KR101355970B1 - 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질 기능의 가역적 저해방법 및 키트 - Google Patents

광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질 기능의 가역적 저해방법 및 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 표적 단백질 기능의 가역적 저해방법 및 키트에 관한 것으로서, 더 상세하게는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석용 키트 및 분석방법을 제공한다.

Description

광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질 기능의 가역적 저해방법 및 키트{Method and kit for reversible inhibiting proteins using light-inducible nanocluster formation}
본 발명은 단백질 기능의 가역적 저해방법 및 키트에 관한 것으로서, 더 상세하게는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질 기능의 가역적 저해방법 및 키트에 관한 것이다.
일반적으로 특정 단백질의 기능을 연구함에 있어서, 해당 단백질을 암호화하는 유전자의 결실 또는 돌연변이를 유도하거나 해당 단백질을 발현하는 세포 또는 개체에 해당 단백질에 특이적인 저해제를 처리한 후 세포 또는 개체 내에서의 생리화학적 변화를 관찰하는 방법을 사용하곤 한다.
이러한 방법 중, 미국 특허 제5,270,163호는 특정 바이오분자에 특이적으로 결합하는 단일가닥 올리고뉴클레오티드인 소위 앱타머(aptamer)의 선별방법을 개시하고 있고, Lunder M. 등은 파지 디스플레이(phage display) 방법을 이용하여 표적-결합 모티프를 탐색하는 방법을 개시한 바 있으며(Lunder et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 127(2): 125-131, 2005), 미국 공개특허 제2010-0143371호는 세포내 단백질에 특이적으로 결합하는 인간 항체의 카파쇄(kappa chain)의 가변 도메인(variable domain)인 인트라바디(intrabody)와 이를 이용한 상기 세포내 단백질의 기능 저해방법을 개시하고 있다.
그러나, 종래 방법들은 유전자 돌연변이 유발이나 특정 단백질에 대한 특이적 저해제의 탐색을 전제로 하는 비용과 시간이 많이 소요되는 방법으로서 비효율적일 뿐만 아니라, 이들 돌연변이나 특이적 저해제의 처리의 경우 비가역적인 단백질 불활성화를 야기하는 경우가 많아서, 세포 생존에 필수적인 단백질의 경우에는 이와 같은 방법으로 그 기능을 연구하기 어려운 점이 있다.
본 발명은 상기 문제점을 포함한 다양한 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 보다 효율적인 개체 또는 세포 수준에서의 특정 표적단백질의 기능의 가역적 저해방법 및 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 더 나아가, 특정 개체의 특정 기관 또는 조직에 국한된 단백질 기능 저해뿐만 아니라, 세포 내에서도 특정 세포내 소기관에 국한된 단백질 기능 저해를 달성할 수 있기 때문에 매우 효율적인 단백질 기능 연구를 수행할 수 있다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 자기조립 단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질를 포함하는 융합단백질, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상호작용하여 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질 및 표적 단백질과 상호작용을 하는 미끼 단백질을 상기 표적 단백질을 내재적 단백질로 발현하는 세포 또는 개체에서 동시에 발현시키는 발현단계; 및 상기 세포 또는 개체에 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상기 짝 단백질 사이의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하여 광유도 나노클러스터 형성을 유도하는 나노클러스터 형성 유도단계를 포함하며, 상기 미끼 단백질은 상기 자기조립 단백질 또는 상기 짝 단백질에 융합되어 발현되는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해방법이 제공된다.
상기 방법에 있어서, 상기 자기조립 단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 융합단백질, 상기 짝 단백질 및 상기 미끼 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결될 수 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)일 수 있다. 여기서, 상기 녹색형광단백질은 EGFP(enhanced green fluorescent protein), Emerald(Tsien, Annu. Rev. Biochem., 67: 509-544, 1998), Superfolder(Pedelacq et al., Nat. Biotech., 24: 79-88, 2006), GFP(Prendergast et al., Biochem., 17(17): 3448-3453, 1978), Azami Green(Karasawa, et al., J. Biol. Chem., 278: 34167-34171, 2003), TagGFP(Evrogen, Russia), TurboGFP(Shagin et al., Mol. Biol. Evol., 21(5): 841-850, 2004), ZsGreen(Matz et al., Nat. Biotechnol., 17: 969-973, 1999) 또는 T-Sapphire(Zapata-Hommer et al., BMC Biotechnol., 3:5, 2003)일 수 있고, 상기 황색형광단백질은 EYFP(enhanced yellow fluorescent protein, Tsien, Annu. Rev. Biochem., 67: 509-544, 1998), Topaz(Hat et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1: 627-633, 2002), Venus(Nagai et al., Nat. Biotechnol., 20(1): 87-90, 2002), mCitrine(Griesbeck et al., J. Biol. Chem., 276: 29188-29194, 2001), Ypet(Nguyet and Daugherty, Nat. Biotechnol., 23(3): 355-360, 2005), TagYFP(Evrogen, Russia), PhiYFP(Shagin et al., Mol. Biol. Evol., 21(5): 841-850, 2004), ZsYellow1(Matz et al., Nat. Biotechnol., 17: 969-973, 1999) 또는 mBanana(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004)일 수 있으며, 상기 적색형광단백질은 mRuby(Kredel et al., PLoS ONE, 4(2):e4391, 2009), mApple(Shaner et al., Nat. Methods, 5(6): 545-551, 2008), mStrawberry(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004), AsRed2(Shanner et al., Nat. Biotehcnol., 22: 1567-1572, 2004) 또는 mRFP(Campbell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(12): 7877-7882, 2002)일 수 있고, 상기 주황형광단백질은 Kusabira Orange(Karawawa et al., Biochem. J., 381(Pt 1): 307-312, 2004), Kusabira Orange2(MBL International Corp., Japan), mOrange(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004), mOrange2(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004), dTomato(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004), dTomato-Tandem(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004), TagRFP(Merzlyak et al., Nat. Methods, 4(7): 555-557, 2007), TagRFP-T(Shaner et al., Nat. Methods, 5(6): 545-551, 2008), DsRed(Baird et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 11984-11989, 1999) DsRed2(Clontech, USA), DsRed-Express(Clontech, USA), DsRed-Monomer(Clontech, USA) 또는 mTangerine(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004)일 수 있으며, 상기 청록색형광단백질은 ECFP(enhanced cyan fluorescent protein, Cubitt et al., Trends Biochem. Sci., 20: 448-455, 1995), mECFP(Ai et al., Biochem. J., 400(3): 531-540, 2006), mCerulean(Koushik et al., Biophys. J., 91(12): L99-L101, 2006), CyPet(Nguyet and Daugherty, Nat. Biotechnol., 23(3): 355-360, 2005), AmCyan1(Matz et al., Nat. Biotechnol., 17: 969-973, 1999), Midori-Ishi Cyan(Karawawa et al., Biochem. J., 381(Pt 1): 307-312, 2004), TagCFP(Evrogen, Russia) 또는 mTFP1(Ai et al., Biochem. J., 400(3): 531-540, 2006)일 수 있고, 상기 청색형광단백질은 EBFP(enhanced blue fluorescent protein, Clontech, USA), EBFP2(Ai et al., Biochemistry, 46(20): 5904-5910, 