KR101751917B1 - 가역적으로 활성화 가능한 항체 유사체 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 가역적으로 활성화되는 항체 유사체의 제조 및 그의 용도에 관한 것으로서, 항체 유사체의 비활성 제1단편에 지극-유도 이합체 형성 단백질이 연결된 융합단백질을 제공한다.

Description

가역적으로 활성화 가능한 항체 유사체 및 그의 용도{Antibody analogue capable of being activated reversibly and uses thereof}
본 발명은 항체 유사체 및 그의 용도에 관한 것으로서, 더 상세하게는 가역적으로 활성화 가능한 항체 유사체 및 그의 용도에 관한 것이다.
항체는 세포 내 신호전달과정을 연구하는데 사용되는 주요한 지시약이다. 특히 형광 표지된 항체는 세포 내에서 관심대상이 되는 항원과의 분자 상호작용의 결과를 확인하는 분자영상기술에 사용되는 결정적인 표지물질이다. 따라서, 종래의 전장 항체는 치료적 목적은 물론 생화학적 및 세포생물학의 응용분야에서 널리 사용되고 있다. 그러나, 기본적으로 전장 항체는 두 가닥의 중쇄와 두 가닥의 경쇄가 결합되어 생성되는 이종사합체(heterotetramer)로서 포유동물 내에서 재조합 방식에 의해 기능성 항체가 제대로 생성되지 않는 것으로 보고되고 있다. 이러한, 특징은 전장 항체를 세포 내에서 재조합 방식으로 발현시켜 세포 내 단백질의 기능을 연구하거나 이의 기능을 조절함으로써 해당 단백질과 관련된 질병의 치료 목적으로 사용하는데 큰 제한이 되는 요인이다. 대안으로 전장 항체를 단백질 상태로 세포 내로 전달하는 기술을 생각할 수 있는데, 항체를 대상으로 한 단백질 전달기술은 아직 제대로 상용화된 것이 없다.
이러한 전장 항체에 대한 대안으로 항체와 같이 항원 결합능을 유지하면서도 더 작은 크기를 갖는 항체 유사체들(antibody mimetics)이 개발되어 왔는데, 대표적인 예로 단일쇄 가변단편(single chain variable fragment, 이하, 'scFv'라 약칭함, Huston et al., Proc. Natl. Acad. Soc. USA, 85(16): 5879-5883, 1988), Nanobody라고 불리우는 불리는 낙타과 유래의 단일 도메인 항체 단편(single-domain antibody fragment, 이하, 'VHH'로 약칭함, Harmsem and Haard, Appl . Microbiol. Biotechnol. 77(1): 13-22, 2007), 상어와 같은 연골어류 유래의 가변 신규 항원 수용체(vriable new antigen receptor, 이하, 'VNAR'이라 약칭함, Greenberg et al., Nature, 374(6518): 168-173, 1995), 피브로넥틴 제3형 도메인(FN3) 유래의 합성 결합단백질인 monobody(Koide et al., J. Mol. Biol. 284 (4): 1141-1151, 1998), 칠성장어나 먹장어와 같은 무악류 유래의 가변 림프구 수용체(variable lymphocyte receptor, 이하, 'VLR'이라 약칭함, Boehm et al., Ann. Rev. Immunol., 30: 203-220, 2012), 단백질 A의 Z 도메인 유래의 Affibody(Nygren, FEBS J., 275(11): 2668-2676, 2008), 인간 감마-B-크리스탈린 유래의 Affilin(Ebersbach et al., J. Mol. Biol., 372(1): 172-185, 2007), Cystatin 유래의 Affimer(Johnson et al., Anal. Chem., 2012), Sulfolobus acidocaldarius Sac7d 유래의 Affitin(Krenhenbrink et al., J. Mol. Biol., 383(5): 1058-1068, 2008), triple helix coiled coil 단백질 유래의 Alphabody(Desmet et al., Nat. Commun., 5: 5237, 2014), 리포칼린 유래의 Anticlin(Skerra A., FEBS J., 275(11): 2677-2083, 2008), 다양성 막 수용체의 도메인 중 하나인 Avimer(Silverman et al., Nat. Biotechnol., 23(12): 1556-1561, 2005), ankyrin 반복 모티프 유래의 DARpin(Stumpp et al., Drug Discov. Today, 13(15-16): 695-701, 2008), Fyn 단백질의 SH3 도메인 유래의 Fynomer(Grabulovski et al., J. Biol. Chem., 282(5): 3196-3204, 2007), 다양한 protease 저해제의 Kunitz 도메인 유래의 Kunitz domain peptide(Nixon et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 9(2): 261-268, 2006) 등이 존재한다. 이들 항체 유사체들은 모두 단일쇄에 크기가 5 내지 20 kDa 정도로서 재조합 방식에 의해 유전자를 세포 내로 도입할 경우 세포 내에서 전사 및 번역을 통해 발현되거나 통상적인 단백질 세포내 전달 담체를 이용하여 단백질 상태로 세포내 도입이 가능하다.
