图2所示的照片。127.5mA和50mA的数值表示以不同电流驱动光学系统LED所拍摄的照片。

在第二步骤中，300μl 100nM兔抗小鼠Cy5标记的抗体被加入到第一室中的微阵列。将该微阵列与样品温育大约1分钟。之后，经所述微阵列抽吸样品多次，而没有中间的清洗步骤。在每次温育步骤之后，通过在使用Philips开发的LED设置(波长ex/em：650/670nM)激发后拍照来监控样品中的分析物即兔抗小鼠Cy5标记的抗体与分析物传感分子即山羊抗兔抗体之间的相互作用。每个循环的温育时间为大约1分钟。

图3显示在经过循环1、2和4之后的照片。图4显示在循环5、6、7和8之后的所记录的照片。图5的下图显示如果在最后循环(循环8)之后使用PBS.7.4，0.05重量％吐温20清洗微阵列3次后所获得的结果。图5的上图显示没有清洗的相同照片。

从最后的照片，可以清楚地看出兔抗小鼠Cy5标记的抗体和山羊抗兔抗体之间发生了相互作用。此外，能够清楚看到在微阵列上布置较多山羊抗兔抗体的情况中的信号比在微阵列上布置较少量的情况具有更强的信号。

实验2

在该实施例中，测试了重复循环可检测标记物对信号强度的影响。

微阵列印制布置图

使用在图6中所示的微阵列印制布置图。如上所述产生该微阵列。Cy5标记的抗体再次代表内标。

实验设置

使用下面的捕获抗体(分析物传感分子)、抗原(分析物)和检测二抗。链霉素标记Cy5被用于检测。PBS一直指PBS pH7.4。PBST一直指PBS pH7.4，0.0％吐温20。

 

名称	浓度	货号	公司
				CRP捕获抗体CRP-9抗原CRP检测抗体TNFα捕获Ab人重组TNFαTNFα检测抗体	9mg/ml2.8mg/ml1.7mg/ml0.5mg/ml0.1mg/ml0.5mg/ml	4C281707-20044C28B14-7348-8114-8329-6313-7349-81	Hytest Ltd.BiotrendHytest Ltd.eBioscienceeBioscienceeBioscience

以下列浓度使用组分：

捕获抗体

小鼠抗人CRP

700nM  3.5μl储液+296.5μl具有5％甘油的PBS

小鼠抗人TNFα

700nM  63μl储液+237μl具有5％甘油的PBS

驴抗山羊Cy5标记的

700nM  21μl储液+279μl具有5％甘油的PBS

200nM  6μl储液+294μl具有5％甘油的PBS

抗原

CRP/TNFα抗原

100nM  8.2μl CRP储液+34μlTNFα+1957.8μl具有1％BSAp.f.的PBS

100pM  2μl的100nM溶液+1998μl具有1％BSAp.f.的PBS

空白  具有1％BSAp.f.的PBS

检测二抗

小鼠抗人CRP/小鼠抗人TNFα

66.7nM CRP+6.67nMTNFα58.8μlCRP+20μlTNFα+9921.2μlPBS

检测抗体全部以生物素进行标记

检测系统

链霉素Cy5标记的

1:1000  10μl储液+9990μlPBS

温育微阵列和检测相互作用的程序如下。实验进行两次：

·在膜上印制阵列

·拍摄阵列照片

·使用1000μlPBS+5％BSA封闭阵列1小时(室温(RT)，黑暗)

·拍摄阵列照片以测定回收

·向阵列加入500μl抗原溶液

·打开真空并等待直到完全除去流体

·再重复4次

·通过吸移(pipetting)500μlPBS清洗阵列

·打开真空并等待直到完全除去流体

·再重复2次

·向阵列加入500μl检测抗体溶液

·打开真空并等待直到完全除去流体

·再重复4次

·如前使用PBS-T清洗阵列3次

·拍摄阵列照片

·向阵列加入500μl链霉素-Cy5溶液

·打开真空并等待直到完全除去流体

·拍摄所有阵列的照片

·根据需要重复最后3个步骤多次

图7显示在印制之后的阵列。下表中显示捕获抗体的回收率值，这是在200nM和700nM驴抗山羊Cy5标记的内标的基础上计算的。

 

溶液	前后	回收率
			200nM700nM	0.0535      0.02070.1774      0.0658	39％37％
	平均回收率＝	38％

结果

图8和9显示在重复循环(即10次，包括最后清洗步骤)后下列经过标准化的强度：结合的C-反应性蛋白(CRP)；不同浓度的肿瘤坏死因子a(TNFa)；以及空白。图10显示在图8和9的基础上所测定的CRP和TNFa信噪(S/N)比。

实验显示可以在15分钟内有效进行该检验。

实验3

在该实施例中，研究可检测标记物的影响。进一步研究抽吸的影响以及流通物通过微阵列的循环。

微阵列印制布置图

使用在图11中所显示的微阵列印制布置图。如上所述产生该微阵列。Cy5标记的抗体仍代表内标。

实验设置

使用下面的捕获抗体(分析物传感分子)、抗原(分析物)和检测二抗。链霉素标记的Cy5被用于检测。PBS一直指PBS pH7.4。PBST一直指PBSpH7.4，0.0％吐温20。

 

名称	浓度	货号	公司
				CRP捕获抗体CRP-6抗原CRP检测抗体TNFα捕获抗体人重组TNFαTNFα检测抗体驴抗绵羊Cy5	9mg/ml2.8mg/ml1.7mg/ml0.5mg/ml0.1mg/ml0.5mg/ml1.5mg/ml	4C281707-20044C28B14-7348-8114-8329-6313-7349-81713-175-003	Hytest Ltd.BiotrendHytest Ltd.eBioscienceeBioscienceeBioscienceJackson Immuno