2007), Azurite(Mena et al., Nat. Biotechnol., 24: 1569-1571, 2006) 또는 mTagBFP(Subach et al., Chem. Biol., 15(10: 1116-1124, 2008)일 수 있고, 상기 원적색형광단백질은 mPlum(Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101: 16745-16749, 2004), mCherry(Shanner et al., Nat. Biotehcnol., 22: 1567-1572, 2004), dKeima-Tandem(Kogure et al., Methods, 45(3): 223-226, 2008), JRed(Shagin et al., Mol. Biol. Evol., 21(5): 841-850, 2004), mRaspberry(Shanner et al., Nat. Biotehcnol., 22: 1567-1572, 2004), HcRed1(Fradkov et al., Biochem. J., 368(Pt 1): 17-21, 2002), HcRed-Tandem(Fradkov et al., Nat. Biotechnol., 22(3): 289-296, 2004) 또는 AQ143(Shkrob et al., Biochem. J., 392: 649-654, 2005)일 수 있으며, 상기 테트라시스테인 모티프는 Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys(서열번호 1)의 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 Xaa는 시스테인을 제외한 아미노산일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단배질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 반대로 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1이다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있다. 이 경우 상기 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 제1자기조립 단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질, 제2자기조립 단백질 및 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제2융합단백질, 및 표적 단백질과 상호작용하는 미끼 단백질을 상기 표적 단백질을 내재적 단백질로 발현하는 세포 또는 개체에서 동시에 발현시키는 발현단계; 및 상기 세포 또는 개체에 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상기 짝 단백질 사이의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하여 광유도 나노클러스터 형성을 유도하는 나노클러스터 형성 유도단계를 포함하며, 상기 미끼 단백질은 상기 제1자기조립 단백질 또는 상기 제2자기조립 단백질에 융합되어 발현되는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해방법이 제공된다.
상기 방법에 있어서, 상기 제1자기조립 단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 제2자기조립 단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 융합단백질, 상기 짝 단백질 및 상기 미끼 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결될 수 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)일 수 있다. 여기서, 상기 녹색형광단백질은 EGFP(enhanced green fluorescent protein), Emerald, Superfolder, GFP, Azami Green, TagGFP, TurboGFP, ZsGreen 또는 T-Sapphire일 수 있고, 상기 황색형광단백질은 EYFP(enhanced yellow fluorescent protein), Topaz, Venus, mCitrine, Ypet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1 또는 mBanana일 수 있으며, 상기 적색형광단백질은 mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2 또는 mRFP일 수 있고, 상기 주황형광단백질은 Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem, TagRFP, TagRFP-T, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer 또는 mTangerine일 수 있으며, 상기 청록색형광단백질은 ECFP(enhanced cyan fluorescent protein), mECFP, mCerulean, CyPet, AmCyan1, Midori-Ishi Cyan, TagCFP 또는 mTFP1일 수 있고, 상기 청색형광단백질은 EBFP(enhanced blue fluorescent protein), EBFP2, Azurite 또는 mTagBFP일 수 있고, 상기 원적색형광단백질은 mPlum, mCherry, dKeima-Tandem, JRed, mRaspberry, HcRed1, HcRed-Tandem 또는 AQ143일 수 있으며, 상기 테트라시스테인 모티프는 Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys(서열번호 1)의 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 Xaa는 시스테인을 제외한 아미노산일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단배질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 반대로 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1이다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있다. 이 경우 상기 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 자기조립 단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상호작용하여 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터 및 표적 단백질과 상호작용을 하는 미끼 단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며, 상기 미끼 단백질은 상기 자기조립 단백질 또는 상기 짝 단백질에 융합되어 발현되는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트가 제공된다.
상기 키트에 있어서, 상기 자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 융합단백질, 상기 짝 단백질 및 상기 미끼 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결될 수 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)일 수 있다. 여기서, 상기 녹색형광단백질은 EGFP(enhanced green fluorescent protein), Emerald, Superfolder, GFP, Azami Green, TagGFP, TurboGFP, ZsGreen 또는 T-Sapphire일 수 있고, 상기 황색형광단백질은 EYFP(enhanced yellow fluorescent protein), Topaz, Venus, mCitrine, Ypet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1 또는 mBanana일 수 있으며, 상기 적색형광단백질은 mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2 또는 mRFP일 수 있고, 상기 주황형광단백질은 Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem, TagRFP, TagRFP-T, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer 또는 mTangerine일 수 있으며, 상기 청록색형광단백질은 ECFP(enhanced cyan fluorescent protein), mECFP, mCerulean, CyPet, AmCyan1, Midori-Ishi Cyan, TagCFP 또는 mTFP1일 수 있고, 상기 청색형광단백질은 EBFP(enhanced blue fluorescent protein), EBFP2, Azurite 또는 mTagBFP일 수 있고, 상기 원적색형광단백질은 mPlum, mCherry, dKeima-Tandem, JRed, mRaspberry, HcRed1, HcRed-Tandem 또는 AQ143일 수 있으며, 상기 테트라시스테인 모티프는 Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys(서열번호 1)의 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 Xaa는 시스테인을 제외한 아미노산일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단배질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 반대로 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1이다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있다. 이 경우 상기 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 제1자기조립 단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터, 제2자기조립 단백질 및 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터, 및 표적 단백질과 상호작용하는 미끼 단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위 및 상기 프로모터를 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며, 상기 미끼 단백질은 상기 제1자기조립 단백질 또는 상기 제2자기조립 단백질에 융합되어 발현되는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트가 제공된다.
