CN111051500A - 有效载荷递送至干细胞 - Google Patents

Abstract

本公开涉及一种利用能够结合表面暴露的磷脂酰丝氨酸的GLA结构域靶向干细胞，特别是非凋亡干细胞的方法。

Description

有效载荷递送至干细胞

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年9月5日提交的美国临时申请第62/554,530号、2017年9月5日提交的美国临时申请第62/554,533号、2017年10月6日提交的美国临时申请第62/569,403号、2017年10月6日提交的美国临时申请第62/569,411号、2017年11月10日提交的美国临时申请第62/584,565号和2017年11月30日提交的美国临时申请第62/593,014号的权利，这些申请各自以全文引用的方式并入本文。

序列表的并入

本申请包含通过EFS网以电子方式提交的序列表，其作为纸印本和计算机可读形式(CRF)并且由名称为“ST-CTl-PCT—sequence.txt”的文件组成，所述文件创建于2018年9月5日，大小为9,831字节，并且以全文引用的方式并入本文。

本公开涉及一种靶向干细胞的方法，特别是非凋亡干细胞，例如应用GLA结构域以促进进入细胞。

背景技术

GLA结构域包含在多种GLA蛋白中，诸如凝血酶、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C、蛋白S(PrS)、蛋白Z、骨钙蛋白、基质GLA蛋白、GAS6、转甲状腺素蛋白、骨膜蛋白、富含脯氨酸的GLA 1、富含脯氨酸的GLA 2、富含脯氨酸的GLA 3以及富含脯氨酸的GLA 4。

所谓GLA蛋白的GLA结构域能够结合凋亡细胞(诸如癌细胞和病原体感染细胞)表面上的磷脂酰丝氨酸(PtdS，也称为PS)。在WO2014/151535和WO2014/151683中公开了特异性结合磷脂酰丝氨酸的排除催化结构域的分子，其通过引用并入本文。

GLA结构域(维生素K依赖性羧化/γ-羧基谷氨酸)是已经通过氨基序列中谷氨酸残基的维生素K依赖性翻译后羧化修饰的蛋白结构域，以用于提供γ-羧基谷氨酸(Gla)。

GLA结构域通过将钙离子螯合在两个羧酸残基之间来结合钙离子。这些残基是区域的一部分，所述区域从GLA蛋白成熟形式的N端开始，并且以保守的芳族残基终止。这导致在结构域的中间发现保守的Gla-x(3)-Gla-x-Cys基序，这似乎对羧化酶识别底物是重要的。

磷脂酰丝氨酸被认为是凋亡细胞的保守标记物，并且是病变细胞降低免疫清除或诱导免疫耐受的机制的一部分。因此，假设GLA结构域只束缚于凋亡细胞。然而，令人惊讶的是，本发明人已经确立本公开的GLA结构域可以应用于靶向干细胞诸如非凋亡干细胞和/或癌症干细胞。这甚至更加令人惊讶，因为发明人有证据表明正常健康分化的细胞不受本公开中应用的GLA结构域的束缚。

这具有重要的意义，例如对于干细胞疗法而言，其用于治疗诸如血癌等情况，诸如白血病。干细胞疗法仅可以在患者自己的骨髓/干细胞/免疫系统被清除干净后才能进行。

这种清除干净过程需要“闭塞疗法”，例如大剂量的化疗、放疗和/或B细胞耗竭疗法。

这种“闭塞疗法”具有很多副作用，例如口腔和咽喉疼痛(其可能使患者难以进食)、恶心和呕吐、对感染的易感性(诸如肺炎和CMV感染)、贫血、出血、不孕、认知紊乱等。这些副作用非常严重，患者，并且对患者，尤其是对儿童难以应对。如果可以减少或消除这些副作用，将大大改善患者的生活质量。

还发现清除免疫系统并重启它可以缓解攻击性形式的MS。然而，这种处理仅保留用于最严重的病例，因为与处理相关的风险是显著的。然而，本公开允许通过应用GLA组分将化疗特异性地靶向干细胞。

本发明提供了一种用于“特异性”靶向干细胞，特别是非凋亡干细胞的机制。例如，通过所述方法靶向的干细胞可以被分离、处理(包含基因校正、扩增、添加)、标记、转化和/或消除。因此，本公开的方法可应用于向干细胞递送疗法干预，例如遗传材料和/或蛋白材料和/或化学疗法。

通过将本公开的GLA结构域与可检测的标签相连，例如荧光标签、组氨酸标签或磁珠，然后可以分离和分选干细胞等。这种对于诊断或分离干细胞以用于进一步操作可能是有用的，这使得它们在治疗应用中是有用的。

发明内容

现在将在下面的“编号”段落中概括本公开：

1a.一种靶向干细胞的方法，所述方法包括使细胞与分子接触的步骤，所述分子包括与γ-羧基谷氨酸组分(GLA-组分)相连的有效载荷，

其中所述GLA组分包括GLA结构域或其中的活性片段，并且不包括来自GLA蛋白的活性催化结构域。

1b.一种分子，其包括与γ-羧基谷氨酸组分(GLA-组分)相连的有效载荷，

其中所述GLA-组分包括GLA结构域或其中的活性片段，并且不包括来自用于处理或诊断干细胞的GLA蛋白的活性催化结构域。

1c.一种分子，其包括与γ-羧基谷氨酸组分(GLA-组分)相连的有效载荷，

其中所述GLA-组分包括GLA结构域或其中的活性片段，并且不包括来自GLA蛋白的活性催化结构域，其用于制造用于治疗或诊断干细胞的药物。

2.根据段落1a、1b或1c使用的方法或分子，其中GLA结构域或其中的活性片段独立地选自凝血酶、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、骨钙蛋白、基质GLA蛋白(MGP)、GAS6，转甲状腺素蛋白(TTR)、间-α-胰蛋白酶抑制剂、骨膜蛋白、富含脯氨酸的gla 1(PRRG1)、富含脯氨酸的gla 2(PRRG2)、富含脯氨酸的gla 3(PRRG3)和富含脯氨酸的gla 4(PRRG4)。

3.根据段落2使用的方法或分子，其中所述GLA结构域或其中的活性片段独立地选自凝血酶、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C、蛋白S、蛋白Z和GAS6，例如来自蛋白S的GLA结构域，特别是SEQ ID NO：1所示的序列。

4.根据段落1a、1b或1c至3使用的方法或分子，其中所述GLA-组分进一步包括EGF结构域，例如结合钙的EGF结构域。

5.根据段落1a、1b或1c至4使用的方法或分子，其中所述构建体包括选自凝血酶、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、骨钙蛋白、基质GLA蛋白、GAS6、转甲状腺素蛋白、骨膜蛋白、富含脯氨酸的GLA 1、富含脯氨酸的GLA 2、富含脯氨酸的GLA 3和富含脯氨酸的GLA 4的EGF结构域。

6.根据段落5使用的方法或分子，其中所述EGF结构域选自凝血酶、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C、蛋白S、蛋白Z和GAS6，例如来自蛋白S的EGF结构域。

7.根据段落1a、1b或1c至6中任一项使用的方法或分子，其中所述GLA组分包括SEQID NO：6所示的序列或排除组氨酸标签的其衍生物。

8.根据段落1a、1b或1c至7使用的方法或分子，其中所述GLA结构域组分进一步包括Kringle结构域。

9.根据段落8使用的方法或分子，其中所述Kringle结构域来自选自包括以下各项的组的蛋白：录激活因子2(ATF)；因子XII(F12)；凝血酶(F2)；透明质酸结合蛋白2(HABP2)；肝细胞生长因子(HGF)；肝细胞生长因子激活剂(HGFAC)；克里门蛋白1(Kremen protein 1)(KREMEN1)；KREMEN2；脂蛋白(a)(LPA)；LPAL2；巨噬细胞刺激蛋白(MSP或MST1)；磷酸肌醇-3-激酶互作蛋白1(PIK3IP1)；组织纤溶酶原激活剂(PLAT)；尿激酶(PLAU)；纤溶酶(PLG)；PRSS12；酪氨酸蛋白激酶跨膜受体ROR1(ROR1)；以及酪氨酸蛋白激酶跨膜受体ROR2(ROR2)。

10.根据段落1a、1b、1c至9中任一项的方法，其中所述方法在体外进行。

11.根据段落1a、1b、1c至10中任一项的方法，其中所述递送是体内细胞，例如，其中将包括GLA组分和有效载荷的分子施用于患者，例如人类患者。

12.根据段落1a、1b或1c至11使用的方法或分子，其中所述分子靶向干细胞的外部。

13.根据段落1a、1b或1c至12使用的方法或分子，其中所述分子被内在化于干细胞中。

14.根据段落1a、1b或1c至13使用的方法或分子，其中所述细胞是非凋亡性的(即健康干细胞)。

15.根据段落1a、1b或1c至13使用的方法或分子，其中所述细胞是凋亡的，例如病变干细胞。

16.根据段落1a、1b或1c至15所述的方法或分子，其中所述干细胞是成体干细胞，例如包含祖细胞和造血干细胞、肌源性干细胞、骨祖干细胞、神经干细胞、间充质干细胞(诸如卫星细胞、放射状神经胶质细胞、骨髓基质细胞、骨膜、胰腺祖细胞、内皮祖细胞、胚细胞和滋养层干细胞)。

17.根据段落1a、1b或1c至16使用的方法或分子，其中所述干细胞表达表面标记物CD34。

18.根据段落1a、1b或1c至17使用的方法或分子，其中所述干细胞对于谱系阳性表面标记物呈阴性(即Lin-ve)。

19.根据段落1a、1b或1c至18使用的方法或分子，其中所述干细胞为Lin-ve、CD34+ve、CD38-ve，CD45RA-ve、CD90阳性和CD49f_+ve。

20.根据段落1a、1b或1c至17使用的方法或的分子，其中所述干细胞是造血干细胞。

21.根据段落20使用的方法或分子，其中所述干细胞表达来自CD48、CD150、CD244、CD34、CD38、SCA-1、Thy1.1、C-kit、lin、CD135、slam1/CD150、Mac-1(CD11b)、CD4、干细胞因子(SCF)以及其中两者或更多者的组合的表面标记物。

22.根据段落1a、1b或1c至19使用的方法或分子，其中所述干细胞是骨祖细胞。

23.根据段落22使用的方法或分子，其中所述干细胞表达选自Gremlin-1、TGF-β、bFGF、BMP-2、ALPP、MCAM、胶原I、胶原1α1、胶原II、RUNX2、核心蛋白聚糖以及其中两者或更多者的组合(诸如所有所述标记物)的表面标记物。

24.根据段落22或23使用的方法或分子，其中所述干细胞是其中的成骨细胞或祖细胞。

25.根据段落24使用的方法或分子，其中所述干细胞表达选自Runx2、碱性磷酸酶/ALPP/ALPI、骨钙蛋白、BAP1、OPN、BAP31、胶原I、SCUBE3、纤连蛋白、SPARC、IGFBP-3以及其中两者或更多者的组合(诸如所有所述标记物)的表面标记物。

26.根据段落1a、1b或1c至16使用的方法或分子，其中所述干细胞是其中的骨细胞或祖细胞。

27.根据段落26使用的方法或分子，其中所述干细胞表达选自TGFβ、RANKL、MCSF、硬化蛋白、DKK以及其中两者或更多者的组合(诸如所有所述标记物)的表面标记物。

28.根据段落26使用的方法或分子，其中所述干细胞表达选自Osterix+ve、CD90+ve、骨钙蛋白+ve、胶原I+ve、骨唾液蛋白+ve以及其中两者或更多者的组合(诸如所有所述标记物)的表面标记物。

29.根据段落26使用的方法或分子，其中所述干细胞表达选自碱性磷酸酶/ALPP(胎盘碱性磷酸酶)/ALPI+ve、胶原I+ve、胶原II+ve、核心蛋白聚糖+ve、MCAM/CD146+ve、MEPE/OF45+ve、osterix+ve、CD90+ve、osterix/Sp7+ve、RUNX2/CBFA1+ve、血小板生成素/Tpo+ve以及其中两者或更多者的组合(诸如所有所述标记物)的表面标记物。

30.根据段落1a、1b或1c至19中任一项使用的方法或分子，其中所述干细胞是肌源性干细胞。

31.根据段落30使用的方法或分子，其中所述干细胞表达选自CD56、CD146、VE-钙粘蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、FABP3、整联蛋白α7、肌间线蛋白、肌球蛋白重链、UEA-1受体以及其中两者或更多者的组合(诸如所有所述标记物)的标记物。

32.根据段落1a、1b或1c至19使用的方法或分子，其中所述干细胞是神经干细胞。

33.根据段落32使用的方法或分子，其中所述干细胞表达选自CD133、CD15、低CD24或CD24-ve、GCTM-2、CD45、CD34、巢蛋白、Sox-2、ABCG2、FGF R4、卷曲受体-9以及其中两者或更多者的组合(诸如所有所述标记物)的标记物。

34.根据段落33使用的方法或分子，其中所述CD24标记物是低的或-ve。

35.根据段落33或34使用的方法或分子，其中所述干细胞表达CD133+ve、5E12+ve、CD34-ve、CD45-ve和低CD24或CD24-ve的组合的标记物。

36.根据段落1a、1b或1c至19使用的方法或分子，其中所述干细胞是间充质干细胞。

37.根据段落36使用的方法或分子，其中所述干细胞表达选自CD10、CD13、CD73、CD105、CD271、CD140b、CD240、卷曲受体-9、CD29、CD90、CD146、oct4、SSEA4、STRO-1、干细胞因子(SCF)以及其中两者或更多者的组合的表面标记物。