以下列浓度使用组分：

捕获抗体

小鼠抗人CRP

8μM  20μl储液+180μlPBS

小鼠抗人TNFα

3.33μM  未稀释的储液

驴抗山羊Cy5标记的

200nM  6μl储液+294μl具有5％甘油的PBS

500nM  15μl储液+285μl具有5％甘油的PBS

700nM  21μl储液+279μl具有5％甘油的PBS

抗原，检测二抗

100nM  8.2μl CRP储液+34μl TNFα储液+1906.1μl具有1％BSA的PBS

100pM  1.9μl上述溶液+1946.3μl具有1％BSA的PBS

100fM  1.9μl上述溶液+1946.3μl具有1％BSA的PBS

空白   1948.2μl具有1％BSA的PBS

接着加入到所有溶液：

66.7nM  11.8μl CRP检测抗体储液

66.7nM  40μl TNFα检测抗体储液

所有检测抗体都以生物素进行标记

检测系统

1:1000  10μl储液链霉素-Cy5+1990μl PBS

1:1000  10μl储液链霉素-A647+1990μl PBS

温育微阵列和检测相互作用的程序如下。实验进行两次：

·印制阵列

·拍摄阵列照片

·对于该实验使用尼龙膜

·使用500μl PBS/孔+5％BSA封闭阵列1小时

·在PBDT中清洗阵列3*5分钟，并拍摄照片确定回收率

·将其他阵列与不同浓度的抗原和检测抗体500μl温育持续5分钟。接着，应用真空直到膜干燥。

·接着温育链霉素染料2分钟。再次应用真空直到膜干燥。拍摄所有膜的照片。

·温育流通物5分钟。之后，应用真空直到膜干燥并拍照。再重复3个步骤。

·温育新鲜的链霉素染料溶液5分钟。之后，应用真空直到膜干燥。拍照。

·通过吸移500μl PBS-T清洗膜，应用真空直到膜干燥。重复两次，接着拍照。

因此，这些循环总结如下：

循环1：5分钟抗原+检测抗体，接着2分钟链霉素-染料

循环2-4：5分钟流通物

循环5：5分钟新鲜链霉素-染料

循环5+w：3次PBS-T(没有在膜上的温育)

图11显示在印制后的阵列。在下表中，显示了在200nM、500nM和700nM驴抗山羊Cy5标记的内标的基础上计算的捕获抗体的回收率值。

结果

图12显示在封闭后拍摄的用于测定回收率的微阵列照片。图13和14显示以不同浓度和染料的CRP和TNFa经标准化的强度。图15和16显示依赖各种循环的CRP和TNFa检测动力学。

结果明确显示可以在短时间内进行免疫检验，并且抽吸、应用真空和重复某些操作步骤能够影响所测量的信号强度。

实验4

在该实施例中，将700nM山羊抗兔抗体印制在尼龙膜上。将该膜与100nM兔抗小鼠Cy5进行温育(参见图17)。为了温育，将分析物溶液经膜抽吸5次。进行该实验3次。

微阵列印制布置图

使用图18中所示的微阵印制列布置图。如上所述生产微阵列。Cy5标记的抗体仍代表内标。

结果

图19显示通过重复分析物溶液的循环，经标准化的信号强度会提高。

从上述实验能够得出三个主要的结论：首先，通过经微阵列快速循环样品，能够显著降低有效检测分析物与分析物传感分子之间相互作用所需的时间。在上述实验1中，如果不在膜上进行温育的话，检测信号的总时间花费大约10分钟。这与现有技术中这种应用所需能够花费最高达到3.5小时不同。

第二，通过将例如图5所获得的信号与之前已经建立的标准校准曲线进行比较，可以测定兔抗小鼠Cy5标记的抗体的浓度。相应地，这也应用于其他实验。

第三，通过监控随着每个循环即随时间变化信号强度的发展，能够实际测定分析物的结合动力学，在实验1中是兔抗小鼠Cy5标记的抗体与其捕获抗体，前提是实验1中的捕获抗体是山羊抗兔抗体已经被以不同的浓度布置在微阵列上，这在不同的时间点产生了不同的信号力度和强度。

Claims (10)

1.检测至少一种样品中至少一种分析物的方法，该方法包括下列步骤：

a)提供至少一种固体多孔支持物，其上被布置了至少一种分析物传感分子；

b)将所述支持物与至少一种含有至少一种分析物的样品接触；

c)任选地使用溶液清洗所述至少一种支持物，其中所述溶液能够除去与所述支持物和/或所述分析物传感分子非特异性结合的样品组分；

d)检测所述至少一种分析物传感分子与所述至少一种分析物之间的特异性相互作用；

e)测定所述至少一种样品中所述至少一种分析物的浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其中随时间变化测定浓度，以测量所述分析物与所述分析物传感分子的实时结合动力学。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述基质的孔隙度允许流体从其流过。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述基质是选自包括由尼龙、硝酸纤维素、PVDF或聚醚砜所制成的膜的组的膜。

5.根据权利要求1所述的方法，其中多次重复步骤b)-d)或者这些步骤中的任何步骤。

6.根据权利要求1所述的方法，其中大量分析物传感分子被以微阵列的形式布置在所述支持物上。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种分析物传感分子是对分析物具有特异性的抗体。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种样品的所述至少一种分析物被至少一种可检测标记物修饰。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述至少一种可检测标记物选自包括荧光团、酶、染料、化学发光化合物、放射性同位素、金属复合物、磁性颗粒、生物素、半抗原、射频发射器和放射发光化合物的组。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析物是蛋白质。

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