상기 키트에 있어서, 상기 제1자기조립 단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 제2자기조립 단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 융합단백질, 상기 짝 단백질 및 상기 미끼 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결될 수 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)일 수 있다. 여기서, 상기 녹색형광단백질은 EGFP(enhanced green fluorescent protein), Emerald, Superfolder, GFP, Azami Green, TagGFP, TurboGFP, ZsGreen 또는 T-Sapphire일 수 있고, 상기 황색형광단백질은 EYFP(enhanced yellow fluorescent protein), Topaz, Venus, mCitrine, Ypet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1 또는 mBanana일 수 있으며, 상기 적색형광단백질은 mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2 또는 mRFP일 수 있고, 상기 주황형광단백질은 Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem, TagRFP, TagRFP-T, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer 또는 mTangerine일 수 있으며, 상기 청록색형광단백질은 ECFP(enhanced cyan fluorescent protein), mECFP, mCerulean, CyPet, AmCyan1, Midori-Ishi Cyan, TagCFP 또는 mTFP1일 수 있고, 상기 청색형광단백질은 EBFP(enhanced blue fluorescent protein), EBFP2, Azurite 또는 mTagBFP일 수 있고, 상기 원적색형광단백질은 mPlum, mCherry, dKeima-Tandem, JRed, mRaspberry, HcRed1, HcRed-Tandem 또는 AQ143일 수 있으며, 상기 테트라시스테인 모티프는 Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys(서열번호 1)의 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 Xaa는 시스테인을 제외한 아미노산일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단배질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 반대로 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1이다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있다. 이 경우 상기 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 자기조립 단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상호작용하여 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터 및 표적 단백질과 상호작용을 하는 미끼 단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위 및 상기 프로모터를 포함하는 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며, 상기 미끼 단백질은 상기 자기조립 단백질 또는 상기 짝 단백질에 융합되어 발현되는 있는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트가 제공된다.
상기 키트에 있어서, 상기 자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 융합단백질, 상기 짝 단백질 및 상기 미끼 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결될 수 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)일 수 있다. 여기서, 상기 녹색형광단백질은 EGFP(enhanced green fluorescent protein), Emerald, Superfolder, GFP, Azami Green, TagGFP, TurboGFP, ZsGreen 또는 T-Sapphire일 수 있고, 상기 황색형광단백질은 EYFP(enhanced yellow fluorescent protein), Topaz, Venus, mCitrine, Ypet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1 또는 mBanana일 수 있으며, 상기 적색형광단백질은 mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2 또는 mRFP일 수 있고, 상기 주황형광단백질은 Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem, TagRFP, TagRFP-T, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer 또는 mTangerine일 수 있으며, 상기 청록색형광단백질은 ECFP(enhanced cyan fluorescent protein), mECFP, mCerulean, CyPet, AmCyan1, Midori-Ishi Cyan, TagCFP 또는 mTFP1일 수 있고, 상기 청색형광단백질은 EBFP(enhanced blue fluorescent protein), EBFP2, Azurite 또는 mTagBFP일 수 있고, 상기 원적색형광단백질은 mPlum, mCherry, dKeima-Tandem, JRed, mRaspberry, HcRed1, HcRed-Tandem 또는 AQ143일 수 있으며, 상기 테트라시스테인 모티프는 Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys(서열번호 1)의 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 Xaa는 시스테인을 제외한 아미노산일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단배질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 반대로 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1이다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있다. 이 경우 상기 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 제1자기조립 단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터, 제2자기조립 단백질 및 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터, 및 표적 단백질과 상호작용하는 미끼 단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며, 상기 미끼 단백질은 상기 제1자기조립 단백질 또는 상기 제2자기조립 단백질에 융합되어 발현되는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트가 제공된다.
상기 키트에 있어서, 상기 제1자기조립 단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 제2자기조립 단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 융합단백질, 상기 짝 단백질 및 상기 미끼 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결될 수 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)일 수 있다. 여기서, 상기 녹색형광단백질은 EGFP(enhanced green fluorescent protein), Emerald, Superfolder, GFP, Azami Green, TagGFP, TurboGFP, ZsGreen 또는 T-Sapphire일 수 있고, 상기 황색형광단백질은 EYFP(enhanced yellow fluorescent protein), Topaz, Venus, mCitrine, Ypet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1 또는 mBanana일 수 있으며, 상기 적색형광단백질은 mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2 또는 mRFP일 수 있고, 상기 주황형광단백질은 Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem, TagRFP, TagRFP-T, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer 또는 mTangerine일 수 있으며, 상기 청록색형광단백질은 ECFP(enhanced cyan fluorescent protein), mECFP, mCerulean, CyPet, AmCyan1, Midori-Ishi Cyan, TagCFP 또는 mTFP1일 수 있고, 상기 청색형광단백질은 EBFP(enhanced blue fluorescent protein), EBFP2, Azurite 또는 mTagBFP일 수 있고, 상기 원적색형광단백질은 mPlum, mCherry, dKeima-Tandem, JRed, mRaspberry, HcRed1, HcRed-Tandem 또는 AQ143일 수 있으며, 상기 테트라시스테인 모티프는 Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys(서열번호 1)의 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 Xaa는 시스테인을 제외한 아미노산일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단배질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 반대로 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1이다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있다. 이 경우 상기 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 자기조립 단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질를 포함하는 제1융합단백질, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상호작용하여 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질 및 표적 단백질을 세포 또는 개체에서 동시에 발현시키는 발현단계; 및 상기 세포 또는 개체에 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상기 짝 단백질 사이의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하여 광유도 나노클러스터 형성을 유도하는 나노클러스터 형성 유도단계를 포함하며, 상기 표적 단백질은 상기 자기조립 단백질 또는 상기 짝 단백질에 융합되어 발현되는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해방법이 제공된다.