38.根据段落1a、1b或1c至19使用的方法或分子，其中所述干细胞是脂肪干细胞。

39.根据段落38使用的方法或分子，其中所述干细胞表达选自K15、CD34、巢蛋白、卵泡抑素、p63、整联蛋白α6、茶蛋白C、EGFR、IGFR、卷曲蛋白因子以及其中两者或更多者的组合的表面标记物。

40.根据段落38或39使用的方法或分子，其中所述干细胞表达选自CD44、ICAM/CD54、CD34、整联蛋白家族成员以及其中两者或更多者的组合的表面标记物。

41.根据段落1a、1b或1c至19使用的方法或分子，其中所述干细胞是卵巢和输卵管上皮干细胞。

42.根据段落41的方法，其中所述干细胞表达选自Gremlin 1、Lrig1、Lgr5、Bmi1、Tert、HopX以及其中两者或更多者的组合的表面标记物。

43.根据段落1a、1b或1c至15使用的方法或分子，其中所述干细胞是胚胎干细胞。

44.根据段落43使用的方法或分子，其中所述干细胞可以基于选自CD24、CD29、CD31、CD59、CD90、CD117、CD133、CD324、CD326、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、卷曲蛋白5、干细胞因子、crypto(TDGF-1)的一种或多种表面标记物进行鉴定。

45.根据段落1a、1b或1c至44使用的方法或分子，其中所述干细胞是非癌性的。

46.根据段落1a、1b或1c至44使用的方法或分子，其中所述干细胞是癌干细胞。

47.根据段落46使用的方法或分子，其中所述癌干细胞是上皮来源。

48.根据段落46或47使用的方法或分子，其中癌干细胞表达选自CD44(其至少在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、鳞状癌以及膀胱癌中过表达)、CD133(其至少在脑癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌和髓母细胞瘤中过表达)、CD24、CD90、CD271、CD4f、CD13以及其中两者或更多者的组合(其他标记物包含ABCB5⁺、CD44+/CD24、CD34⁺/CD38^-以及CD44⁺/ESA⁺)的表面标记物。

49.根据段落46使用的方法或分子，其中所述干细胞是造血来源。

50.根据段落49使用的方法或分子，其中所述细胞具有选自CD19、WT-1以及其中的组合的标记物。

51.根据段落1至50中任一项使用的方法或分子，其中所述GLA组分缀合至所述有效载荷。

52.根据段落1a、1b或1c至51使用的方法或分子，其中所述有效载荷包括治疗剂、靶向剂和/或标签。

53.根据段落52使用的方法或分子，其中所述治疗剂是化学实体，或生物分子(诸如蛋白)，例如抗癌药物、抗癌疗法、化学治疗剂、病毒或病毒载体(诸如溶瘤病毒)。

54.根据段落1a、1b或1c至53使用的方法或分子，其中所述有效载荷选自毒素、聚合物(例如合成或天然存在的聚合物)、生物活性蛋白(例如酶、其他抗体或抗体片段)、药物(例如，小分子(化学实体)或化学治疗剂)、核酸以及其中的片段(例如DNA、诸如shRNA和siRNA以及其中的片段的RNA，其包含CRISPRCas9和CRISPRa/i的gRNA、放射性核素(特别是放射性碘化物、放射性同位素)金属螯合剂、纳米颗粒和报告基团(诸如荧光或发光标签或可通过NMR或ESR光谱法检测的化合物)。

55.根据段落54使用的方法或分子，其中所述毒素选自瑞奥西汀(例如MMAE(一甲基瑞奥西汀E)、MMAF(一甲基瑞奥西汀F))、吡咯烷酮苯二氮(PBD)、多柔比星、双卡霉素、美登木素生物碱(例如N 2'-脱乙酰基-N 2'-(3-巯基-1-氧丙基)-美登素(DM1)、N 2'-脱乙酰基-N2'-(4-巯基-1-氧戊基)-美登素(DM3)和N 2'-脱乙酰基-N 2'(4-甲基-4-巯基-1-氧戊基)-美登素(DM4))、降钙霉素、尾海兔素、美登素、α-鹅膏毒素、绿脓杆菌外毒素(PE38)、蓖麻毒蛋白A链、白喉毒素、商陆抗病毒蛋白(PAP)、皂草素、白树毒素和微管蛋白细胞溶素。

56.根据段落53使用的方法或分子，其中化学治疗剂选自替莫唑胺、埃博霉素、美法仑、卡莫司汀、白消安、洛莫司汀、环磷酰胺、达卡巴嗪、聚苯丙生、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、二氯甲基二乙胺、白消安、环磷酰胺、卡铂、顺铂、噻替哌、卡培他滨、链脲佐菌素、比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特、醋酸亮丙瑞林、盐酸阿霉素、硫酸博来霉素、盐酸柔红霉素、放线菌素、柠檬酸脂质体柔红霉素、盐酸脂质体多柔比星、盐酸表柔比星、盐酸依达比星、丝裂霉素、多柔比星、戊柔比星、阿那曲唑、枸橼酸托瑞米芬、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟达拉滨、氟尿苷、干扰素α-2b、普卡霉素、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、干扰素α-2a、醋酸甲羟孕酮、雌莫司汀磷酸钠、雌二醇、醋酸亮丙瑞林、醋酸甲地孕酮、醋酸奥曲肽、二磷酸己烯雌酚、睾内酯、醋酸戈舍瑞林、磷酸依托泊苷、硫酸长春新碱、依托泊苷、长春碱、依托泊苷、硫酸长春新碱、替尼泊苷、曲妥珠单抗、吉妥珠单抗、利妥昔单抗、依西美坦、盐酸依立替康、天冬酰胺酶、盐酸吉西他滨、六甲蜜胺、米托坦、盐酸丙卡巴肼、酒石酸长春瑞滨、戊抑素钠、米托蒽醌、培门冬酶、昂他克、阿利维甲酸、卟菲尔钠、蓓萨罗丁、紫杉醇、多西紫杉醇、三氧化二砷、维甲酸以及其中两者或更多者的组合。

57.根据段落52至54中任一项使用的方法或分子，其中所述化学治疗剂选自烷基化剂、包含胸苷酸合酶抑制剂的抗代谢药物、紫杉烷、蒽环类、包含植物生物碱的抗微管剂以及其中两者或更多者的组合。

58.根据段落57使用的方法或分子，其中所述化学治疗剂选自紫杉醇、多西紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇、卡巴他赛、其任何一种相同的衍生物以及任何以上提及的两种或更多种的组合。

59.根据段落57或58的方法，其中所述烷基化剂选自氮芥、亚硝基脲(诸如卡莫司汀)、四嗪、氮丙啶、铂以及其中的衍生物、非经典烷基化剂以及其中两者或更多者的组合。

60.根据段落59使用的方法或分子，其中所述铂选自顺铂、卡铂、奥沙利铂、赛特铂、吡铂、奈达铂、三铂、顺铂脂质体以及其中两者或更多者的组合。

61.根据段落57或58中任一项使用的方法或分子，其中所述烷基化剂是选自抗叶酸剂(例如甲氨蝶呤和培美曲塞)、嘌呤类似物(例如诸如硫唑嘌呤、巯基嘌呤、硫嘌呤的硫嘌呤、氟达拉滨(包含磷酸盐形式)、喷司他丁和克拉屈滨)、嘧啶类似物(例如诸如5-氟尿嘧啶的氟嘧啶类药物和诸如卡培他滨

的其前药)、氟尿苷、吉西他滨、阿糖胞苷、地西他滨、盐酸雷替曲定(托莫德)、克拉屈滨和6-氮杂尿嘧啶以及两种或更多种其中的组合的抗代谢药物。

62.根据段落56至60中任一项使用的方法或分子，其中所述蒽环类选自柔红霉素(道诺霉素)、柔红霉素(脂质体)、多柔比星(阿霉素)、多柔比星(脂质体)、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌以及两种或更多种其组合，特别是多柔比星。

63.根据段落53至62中任一项使用的方法或分子，其中所述药物是抗癌药，例如选自拓扑异构酶抑制剂、PARP抑制剂以及它们的组合或更多种相同的组合。

64.根据段落53至64中任一项使用的方法或分子，其中所述抗癌疗法是放射性核素，例如选自Y-90、P-32、I-131、In-111、Sr-89、Re-186、Sm-153、Sn-117m以及其中两者或更多者的组合。

65.根据段落1a、1b或1c至64中任一项使用的方法或分子，其包括向癌症患者施用包括GLA组分和有效载荷的分子，例如在癌症难治的情况下。

66.根据段落65使用的方法或分子，其中所述癌症是上皮癌，例如结肠直肠癌、睾丸癌、肝癌、胆道癌、成胶质细胞瘤、黑素瘤、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、子宫癌、胃癌、食道癌、甲状腺癌、肾癌、膀胱癌、脑癌、头颈癌或肺癌，或者可选地，所述癌症可以是血癌，例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤和诸如AML、CML、ALL和CLL的慢性骨髓增生性疾病。

67.根据段落1至66中任一项使用的方法或分子，其中所述有效载荷被转化为来自细胞内部的活性形式。

68.根据段落67使用的方法或分子，其中通过酶进行向活性形式的转化。

69.根据段落68使用的方法或分子，其中所述酶选自羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶、对氧磷酶(诸如对氧磷酶2)、基质金属蛋白酶、碱性磷酸酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、嘌呤-核苷磷酸化酶、β-内酰胺酶(例如，由结核分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌生产)以及胞嘧啶脱氨酶。

70.根据权利要求1至69中任一项所述方法或分子，其中所述GLA组分具有SEQ IDNO：6所示的序列或排除组氨酸标签的等同序列。

在一个实施例中，GLA组分在内在化之前在细胞上结合表面暴露的磷脂酰丝氨酸。

虽然不希望受到理论的束缚，但本发明人相信，从生物学的观点来看，并非所有的磷脂酰丝氨酸都是等同的。本发明人认为，由酶TMEM16F暴露的磷脂酰丝氨酸参与免疫抑制，并且是本公开的分子“看到的”。

在一个实施例中，所述干细胞是成体干细胞或由此衍生的囊泡，例如体干细胞，诸如造血干细胞、间充质干细胞或基质干细胞。

在一个实施例中，所述干细胞是胚胎干细胞或由此衍生的囊泡。在一个实施例中，所述细胞不是胚胎干细胞。

在一个实施例中，所述方法涉及哺乳动物干细胞，例如人干细胞。本文讨论的干细胞主要是人干细胞。然而，技术人员能够根据需要鉴定其他哺乳动物的相关或相应的干细胞群。例如，SSEA-1是用于小鼠胚胎干细胞、人类生殖系细胞和胚胎癌细胞的标记物；SSEA-3是用于灵长类胚胎干细胞、人类胚胎生殖系细胞、人类胚胎干细胞和胚胎癌细胞的标记物；SSEA-4是用于灵长类胚胎干细胞、人类胚胎生殖系细胞、人类干细胞、胚胎癌细胞的标签；CD324是用于人类和小鼠胚胎干细胞、胚胎癌细胞的标记物；CD90是用于人类和小鼠胚胎干细胞、造血干细胞、胚胎癌细胞的标记物；CD117是用于人类和小鼠胚胎干细胞、造血干祖细胞、神经脊源性黑素细胞、原生殖细胞、胚胎癌细胞的标记物；CD326是用于人类和小鼠胚胎干细胞、胚胎癌细胞的标记物；CD9是用于人类和小鼠胚胎干细胞的标记物；CD24是用于人类和小鼠胚胎干细胞的标签。CD29是用于人类和小鼠胚胎干细胞的标记物；CD59是用于人类和小鼠胚胎干细胞的标记物；CD133是用于人类和小鼠胚胎干、胚胎癌细胞、造血干细胞的标记物；CD31是用于人类和小鼠胚胎干细胞的标记物；TRA-1-60是用于人类胚胎干细胞、畸胎癌、胚胎生殖细胞、胚胎癌细胞的标记物。TRA-1-81是用于人类胚胎干细胞、畸胎癌、胚胎生殖细胞、胚胎癌细胞的标记物；卷曲受体5是用于人类和小鼠胚胎干细胞的标记物；干细胞因子(SCF)是用于人类和胚胎干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、胚胎癌细胞的标记物；以及Cripto是用于人类和小鼠胚胎干细胞、心肌细胞和胚胎癌细胞的标记物。

在一个实施例中，所述有效载荷包括治疗剂。

在一个实施例中，所述有效载荷包括可检测的标签。

在一个实施例中，所述有效载荷包括DNA或RNA序列，例如包括转基因或RNAi序列的cDNA(诸如miRNA、包含shRNA的siRNA)。编码转基因的DNA可以被递送转录活性DNA或用于瞬时或稳定表达的质粒。

在一个实施例中，所述有效载荷适合于诱导干细胞的分化，例如激活和/或成熟细胞成为特定谱系。

在一个实施例中，本公开的方法包括对患者进行预处理，例如以诱导或增强干细胞上PS的表达，例如，所述预处理步骤可以用放射疗法，特别是骨髓细胞的辐射处理。

本公开还扩展到药用组合物，所述药用组合物包括根据本公开使用的，特别是如本文所描述使用的分子。因此，在一个实施例中，根据本公开的分子应用于细胞内靶标的处理。

本公开还扩展到GLA-组分的使用，所述GLA-组分包括GLA结构域或其中的活性片段，其中所述GLA-组分不包括来自GLA蛋白的活性催化结构域，用于细胞内靶向和递送(包含有效载荷的细胞内递送)。