그러나, 상기와 같은 항체 유사체들의 경우 세포내 전달 효율이 높지 않고, 재조합 방식으로 세포 내 발현을 시킬 경우, 발현되는 순간부터 세포 내에 존재하는 표적 항원 단백질과 상호작용을 하기 때문에, 표적 항원 단백질의 세포내 분포나 기능을 제대로 연구하기 어렵다는 단점을 가지고 있다.
본 발명은 상기 문제점을 포함한 다양한 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 시험관내 조건은 물론 생체 내(in vivo) 조건에서도 사용이 가능하고, 특정 자극에 의해 가역적으로 활성화될 수 있는 항체 유사체 및 그의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 항체 유사체의 비활성 제1단편에 자극-유도 이합체 형성 단백질이 연결된 융합단백질이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 항체 유사체 비활성 제1단편과 결합시 항원 결합능을 회복하는 항체 유사체의 비활성 제2단편에 자극-유도 이합체 형성 단백질과 상기 자극에 의해 이합체를 형성할 수 있는 자극-유도 이합체 형성 짝 단백질이 연결된 융합단백질이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
본 발명이 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 융합단백질을 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 항원의 과발현으로 인해서 발생하는 질병의 치료에 사용되는, 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 항체 유사체의 비활성 제1단편에 자극-유도 이합체 형성 단백질이 연결된 제1융합단백질 및 상기 항체 유사체 비활성 제1단편과 결합시 항원 결합능을 회복하는 항체 유사체의 비활성 제2단편에 상기 자극-유도 이합체 형성 단백질과 상기 자극에 의해 이합체를 형성할 수 있는 자극-유도 이합체 형성 짝 단백질이 연결된 제2융합단백질을 개체, 조직, 또는 세포에 도입하는 융합단백질 도입 단계; 및 상기 융합단백질이 도입된 개체, 조직, 또는 세포에 상기 자극-유도 이합체 형성 단백질 및 상기 자극-유도 이합체 형성 짝 단백질의 광유도 이합체 형성을 유도할 수 있는 자극을 가하는 자극 단계를 포함하는 상기 항체 유사체의 활성화 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 항체 유사체의 비활성 제1단편에 자극-유도 이합체 형성 단백질이 연결된 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드 및 상기 항체 유사체 비활성 제1단편과 결합시 항원 결합능을 회복하는 항체 유사체의 비활성 제2단편에 상기 자극-유도 이합체 형성 단백질과 광조사시 이합체를 형성할 수 있는 자극-유도 이합체 형성 짝 단백질이 연결된 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드를 개체, 조직 또는 세포에 형질도입하는 유전자 형질도입 단계; 및 상기 제1폴리뉴클레오티드 및 제2폴리뉴클레오티드가 형질도입된 비인간 개체, 조직 또는 세포에 상기 광유도 이합체 형성 단백질 및 상기 자극-유도 이합체 형성 짝 단백질의 자극-유도 이합체 형성을 유도할 수 있는 자극을 가하는 자극 단계를 포함하는 상기 항체 유사체의 활성화 방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 동물 또는 식물의 세포 내에서 항체 유사체를 빛으로 활성화 시키고 그리고 가역적으로 조절할 수 있다. 물론 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 일반적 항체(Antibody)의 구조와 항체로 사용할 수 있는 부분에 대한 설명을 개략적으로 도시한 개요도이다.