상기 방법에 있어서, 상기 자기조립 단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 융합단백질 및 상기 짝 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결될 수 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)일 수 있다. 여기서, 상기 녹색형광단백질은 EGFP(enhanced green fluorescent protein), Emerald, Superfolder, GFP, Azami Green, TagGFP, TurboGFP, ZsGreen 또는 T-Sapphire일 수 있고, 상기 황색형광단백질은 EYFP(enhanced yellow fluorescent protein), Topaz, Venus, mCitrine, Ypet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1 또는 mBanana일 수 있으며, 상기 적색형광단백질은 mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2 또는 mRFP일 수 있고, 상기 주황형광단백질은 Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem, TagRFP, TagRFP-T, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer 또는 mTangerine일 수 있으며, 상기 청록색형광단백질은 ECFP(enhanced cyan fluorescent protein), mECFP, mCerulean, CyPet, AmCyan1, Midori-Ishi Cyan, TagCFP 또는 mTFP1일 수 있고, 상기 청색형광단백질은 EBFP(enhanced blue fluorescent protein), EBFP2, Azurite 또는 mTagBFP일 수 있고, 상기 원적색형광단백질은 mPlum, mCherry, dKeima-Tandem, JRed, mRaspberry, HcRed1, HcRed-Tandem 또는 AQ143일 수 있으며, 상기 테트라시스테인 모티프는 Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys(서열번호 1)의 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 Xaa는 시스테인을 제외한 아미노산일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단배질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 반대로 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1이다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있다. 이 경우 상기 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 자기조립 단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터, 및 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터를 포함하며, 표적 단백질 및 상기 자기조립 단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호호하하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 추가적으로 포함하거나, 상기 표적 단백질이 제2융합단백질에 포함되는, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 자기조립 단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터, 및 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터를 포함하며, 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위 및 상기 자기조립 단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제3유전자컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 추자적으로 포함하거나, 상기 표적단백질이 상기 제2융합단백질에 포함되어 발현될 수 있도록, 상기 제2폴리뉴클레오티드 내에 상기 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위가 포함되는, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트가 제공된다.
상기 키트에 있어서, 상기 융합단백질 및 상기 짝 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결될 수 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)일 수 있다. 여기서, 상기 녹색형광단백질은 EGFP(enhanced green fluorescent protein), Emerald, Superfolder, GFP, Azami Green, TagGFP, TurboGFP, ZsGreen 또는 T-Sapphire일 수 있고, 상기 황색형광단백질은 EYFP(enhanced yellow fluorescent protein), Topaz, Venus, mCitrine, Ypet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1 또는 mBanana일 수 있으며, 상기 적색형광단백질은 mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2 또는 mRFP일 수 있고, 상기 주황형광단백질은 Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem, TagRFP, TagRFP-T, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer 또는 mTangerine일 수 있으며, 상기 청록색형광단백질은 ECFP(enhanced cyan fluorescent protein), mECFP, mCerulean, CyPet, AmCyan1, Midori-Ishi Cyan, TagCFP 또는 mTFP1일 수 있고, 상기 청색형광단백질은 EBFP(enhanced blue fluorescent protein), EBFP2, Azurite 또는 mTagBFP일 수 있고, 상기 원적색형광단백질은 mPlum, mCherry, dKeima-Tandem, JRed, mRaspberry, HcRed1, HcRed-Tandem 또는 AQ143일 수 있으며, 상기 테트라시스테인 모티프는 Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys(서열번호 1)의 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 Xaa는 시스테인을 제외한 아미노산일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단배질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 반대로 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1이다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있다. 이 경우 상기 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
본 발명자들은 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 자기조립단백질과 융합단백질로 세포 내에서 발현시키고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성하고 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 표적 단백질의 융합단백질로 세포 내에서 발현시킨 후, 상기 두 융합단백질이 광조사에 의해 상호작용함으로써 나노클러스터를 형성시킬 경우, 상기 표적 단백질이 상기 나노클러스터 내로 포획됨으로써, 그 기능이 일시적으로 마비됨을 실험적으로 입증함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 방법 및 키트는 살아 있는 세포 및 개체 내에서 특정 표적단백질의 기능을 시공간적으로 조절함으로써, 해당 단백질의 생리학적 기능을 연구하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 특정 표적 단백질의 기능을 시공간적으로 그리고 가역적으로 조절할 수 있다. 물론 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 광유도 나노클러스터 형성에 의한 표적 단백질의 기능 저해방법의 개념을 나타내는 개요도이다.
도 2는 세포의 부분영역(active region)에 대하여 특정 파장의 광조사를 통한 나노클러스터 형성과 상기 부분영역에 존재하는 활성단백질과 상호작용하는 표적단백질의 감금을 통한 상기 활성 단백질의 기능 저해를 개념적으로 나타내는 개요도이다.
도 3은 개체 또는 조직 등 다세포영역에서 특정 세포영역에 대한 광조사를 통한 나노클러스터 형성과 상기 특정 세포영역에 존재하는 표적단백질의 기능 저해를 개념적으로 나타내는 개요도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 광조사를 통한 나노클러스터 형성과 그에 의한 분자기능 조절 방법을 개념적으로 나타낸 개요도이다.
도 5는 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 두 가지 다른 나노입자에 대한 광조사에 의한 나노클러스터의 형성과 그에 의한 분자기능 조절 방법을 개념적으로 나타낸 개요도이다.
도 6은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 광조사를 통한 나노클러스터 형성과 그에 의한 분자기능 조절 방법을 개념적으로 나타낸 개요도이다.
도 7은 본 발명의 다른 실시예에 따른 광조사를 통한 나노클러스터 형성과 그에 의한 분자기능 조절 방법을 개념적으로 나타낸 개요도이다.
도 8은 도 6에 도시된 본 발명의 일 실시예 따른 방법을 이용한 광조사를 통한 나노클러스터 형성과 이를 이용한 PI3K 단백질의 기능 조절을 도식적으로 나타낸 개요도이다.
도 9는 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 방법을 이용한 광조사를 통한 나노클러스터 형성과 이를 이용한 Vav2 단백질의 기능 조절을 도식적으로 나타낸 개요도이다.
도 10는 도 9에 도시된 개념을 입증하기 위해, 광조사에 의한 나노클러스터의 형성과 시간 경과에 따른 특정 단백질의 기능 억제 결과를 보여주는 세포에 대한 형광현미경 사진이다.
본 문서에서 사용되는 용어를 정의하면 하기와 같다.