本公开还扩展到GLA-组分的使用，所述GLA-组分包括GLA结构域或其中的活性片段，其中所述GLA-组分不包括来自GLA蛋白的活性催化结构域，用于制造细胞内靶向和递送(包含有效载荷的细胞内递送，特别是在有效载荷包括治疗实体/分子的情况下)的药物。

本技术可以用于在干细胞移植之前清除患者的免疫细胞，例如有效载荷通常是例如包括卡莫司汀的化疗。

用于免疫细胞消融的当前制度是，第6天(BCNU)300mg/m²，第5天至第2天(每天)依托泊苷200mg/m²和阿糖胞苷200mg/m²，第1天美法仑140mg/m²(BEAM)。在第2天和第1天施用兔抗胸腺细胞球蛋白(2.5mg/kg/d)。这种制度可以通过将每种药剂与本公开的GLA分子缀合调整适应。

在一个实施例中，免疫闭塞用于癌症、用于血癌(例如选自骨髓瘤、淋巴瘤、诸如急性髓细胞白血病(AML)的白血病、慢性骨髓增生性疾病、原因不明的单克隆丙种球蛋白病、诸如AML、CML、CLL或ALL的骨髓增生异常综合征和淀粉样变性)。

在一个实施例中，所述骨髓瘤选自多发性骨髓瘤，淀粉样变性和浆细胞瘤。

在一个实施例中，所述骨髓瘤选自原因不明的单克隆丙种球蛋白病、无症状骨髓瘤、有症状骨髓瘤和卡勒氏病。

在一个实施例中，所述淋巴瘤选自间变性大细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤，伯基特样淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、纵隔大B细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、甲状腺淋巴瘤和华氏巨球蛋白血症。

在一个实施例中，所述慢性骨髓增生性疾病选自原发性血小板增多症、慢性特发性骨髓纤维化和真性红细胞增多症。

在一个实施例中，所述白血病选自急性髓细胞性白血病(AML)、毛细胞白血病、急性淋巴细胞性白血病和诸如AML的慢性淋巴细胞性白血病。

最近变得很明显，对于严重的自身免疫性疾病，诸如严重的多发性硬化症和严重的关节炎，跟随干细胞移植的免疫细胞闭塞可以缓解疾病。因此，本公开的消融疗法可以用于自身免疫疾病，诸如多发性硬化症和关节炎。

在一个实施例中，本公开的GLA分子连接(例如缀合)至包括可检测标签的有效载荷。下面给出了可检测标签的实例。所述可检测标签可以应用于分选或分离干细胞，例如应用FAC分选、磁性分选或类似方法。因此，在一个实施例中提供了一种方法，所述方法应用本公开的GLA分子分离或富集干细胞。这是有利的，因为从历史上讲，某些干细胞群(诸如癌干细胞)的分离非常困难。

所述标记的GLA分子也可以作为显像剂应用于体内，特别是作为诊断工具，例如鉴定原发性肿瘤或转移灶中的癌干细胞。这对于在手术和/或化疗后监测患者以确保癌症缓解可能很重要。

可以将连接到GLA分子的DNA转基因有效载荷和/或RNA有效载荷应用为病毒载体递送(转导)或传统转染的替代性细胞内递送。这可以应用于体外以在细胞(例如，修饰的干细胞用于再输注到患者体内)中表达外源或内源蛋白或可以在体内实现。所述基因可以瞬时表达，或可以设计成稳定整合到干细胞中。

令人惊讶的是，本发明人已经表明，根据本公开的分子不仅结合干细胞，它们还与附着在其上的有效载荷一起快速内在化。

具体实施方式

如本文所应用的细胞内递送是指运送，例如将有效载荷运送至细胞内部。

在一个实施例中，所述有效载荷未被内在化。

在一个实施例中，所述GLA-组分和有效载荷未被内在化。

本文所应用的有效载荷是指与GLA结构域连接的分子，特别是为了细胞内递送的目的。所述连接可以是通过化学偶联的连接，其使用例如马来酰亚胺化学或点击化学以将一部分锚定到暴露于溶剂的赖氨酸。可选地，所述连接可以是融合，例如肽键，其中所连接的实体表达为与GLA组分的融合蛋白，例如，这可能适合于某些可检测的标签，诸如荧光蛋白或抗体。可以在GLA-组分和有效载荷之间应用连接子。有效载荷可以包括药物、毒素、聚合物、生物活性蛋白、治疗性病毒、溶瘤病毒、病毒载体、放射性核素、金属螯合剂和/或报告基团(诸如标签)。

在一个实施例中，每个GLA-组分连接1、2、3、4或5个有效载荷。

GLA-组分(在本文中也称为γ-羧基谷氨酸组分)是指在缺少来自GLA蛋白(诸如蛋白S)的催化结构域的情况下包括GLA-结构域的多肽。所述多肽可以进一步包括例如来自蛋白S的EGF结构域和/kringle结构域。在一个实施例中，GLA组分包括30至300个氨基酸残基，例如50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300个残基。在一个实施例中，GLA组分在4.5至30kDa的范围内。在一个实施例中，GLA组分包括SEQ ID NO：1所示的序列。在一个实施例中，GLA组分包括SEQ ID NO：6所示的序列或其排除组氨酸标签的其衍生物。

本文所用的GLA结构域(维生素K依赖性羧化/γ-羧基谷氨酸)是已经通过氨基序列中谷氨酸残基的维生素K依赖性翻译后羧化修饰的蛋白结构域，以用于提供γ-羧基谷氨酸(Gla)。在一个实施例中，在本公开的分子中应用的GLA结构域包括来自天然(野生型)GLA结构域的30至45个连续残基。在一个实施例中，GLA结构域包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个GLA残基。

在一个实施例中，30％或更少的GLA组分是GLA残基。

在一个实施例中，GLA组分包括1至5个二硫键，例如1、2、3、4或5个二硫键。

GLA结构域通过将钙离子螯合在两个羧酸残基之间来结合钙离子。这些残基是区域的一部分，所述区域从GLA蛋白成熟形式的N端开始，并且以保守的芳族残基终止。这导致在结构域的中间发现保守的Gla-x(3)-Gla-x-Cys基序，并且这似乎对羧化酶识别底物是重要的。

GLA结构域包含在多种GLA蛋白中，诸如凝血酶、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C、蛋白S(PrS)、蛋白Z、骨钙蛋白、基质GLA蛋白、GAS6、转甲状腺素蛋白、骨膜蛋白、富含脯氨酸的GLA 1、富含脯氨酸的GLA2、富含脯氨酸的GLA3以及富含脯氨酸的GLA 4。

如本文所应用，GLA结构域还延伸至蛋白，其中天然GLA结构域中1％至10％(诸如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％)的氨基酸可以被替换并删除，前提是在适合的体外测定中修饰的结构域保留了天然(未修饰的GLA结构域)的天然活性的至少70％(诸如75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。

本文所应用的EGF结构域是指保守的蛋白结构域。它包括约30至40个氨基酸残基，并且已经在许多大部分动物蛋白中发现。在膜束缚蛋白的细胞外结构域或已知分泌的蛋白中发现大部分EGF样结构域的出现。EGF样结构域包含6个半胱氨酸残基。EGF样结构域的主要结构是两链β折叠，其跟随一个短C端、两链β折叠的环。这两个β折叠通常表示为主要(N端)折叠和次要(C端)折叠。EGF样结构域频繁出现在蛋白中的许多串联拷贝中：这些重复通常折叠在一起以形成一个单一的、线性的螺线管结构域块作为一个功能单元。在一个实施例中，所应用的结构域是全长的天然结构域。

如本文所应用，EGF结构域还延伸至蛋白，其中天然EGF结构域中1％至10％(诸如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％)的氨基酸可以被替换并删除，前提是在适合的体外测定中修饰的结构域保留了天然(未修饰的EGF结构域)的天然活性的至少70％(诸如75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。在一实施例中，所述蛋白是全长天然结构域。

本文所应用的Kringle结构域是指折叠成由3个二硫键稳定的大环的自主蛋白结构域。它们的特征在于三环、3-二硫键桥结构，其构象由多个氢键和反平行β折叠的小片限定。它们在血液凝固蛋白和纤溶蛋白中以不同数量的拷贝被发现于一些血浆蛋白中，其包含凝血酶原和尿激酶型纤溶酶原激活剂，它们是MEROPS肽酶家族S1A的丝氨酸蛋白酶。

如本文所应用，Kringle结构域还延伸至蛋白，其中天然kringle结构域中1％至10％(诸如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％)的氨基酸可以被替换并删除，前提是在适合的体外测定中修饰的结构域保留了天然(未修饰的Kringle结构域)的天然活性的至少70％(诸如75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。在一个实施例中，所应用的结构域是全长的天然结构域。

本文所应用的蛋白活性片段小于整个天然蛋白(或相关结构域)，在相关的体外测定中，所述蛋白保留了天然全长结构域或蛋白活性的至少50％(诸如60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。

本文所应用的催化结构域是在C端方向上的EGF结构域下游的一个结构域(或片段)，例如如图1A所示。

本文所应用的体外是指未在人或动物体内进行的实验室工作。

本文所应用的体内是指在活生物体，特别是人或动物中的工作/测试/治疗。

本文所应用的干细胞是指能够分化的未分化细胞，并且包含胚胎干细胞和成体干细胞，特别是成体干细胞。

造血干细胞(HSCs)或血胚细胞是通过造血过程产生所有其他血细胞的干细胞。它们来源于中胚层，位于红骨髓中，这是大多数骨骼的核心。

如本文所应用，癌症干细胞是指致瘤细胞(即在肿瘤或血癌范围内发现的癌细胞)，所述致瘤细胞具备与正常干细胞相关的特征，特别是产生特定的癌症样本中发现的所有细胞类型的能力。例如参见2009年10月《生物学论文集(BioessayS)》癌症干细胞的鉴定和靶向，31(10)1038-1049。癌干细胞由三个不同的特性限定：i)引发肿瘤和驱动瘤性增生的选择性能力；ii)通过自我更新创造自身无限拷贝的能力，以及iii)通过分化产生更成熟的非干细胞癌后代的潜力。癌干细胞不一定源自健康的干细胞，而可能源自来源于分化的细胞。

CD34也被称为造血祖细胞抗原CD34，其具有作为细胞-细胞粘附因子的功能。它可以应用为富集干细胞群的标记物。

本文所应用的分子在最广泛的意义上使用，并且不仅包含合成化学分子，还包含诸如蛋白、聚合物(天然或其他)、核糖核酸分子、标签等的大分子。

有效载荷可以包括药物、毒素、聚合物、生物活性蛋白、放射性核素、金属螯合剂和/或报告基团。

除非上下文另有说明，否则本文所应用的药物旨在指小的化学实体，例如已经通过有机化学方法合成的小化学实体，特别是已经批准或许可使用或正在许可用于治疗用途的分子，尤其是在人类中。本文所应用的药物还包含抗病毒化合物、抗生素和抗癌疗法。

本文所应用的抗病毒化合物(抗病毒剂)是指特异性地用于治疗病毒感染的药物级别，包含广谱抗病毒剂以及特异于特定病毒或特定病毒家族的“窄”谱。

本文所应用的抗生素是指抑制细菌生长或破坏细菌的药物或药剂。除非上下文另有说明，否则本文的抗菌剂和抗生素可以互换使用。

本文所应用的抗寄生虫药是指抑制寄生虫生长、破坏寄生虫或从宿主去除寄生虫的药物或药剂。

抗癌疗法是一个广义术语，其包含抗癌药物、化疗、放疗、免疫肿瘤疗法等。

本文所应用的抗癌药通常是指小分子癌症疗法。

如本文中的化疗通常是指细胞毒性剂并且包含抗肿瘤药。

生物治疗剂(也称为生物制药、生物学或生物制剂)是从生物学来源“衍生”的治疗产品，例如包含抗体分子的重组蛋白和片段，其包含抗体、抗体结合片段和多特异性抗体分子以及这些材料的复杂组合。生物活性蛋白是生物治疗剂的一个亚组，并且包含重组蛋白及其中的活性片段(包含抗体分子)。

本文所应用的抗体分子包含具有全长重链和轻链的完整抗体或其中的片段，以及包括任一项相同的分子，例如Fab、修饰的Fab、Fab'、修饰的Fab'、F(ab')2、Fv、Fab-Fv、Fab-dsFv、单结构域抗体(例如VH或VL或VHH)、scFv、双价、三价或四价抗体、Bis-scFv、双抗体、三抗体、四抗体和以上任一项的表位结合片段(例如参见Holliger和Hudson 2005年《自然生物技术(Nature Biotech)》，23(9):1126-1136与Adair和Lawson 2005年《药物设计线上综述(Drug Design Reviews-Online)》，2(3),209-217)。用于创造和制造这些抗体片段的方法在本领域中是众所周知的(例如参见Verma等人1998年《免疫学方法杂志(Journal ofImmunological Methods)》，216,165-181)。用于本发明的其他抗体片段包含国际专利申请WO2005/003169、WO2005/003170和WO2005/003171中描述的Fab和Fab′片段。多价抗体可以包括例如双特异性的多特异性，或可以是单特异性(例如参见WO 92/22853和WO05/113605)。在所述实例中尤其考虑双特异性和多特异性抗体变体，因为目的是中和两个独立的靶蛋白。本公开的抗体的可变区可以配置为生产能够与两个靶抗原结合并且中和的单一抗体变体。