HCAbs: Heavy-chain antibodies; 항체 중쇄
VHH: Variable domain of heavy-chain antibody; 낙타과의 중쇄 항체의 가변 도메인(Nanobody)
Fab: fragment-antigen binding; 항원 결합 단편
Fc: fragment crystalline; 결정화 단편
scFv: single-chain variable fragment; 단일쇄 가변 단편
VH: variable domain of the heavy chain; 중쇄 가변 도메인
VL: variable domain of the light chain; 경쇄 가변 도메인
도 2는 세포내에서 발현된 scFv와 nanobody가 각 항원에 결합하는 것을 확인한 형광현미경 사진으로 도 2A는 GFP-αTubulin의 융합단백질(좌) 항-튜블린 αTubulin intrabody(scFv)-mCherry 융합단백질(우)을 공발현시킨 세포에 대한 형광현미경 사진이고, 도 2B는 GFP-히스톤2B(H2B) 융합단백질(좌) 및 항-GFP nanobody(VHH)-mCherry 융합단백질을 각각 공발현시킨 세포에 대한 형광현미경 사진이다.
도 3은 단백질 분할(split)을 통한 항체 단편들의 비활성화 유도를 개략적으로 도식화한 개요도들이다. 도 4는 항체 단편들의 비활성화를 유도하기 위한 단백질 분할(split) 위치를 나타내는 것으로서, 도 4A 항-αtubulin intrabody의 구조 및 잠재적 분할 위치로 두 항체 단편(VH 및 VL)을 인위적으로 연결한 링커 부분을 나타내는 개요도이고, 도 4B는 상보 결정기인 CDR1, CDR2, 및 CDR3를 갖는 GFP 단일 도메인 항체(nanobody)의 구조 및 서열을 나타내는 개요도로서, 역삼각형은 잠재적 분할 부위를 나타낸다.
CDR: complementarity-determining regions; 상보결정영역
GFP: Green Fluorecence Protein; 녹색 형광 단백질
Lamin: intermediate filament; 섬유성 단백질
Actin: microfilament; 구형의 다기능 단백질
도 5는 단백질 분할(split)을 통해 비활성화된 항체 단편의 광-유도 활성화 과정을 개략적으로 도식화한 개요도이다.
도 6은 단백질 분할(split)을 통해 비활성화된 항체 단편의 리간드-유도 활성화 과정을 개략적으로 도식화한 개요도이다.
도 7은 광조사를 이용하여 분할된 항-GFP nanobody(VHH) 활성화를 유도한 결과를 나타내는 것으로서, 도 7A는 대조군으로 mCherry-VHHGFP 컨스트럭트 및 GFP-H2B 컨스트럭트를 공형질감염시킨 HeLa 세포를 촬영한 형광현미경 사진(좌측) 및 본 발명의 분할된 N-term VHHGFP-nMagH-mCherry 컨스트럭트(제1단편) 및 iRFP-pMagH-C-term VHHGF 컨스트럭트(제2단편)를 상기 GFP-H2B 컨스트럭트와 함께 공형질감염시킨 HeLa 세포의 광조사 전후의 형광현미경 사진(우측)이고, 도 7B는 일련의 형광현미경 사진 광조사 시간 경과에 따른 세포질 대비 핵의 형광세기의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 8은 광조사를 이용하여 분할된 항-GFP nanobody(VHH) 활성화를 유도한 결과를 나타내는 것으로서, 도 8A는 대조군으로 mCherry-VHHGFP 컨스트럭트 및 TOMM20-EGFP 컨스트럭트를 공형질감염시킨 HeLa 세포를 촬영한 형광현미경 사진(좌측) 및 본 발명의 분할된 N-term VHHGFP-nMagH-mCherry 컨스트럭트(제1단편) 및 iRFP-pMagH-C-term VHHGF 컨스트럭트(제2단편)를 상기 TOMM20-EGFP 컨스트럭트와 함께 공형질감염시킨 HeLa 세포의 광조사 전후의 형광현미경 사진(우측)이고, 도 9B는 일련의 형광현미경 사진 광조사 시간 경과에 따른 동일 위치에서의 EGFP 신호(녹색형광) 대비 적색형광의 일치정도를 나타낸 그래프이다.