본 문서에서 사용되는 "미끼(bait) 단백질"이란, 표적 단백질과 상호작용을 하는 단백질을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "표적(pray) 단백질"이란, 상기 "미끼 단백질"의 상호작용 파트너로서, 분석 대상이 되는 단백질을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "자기조립 단백질(self-assembled protein, SAP)"은 매개물질의 도움 없이 단백질 발현과 동시에 자가조립(self-assembly)되는 단백질을 의미하며, 대표적인 자기조립단백질로는 페리틴(ferritin)을 들 수 있다.
본 문서에서 사용되는 "나노클러스터(nanocluster)"는 자기조립단백질의 자가조립에 의해 형성된 나노입자가 나노입자간 상호작용에 의해 군집을 형성한 군집체를 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "광유도 이형 이합체 형성 단백질(light-induced heterodimerized protein)"는 특정 파장의 빛을 조사할 경우 다른 단백질과 이형 이합체(heterodimer)를 형성하는 단백질을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "짝 단백질(partner protein)"은 특정 파장의 빛을 조사할 경우 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 입합체를 형성하는 대상 단백질을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "이형 이합체(heterodimer)"는 서로 다른 두 가지 단백질이 상호작용에 의해 하나의 복합체(complex)를 형성한 것을 의민한다.
본 문서에서 사용되는 "동형 이합체(homodimer)"는 같은 단백질이 서로 두 개가 상호작용하여 하나의 복합체(complex)를 형성한 것을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "작동 가능하게 연결된(operably linked to)"는 특정 폴리뉴클레오티드가 그 기능을 발휘할 수 있게 다른 폴리뉴클레오티드에 연결된 것을 의미한다. 즉, 특정 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결되었다는 것은 당해 프로모터의 작용에 의해 mRNA로 전사되고 당해 단백질로 번역까지 될 수 있게 연결되었다는 것을 의미하고, 특정 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 다른 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되었다는 것은 당해 특정 단백질이 다른 단백질과 융합단백질의 형태로 발현될 수 있게 연결되었다는 것을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "CIB"는 크립토크롬-상호작용 염기성 헬릭스-루프-헬릭스 단백질(cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix protein)을 의미하며, 대표적으로 애기장대의 CIB1(GenBank No.: NM_119618)가 있다.
본 문서에서 사용되는 "CIBN"은 상기 CIB의 N-말단으로서 광조사시 크립토크롬(cryptochrome, CRY)와 상호작용하는 부위를 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "CRY"는 크립토크롬(chryptochrome) 단백질을 의미하며, 대표적으로 애기장대의 CRY2(GenBank No.: NM_100320)가 있다.
본 문서에서 사용되는 "PHR"은 상기 CRY의 N-말단 부위로서 파이토라이아제 상동성 지역(phytolyase homolgous region)을 의미하며, 광조사시 상기 CIB 또는 CIBN과 상호작용한다(Kennedy et al., Nat. Methods, 7(12): 973-975, 2010).
본 문서에서 사용되는 "Phy"는 파이토크롬(phytochrome) 단백질을 의미하고, 대표적으로 애기장대의 PhyA(GenBank No.: NM_001123784), PhyB(GenBank No.: NM_127435) 등이 있으며, PIF(phytochrome interacting factor)와 상호작용하는 것으로 알려져 있다(Min et al., Nature, 400: 781-784, 1999)
본 문서에서 사용되는 "PIF"는 파이토크롬 상호작용 인자(phytochrome interacting factor)을 의미하며, 대표적으로 애기장대의 PIF1(GenBank No.: NM_001202630), PIF3(GenBank No.: NM_179295), PIF4(GenBank No.: NM_180050), PIF5(GenBank No.: NM_180690), PIF6(GenBank No.: NM_001203231) 또는 PIF7(GenBank No.: NM_125520)이 있다.
본 문서에서 사용되는 "FKF"는 플라빈-결합, 켈치 반복, F-박스(Flavin-binding, Kelch repeat, F-box) 단백질을 의미하고, 대표적으로 애기장대의 FKF1(GenBank No.: NM_105475)이 있으며, 광조사시 GIGANTEA 단백질과 상호작용하는 것으로 알려져 있다(Sawa et al., Science, 318(5848): 261-265, 2007).
본 문서에서 사용되는 "GIGANTEA"는 파이토크롬 신호전달에 관련되어 있고, 꽃의 개화시기를 조절하는 단백질로 알려져 있다.
본 문서에서 사용되는 "테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)"는 Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys(서열번호 1)의 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, Xaa는 시스테인을 제외한 아미노산으로서, 상기 Xaa의 종류와 폴리펩티드의 길이에 따라, 형광패턴이 달라진다(Adams et al., J. Am. Chem. Soc., 124: 6063-6077, 2002).
이하, 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하면 다음과 같다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다. 또한 설명의 편의를 위하여 도면에서는 구성 요소들이 그 크기가 과장 또는 축소될 수 있다.
도 1은 본 발명의 광유도 나노클러스터 형성에 의한 표적 단백질의 기능 저해방법의 개념을 나타내는 개요도이다. 세포 내에 미끼 단백질과 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 가지고 있는 나노입자와 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 발현시킨 후, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상기 짝 단백질의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하여 상기 나노입자간의 클러스터(나노클러스터)를 형성시킬 경우, 상기 미끼 단백질에 포획된 상기 표적 단백질은 결국 상기 나노클러스터 내에 감금된다.