可以使用本技术在细胞内递送抗体以及其中的结合片段，特别是小抗体片段，诸如结构域抗体、VHH、单链Fv(scFv)、ds-scFv和dsFv。

在一个实施例中，抗体或其中的结合片段是检查点抑制剂，例如抗PD-1或抗PD-L1抑制剂。

在一个实施例中，抗体分子是人类的或人性化的。

毒素是有毒物质，尤其是源自天然来源，特别是蛋白。许多毒素(诸如加利车霉素)已经用于癌症疗法。此外，化学治疗剂可以被认为是有毒的(或毒素)。因此，毒素的定义与本文的其他定义重叠。然而，像蛇毒一样的神经毒素是毒素，而不是化学治疗剂。然而，本领域技术人员熟悉这些技术定义并且能够理解本公开的上下文的含义。

本文所用的诊断剂是用于分析或成像以诊断、标记或监测或了解疾病状态的药剂。诊断通常将包括报告分子，诸如可以某种方式可视化、测量或监测的标签或类似物。

适合于本公开的放射性核素包含铊-201、锝-99m、碘-123、碘-131、碘-125、氟-18和氧-15。

同样地，特别感兴趣的是，使用GLA-组分例如经由GLA-融合来递送胞内抗体，例如其中所述胞内抗体被融合到GLA-组分的N端或C端。胞内抗体能够靶向细胞内抗原。

在一个实施例中，在RAS信号传导通路中互作和抑制RAS或蛋白的抗体被用于有效载荷中。RAS基因构成一个多基因家族，包含HRAS、NRAS和KRAS。RAS蛋白是小鸟嘌呤核苷酸结合的GTP酶，其在细胞内起着关键信号传导枢纽的作用。RAS/MAPK通路已经在肿瘤发生方面进行了广泛研究，因为它的体细胞失调是癌症的主要原因之一。RAS在约20％的恶性肿瘤中发生体细胞突变(Bos JL 1989年《癌症研究(Cancer Res)》49:4682-4689)。在这种特定的情况下，可以设想，例如，GLA组分融合至RAS胞内抗体(在Cetin M等人2017年《分子生物学杂志(J Mol Biol)》429:562-573中描述)。

本文所应用的凋亡是细胞死亡通路，其作为生物体生长的正常和受控部分而发生。由凋亡引起的细胞死亡对周围组织的损害小于诸如坏死的细胞死亡机制。

本文所应用的坏死是来自疾病或损伤的细胞死亡。它向周围组织释放可能损害周围细胞的细胞因子和因子。坏疽是坏死细胞死亡的一个实例。

化学治疗剂

除非上下文另有说明，否则化学治疗剂和化疗或细胞毒性剂在本文中可以互换应用。

如本文所应用的化疗旨在指对恶性细胞和组织具有“选择性”破坏的特定抗肿瘤化学剂或药物，例如烷基化剂、包含胸苷酸合酶抑制剂的抗代谢药物、蒽环类药物、包含植物生物碱的抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂、parp抑制剂和其他抗肿瘤药剂。在这种情况下，选择性地松散使用是因为这些药剂中的许多当然具有严重的副作用。

执业医师可以基于所治疗癌症的性质来选择优选剂量。

可以在本公开的方法中应用的烷基化剂的实例包含烷基化剂氮芥、亚硝基脲、四嗪、氮丙啶、铂及其衍生物以及非经典烷基化剂。

例如含有铂的化学治疗剂(也称为铂)，诸如顺铂、卡铂、奥沙利铂、赛特铂、吡铂、奈达铂、三铂和顺铂脂质体(顺铂的脂质体版本)，尤其是顺铂、卡铂和奥沙利铂。

取决于确切的癌症，顺铂的剂量范围为约20至约270mg/m²。通常地，所述剂量范围为约70至约100mg/m²。

氮芥包含二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺和白消安。

亚硝基脲包含N-亚硝基-N-甲基脲(MNU)、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)和甲基环己亚硝脲(MeCCNU)、福莫司汀和链脲霉素。四嗪包含达卡巴嗪、米托唑胺和替莫唑胺。

氮丙啶包含噻替派、自力霉素和亚丝醌(AZQ)。

可以在本公开的方法中应用的抗代谢药物的实例包含抗叶酸剂(例如甲氨蝶呤和培美曲塞)、嘌呤类似物(例如诸如硫唑嘌呤、巯基嘌呤、硫嘌呤的硫嘌呤、氟达拉滨(包含磷酸盐形式)、喷司他丁和克拉屈滨)、嘧啶类似物(例如诸如5-氟尿嘧啶的氟嘧啶类药物和诸如卡培他滨

的其前药)、氟尿苷、吉西他滨、阿糖胞苷、地西他滨、盐酸雷替曲定(托莫德)、克拉屈滨和6-氮杂尿嘧啶。

可以在本公开的方法中应用的蒽环类药物的实例包含柔红霉素(道诺霉素)、柔红霉素(脂质体)、多柔比星(阿霉素)、多柔比星(脂质体)、表柔比星、伊达比星、目前仅用于治疗膀胱癌的戊柔比星以及http://en.wikipedia.org/wiki/Bladder_cancer蒽环类药物类似物http://en.wikipedia.org/wiki/Mitoxantrone的米托蒽醌，尤其是多柔比星。

可以在本公开的方法中应用的抗微管剂的实例包含长春花生物碱和紫杉烷。

长春花生物碱包含完全天然的化学品，例如长春新碱和长春花碱，并且也包含半合成的长春花生物碱，例如长春瑞滨、长春地辛和长春氟宁。

紫杉烷包含紫杉醇、多西紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇、卡巴他赛以及其衍生物。如本文所应用的紫杉烷的衍生物包含例如在胶束配方中的紫杉烷样紫杉醇的重制，衍生物还包含化学衍生物，其中合成化学应用于修饰原始材料，即紫杉烷。

可应用于本公开的方法的拓扑异构酶抑制剂包含I型拓扑异构酶抑制剂、II型拓扑异构酶抑制剂和II型拓扑异构酶毒物。I型抑制剂包含拓扑替康、伊立替康、吲哚替康和靛蓝替康。II型抑制剂包含染料木黄酮和具有以下结构的ICRF 193：

II型毒物包含安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷以及多柔比星和氟喹诺酮。

在一个实施例中，所述化学治疗剂是PARP抑制剂。

标签

在一个实施例中，所述有效载荷包括荧光标签、化学发光标签、放射性标签、酶、染料或配体。

根据本公开的标签被限定为可以使用测定法检测的任何部分。报告分子的非限制性实例包含酶、放射性标签、半抗原、荧光标签、磷光分子、化学发光分子、生色团、光亲和分子、诸如生物素的有色颗粒或配体。

标签缀合物通常优选用作诊断剂。诊断剂通常属于两类，它们是用于体外诊断的药剂以及用于体内诊断规程的药剂，通常被称为“定向成像”。许多合适的成像剂是本领域已知的，它们附着在肽和多肽上的方法也是如此(例如，参见美国专利5,021,236、4,938,948和4,472,509)。所使用的成像部分可以是顺磁性离子、放射性同位素、荧光染料、NMR可检测物质和X射线成像剂。

在顺磁性离子的情况下，可以举例提及离子，诸如铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II))、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和/或铒(III)，特别优选钆。在其他情况下，有用的离子(诸如X射线成像)包括但不局限于镧(III)、金(III)、铅(II)，并且尤其是铋(III)。

在用于治疗和/或诊断应用的放射性同位素的情况下，可以提及砹²¹¹、¹⁴碳、⁵¹铬、³⁶氯、⁵⁷钴、⁵⁸钴、铜⁶⁷、¹⁵²铕、镓⁶⁷、³氢、碘¹²³、碘¹²⁵、碘¹³¹、铟¹¹¹、⁵⁹铁、³²磷、铼¹⁸⁶、铼¹⁸⁸、⁷⁵硒、³⁵硫、锝^99m和/或钇⁹⁰。¹²⁵碘适合用于某些实施例，并且锝^99m和/或铟¹¹¹由于它们的低能量和适合于远距离检测而特别适用。放射性标记的肽和多肽可以根据本领域众所周知的方法生产。例如，可以通过使碘化钠和/或碘化钾与诸如次氯酸钠或诸如乳过氧化物酶的酶促氧化剂的化学氧化剂接触来碘化肽和多肽。可以通过配体交换过程用锝^99m标记肽，例如，用亚锡溶液还原高锝酸盐，将还原的锝螯合在交联葡聚糖色谱柱上，并且将肽施用于所述色谱柱上。可选地，可以使用直接标记技术，例如通过孵育高锝酸盐、还原剂(诸如SNCl₂)、缓冲溶液(诸如邻苯二甲酸钠钾盐溶液)和肽。通常用于将作为金属离子存在的放射性同位素结合到肽上的中间官能团是二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。

适合用于有效载荷的荧光标签包含Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、级联蓝、Cy3、Cy5,6-FAM、异硫氰酸酯荧光素、HEX、6-JOE，俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、海水蓝、REG、若丹明绿、若丹明红、肾造影剂、ROX、TAMRA、TET、四甲基若丹明和/或德克萨斯红。

有效载荷的另一种类型是适合用于体外，其中肽与次级结合配体和/或与酶(一种酶标签)连接，所述酶在与生色底物接触时会生成有色产物。适合的酶的实例包含脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶。优选的次级结合配体是生物素和抗生物素蛋白以及链霉亲和素化合物。这种标签的使用是本领域技术人员众所周知的，并且例如在美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241中描述。

用于将肽连接至其缀合物部分的附着的其他方法是本领域已知的。一些附着方法涉及使用金属螯合复合物，例如使用一种有机螯合剂，诸如二乙烯三胺五乙酸酐(DTPA)；乙烯三胺四乙酸；N-氯-对甲苯磺酰胺；和/或附着在抗体上(美国专利4,472,509和4,938,948)的四氯-3α-6α-二苯基甘脲-3。肽或多肽也可以在偶联剂(诸如戊二醛或高碘酸盐)的存在下与酶反应。在这些偶联剂的存在下或通过与异硫氰酸酯反应来制备具有荧光素标记物的缀合物。

在一个实施例中，所述标记物能够染色或标记干细胞的细胞核。

在本公开中适合用作有效载荷的病毒

在一个实施例中，本公开中所应用的病毒是包膜病毒，例如选自疱疹病毒(诸如单纯性疱疹1)、痘病毒(诸如痘苗病毒)、肝炎病毒、黄病毒、囊膜病毒、冠状病毒、D型肝炎、正粘病毒、副粘病毒(诸如麻疹或新城鸡瘟病毒)、棒状病毒、布尼亚病毒、丝状病毒以及弹状病毒(诸如印第安纳水泡性口炎病毒(VSV))。

在一个实施例中，本公开中所应用的病毒是非包膜病毒，例如选自腺病毒科(诸如腺病毒)、乳头瘤病毒科、小核糖核酸病毒科(诸如柯萨奇病毒或塞内加谷病毒(例如塞内卡病毒))、呼肠孤病毒。

在一个实施例中，所述病毒是腺病毒，例如人腺病毒，诸如选自B组病毒(特别是Ad3、Ad7、Ad11、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35、Ad51或其中的嵌合体，诸如Enadenotucirev)、C组病毒(特别是Ad1、Ad2、Ad5、Ad6或其中的嵌合体)、D组病毒(特别是Ad8、Ad10、Ad13、Ad15、Ad17、Ad19、Ad20、Ad22、Ad30、Ad32、Ad33、Ad36、Ad37、Ad38、Ad39、Ad42、Ad43、Ad44、Ad45、A46、Ad47、Ad48、Ad49、Ad50或其中的嵌合体)、E组病毒(特别是Ad4)、F组病毒(特别是Ad40、Ad41或其中的嵌合体)以及B组病毒、C组病毒、D组病毒、E组病毒或F组病毒中两种或更多种的嵌合体。

绝大多数病毒具有已经充分描述了的与靶细胞识别和摄取有关的蛋白。可以使用Verheije和Rottier 2012年《病毒学进展(Adv.Virology)》综述2012:798526中描述的方法改变它们的取向，以将肿瘤重新定向或使之更有选择性地靶向溶瘤病毒。

不涉及天然病毒靶向的其他病毒细胞表面蛋白可以具有在其上改造的靶向基序(例如Salisch等人2017年《公共科学图书馆期刊(PLoS One)》12:e0174728：腺病毒病毒体小外壳蛋白IX)。

包膜病毒具有覆盖病毒衣壳的外膜(包膜)。所述包膜通常源自宿主细胞膜的部分(磷脂和蛋白)，但也包含一些病毒蛋白。包膜表面的糖蛋白有助于鉴定并结合至宿主膜上的受体位点。病毒的包膜随后与宿主膜融合，允许衣壳和病毒基因组进入并感染宿主。