도 9는 분할된 항-GCN4 scFv 활성화를 유도한 결과를 나타내는 것으로서, 도 9A는 대조군으로 scFvGCN4-FuRed 컨스트럭트 및 Mito-GFP-24XGCN4pep 컨스트럭트를 공형질감염시킨 HeLa 세포를 촬영한 형광현미경 사진(좌측) 및 본 발명의 분할된 N-term scFvGCN4-nMagH-FuRed 컨스트럭트(제1단편), iRFP-pMagH-C-term scFvGCN4 컨스트럭트 및 상기 Mito-GFP-24XGCN4pep 컨스트럭트를 함께 공형질감염시킨 HeLa 세포의 광조사 전후의 형광현미경 사진(우측)이고, 도 9B는 일련의 형광현미경 사진 광조사 시간 경과에 동일 위치에서의 EGFP 신호(녹색형광) 대비 적색형광의 일치정도(Pearson Correlation Coefficiency)를 나타낸 그래프이다.
도 10은 라파마이신를 처리하여 분할된 항-GFP nanobody(VHH) 활성화를 유도한 결과를 나타내는 것으로서, 도 10A는 대조군으로 mCherry-VHHGFP 컨스트럭트 및 TOMM20-EGFP 컨스트럭트를 공형질감염시킨 HeLa 세포를 촬영한 형광현미경 사진(좌측) 및 본 발명의 분할된 융합단백질들을 암호화하는 N-term VHHGFP-FRB-FuRed-P2A-FKBP-C-term VHHGF 컨스트럭트를 상기 TOMM20-EGFP 컨스트럭트와 함께 공형질감염시킨 HeLa 세포의 광조사 전후의 형광현미경 사진(우측)이고, 도 10B는 일련의 형광현미경 사진 라파마이신 처리 시간 경과에 따른 동일 위치에서의 EGFP 신호(녹색형광) 대비 적색형광의 일치정도(Pearson Correlation Coefficiency)를 나타낸 그래프이다.
도 11은 빛과 라파마이신을 이용하여 분할된 항-actin nanobody(VHH) 활성화를 유도한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
본 문서에서 사용되는 용어를 정의하면 하기와 같다.
본 문서에서 사용되는 "항체 유사체(antibody mimetic)"는 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄가 이종사합체의 4차구조를 형성하여 기능을 발휘하는 통상의 전장 항체와 달리, 항원 결합능을 유지하는 최소단위를 포함하는 단편(예컨대, Fab, F(ab')2, Fab' 또는 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 링커로 연결한 인위적 단편인 단일쇄 가변 단편(single-chain variable fragment, scFv), 경쇄가 없이 중쇄만으로 구성되는 낙타과 또는 연골어류 유래의 항체 단편(VHH, VNAR 등) 또는 nanobody, monobody, 가변 림프구 수용체(VLR) 등 비항체 유래의 단백질 스캐폴드로부터 제조되는 항체 유사단백질을 포함하는 개념이다.
본 문서에서 사용되는 "항체 유사체의 비활성 단편"은 항체 유사체의 기능적 최소 단위 단백질을 적절한 지점에서 분할시켜 생성되는 단백질 단편을 일컫는다. 상기 항체 유사체의 비활성 단편은 단독으로 발현시 및 반대쪽 비활성 단편과 공발현시에는 항체 유사체로서의 구조와 기능을 갖추지 못하고 있기 때문에 항원 결합능이 없다. 이에, 상기 단편을 "비활성 단편"이라 지칭하며, 본 문서에서는 분할에 의해 생성되는 두 개의 단편을 편의상 제1단편 및 제2단편이라 명명하였으며, N-말단쪽 단편 및 C-말단쪽 단편 중 어느 것을 제1단편이라고 지칭해도 무방하다. 다만, 상기 항체 유사체가 Fab인 경우에는 상기 제1단편 및 제2단편은 각각 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인이거나 각각 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인일 수 있다.