도 2는 세포의 부분영역(active region)에 대하여 특정 파장의 광조사를 통한 나노클러스터 형성과 상기 부분영역에 존재하는 활성단백질과 상호작용하는 표적단백질의 감금을 통한 상기 활성 단백질의 기능 저해를 개념적으로 나타내는 개요도이다. 레이져 등을 이용하면 세포내의 특정 부분에만 광을 조사할 수 있기 때문에, 본 발명의 방법은 세포내 일부 구역의 단백질 기능 저해에 따른 효과를 조사할 때 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 3은 개체 또는 조직 등 다세포영역에서 특정 세포영역에 대한 광조사를 통한 나노클러스터 형성과 상기 특정 세포영역에 존재하는 표적단백질의 기능 저해를 개념적으로 나타내는 개요도이다. 본 발명의 방법은 한 시료 내에서 인접한 실험군과 대조군 상이의 변화를 비교하여 관찰할 수 있다는 점에서 매우 유용한 방법이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 광조사를 통한 나노클러스터 형성과 그에 의한 분자기능 조절 방법을 개념적으로 나타낸 개요도이다. 도 4에 나타난 바와 같이, 나노입자는 자기조립단백질(SAP)과 광유도 이형이합체 형성 단백질(3, 예로, CIBN)의 융합단백질과, 상기 자기조립단백질과 미끼 단백질(2)의 융합단백질의 자기조립에 의해 형성된 이형 복합체로서 미끼 단백질(2)은 세포에 내재하고 있는 표적 단백질(1)을 포획하는 미끼 역할을 수행하고, 광유도 이형이합체 형성 단백질(3)은 동형 이합체를 형성하고 있는 짝 단백질(4, 예로, PHR)과 광조사시(5) 상호작용을 통해 나노클러스터를 형성하게 되고, 미끼 단백질(2)에 포획된 표적 단백질(1)은 결국 상기 나노클러스터 내에 감금되게 된다.
도 5는 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 두 가지 다른 나노입자에 대한 광조사에 의한 나노클러스터의 형성과 그에 의한 분자기능 조절 방법을 개념적으로 나타낸 개요도이다. 이 경우 제1나노입자는 제1자기조립 단백질(1st SAP)과 광유도 이형이합체 형성 단백질(3)을 포함하는 제1융합단백질과 상기 제1자기조립 단백질과 미끼 단백질(2)을 포함하는 제2융합단백질의 자기조립에 의해 이형 복합체로 형성되고, 제2나노입자는 제2자기조립 단백질(2nd SAP)과 광유도 이형이합체 형성 단백질(3)과 광조사(5)에 의해 이형이합체를 형성하는 짝 단백질(4)을 포함하는 제3융합단백질의 자기조립에 의해 형성되는데, 상기 제1나노입자와 제2나노입자의 표면에 노출된 광유도 이형이합체 형성 단백질(3)과 짝 단백질(4)이 광조사(5)에 의해 상호작용함으로써 나노클러스터가 형성되면 미끼 단백질(2)에 포획된 표적 단백질(1)은 결국 상기 나노클러스터 내에 감금되게 된다.
도 6은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 광조사를 통한 나노클러스터 형성과 그에 의한 분자기능 조절 방법을 개념적으로 나타낸 개요도이다. 이 경우, 나노입자는 자기조립단백질과 광유도 이형이합체 형성 단백질(3)을 포함하는 제1융합단백질의 자기조립에 의해 형성되는 동형 복합체로서, 광조사(5)와 무관하게 동형이합체를 형성하는 짝 단백질(4)과 미끼 단백질(2)을 포함하는 제2융합단백질을 세포 내에서 동시에 발현시킨 후, 광유도 이형이합체 형성 단백질(3)과 짝 단백질(4) 사이의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 광조사시(5) 나노클러스터가 형성되며, 세포에 내재하고 있는 표적 단백질(1)은 미끼 단백질(2)에 포획되어 결국 상기 나노클러스터 내에 감금된다.
도 7은 본 발명의 다른 실시예에 따른 광조사를 통한 나노클러스터 형성과 그에 의한 분자기능 조절 방법을 개념적으로 나타낸 개요도이다. 도 7에서 나타난 바와 같이, 나노입자는 자기조립 단백질과 광조사(5)와 무관하게 동형 이합체를 형성하는 광유도 이형이합체 형성 단백질(3, 예로, PHR)을 포함하는 제1융합단백질의 자기조립에 의해 형성되는 동형 복합체이고, 광유도 이형이합체 형성 단백질(3)과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질(2)과 미끼 단백질(2)을 포함하는 제2융합단백질을 동시에 발현시킨 뒤, 광조사(5)를 통해 광유도 이형이합체 형성 단백질(3)과 짝 단백질(4) 사이의 이형 이합체 형성을 유도하면, 세포에 내재하고 있는 표적 단백질(1)은 미끼 단백질(2)에 포획되어 결국 상기 나노클러스터에 감금된다.
도 8은 도 6에 도시된 본 발명의 일 실시예 따른 방법을 이용한 광조사를 통한 나노클러스터 형성과 이를 이용한 PI3K 단백질의 기능 조절을 도식적으로 나타낸 개요도이다. 세포질 내 단백질인 p110(PI3K catalytic subunit)은 PDGF(platelet-derived growth factor)와 같은 성장인자를 세포에 처리하면, 세포막에 부착된 기질인 PIP2(phosphatidyl-inositol-4,5-bisphosphate)을 인산화시키는데, PIP2의 인산화로 PIP3(phosphatidyl-inositol-3,4,5-bisphosphate)가 생성되면, 세포질에 있던 PIP3 바이오센서인 Akt단백질의 PH도메인이 생성된 PIP3를 인식하여 세포막으로 이동하게 된다. 그러나, 본 발명의 광유도 나노클러스터 형성을 통하여 세포질 내의 내재 단백질인 p110을 미끼 단백질로서 PI3K 조절 서브유닛인 p85의 iSH2(inter Src homology 2 domain) 단백질로 포획하여 상기 나노클러스터 내에 감금시키면, PIP2의 인산화가 저해되어 결국, PH 도메인의 세포막으로의 이동이 저해될 수 있다.
도 9는 본 발명의 다른 실시예에 따른 광조사를 통한 나노클러스터 형성과 그에 의한 분자기능 조절 방법을 개념적으로 나타낸 개요도이다. 이 개요도는 과발현된 표적단백질이 세포 내에 기능을 작용하다가 광조사에 따른 나노클러스터 형성에 의해 표적단백질이 감금되는 것에 대한 방법으로, 도 9에서 나타난 바와 같이 나노입자는 자기조립 단백질과 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질의 자기조립에 의해 형성되는 동형 복합체로서, 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는 짝 단백질과 표적 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 세포 내에서 동시에 발현시킨 후, 상기 광조사 이형 이합체 형성 단백질과 상기 짝 단백질 사이의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 광조사시 나노클러스터가 형성되며, 표적단백질이 상기 나노클러스터 내에 감금된다.