WO2014/13834中公开了多种溶瘤病毒，通过引用将其并入本文。

单纯疱疹病毒(HSV)通过四种必需糖蛋白-gD、gH/gL、gB的方式进入细胞，这些糖蛋白通过gD与其受体之一的粘连蛋白1和HVEM结合而以级联方式激活。通过将配体和scFv插入gC和/或gD蛋白或gH中，实现了HSV的重新靶向(Campadelli-Fiume G等人2011年《医学病毒综述(Rev in Med Virol)》21:213-226、Gatta V 2015年《公共图书馆病原体(PLoSPathog)》11:e1004907)。已经开发出溶瘤性单纯疱疹病毒1型载体用于临床。这些病毒具有复制能力，并且在影响病毒复制、神经致病性和免疫逃避性的基因中具有突变，并且例如包含诸如NV1020(R7020)、dlsptk、d18.36tk、hrR3、R3616、1716的第一代病毒、诸如G207(MGH-1)、3616UB、SUP、NV1023的第二代病毒、诸如G47Δ的第三代病毒、转录表达载体(例如G92A、d12.CALP、Myb34.5)，诸如rRP450的转基因表达载体以及诸如Talimogene laherparepvec(T-Vec)的其他病毒。所述HSV-1载体被认为可用于治疗多种实体瘤，例如包含神经胶质瘤、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌和胰腺癌。所述HSV-1病毒感染大范围的细胞类型和种类，其本质上具有溶细胞作用，所述病毒的复制生命周期导致宿主细胞被破坏，其特征明确且基因组庞大(152K)，但包含许多用于插入治疗性基因提供高达30K空间的非必需基因。通常地，出于安全原因，HSV病毒不会在胸苷激酶基因中突变。Talimogenelaherparepvec是溶瘤性疱疹病毒，其已经被批准用于黑色素瘤的治疗。其他疱疹基础病毒包含Virttu Biologics的G207、SEPREHVIR(HSV-1716)、HSV-1R3616突变体、HSV-1 1716突变体、NV1020(R7020)、R3616突变体(已删除RL1)，KM100突变体已经插入UL48(编码反式激活蛋白pUL48[VP16])和RL2基因、G92A、突变体、Myb34.5和rQNestin34.5。

痘病毒-可以应用诸如修饰的痘苗安卡拉(MVA)的痘苗病毒(Galmiche MC等人1997年《普通病毒学杂志(J Gen Virol)》78:3019-3027)，MVA可以被一个p14融合分子替换，所述融合分子携带一个针对肿瘤相关抗原MUC-1的插入的scFv(Paul S等人2007年《病毒免疫学(Viral Immunol)》20:664-671)。同时也参见，Liang L等人2014年《病毒(Viruses)》6:3787-3808、Hsiao JC等人1999年《病毒学杂志(J Virol)》73:8750-8761、Chen TL和Roffler S 2008年《药物研究综述(Med Res.Rev)》28:885-928以及Kinoshita T等人2008年《生物化学杂志(J Biochem)》144:287-294。由Jennerex公司提供的JX-594是一种删除了胸苷激酶的痘苗病毒加GM-CSF。GL-ONC1是减毒的痘苗病毒(李斯特菌株)，其可在临床前小鼠模型中引起多种实体瘤的消退和消除。

副粘病毒(诸如麻疹或新城鸡瘟病毒)，

麻疹病毒(MeV)是副粘病毒范围内的麻疹病毒属的单链、副链、有包膜(无分段)RNA病毒。麻疹病毒具有两个包膜糖蛋白：血凝素(H)附着蛋白和融合(F)蛋白。附着、进入和随后的细胞-细胞融合是经由2个麻疹受体、CD46和信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)介导。例如，参见Msaouel P等人2012年《分子生物学方法(Methods Mol Biol)》797:141-162、Robinson S.和Galanis E.2017年《关于生物疗法的专家意见(Expert Opin Biol Ther.)》17:353-363、Aref S等人2016年《病毒(Viruses)》8.Pii:E294；(Chen TL和Roffler S 2008年《药物研究综述(Med Res.Rev.)》28:885-928)和Kinoshita T等人2008年《生物化学杂志(J Biochem)》144:287-294)和(Russell SJ和Peng KW 2009年《当今微生物免疫主题(CurrTopic Microbiol.Immunol.)》330:213-241、Robinson S和Galanis E 2017年《关于生物疗法的专家意见(Expert Opin Biol Ther)》17:353-363、Aref S等人2016年《病毒(Viruses)》8.Pii:E294)。编码人类甲状腺碘化钠同向转运体或MV-NIS的麻疹病毒是麻疹病毒的减毒溶瘤埃德蒙斯顿(Ed)菌株。放射性碘成像为NIS基因表达监测提供了一种新技术。

也可以应用新城鸡瘟病毒。

腺病毒科腺病毒是用作溶瘤剂的研究最广泛的病毒之一。已经将一系列肽和蛋白工程化为与病毒体相关的病毒蛋白，以改变病毒的天然取向(Verheije MH和Rottier PJM2012年《病毒学进展(Adv Virol)》综述2012:798526)。然而，所有这些都依赖于细胞核中的病毒组装，这提出了显著性地挑战。

https://en.wikipedia.org/wiki/Adenoviridae-cite_note-1其他非包膜病毒包含柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒和呼肠孤病毒。例如参见Altan-Bonnet N 2016年《微生物界的最新意见(Curr Opin Microbiol)》32:77-81和Chen YH等人2015年《细胞(Cell)》160:619-630、Chen TL和Roffler S 2008年《药物研究综述(Med Res.Rev.)》28:885-928和Kinoshita T等人2008年在《生物化学杂志(J Biochem)》144:287-294和Verheije MH和Rottier PJM 2012年《Adv Virol》2012:798526)。

有多种腺病毒，例如诸如用于治疗前列腺癌的Ad5-yCD/mutTKSR39rep-hIL12、CGTG-102(Ad5/3-D24-GMCSF)、由Oncos Therapeutics，https://en.wikipedia.org/wiki/ Oncolytic_virus-cite_note-107例如用于治疗软组织肉瘤，例如Oncorine(H101)、CG0070、Enadenotucirev(EnAd)WO2005/118825、WO2008/080003中公开的OvAd1和OvAd2、ONCOS-102(例如用于不可切除的恶性胸膜间皮瘤)和DNX-2401(例如用于神经胶质瘤)。

Cavatak是一种制备野生型柯萨奇病毒A21的商品名，在治疗恶性黑色素瘤方面很有用。塞内加谷病毒(NTX-010)和(SVV-001)，例如用于小细胞肺癌和神经母细胞瘤。

呼肠孤病毒-

(pelareorep；野生型呼肠孤病毒；3型血清型Dearing；溶瘤细胞生物技术公司(Oncolytics Biotech))，例如用于治疗各种癌症和细胞增殖性障碍。

水泡性口腔炎病毒(VSV)VSV是另一种包膜的病毒，被应用为溶瘤剂。例如，参见Betancourt D等人2015年《病毒学杂志(J Virol)》89:11786-11800)和Hastie E和Grdzelishvili VZ 2012年《普通病毒学杂志(J Gen Virol)》综述93:2529-2545)。

病毒编码的蛋白

在一个实施例中，本公开的方法中应用的病毒或载体包括转基因，例如其中转基因用于替换细胞中的有缺陷的遗传物质，以在细胞中提供新的或增强的功能、以使细胞对治疗敏感、以阻断细胞功能或表达治疗性蛋白或肽。

在一个实施例中，根据本公开应用为有效载荷的病毒包括一种或多种转基因，例如编码独立地选自RNAi序列、蛋白、多肽或肽的药剂(例如抗体分子或其中的结合片段、趋化因子、细胞因子、免疫调节剂、荧光标签或酶)。

这包括但不局限于已经示出临床前承诺但缺乏有效且经济的递送方式的独特格式，例如肽、体内抗体和替代性支架(Boldicke T 2017年《蛋白科学(Protein Sci)》综述26:925-945、Marschall和Dubel 2016年《计算与结构生物技术杂志(Comput StructBiotechnol J)》14:304-308、Miersch和Sidhu 2016年《肽(Peptides)》F1000Res5.pii.F1000《学院综述(Faculty Rev)》1947、2015年Tsomaia《欧洲药物化学杂志(Eur JMed Chem)94:459-470》、Marschall ALJ等人2015年《单克隆抗体Mabs》7:1010-1035、AlDeghaither D等人《临床药理学杂志(J Clin Pharmacol)》55:S4-S20，2015)，并包含对肿瘤细胞、肿瘤干细胞、肿瘤相关内皮和肿瘤相关基质具有治疗作用的药剂。特别令人感兴趣的是可以起到多种功能例如作为治疗剂、生物标记物和/或诊断剂的分子。单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因是一种确立已久的前药转化酶，具有临床批准的前药(更昔洛韦-GCV)，例如参见Holder等人1993年《癌症研究(Cancer Res)》53:3475-3485、Touraine RL等人1998年《基因治疗(Gene Therapy)》5:1705-1711)。

此外，还可在治疗过程期间利用胸苷激酶蛋白表达来成像和跟踪病毒疗法的活性。正电子发射断层摄影术和单光子发射计算机断层摄影术两者均为常规用于检测和监测癌症和癌症疗法的方法，并且均为在施用合适的胸苷激酶底物后检测胸苷激酶蛋白表达的可行方式(Wang JQ等人2005年《生物有机化学与医药化学(Bioorg Med Chem)》13:549-556、Tjuvajev JG等人2002年《核医学杂志(J Nucl Med)》43:1072-1083)。可选地，可以使用NIS基因，并已经将其作为溶瘤病毒中用于诊断和治疗目的的药剂进行探索，非常类似于TK(Miller A和Russell S 2016年《关于生物疗法的专家意见(Expert Opin Biol Ther)》16:15-32、Ravera S等人2017年《生理学年评(Annu Rev Physiol)》79:261-289、Portulano等人2014年《内分泌综述(Endocr Rev.)》35:106-149)。

在一个实施例中，在本公开的病毒中编码互作和抑制RAS或RAS信号传导通路中的蛋白的抗体，例如作为具有GLA-组分的融合蛋白。RAS基因构成一个多基因家族，包含HRAS、NRAS和KRAS。例如参见Bos JL 1989年《癌症研究(Cancer Res)》49:4682-4689以及Cetin M等人2017年《分子生物学杂志(J Mol Biol)》429:562-573。

组合疗法

在一个实施例中，GLA-组分与例如抗癌疗法的第二种疗法组合使用。这是对GLA组分单独施用(即未与GLA组分连接)的疗法。

在一个实施例中，所应用的化学治疗剂的组合是本文所述的化学治疗剂，例如铂和5-FU或其前药，例如顺铂或奥沙铂和卡培他滨或吉西他滨，诸如FOLFOX。

在一个实施例中，所述化疗包括化学治疗剂，特别是细胞毒性化学治疗剂的组合。

在一个实施例中，所述化疗的组合包括铂，诸如顺铂和氟尿嘧啶或卡培他滨。

在一个实施例中，卡培他滨和奥沙利铂(Xelox)中的化疗组合。

在一个实施例中，所述化疗是亚叶酸和5-FU的组合，任选地与奥沙利铂组合。

在一个实施例中，所述化疗是亚叶酸、5-FU和伊立替康(FOLFIRI)的组合，任选地与奥沙利铂(FOLFIRINOX)组合。所述方案包含：伊立替康(90分钟内静脉输注180mg/m²)和亚叶酸(120分钟内静脉输注400mg/m²或[2 x 250mg/m²])；随后氟尿嘧啶(静脉输注400至500mg/m²)，然后是氟尿嘧啶(静脉输注2400至3000mg/m²，持续46小时)。此周期通常每两周重复一次。以上示出的剂量可能因周期而异。

在一个实施例中，化疗组合应用微管抑制剂，例如硫酸长春花碱、埃博霉素A、N-[2-[(4-羟基苯基)氨基]-3-吡啶基]-4-甲氧基苯磺酰胺(ABT-751)、紫杉醇衍生的化学治疗剂，例如紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇或多西紫杉醇或其组合。

在一个实施例中，组合疗法应用mTor抑制剂。mTor抑制剂的实例包含：依维莫司(RAD001)、WYE-354、KU-0063794、帕帕霉素(西罗莫司)、西罗莫司脂化物、雷帕霉素(MK-8669)、AZD8055和BEZ235(NVP-BEZ235)。

在一实施例中，组合疗法应用MEK抑制剂。MEK抑制剂的实例包含：AS703026、CI-1040(PD184352)、AZD6244(司美替尼)、PD318088、PD0325901、AZD8330、PD98059、U0126-EtOH、BIX 02189或BIX 02188。

在一个实施例中，组合疗法应用AKT抑制剂。AKT抑制剂的实例包含：MK-2206和AT7867。

在一个实施例中，所述组合应用光激酶抑制剂。光激酶抑制剂的实例包含：光A抑制剂I、VX-680、AZD1152-HQPA(Barasertib)、SNS-314甲磺酸酯、PHA-680632、ZM-447439、CCT129202和橘皮苷。

在一个实施例中，组合疗法应用例如WO2010/038086中公开的p38抑制剂，诸如N-[4-({4-[3-(3-叔丁基-1-对甲苯基-1H-吡唑-5-基)脲基]萘-1-基氧}甲基)吡啶-2-基]-2-甲氧基乙酰胺。

在一个实施例中，所述组合应用Bcl-2抑制剂。Bcl-2抑制剂的实例包含：obatoclax甲磺酸酯、ABT-737、ABT-263(navitoclax)和TW-37。