본 문서에서 사용되는 "자극-유도 이합체 형성 단백질(stimulus-induced dimerized protein)"은 특정 자극을 가할 경우, 동형이합체를 형성하거나 짝 단백질과 이형이합체를 형성하는 단백질을 의미한다. 이러한 자극-유도 이합체 형성 단백질에는 특정 파장의 빛을 조사할 경우 이합체를 형성하는 광유도 이합체 형성 단백질과 특정 화합물을 처리할 경우 이합체를 형성하는 리간드-유도 이합체 형성 단백질이 존재한다. 이외에도 아직 규명되지는 아니하였으나, 초음파, 자성, 또는 열을 가할 경우 이합체를 형성하는 단백질도 있을 것으로 추정된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "광유도 이합체 형성 단백질(light-induced dimerized protein)"은 특정 파장의 빛을 조사할 경우 동형이합체를 형성하거나 짝 단백질과 이형이합체(heterodimer)를 형성하는 단백질을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "리간드-유도 이합체 형성 단백질"는 특정 화합물을 처리할 경우 동형이합체를 형성하거나 짝 단백질과 이형이합체를 형성하는 단백질을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "이형이합체(heterodimer)"는 서로 다른 두 가지 단백질이 상호작용에 의해 하나의 복합체(complex)를 형성한 것을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "동형이합체(homodimer)"는 같은 단백질이 서로 두 개가 상호작용하여 하나의 복합체(complex)를 형성한 것을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "짝 단백질(partner protein)"은 특정 파장의 빛을 조사할 경우 광유도 이형이합체 형성 단백질과 상호작용하여 이형이합체를 형성하는 대상 단백질을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "PHR"은 상기 CRY의 N-말단 부위로서 포토라이아제 상동성 지역(photolyase homology region)을 의미하며, 광조사시 상기 CIB 또는 CIBN과 상호작용한다(Kennedy et al., Nat. Methods, 7(12): 973-975, 2010).
본 문서에서 사용되는 "CIB"는 크립토크롬-상호작용 염기성 헬릭스-루프-헬릭스 단백질(cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix protein)을 의미하며, 대표적으로 애기장대의 CIB1(GenBank No.: NM_119618)가 있다.
본 문서에서 사용되는 "CIBN"은 상기 CIB의 N-말단으로서 광조사시 크립토크롬(cryptochrome, CRY)와 상호작용하는 부위를 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "CRY"는 크립토크롬(chryptochrome) 단백질을 의미하며, 대표적으로 애기장대의 CRY2(GenBank No.: NM_100320)가 있다.
본 문서에서 사용되는 "PHR"은 상기 CRY의 N-말단 부위로서 파이토라이아제 상동성 지역(phytolyase homolgous region)을 의미하며, 광조사시 상기 CIB 또는 CIBN과 상호작용한다(Kennedy et al., Nat. Methods, 7(12): 973-975, 2010).
본 문서에서 사용되는 "Phy"는 파이토크롬(phytochrome) 단백질을 의미하고, 대표적으로 애기장대의 PhyA(GenBank No.: NM_001123784), PhyB(GenBank No.: NM_127435) 등이 있으며, PIF(phytochrome interacting factor)와 상호작용하는 것으로 알려져 있다(Min et al., Nature, 400: 781-784, 1999)
본 문서에서 사용되는 "PIF"는 파이토크롬 상호작용 인자(phytochrome interacting factor)을 의미하며, 대표적으로 애기장대의 PIF1(GenBank No.: NM_001202630), PIF3(GenBank No.: NM_179295), PIF4(GenBank No.: NM_180050), PIF5(GenBank No.: NM_180690), PIF6(GenBank No.: NM_001203231) 또는 PIF7(GenBank No.: NM_125520)이 있다.
본 문서에서 사용되는 "FKF"는 플라빈-결합, 켈치 반복, F-박스(Flavin-binding, Kelch repeat, F-box) 단백질을 의미하고, 대표적으로 애기장대의 FKF1(GenBank No.: NM_105475)이 있으며, 광조사시 GIGANTEA 단백질과 상호작용하는 것으로 알려져 있다(Sawa et al., Science, 318(5848): 261-265, 2007).
본 문서에서 사용되는 "GIGANTEA"는 파이토크롬 신호전달에 관련되어 있고, 꽃의 개화시기를 조절하는 단백질로 알려져 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)"는 Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys(서열번호 1)의 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, Xaa는 시스테인을 제외한 아미노산으로서, 상기 Xaa의 종류와 폴리펩티드의 길이에 따라, 형광패턴이 달라진다(Adams et al., J. Am. Chem. Soc., 124: 6063-6077, 2002).
본 문서에서 사용되는 "nMag"는 Vivid 단백질 시스템의 변이체로서 negative Magnet의 약자이며, positive Magnet(pMag)와 488 nm 파장의 빛을 조사할 경우 이형 이합체를 형성하는 것으로 알려져 있고, 변이 종류에 따라, nMagFast1, nMagFast2, 및 nMagHigh1의 세 가지로 구분될 수 있다(Kawano et al., Nat. Comm., 6: 6256, 2015).