본 발명의 발명자들은 도 9에 도시된 개념을 실험적으로 입증하기 위하여, CaMKIIα 유전자(GenBank No.: NM_012920)의 자기조립에 관여하는 결합도메인(association domain, AD)과 광유도 이형 이합체를 형성하는 CIBN(N-terminal of cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix)의 융합단백질을 세포 내에 발현시켜서 자기조립 단백질의 자기조립에 의한 나노입자를 형성시키고, 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는 단백질이자 광유도에 따라 상기 CIBN과 이형이합체를 형성하는 PHR(photolyase homologous region of cryptochrome 2)을 표적 단백질 Vav2(DH-PH) 단백질과 융합단백질로 발현시킨 뒤, 상기 CIBN과 PHR 사이의 이형 이합체를 형성할 수 있는 488 nm 파장의 청색광을 조사할 경우, 나노 클러스터가 형성되고 나노 클러스터 내에 상기 Vav2 단백질이 포획되어, Vav2에 의해 유도된 접착용 세포체(lamellipodia)의 형성이 억제됨을 실험적으로 입증하였다(도 10 참조). 반면, 표적 단백질인 Vav2가 누락된 유전자 컨스트럭트를 사용할 경우에는 나노클러스터는 형성되지만, 접착용 세포체의 형성은 광조사 전이나 후나 차이가 없음을 알 수 있었다(도 10 참조). 따라서, 본 발명의 방법 및 키트는 세포 내에 발현된 또는 내재하고 있는 특정 표적 단백질 및 생화학적 경로상 그 하위에 존재하는 단백질의 기능을 유효 적절하게 그리고 가역적으로 조절할 수 있는 유용한 방법임을 알 수 있다.
본 발명의 다양한 실시예에 따른 단백질 상호작용 분석방법을 첨부되는 도면을 통해 설명하기로 한다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 벡터의 제작
1-1: CIBN-mCerulean-AD 컨스트럭트의 제작
CaMKIIα 유전자(GenBank 등록번호: NM_012920)의 자기조립에 관여하는 결합도메인(Association domain (AD), CaMKIIα의 315-478 아미노산 잔기)의 N-말단에 시안형광단백질(mCerulean)와 CIB1 유전자(GenBank 등록번호: NM_119618) 광유도 단백질 상호작용에 참여하는 N-말단(CIBN, CIB1의 1??170 아미노산 잔기)를 순차적으로 융합시킨 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조한 후, 이를 pmCerulean-C1 벡터(Clontech, USA)에 삽입하여 CIBN-mCerulean-AD 컨스트럭트를 제작하였다.
1-2: mCitrine-PHR CRY2 컨스트럭트의 제작
CRY2 유전자(GenBank No.: NM_100320)의 PHR에 해당하는 1-498 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 pmCitrine-C1 벡터(Clonthch, USA)에 삽입하여 mCitrine-PHRCRY2 컨스트럭트를 제작하였다. CRY 단백질 또는 PHR은 세포 내에서 발현시킬 경우 동형 이합체를 형성한다.
1-3: mCitrine-PHR CRY2 -Rit tail 컨스트럭트의 제작
CRY2(GenBank 등록번호: NM_100320) PHR 부분(1-498)을 mCitrine의 C-말단에 연결하고, 상기 PHR의 C-말단에 세포막에 위치하는 단백질인 Rit(GeneBank 등록번호: NM_006912)의 꼬리(tail, 아미노 잔기 : 193-219)를 순차적으로 융합시킨 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조한 후, 이를 mCitrine-C1 벡터(Clontech, USA)에 삽입하여 mCitrine-PHRCRY2-Rit tail 컨스트럭트를 제작하였다. Rit tail은 세포막에 존재하는 음전하를 띠는 인지질에 직접 전기적으로 부착되는 단백질로서 세포막으로 단백질을 포획할 수 있다.
1-4: mCitrine-PHR CRY2 -DHPH Vav2 -Rit tail 컨스트럭트의 제작
mCitrine의 C-말단에 CRY2 유전자(GenBank No.: NM_100320)의 PHR 부분(1-498)과 표적단백질로서 접착용 세포체(lamellipodia)의 형성을 유도하는 Vav2(GenBank 등록번호: NM_001134398)의 DH-PH(아미노 잔기 : 167-541)부분 그리고 Rit 단백질(GeneBank 등록번호: NM_006912)의 꼬리 부분(tail, 아미노 잔기: 193-219)을 순차적으로 융합시킨 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조한 후, 이를 pmCitrine-C1 벡터(Clontech, USA)에 삽입하여 mCitrine-PHRCRY2-DHPHVav2-Rit tail 컨스트럭트를 제작하였다. Vav2 단백질은 PH 도메인을 갖고서 세포막으로 약하게 이동하여 세포막에 존재하는 단백질을 활성화시키기 때문에, Rit tail이 없더라도 세포막에서의 기능을 발휘할 수 있으나, 본 발명의 실시예에서는 Vav2 단백질의 세포막으로의 recruit를 보다 확실하게 하기 위하여 Rit tail 컨스트럭트를 사용하였다.
1-5: mCherry-lifeact 컨스트럭트의 제작
Abp140(actin binding protein 140, GenBank 등록번호: NM_001183658) N-말단 부분(1-17)으로 이루어진 펩티드로서 F-액틴을 시각화하기 위한 마커인 lifeact(Riedl et al., Nat. Methods, 5: 605-607, 2008)를 pmCherry-C1(Clonetech, USA)의 C-말단에 삽입하여, mCherry-lifeact 컨스트럭트를 제조하였다.