在一个实施例中，所述组合疗法包括用于抗PD-1抑制剂或抗PD-L1抑制剂的检查点抑制剂。

在一个实施例中，所述化疗组合包括抗代谢药物，诸如卡培他滨(希洛达)、磷酸氟达拉滨、氟达拉滨(氟达拉)、地西他滨、雷替曲塞(托莫德)、盐酸吉西他滨和克拉屈滨。

在一个实施例中，所述化疗组合包括更昔洛韦，其可能有助于控制免疫应答和/或肿瘤维管形成。

在一个实施例中，所述化疗包含PARP抑制剂。

在一个实施例中，所述组合疗法包含具有特定抑制DHODH酶活性的癌症代谢抑制剂。

在一个实施例中，本文方法中应用的一种或多种疗法是节律性的，即用低剂量的抗癌药物连续或频繁地治疗，通常与其他治疗方法同时进行。

在一个实施例中，提供了使用多个治疗周期(诸如化疗)的使用，例如2、3、4、5、6、7、8。

在一个实施例中，所述化疗以28天为一个周期应用。

在一个实施例中，本公开的分子以包括赋形剂、稀释剂和/或载体的药物组合物的形式提供。在一个实施例中，所述组合物为肠胃外制剂。

肠胃外制剂是指设计为不通过肠胃道递送的制剂。典型的肠胃外递送途径包含注射、移植或输注。

在一个实施例中，肠胃外制剂为注射的形式。注射包含静脉内、皮下、颅内、鞘内、肿瘤内或肌内注射。如本文所用，注射是指通过注射器将液体插入体内。

在一个实施例中，肠胃外制剂为输注形式。

本文所应用的输注是指通过滴注、输液泵、注射器驱动器或等同装置以较慢的速率施用药液。在一个实施例中，在1.5分钟至120分钟的时间范围内施用输注，诸如约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110或115分钟。

在一个实施例中，所述制剂用于静脉内(i.v.)施用。该途径是特别有效的，因为它允许快速进入大部分器官和组织，并且对于转移灶的治疗特别有用，例如已经确立的转移灶，尤其是那些位于高度血管化区域，诸如肝和肺的转移灶。

治疗制剂通常在制造和储存条件下是无菌的和稳定的。所述组合物可以配制为溶液、微乳液、脂质体或其他适合给人的肠外制剂，并可配制为诸如注射器或特别是单剂量的小瓶的预充装置。

如上所讨论，所述制剂通常将包括药学上可接受的稀释剂或载体，例如与病毒相容的无毒等渗载体，并且其中病毒在所需的时间段内是稳定的。

所述载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)以及其合适的混合物。可以通过使用分散剂或表面活性剂(诸如卵磷脂)或非离子表面活性剂(诸如聚山梨酯80或40)来维持适当的流动性。在分散剂中，表面活性剂的存在可以有助于维持所需的粒度。等渗剂的实例包含组合物中的糖、多元醇(诸如甘露醇)、山梨糖醇或氯化钠。

在一个实施例中，提供了一种套件，其包括根据本公开的GLA组件和有效载荷，其中有效载荷连接或未连接到所述GLA组件。

在本说明书的上下文中，“包括”旨在表示“包含”。

在技术上适当的地方，可以组合本发明的实施例。

本文将实施例描述为包括某些特征/元件。本公开还扩展到由所述特征/元件组成或基本上由所述特征/元件组成的单独的实施例。

通过引用将诸如专利和申请之类的技术参考文献并入本文。

技术背景是本说明书的技术公开的一部分，并且可以用作修改的基础，因为其中的讨论不限于讨论现有技术，因为它还包含对本领域和应用本技术中遇到的技术问题的讨论。

本文具体和明确叙述的任何实施例可以单独或与一个或多个其他实施例组合形成免责声明的基础。

本申请要求美国序列号的优先权：62/554530、62/569,403、62/554533、62/569,411、62/584,565和62/593,014。这些申请中的每一个都通过引用并入。这些应用可以用作对本说明书进行校正的基础。

现在将参考以下实施例描述本发明，这些实施例仅是示例性的，绝不应以任何方式解释为限制本发明的范围。

实例

图1A-D显示了GLA蛋白结构的各种表示。

图1E示出了根据本公开的GLA组分的实施例。

图2显示了用过氧化物处理以诱导凋亡的乳腺癌细胞系的蛋白S(PrS)和膜联蛋白染色。A，用过氧化物处理并用FITC-PrS染色的人MDA-231细胞。B，如在A中染色的未处理的MDA-231细胞。C，用膜联蛋白染色的处理的MDA-231细胞。D，用过氧化物处理并用PrS染色的人MCF-7细胞。E，小鼠MET-1细胞，如D中。F，小鼠4T1细胞，如D中。

图3显示了PrS和膜联蛋白的重叠但独特的细胞定位。A，用过氧化物处理并用Cy5PrS(红色)和FITC Annexin(绿色)染色的鼠4T1细胞。浅箭头，共定位信号；红色箭头，用PrS而非膜联蛋白染色的细胞；绿色箭头，用膜联蛋白染色的细胞相对较亮，而用PrS染色的细胞则较不亮，表明不同的结合模式(插图分别显示PrS和膜联蛋白染色)。B，用FITC PrS和Cy5膜联蛋白染色的处理过的4T1细胞。绿色箭头，用PrS而非膜联蛋白染色的细胞。C，用1,000倍过量的冷膜联蛋白预孵育的处理过的4T1细胞的Cy5膜联蛋白染色。

图4显示用PrS和膜联蛋白对凋亡的COS-1细胞进行染色。如所述用t-BHP处理细胞，并用FITC膜联蛋白(左)和Cy5 PrS(右)染色。箭头指示推测为凋亡小体的亚细胞结构。

图5显示了用PrS和膜联蛋白对细胞外囊泡的差异染色。从4T1细胞制备细胞外囊泡，并用FITC PrS(绿色)和Cy5膜联蛋白(红色)染色。箭头指示仅用膜联蛋白(红色箭头)，仅PrS(绿色箭头)和两种蛋白(浅箭头)染色的囊泡。

图6显示PrS和膜联蛋白的亚细胞定位。A，B，用FITC PrS(绿色箭头)和Cy5膜联蛋白(红色箭头)将凋亡4T1细胞染色；浅箭头，共定位。C，可能的凋亡小体。

图7显示5分钟内PrS的内在化。凋亡的4T1细胞用FITC PrS(绿色)和Cy5膜联蛋白(红色)染色，并在添加蛋白后10分钟内成像。A，合并图像。B，仅赫斯特核染色。

图8显示了小鼠4T1肿瘤的BLI图像。

图9使用放射标记的PrS和膜联蛋白对阿霉素对4T1肿瘤的作用的SPECT成像。在阿霉素(A和C)之前和阿霉素24小时后(B和D)用99mTc PrS(A和B)或膜联蛋白(C和D)对患有4T1乳腺癌肿瘤的小鼠进行成像。

图10显示了用环己酰亚胺处理的小鼠的SPECT成像。在(A和C)之前以及(B和D)处理24小时后每组显示五只小鼠。用^99mTc PrS(A和B)或膜联蛋白(C和D)对小鼠进行成像，箭头指示肝脏信号增强。

图11显示Cy5 PrS定位于感染的脾脏。CD1小鼠感染了生物发光李斯特菌，并在感染后第2天成像。处死前30分钟，给小鼠注射Cy5 PrS，并取出脾脏并冷冻。显示了中等感染(A)和对照未感染(C)的小鼠。显示了Cy5通道中每只小鼠的感染(B)和未感染(D)脾脏的部分，并与相衬图像合并。

图12显示Cy5 PrS定位于用阿霉素治疗的肿瘤。植入了4T1乳腺癌肿瘤的小鼠用阿霉素治疗(右图)或未治疗(左图)。24小时后，给小鼠静脉内注射Cy5 PrS，并在30分钟后处死。取出肿瘤，冷冻，并切片以进行荧光显微镜检查。显示了来自四只不同小鼠的合并的Cy5/相对比图像。

图13显示了TSC的区别。在存在(左)或不存在(右)生长因子的情况下培养TSC。右侧面板中的箭头表示分化特征性巨细胞。

图14显示了滋养层干细胞和分化的滋养层细胞的PrS染色。通过撤除生长因子，滋养层干细胞(左)分化为滋养层巨细胞(右)。将细胞用Cy5 PrS染色并成像。

图15显示了MSC的分化。如文中所述对MSC进行处理，以分化为脂肪细胞(上图)或成骨细胞(下图)。在每种情况下，分化的细胞均表现出预期的形态。

图16显示了用PrS(绿色)，膜联蛋白(红色)和Hoechst(蓝色)染色的MSC。加入染色剂混合物后10分钟内对细胞成像。

图17显示TSC用PrS(绿色，最亮的区域)，膜联蛋白(红色，细胞膜周围的浅色)和Hoechst(蓝色)染色。加入染色剂混合物后5分钟内对细胞成像。

图18显示了TSC囊泡的差异染色。TSC染色如图17所示。这组细胞分泌的大泡囊被膜联蛋白(红色)而不是PrS(绿膜)染色。

图19显示C17.2神经祖细胞的PrS染色。细胞用PrS-FITC染色，并用标准(非共焦)显微镜成像。

图20显示在4C下PrS内在化为TSC将FITC PrS(绿色)和Cy5膜联蛋白(红色)于4C添加到TSC中，并用共聚焦显微镜成像。

图21显示了来自小鼠骨髓的谱系阴性SCA-1/c-kit染色细胞。在分析的这一点上，细胞未用PI(碘化丙啶；检测死细胞)或PrS染色。造血谱系无染色(左图)，c-kit和SCA1染色(右图)定义了HSC的数量，以绿色(最亮的区域)显示。

图22长期HSC的PrS染色如图1所示分离HSC，并用FITC PrS染色。使用Cy7(x轴)确定SLAM模式。

图23短期HSC的PrS染色。如图1所示分离HSC，并用FITC PrS染色。使用Cy7(x轴)确定SLAM模式。

图24显示了长期HSC中PrS的内在化。如所述制备HSC，对PrS染色，并用共聚焦显微镜检查。绿色(最亮的区域)，FITC PrS；蓝色，赫斯特核染色；红色，PI。请注意，PI染色被排除在细胞核之外，表明细胞还活着。

图25显示了一个死亡的HSC表现出核PI的例子。

图26GLA介导的递送对细胞无毒

该说明书在相关的序列表中还包含序列1至6。

该项目启动了对标记的重组PrS作为SPECT(单光子计算机断层扫描)的体内成像剂的测试。令人惊讶地发现，该分子迅速内在化为凋亡细胞。这一出乎意料的发现使我们进一步探索了该现象，随后我们发现PrS也被内在化为几种类型的非凋亡干细胞的子集。

PrS是SEQ ID NO：6中所示的蛋白S GLA域和蛋白S EGF域。

方法

对于荧光，根据制造商的说明，分别使用Amersham(GE Heathcare)和MolecularProbes(Invitrogen)标签药剂盒实现Cy5和FITC的偶联。两种药剂盒均提供了用于去除未结合的荧光团的色谱柱。最初，用FITC标记1ml中的0.77mg PrS(馏分2)和1ml中的0.77mg膜联蛋白，以测试与凋亡细胞结合的特异性。为了共定位和竞争研究，用Cy5标记1ml中的0.68mg PrS(馏分3)和0.68mg的膜联蛋白。对于共焦显微镜，将第二批货物中的0.76mg PrS用FITC标记，并使用先前标记的Cy5偶联的膜联蛋白。应该注意的是，根据标记试剂盒制造商的说明，未确定精确的标记效率，并且假定从色谱柱中回收率为85％。因此，在任何情况下，两种蛋白质的相对染色强度都可能反映出这些意外事件。最初将细胞染色30分钟，但随后确定少于5分钟就足够了。为了测试PrS对凋亡细胞特异性，最初应用了四种乳腺癌细胞系；人MDA-231和MCF7以及小鼠4T1和MET-1。随后，还使用了COS-1猴肾细胞。用过氧化氢或氢过氧化叔丁基(t-BHP)诱导细胞凋亡。将细胞以每孔6 x 10⁴个细胞或以每孔1 x 10⁴个细胞的Eppendorf载玻片铺板在24孔板中，第二天使用2mM H₂O₂或t-BHP诱导细胞凋亡，时间为30分钟至2小时。诱导后，将孔用膜联蛋白结合缓冲液(AB；Santa Cruz Biotech)洗涤，并用标记蛋白染色。根据过去的经验和文献，使用5.5μg/ml的膜联蛋白染色。基于提供的凝胶图像，通过假设膜联蛋白的分子量为36kD，重组PrS为30kD，调整等摩尔添加PrS的量。将细胞染色15分钟。赫斯特33342染料用于可视化核酸。然后用AB洗涤孔，并在仍然可行的情况下使用EVOS荧光显微镜观察。对于共焦显微镜，应用了斯坦福细胞科学成像设施中的LeicaSP8显微镜。然后将孔用AB洗涤并使用Leica sp8显微镜观察。赫斯特33342染料用于可视化核。为了进行毒性研究，将PrS添加到滋养层干细胞(TSC)中，并使用Nexcelom Cellometer用台盼蓝测试了活性。

为了测试标记蛋白检测肿瘤的能力，在左腋下脂肪垫中将5 x 10⁴个4T1-luc细胞植入5只雄性BALB/c小鼠的组中。从植入后1周开始，每天使用体内生物发光成像(BLI)对小鼠进行成像，以监测肿瘤生长。然后在植入后第11天用13mg/kg体重的腹膜内(IP)阿霉素处理小鼠，第二天进行BLI。带有肿瘤的对照小鼠未经阿霉素治疗。处理后48小时，用单头A-SPECT伽马照相机(Gamma Medica)在静脉内示踪剂注射后1小时(麻醉1.3g/kg的尿烷IP)对小鼠成像；1mm针孔准直仪，128步进入128 x 128成像矩阵，每步15秒，2.7cm ROR；FOV＝上胸部/颈部。每种蛋白的注射剂量为160μl(800μCi)。然后处死动物并进行生物分布。对于环己酰亚胺处理实验，对每组5只年轻(7周龄)的雄性瑞士韦伯斯特小鼠麻醉(1.3g/kg的尿烷IP)并静脉注射50mg/kg的环己酰亚胺。注射环己酰亚胺1小时45分钟后，注射示踪剂(每剂PrS＝180ul/1.2mCi；每剂膜联蛋白V＝170μl/1.05mCi)。注射示踪剂45分钟后，使用单头平行孔准直仪(128 x 128矩阵)在A-SPECT伽马相机上为小鼠成像10分钟的静态全身图像。