본 문서에서 사용되는 용어 "pMag"는 Vivid 단백질 시스템의 변이체로서 positive Magnet의 약자이며, 상술한 nMag와 488 nm 파장의 빛을 조사할 경우 이형이합체를 형성하며, 상기 nMag와 마찬가지로 변이 종류에 따라, pMagFast1, pMagFast2 및 pMagHigh1로 구분될 수 있다(Kawano et al., Nat. Comm., 6: 6256, 2015).
본 문서에서 사용되는 용어 "FKBP(FK506 Binding Protein)"는 기능에 있어서 사이클로필린과 연관되어 있고 프롤릴 이소머라아제(proly isomerase) 활성을 가진 단백질로서 프롤린 잔기를 가진 단백질의 단백질 접힘 챠페론(chaperone)으로 기능하는 것으로 알려져 있으며, 특정 화합물인 FK1012, FK506, FKScA, 및 라파마이신(rapamycin)을 처리할 경우, 각각 FKBP, CalcineurinA, CyP-Fas, 및 FRB와 상호작용하여 이합체를 형성하는 것으로 알려져 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "CalcineurinA"은 칼슘 및 칼모듈린 의존성 세린/트레오닌 단백질 탈인산화효소로서 화합물 FK506 처리시 FKBP와 이형이합체를 형성하는 것으로 알려져 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Cyp-Fas"는, CyP(cyclophillin) 단백질과 Fas 수용체 단백질이 연결된 일종의 키메라 단백질로서 화합물 합성 cyclosporin A인 AFKCsA 처리시 FKBP와 이형이합체를 형성하는 것으로 알려지고 있다(Belshaw et al., Proc. Natl. Acad. Soc. U.S.A., 93: 4604-4607, 1996).
본 문서에서 사용되는 용어 "FRB(FKBP-rapamycin-biding protein)"는 mTOR 단백질에서 FKBP와 rapamycin과 결합하는 도메인을 지칭하는 것으로서, 라파마이신 처리시 FKBP와 상호작용하여 이형이합체를 형성하는 것으로 알려지고 있다(Rivera et al., Nat. Med., 2(9): 1028-1032, 1996).
본 문서에서 사용되는 용어 "GyrB"는 DNA gyrase 소단위 B로서, ATP 의존적으로 이중가닥 DNA를 절단하고, 통과하며 재결합함으로써 DNA 슈퍼코일을 해소하는 역할을 수행하는데, 항생제 coumermycin 처리시 동형이합체를 형성하는 것으로 알려져 있다(Farrar et al., Nature, 383(6596): 178-181, 1996).
본 문서에서 사용되는 용어 "GAI(gibberellin insensitive)"는 식물호르몬인 지베렐린 반응성에 관여하는 단백질로서 지베렐린 처리시 GID1(gibberellin insensitive dewarf 1)과 이형이합체를 형성하는 것으로 알려지고 있다(Wilson and Somerville, Plant Physiol., 108: 495-502, 1995).
본 문서에서 사용되는 용어 "GID1(gibberellin insensitive dewarf 1)"는 식물호르몬인 지베렐린에 대한 반응성에 관여하는 단백질로서 지베렐린 처리시 GAI(giberellin insensitive)와 이형이합체를 형성하는 것으로 알려지고 있다(Wilson and Somerville, Plant Physiol., 108: 495-502, 1995).
본 문서에서 사용되는 용어 "Snap-tag"은 O-6-methylguanine-DNA methyltransferase를 개량한 단백질로서 182 아미노산으로 구성된 19.4 kD 크기의 단백질이다. SNAP-tag는 형광을 나타내는 화합물인 HaXS 처리시 HaloTag와 이형이합체를 형성하는 것으로 알려지고 있다(Erhart et al., Chem. Biol., 20(4): 549-557, 2013).
본 문서에서 사용되는 용어 "HaloTag"는 원래 단백질의 정제를 위한 태그로 개발된 합성 리간드이나, 형광 화합물인 HaXS 처리시 상기 Snap-tag와 이형이합체를 형성하는 것으로 알려지고 있다(Erhart et al., Chem . Biol., 20(4): 549-557, 2013).