실험예 1: 광유도에 의한 단백질 기능저해 여부 확인
상기 실시예 1-1, 1-4 및 1-5 에서 각각 제작한 CIBN-mCerulean-AD 컨스트럭트, mCitrine-PHRCRY2-DHPHVav2-Rit tail 컨스트럭트 및 mCherry-lifeact 컨스트럭트를 미리 배양한 NIH-3T3 세포(ATCC No. CRL-1658)에 공형질도입한 후, CIBN과 CRY2 사이의 상호작용을 유발하는 488 nm 파장의 청색광을 10초 간격으로 4분 동안 조사하고 시간의 경과에 따른 세포 내의 형광의 양상을 관찰하였다. 그 결과, 빛을 조사한 경우에는 세포질 내에 강한 녹색 형광 점이 형성되어, 나노클러스터가 형성되었음을 알 수 있었고, 라멜라포디아(lamellipodia) 형성이 저해되는 것을 관찰하였다(도 10). 본 발명의 발명자들은 이러한 접착용 세포체 형성 저해가 Vav2 단백질의 나노클러스터 내의 감금에 의한 것인지 확증하기 위하여, 상기 실시예 1-4에서 제조한 mCitrine-PHRCRY2-DHPHVav2-Rit tail 대신, 상기 실시예 1-3에서 제작한 DHPHVav2가 생략된 mCitrine-PHRCRY2-Rit tail을 사용하여, 동일한 실험을 수행하였다. 그 결과, 도 10에서 나타난 바와 같이, 광조사를 한 경우에 나노클러스터는 형성되었으나, 세포체 형성은 이와 무관한 것으로 관찰하였다. 이는, 본 발명의 방법이 제대로 작동하고 있음을 증명하는 것이다.
본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
1: 표적 단백질
2: 미끼 단백질
3: 광유도 이형이합체 형성 단백질
4: 짝 단백질
5: 광조사
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Claims (35)

  1. 자기조립 단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질를 포함하는 융합단백질, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상호작용하여 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질 및 표적 단백질과 상호작용을 하는 미끼 단백질을 상기 표적 단백질을 내재적 단백질로 발현하는 세포 또는 개체에서 동시에 발현시키는 발현단계; 및
    상기 세포 또는 개체에 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상기 짝 단백질 사이의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하여 광유도 나노클러스터 형성을 유도하는 나노클러스터 형성 유도단계를 포함하며,
    상기 미끼 단백질은 상기 자기조립 단백질 또는 상기 짝 단백질에 융합되어 발현되는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 자기조립 단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질인, 저해방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질, 상기 짝 단백질 및 상기 미끼 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결되는, 저해방법.
  4. 제3항에 있어서,
    녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)인, 저해방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR인, 저해방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 짝 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR인, 저해방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는, 저해방법.
  8. 제1자기조립 단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질, 제2자기조립 단백질 및 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제2융합단백질, 및 표적 단백질과 상호작용하는 미끼 단백질을 상기 표적 단백질을 내재적 단백질로 발현하는 세포 또는 개체에서 동시에 발현시키는 발현단계; 및
    상기 세포 또는 개체에 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상기 짝 단백질 사이의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하여 광유도 나노클러스터 형성을 유도하는 나노클러스터 형성 유도단계를 포함하며,
    상기 미끼 단백질은 상기 제1자기조립 단백질 또는 상기 제2자기조립 단백질에 융합되어 발현되는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 제1자기조립 단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질인, 저해방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 제2자기조립 단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질인, 저해방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 제1융합단백질, 상기 제2융합단백질, 상기 짝 단백질 및 상기 미끼 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결되는, 저해방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)인, 저해방법.
  13. 제8항에 있어서,
    상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR인, 저해방법.
  14. 제8항에 있어서,
    상기 짝 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR인, 저해방법.
  15. 제8항에 있어서,
    상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는, 저해방법.
  16. 자기조립 단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터;
    상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상호작용하여 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터; 및
    표적 단백질과 상호작용을 하는 미끼 단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며,
    상기 미끼 단백질은 상기 자기조립 단백질 또는 상기 짝 단백질에 융합되어 발현되는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 자기조립 단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질인, 키트.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 융합단백질, 상기 짝 단백질 및 상기 미끼 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결되는, 키트.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)인, 키트.
  20. 제16항에 있어서,
    상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR인, 키트.
  21. 제16항에 있어서,
    상기 짝 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR인, 키트.
  22. 제16항에 있어서,
    상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는, 키트.
  23. 제1자기조립 단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터;
    제2자기조립 단백질 및 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터; 및
    표적 단백질과 상호작용하는 미끼 단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위 및 상기 프로모터를 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며,
    상기 미끼 단백질은 상기 제1자기조립 단백질 또는 상기 제2자기조립 단백질에 융합되어 발현되는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 제1자기조립 단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질인, 키트.
  25. 제23항에 있어서,
    상기 제2자기조립 단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질인, 키트.
  26. 제23항에 있어서,
    상기 제1융합단백질, 상기 제2융합단백질, 상기 짝 단백질 및 상기 미끼 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결되는, 키트.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)인, 키트.
  28. 제23항에 있어서,
    상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR인, 키트.
  29. 제23항에 있어서,
    상기 짝 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR인, 키트.
  30. 제23항에 있어서,
    상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는, 키트.
  31. 제1자기조립 단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터;
    제2자기조립 단백질 및 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터; 및
    표적 단백질과 상호작용하는 미끼 단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위 및 상기 프로모터를 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며,
    상기 미끼 단백질은 상기 제1자기조립 단백질 또는 상기 제2자기조립 단백질에 융합되어 발현되는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트.
  32. 자기조립 단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터;
    상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상호작용하여 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터; 및
    표적 단백질과 상호작용을 하는 미끼 단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위 및 상기 프로모터를 포함하는 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며,
    상기 미끼 단백질은 상기 자기조립 단백질 또는 상기 짝 단백질에 융합되어 발현되는 있는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트.
  33. 자기조립 단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질를 포함하는 제1융합단백질, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상호작용하여 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질 및 표적 단백질을 세포 또는 개체에서 동시에 발현시키는 발현단계; 및
    상기 세포 또는 개체에 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상기 짝 단백질 사이의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하여 광유도 나노클러스터 형성을 유도하는 나노클러스터 형성 유도단계를 포함하며,
    상기 표적 단백질은 상기 자기조립 단백질 또는 상기 짝 단백질에 융합되어 발현되는, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해방법.
  34. 자기조립 단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터, 및
    광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터를 포함하며,
    표적 단백질 및 상기 자기조립 단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호호하하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 추가적으로 포함하거나, 상기 표적 단백질이 제2융합단백질에 포함되는, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트.
  35. 자기조립 단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터, 및
    광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터를 포함하며,
    표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위 및 상기 자기조립 단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제3유전자컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 추자적으로 포함하거나,
    상기 표적단백질이 상기 제2융합단백질에 포함되어 발현될 수 있도록, 상기 제2폴리뉴클레오티드 내에 상기 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위가 포함되는, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트.
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