为了测试由于活体动物感染引起的荧光PrS在凋亡位点的特异性定位，向CD1小鼠静脉注射生物发光单核细胞增生性李斯特菌。该细菌病原体感染包括脾脏在内的许多器官，在其中发生单核细胞和粒细胞的广泛凋亡。在感染后的某些时间，脾脏是细菌复制的主要位点，因此来自细菌的脾脏BLI信号可以与凋亡探针的定位相关联。每天感染小鼠并对其成像。当脾脏信号明显时(感染后第2天，在8周大的CD1雌性小鼠中感染2 x 10⁵个菌落形成单位)，将300mg/kg体重的Cy5 PrS注入小鼠体内，在30分钟后处死动物，去除脾脏，在OCT中冷冻，并切片进行荧光显微镜检查。应用未感染的对照小鼠。

进行流式细胞术。应用如上所描述制备的新鲜标记的FITC PrS。在该实验室中常规纯化小鼠造血干细胞(HSC)。通过对c-Kit+谱系阴性细胞染色，从正常小鼠骨髓中分离出细胞。为了进一步表征细胞，还进行了SLAM标记物染色。这些标记物使细胞自我更新和分化，而不染色的HSC只能分化。如结果所示，随后用FITC PrS染色显示SLAM染色细胞中阳性百分数。然后用FITC分选细胞，并用共焦显微镜检查，并使用赫斯特33342用于核可视化。

结果

为了评估细胞培养中细胞凋亡过程中的PrS结合特异性，我们使用了几种人和小鼠乳腺癌细胞系。如上所描述用过氧化物诱导凋亡，并评估FITC PrS结合。这些实验的实例如图2所示。未处理的细胞表现出最小的结合，诸如图2的板B中所示。选择过氧化物的浓度和孵育时间，使得仅少数细胞受到影响，因为在较高的浓度和/或较长的孵育时间下，细胞会脱离，并且无法进行染色和显微镜检查。此外，许多未受影响的细胞的存在作为每个领域范围内的内部阴性对照。FITC-膜联蛋白示出类似于PrS的凋亡特异性，作为内部阳性对照。然后，我们测试了这两种蛋白质的共定位和竞争性结合。为了共定位，制备了FITC和Cy5标记的PrS和膜联蛋白。4T1细胞用过氧化物处理，并用两种荧光团组合用Cy5和FITC标记的PrS和膜联蛋白染色。然后在EVOS荧光显微镜下可视化细胞。结果如图3示出。在所测试的条件下，所有亮染色的细胞均表现出两种蛋白的染色。然而，无论是使用Cy5还是FITC，PrS似乎都会染色一些膜联蛋白没有染色的细胞，尽管微弱(图3)。在两种探针之间，每种蛋白质对不同细胞的相对染色强度有时不同，即，有时膜联蛋白以相同的强度染色两个细胞，而PrS却没有，反之亦然(图3A，绿色箭头和插入物)。因此，尽管两种探针通常都染色相同的细胞，但它们似乎表现出细微的差异。在竞争测定中，将过量的未标记膜联蛋白与凋亡的4T1细胞预孵育15分钟，然后将细胞用Cy5PrS染色。令人惊讶的是，尽管被认为这些蛋白与暴露在PS上的相同靶分子结合，但即使被1000倍过量的膜联蛋白也没有阻碍PrS染色，膜联蛋白的测试量最高(图3C)。在许多细胞类型中都观察到膜联蛋白和PrS的共染色。虽然两种蛋白通常在每种细胞类型中都对相同的细胞染色，但其他差异却显而易见。特别是，一些小于细胞的物体被差异染色(图4)这些物体在过氧化物处理后数量增加，被解释为凋亡小体；在凋亡细胞分裂期间产生的膜束缚细胞片段。如图4示出，PrS染色这些实体，而膜联蛋白没有，尽管其中一些物体确实对两种蛋白质都进行了染色。这种观察是出乎意料的。为了进一步探索亚细胞实体的差异染色，使用标准离心规程从4T1小鼠肿瘤细胞制备了细胞外囊泡(EV)。这两种蛋白还对这些囊泡进行差异染色(图5)，这一结果可能具有生物学和治疗意义。

据推测，EVS，特别是外显子、微囊泡(MVS)和凋亡小体(AB)，通过细胞间生物分子的转移，在细胞-细胞通讯中起着关键作用。这些类型的EV的生物发生不同，它们源自内体(外来体)或质膜(MV)，或者是程序性细胞死亡(AB)的产物。所有哺乳动物细胞都被认为分泌EV。每种类型的EV都可以将分子货物转移至邻近和远处的细胞，影响诸如涉及肿瘤发展和进程的细胞行为。实际上，EV可能在几乎所有癌症印记中都起作用，包括维持增殖信号传导、规避生长抑制、抵抗细胞死亡、重新编程能量代谢、获得基因组不稳定性以及发展肿瘤微环境。它们也与诱导血管生成、侵袭控制、启动转移前小生境、维持炎症和规避免疫监视有关。免疫细胞似乎也可以通过EV进行通讯，并且我认为EV是来自肿瘤细胞、受感染的组织和伤口的信号。对电动汽车生物学及其对癌症标志的贡献的更深入了解，为诊断和治疗癌症提供了新的可能性。开发其他EV表面标记物对于推进该领域至关重要，并且PrS可能是决定因素。

用荧光显微镜进行这些研究之后，然后经由共焦显微镜评估PrS和膜联蛋白染色的亚细胞定位。将小鼠4T1细胞(缺少Luc-GFP报告基因)以每室1 x 10⁴个细胞铺板在8部分载玻片上，第二天用2mM H₂O₂或t-BHP(暴露2小时)诱导凋亡。然后洗涤细胞，并用PrS和膜联蛋白染色15分钟。赫斯特33342染料用于染色核酸。在所有情况下，用两种探针都将染色最亮的细胞染色。然而，在许多细胞中，在细胞质中观察到标记的PrS，而未未观察到标记的膜联蛋白(图6)。尽管膜联蛋白被内在化并出现在少数细胞的囊泡中，但是未观察到内在化膜联蛋白和表面定位在同一细胞中的PrS。这些结果是出乎意料的，因为推测这两种蛋白都结合了PS。为了进一步研究PrS的内在化，进行了时程实验。用Cy5膜联蛋白和FITC PrS将凋亡的4T1细胞染色5分钟，并在添加探针后5分钟内观察到。立即在这些细胞的细胞质中观察到PrS，这表明在5分钟范围内内在化(图7)。时程图像还示出，PrS和膜联蛋白并不总是在早期时间点均等地染色相同的细胞。图7中的细胞似乎处于凋亡的不同阶段，因为左侧的细胞示出一个未凝结的核，被一个看起来完整的核膜包围，而右侧的细胞则表现出染色质凝结的强染色特性，这种染色通常发生在细胞的后期的凋亡过程中。这种染色模式可能指示PrS在细胞凋亡中比膜联蛋白的结合更早。尽管在这一点上纯属推测，但这种偏好将解释到目前为止已观察到的这些蛋白质之间的许多差异。例如，一些细胞被PrS而非膜联蛋白染色，诸如图3A和B示出，这可能是由于PrS在细胞凋亡过程中的结合更早。为了检查PrS在活体动物中的定位，进行了一些实验。这些研究应用了体内化学和感染性诱导细胞凋亡的方法，以及将PrS定位于用阿霉素处理的肿瘤上，已知阿霉素诱导细胞凋亡。使用HYNIC-标记的PrS和膜联蛋白对给予4T1Luc乳腺肿瘤的动物进行SPECT成像，并用阿霉素处理。因为4T1肿瘤已经用荧光素酶标记，所以可以使用体内生物发光成像(BLI)在小鼠中成像。该实验的图像之一在图8中示出。该方法可用于评估肿瘤植入情况，并跟踪随时间推移个别动物的进展。然后将^99mTc标记的PrS和膜联蛋白应用于经阿霉素和对照处理的动物的SPECT成像。结果的实例在图9中示出。两只动物的头部和胸部的图像示出PrS探针在唾液腺中非特异性积聚，并且使用该探针的信噪比低。因此，PrS图像中示出的显示阈值被降低，以揭示更多的背景，从而导致图像的假色更亮。低信噪比可能是由于HYNIC标记的蛋白只有1毫克，这是次优的，并且也是由于无法对HYNIC进行控制研究：蛋白标记比。

还对环己酰胺诱导肝脏凋亡的小鼠进行了SPECT成像(图10)。在图10中，每板示出了5只小鼠的全身图像。与许多放射性标记的探针一样，在肾脏中也可以看到背景。用环己酰胺处理小鼠会增加肝脏中膜联蛋白SPECT信号。再次，与膜联蛋白相比，PrS示出低信号。膜联蛋白能够检测环己酰胺处理的小鼠的凋亡肝脏，而PrS由于处理而在肝脏中仅显示出轻微的信号增加。为了测试PrS在凋亡组织中的定位，并独立于SPECT成像和HYNIC标记的伴随并发症来处理肿瘤，为感染了诱导凋亡应答的细菌的小鼠和携带肿瘤的小鼠注射了Cy5PrS。对于感染，我们应用了单核细胞增生李斯特菌，一种用荧光素酶标记的细菌病原体，具有良好的BLI表征。来自脾脏的特征性BLI信号提供了出色的共定位研究。如上所描述，感染CD1小鼠，并在感染后第2天用BLI成像。然后给小鼠注射Cy5 PrS，并且30分钟后处死，去除脾脏进行切片和荧光显微镜检查(图11)。在所有情况下，受感染小鼠的脾脏切片示出的Cy5荧光信号均比对照组强。在图11中，示出的受感染小鼠显示出较低的光子计数，这表明该动物的感染尚未进展很远。在这一天，许多小鼠的脾脏信号强度提高了10倍。然而，相对于示出的未感染对照，Cy5通道荧光仍然非常强。该结果可能反映了对感染的持续的先天免疫应答，因为已经证明粒细胞和巨噬细胞是这类动物膜联蛋白信号的主要来源(这些细胞被编程用于凋亡以限制组织破坏)。

然后测试了荧光PrS在用阿霉素处理的4T1肿瘤中的定位。如上所描述，用阿霉素处理植入肿瘤的小鼠，并在处死和去除肿瘤前30分钟静脉内注射Cy5PrS，以进行切片和荧光显微镜检查。结果在图12中示出。在处理的动物中观察到强烈染色的区域，而从未处理的肿瘤切片观察到更适度的信号。尽管一些未处理的肿瘤确实表现出比背景高的小区域信号，但在任何未处理的切片中都没有观察到与处理肿瘤相似强度的信号。

干细胞的表型与分化的细胞不同，并且可能非凋亡地表达PS，从而避免诱导免疫应答。滋养层干细胞(TSC)在培养中分化为几种类型的滋养层细胞。TSC是从在成纤维细胞生长因子，激活素和肝素存在下生长的小鼠子宫刮取物中制备的。这些因子从介质中去除后，TSC会自发分化为巨细胞(图13)。TSC用PrS染色，而源自培养基中这些细胞的分化的滋养层细胞没有染色(图14)。我们还确定了PrS被内化成干细胞而没有凋亡诱导。该结果证实了在诱导凋亡的肿瘤细胞系中的观察。在不诱导凋亡的情况下，在肿瘤细胞中观察到最小的染色。为了测试干细胞的内在化，我们采用了间充质干细胞(MSC)和TSC。MSC是从小鼠骨髓中制备的。从小鼠冲洗骨髓并在不存在生长因子的情况下培养6天。在此孵育过程中，MSC和造血干细胞(HSC)会复制，而成纤维细胞会粘附但不会繁殖超过几代。6天后，可视单层。通过胰蛋白酶消化后，保留了粘附的MSC，而失去了悬浮生长的HSC。由于缺乏生长因子，成纤维细胞不会持续存在，也不会保留。因此，该简单程序导致了几乎同质的MSC群体。为了确认这些细胞的身份，我们分别用地塞米松和磷酸甘油(诱导分化为成骨细胞)或地塞米松和吲哚美辛(诱导分化为脂肪细胞)分别处理培养物。结果在图15中示出。响应于以上处理，分化的细胞示出各自细胞的外观。脂肪细胞包含大的脂肪囊泡，并且成骨细胞是深色的，具有独特的细胞内胶原蛋白和矿化作用。