본 문서에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된(operably linked to)"은 특정 폴리뉴클레오티드가 그 기능을 발휘할 수 있게 다른 폴리뉴클레오티드에 연결된 것을 의미한다. 즉, 특정 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결되었다는 것은 당해 프로모터의 작용에 의해 mRNA로 전사되고 당해 단백질로 번역까지 될 수 있게 연결되었다는 것을 의미하고, 특정 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 다른 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되었다는 것은 당해 특정 단백질이 다른 단백질과 융합단백질의 형태로 발현될 수 있게 연결되었다는 것을 의미한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 항체 유사체의 비활성 제1단편에 광유도 이합체 형성 단백질이 연결된 융합단백질이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 항체 유사체 비활성 제1단편과 결합시 항원 결합능을 회복하는 항체 유사체의 비활성 제2단편에 상기 광유도 이합체 형성 단백질과 광조사시 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이합체 형성 짝 단백질이 연결된 융합단백질이 제공된다.
상기 융합단백질에 있어서, 상기 비활성 제1단편 및 비활성 제2단편은 상기 항체 유사체를 적절한 지점에서 절단하여 생성된 단편들로서 상기 적절한 지점은 CDR을 제외한 지점으로서 항체 유사체의 분자간 이황화결합, 링커(linker) 부분, 비-CDR 루프 부분 또는 힌지(hinge) 부분일 수 있다.
상기 융합단백질에 있어서, 상기 항체 유사체는 Fab, F(ab')2, Fab', VHH, monobody, VLR, Affibody, Affilin, Affimer, Affitin, Alphabody, Anticlin, Avimer, DARpin, Fynomoer 또는 Kunitz domain peptide일 수 있다.
상기 융합단백질은 형광단백질을 추가로 포함할 수 있다.
이때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)일 수 있다. 여기서, 상기 녹색형광단백질은 EGFP(enhanced green fluorescent protein), Emerald, Superfolder, GFP, Azami Green, TagGFP, TurboGFP, ZsGreen 또는 T-Sapphire일 수 있고, 상기 황색형광단백질은 EYFP(enhanced yellow fluorescent protein), Topaz, Venus, mCitrine, Ypet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1 또는 mBanana일 수 있으며, 상기 적색형광단백질은 mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2 또는 mRFP일 수 있고, 상기 주황형광단백질은 Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem, TagRFP, TagRFP-T, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer 또는 mTangerine일 수 있으며, 상기 청록색형광단백질은 ECFP(enhanced cyan fluorescent protein), mECFP, mCerulean, CyPet, AmCyan1, Midori-Ishi Cyan, TagCFP 또는 mTFP1일 수 있고, 상기 청색형광단백질은 EBFP(enhanced blue fluorescent protein), EBFP2, Azurite 또는 mTagBFP일 수 있고, 상기 원적색형광단백질은 mPlum, mCherry, dKeima-Tandem, JRed, mRaspberry, HcRed1, HcRed-Tandem 또는 AQ143일 수 있으며, 상기 테트라시스테인 모티프는 Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys(서열번호 1)의 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 Xaa는 시스테인을 제외한 아미노산일 수 있다.
상기 자극은 리간드 또는 빛일 수 있고, 자극-유도 이합체 형성 단백질은 상기 자극일 경우 리간드-유도 이합체 형성 단백질이고, 상기 리간드-유도 이합체 형성 단백질과 이합체를 형성하는 단백질은 리간드-유도 이합체 형성 짝 단백질이며, 상기 자극이 빛일 경우 광-유도 이합체 형성 단백질이고, 상기 광-유도 이합체 형성 단백질과 이합체를 형성하는 단백질은 광-유도 이합체 형성 짝 단백질이다.
상기 리간드-유도 이합체 형성 단백질은 FKBP(FK506 Binding Protein), CalcineurinA, Cyp-Fas, FRB(FKBP-rapamycin-biding protein), GyrB, GAI(gibberellin insensitive), GID1(gibberellin insensitive dewarf 1), Snap-tag 또는 HaloTag일 수 있다.