为评估亚细胞染色模式，未分化的MSC用PrS和膜联蛋白以及赫斯特核染色剂染色，并用共焦显微镜观察。观察结果在图16中示出。PrS被迅速内在化。在MSC的情况下，约20个细胞中有1个被PrS染色，与先前的数据一致，但是未确定染色的确切百分比。MSC的形态是异质的，并且细胞向介质中分泌大量物质，其中一些物质会粘附在载玻片的表面上，从而在一些图像中产生背景。但是，数据清楚地显示出内在化的PrS，在添加后5分钟内表面上的膜联蛋白。TSC也像MSC一样进行染色和成像。观察结果也证实了这些细胞的内在化，这也发生在添加蛋白质后5分钟之内。结果在图17中示出。如在图所见，TSC的形态在很大程度上是可变的，并且在没有分化的情况下可以是多核的。与MSC一样，这些原代细胞向培养基中释放了大量物质，我们已经将其中一些建立为细胞外囊泡(先前的数据)。这种物质再次使成像困难。在图18中，一些EV用膜联蛋白而非PrS染色，这种现象在TSC中可见。在TSC簇的图像中，被细胞释放的囊泡被膜联蛋白而不是被内化的PrS染色。这些模式引起有关PrS和膜联蛋白的特异性和结合目标的有趣问题。据说这两种蛋白都可以结合PS。但是，与EV的差异性结合以及不同的亚细胞定位模式表明它们并非以完全相同的方式结合。需要进一步研究来建立这种区别的基础，这可能被证明是明显的。我们还观察到神经祖细胞系C17.2(图19)的PrS染色，这是一种能够在体外分化为星形胶质细胞和其他神经元细胞的转化细胞系。这些转化细胞中约有5％被染色，尽管该百分比是估计值。值得注意的是，即使将细胞冷却至4℃°，也会进入TSC(图20)。但是，必须注意的是，一旦将腔室放在显微镜上，就无法对其进行连续冷却。但是，在成像过程的5分钟内温度可能不会升高太多。这一结果虽然具有挑衅性，但必须在更加可控的条件下明确重复。如果发现得到证实，则所述机制的确必须非常有趣。

我们已经成功地用PrS染色了造血干细胞(HSC)。使用流式细胞仪，我们确定HSC被PrS染色，并通过共焦显微镜观察到这些细胞中PrS的内在化。使用荧光激活细胞分选术(FACS)鉴定并分离HSC。在骨髓中将这些细胞鉴定为谱系阴性、SCA/c-kit阳性细胞(图21)。然后将它们用FITC-PrS染色。可以通过SLAM标记物染色的模式识别短期和长期两个HSC群体。信号传导淋巴细胞活化分子标记CD48、CD150、CD229和CD244差异染色HSC具有明显的模式，使SLAM模式阳性染色表明了自我更新和分化的能力，而SLAM模式阴性HSC只能分化。PrS染色了长期HSC(图22)和短期HSC(图23)的一个子集。示出的细胞是碘化丙啶(PI)阴性，这意味着它们都是活细胞。这一结果证实了先前的实验，证明了一部分干细胞被PrS染色而没有诱导细胞凋亡。

然后，我们进行了PrS内化到HSC的测试。这个实验受许多因素影响。也许最困难的是HSC培养基的存活，其在介质过夜中大量死亡。因此，我们必须对实验进行计时，以便在同一天进行流式细胞术分析和共焦显微镜检查。此外，细胞不粘附，使显微镜检查不理想。为了使显微镜检查更有效，将细胞重悬于一小滴培养基中。最后，我们需要确保通过显微镜分析的PrS染色的细胞仍然存活。在分析和隔离过程中，许多HSC死亡。因此，除了赫斯特核染色剂外，还添加了PI并进行了扫描，并使用了另一个通道。PI亮核的存在表明死细胞。尽管存在这些困难和时间安排的复杂性，我们仍能够进行实验，并证实了PrS内在化进入了HSC(图24)。缺乏核PI染色证实了这些细胞是活的。但是，在图25中示出，一些细胞已经死亡或正在死亡。尽管显示了实验的复杂性和持续时间，结果仍示出内在化。

最终，在图26中，我们对TSC进行了初步毒性研究，并确定在135微克/毫升的浓度下，活性仅降低30分钟后，相对于PBS的最小程度从78％降至74％。考虑到在此水平下，培养基体积的10％包含PrS溶液，这一结果证实了我们的定性观察结果，即PrS对干细胞基本上无毒，观察到的次要毒性很可能是由于污染了制剂本身的内容物所致。较低浓度的PrS对活性没有影响。测试的最高蛋白质含量是染色浓度的1000倍以上。全面的毒性研究虽然不是该项目的正式组成部分，但需要更广泛的测试，但在我们看来PrS几乎没有毒性。

总结

上述结果示出，PrS被迅速内在化成大量细胞，包括多种类型的干细胞，这表明PrS具有独特的特性，可用于开发治疗剂的目标。此外，如图3和图7所示，PrS和膜联蛋白之间的特异性差异表明这两种蛋白之间的结合本身是不同的。膜联蛋白是四聚体而PrS是单体的事实不能解释这些差异，这些数据表明细胞表面上的某些其他成分可能与PrS结合有关。PrS的结合，特异性和内在化机制以及模块化操作的能力提供了许多可能性。

实例2

干细胞在表型上与分化的细胞不同，并且可能非凋亡地表达PS，以避免诱导免疫反应。干细胞被本公开的GLA结构域分子染色，包括荧光标记的有效载荷，而不诱导细胞凋亡。

滋养层干细胞(图14)在胎盘中分化为几种滋养层细胞，并被蛋白S染色，而在培养基中的这些细胞中分化出来的滋养层细胞没有染色。该染色剂能够区分体内分化的干细胞和体外分化的细胞。

该数据可以将本公开的分子用于体内或离体样品中的靶细胞。

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序列表

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<120> 有效载荷递送至干细胞

<130> P000227_WO

<150> US 62/569,403

<151> 2017-10-06

<150> US 62/554,530

<151> 2017-09-05

<160> 6

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (6)..(7)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (14)..(14)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (16)..(16)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (19)..(20)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (25)..(26)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (29)..(29)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (32)..(32)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (36)..(36)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<400> 1

Ala Asn Ser Leu Leu Xaa Xaa Thr Lys Gln Gly Asn Leu Xaa Arg Xaa

1 5 10 15

Cys Ile Xaa Xaa Leu Cys Asn Lys Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe Xaa

20 25 30

Asn Asp Pro Xaa Thr Asp Tyr Phe Tyr Pro Lys Tyr Leu

35 40 45

<210> 2

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (7)..(8)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (11)..(11)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (15)..(15)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (17)..(17)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (20)..(21)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (26)..(27)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (30)..(30)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (33)..(33)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (35)..(35)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (40)..(40)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<400> 2

Ala Gly Ser Tyr Leu Leu Xaa Xaa Leu Phe Xaa Gly Asn Leu Xaa Lys

1 5 10 15

Xaa Cys Tyr Xaa Xaa Ile Cys Val Tyr Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe

20 25 30

Xaa Asn Xaa Val Val Thr Asp Xaa Phe Trp Arg Arg Tyr Lys

35 40 45

<210> 3

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (6)..(7)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (14)..(14)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (16)..(16)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (19)..(20)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (25)..(26)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (29)..(29)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (32)..(32)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<400> 3

Ala Asn Thr Phe Leu Xaa Xaa Val Arg Lys Gly Asn Leu Xaa Arg Xaa

1 5 10 15

Cys Val Xaa Xaa Thr Cys Ser Tyr Xaa Xaa Ala Phe Xaa Ala Leu Xaa

20 25 30

Ser Ser Thr Ala Thr Asp Val Phe Trp Ala Lys Tyr Thr

35 40 45

<210> 4

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (6)..(7)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (14)..(14)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (16)..(16)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (19)..(20)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (25)..(26)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (29)..(29)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (35)..(35)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<400> 4

Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Pro Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa

1 5 10 15

Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Ile Phe Lys

20 25 30

Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser

35 40 45

<210> 5

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (6)..(7)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (14)..(14)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (16)..(16)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (19)..(20)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (25)..(26)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (29)..(29)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (32)..(32)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (35)..(35)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<400> 5

Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Gln Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa

1 5 10 15

Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Ile Phe Xaa

20 25 30

Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser

35 40 45

<210> 6

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (6)..(7)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (14)..(14)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (16)..(16)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (19)..(20)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (25)..(26)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (29)..(29)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (32)..(32)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<220>

<221> 未归类的特征

<222> (36)..(36)

<223> X是γ-羧基谷氨酸残基

<400> 6

Ala Asn Ser Leu Leu Xaa Xaa Thr Lys Gln Gly Asn Leu Xaa Arg Xaa

1 5 10 15

Cys Ile Xaa Xaa Leu Cys Asn Lys Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe Xaa

20 25 30

Asn Asp Pro Xaa Thr Asp Tyr Phe Tyr Pro Lys Tyr Leu Val Cys Leu

35 40 45

Arg Ser Phe Gln Thr Gly Leu Phe Thr Ala Ala Arg Gln Ser Thr Asn

50 55 60

Ala Tyr Pro Asp Leu Arg Ser Cys Val Asn Ala Ile Pro Asp Gln Cys

65 70 75 80

Ser Pro Leu Pro Cys Asn Glu Asp Gly Tyr Met Ser Cys Lys Asp Gly

85 90 95

Lys Ala Ser Phe Thr Cys Thr Cys Lys Pro Gly Trp Gln Gly Glu Lys

100 105 110

Cys Glu Phe Asp Ile Asn Glu Cys Lys Asp Pro Ser Asn Ile Asn Gly

115 120 125

Gly Cys Ser Gln Ile Cys Asp Asn Thr Pro Gly Ser Tyr His Cys Ser

130 135 140

Cys Lys Asn Gly Phe Val Met Leu Ser Asn Lys Lys Asp Cys Lys Asp

145 150 155 160

Val Asp Glu Cys Ser Leu Lys Pro Ser Ile Cys Gly Thr Ala Val Cys

165 170 175

Lys Asn Ile Pro Gly Asp Phe Glu Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Arg

180 185 190

Tyr Asn Leu Lys Ser Lys Ser Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ser Glu

195 200 205

Asn Met Cys Ala Gln Leu Cys Val Asn Tyr Pro Gly Gly Tyr Thr Cys

210 215 220

Tyr Cys Asp Gly Lys Lys Gly Phe Lys Leu Ala Gln Asp Gln Lys Ser

225 230 235 240

Cys Glu Ser Arg His His His His His His

245 250

Claims (25)

1.一种靶向干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：使细胞与包括与γ-羧基谷氨酸组分(GLA组分)连接的有效载荷的分子接触，

其中所述GLA组分包括GLA结构域或其活性片段，并且所述分子不包括来自GLA蛋白的活性催化结构域。

2.根据权利要求1所述的方法，其中GLA结构域或其活性片段独立地选自凝血酶、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、骨钙蛋白、基质GLA蛋白(MGP)、GAS6、转甲状腺素蛋白(TTR)、间-α-胰蛋白酶抑制剂、骨膜蛋白、富含脯氨酸的gla 1(PRRG1)、富含脯氨酸的gla 2(PRRG2)、富含脯氨酸的gla 3(PRRG3)和富含脯氨酸的gla 4(PRRG4)。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述GLA结构域或其活性片段来自蛋白S。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述GLA组分还包括EGF结构域，例如结合钙的EGF结构域。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中构建体包括选自凝血酶、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、骨钙蛋白、基质GLA蛋白、GAS6、转甲状腺素蛋白、骨膜蛋白、富含脯氨酸的GLA 1、富含脯氨酸的GLA 2、富含脯氨酸的GLA 3和富含脯氨酸的GLA 4的EGF结构域。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述EGF结构域来自蛋白S。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中GLA结构域组分还包括Kringle结构域。

8.根据权利要求10所述的方法，其中所述Kringle结构域来自选自包括以下各项的组的蛋白：转录激活因子2(ATF)；因子XII(F12)；凝血酶(F2)；透明质酸结合蛋白2(HABP2)；肝细胞生长因子(HGF)；肝细胞生长因子激活剂(HGFAC)；克里门蛋白1(Kremen protein 1)(KREMEN1)；KREMEN2；脂蛋白(a)(LPA)；LPAL2；巨噬细胞刺激蛋白(MSP或MST1)；磷酸肌醇-3-激酶互作蛋白1(PIK3IP1)；组织纤溶酶原激活剂(PLAT)；尿激酶(PLAU)；纤溶酶(PLG)；PRSS12；酪氨酸蛋白激酶跨膜受体ROR1(ROR1)；以及酪氨酸蛋白激酶跨膜受体ROR2(ROR2)。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述GLA组分包括SEQ ID NO：6示出的序列。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述方法在体外进行。

11.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中递送是体内递送至细胞，例如，其中向患者施用包括所述GLA组分和所述有效载荷的所述分子。

12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述分子靶向所述干细胞的外部。

13.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述分子被内在化所述干细胞中。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述细胞是非凋亡的。

15.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述细胞是凋亡的，例如病变的干细胞。

16.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述干细胞是胚胎干细胞或成体干细胞，其包含祖细胞和造血干细胞、成肌干细胞、骨祖干细胞、神经干细胞、间充质干细胞，诸如卫星细胞、放射状神经胶质细胞、骨髓基质细胞、骨膜、胰腺祖细胞、内皮祖细胞、胚细胞和滋养层干细胞。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述干细胞表达表面标记物CD34。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述干细胞对于谱系阳性表面标记物呈阴性(即Lin-ve)。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述干细胞是CD90+ve、CD133+ve、CD105+ve、CD45+、Lin-ve、CD48-ve和CD244-ve。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述干细胞是Lin-ve、CD34+ve、CD38-ve、CD45RA-ve、CD90+ve和CD49f_+ve。

21.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述干细胞是非癌性的。

22.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述干细胞是癌干细胞。

23.根据权利要求23所述的方法，其中所述癌干细胞是上皮来源。

24.根据权利要求44或45所述的方法，其中癌干细胞表达选自CD44(其至少在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、鳞状癌和膀胱癌中过表达)、CD133(其至少在脑癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌和髓母细胞瘤中过表达)、CD24、CD90、CD271、CD4f、CD13以及其中两者或更多者的组合的表面标记物。

25.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述干细胞是造血来源。

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