상기 리간드-유도 이합체 형성 짝 단백질은 상기 리간드-유도 형성 단백질이 FKBP일 경우, FKBP, Calcineurine, Cyp-Fas 또는 FRB일 수 있고, 상기 리간드-유도 형성 단백질이 CalcineurinA, Cyp-Fas 또는 FRB일 경우 상기 리간드-유도 형성 짝 단백질은 FKBP이며, 상기 리간드-유도 형성 단백질이 GyrB일 경우, 상기 리간드-유도 형성 짝 단백질은 GyrB이며, 상기 리간드-유도 형성 단백질이 GAI일 경우, 상기 리간드-유도 이합체 형성 짝 단백질은 GID1이고, 반대로 상기 리간드-유도 형성 단백질이 GID1일 경우 상기 리간드-유도 이합체 형성 짝 단백질은 GAI이며, 상기 리간드-유도 이합체 형성 단백질이 Sanp-tag일 경우 상기 리간드-유도 이합체 형성 짝 단백질은 Halo Tag이고, 반대로 상기 리간드-유도 형성 단백질이 Halo Tag일 경우 상기 리간드-유도 이합체 형성 짝 단백질은 Snap-tag이다.
상기의 경우, FKBP와 FKBP 간의 동형이합체 형성을 유도하는 리간드는 FK1012이고, FKBP와 CalcieurinA 간의 이형이합체 형성을 유도하는 리간드는 FK506이며, FKBP와 Cyp-Fas 간의 이형이합체 형성을 유도하는 리간드는 FKCsA이고, FKBP와 FRB 간의 이형이합체 형성을 유도하는 리간드는 라파마이신이며, GyrB와 CyrB 사이의 동형이합체 형성을 유도하는 리간드는 쿠메르마이신(Coumermycin)이고, GAI와 GID1 사이의 이형이합체 형성을 유도하는 리간드는 지베렐린(Gibberellin)이며, Snap-tag와 Halo Tag 사이의 이형이합체 형성을 유도하는 리간드는 HaXS이다.
상기 광유도 이합체 형성 단백질은 광유도 이형이합체 형성 단백질 및/또는 광유도 동형이합체 형성단백질일 수 있다. 상기 광유도 이형이합체 형성 단백질은 CIB(cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix protein), CIBN(N-terminal domain of CIB), Phy(phytochrome), PIF(phytochrome interacting factor), FKF1(Flavin-binding, Kelch repeat, F-box 1), GIGANTEA, CRY(chryptochrome), PHR(phytolyase homolgous region), nMag 또는 pMag 또는 일 수 있고, 상기 동형이합체 형성 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다. 종래에는 CRY 또는 PHR은 광조사와 무관하게 동형이합체를 형성하는 것으로 알려졌으나, 본 발명자에 의해 광조사에 의해 동형이합체를 형성하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, CRY 또는 PHR은 광조사에 의해 이형이합체를 형성할 뿐만 아니라 동형이합체도 형성할 수 있는 단백질이다.
상기 융합 단백질에 있어서, 상기 광유도 이합체 형성 단백질은 광유도 이형이합체 형성 단백질 또는 광유도 동형이합체 형성 단백질일 수 있고, 상기 광유도 이형이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY, PHR, nMag 또는 pMag일 수 있다.
상기 융합 단백질에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY, PHR, nMag 또는 pMag일 수 있고, 상기 광유도 이형이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 반대로 상기 광유도 이형이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN일 수 있고, 상기 광유도 이형이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1이고, 상기 광유도 이형이합체 형성 단백질이 nMag이 경우 pMag이고, 반대로 상기 광유도 이형이합체 형성 단백질이 pMag일 경우, nMag이다. 한편, 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다.
상기 융합 단백질에 있어서, 상기 광유도 이형이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사에 의해 동형이합체를 형성할 수 있다. 이 경우 상기 광 조사에 의해 동형이합체를 형성할 수 있는 광유도 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
본 발명이 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터가 제공된다. 상기 재조합 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드 외에 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 전사조절인자 예컨대 프로모터, 인핸서, 터미네이터 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 융합단백질을 포함하는 조성물이 제공된다.
상기 조성물은 항원의 과발현으로 인해서 발생하는 질병의 치료용 약학적 조성물일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 항원의 과발현으로 인해서 발생하는 질병의 치료에 사용되는, 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 항체 유사체의 비활성 제1단편에 자극-유도 이합체 형성 단백질이 연결된 제1융합단백질 및 상기 항체 유사체 비활성 제1단편과 결합시 항원 결합능을 회복하는 항체 유사체의 비활성 제2단편에 상기 자극-유도 이합체 형성 단백질과 상기 자극을 가할 때 이합체를 형성할 수 있는 자극-유도 이합체 형성 짝 단백질이 연결된 제2융합단백질을 개체, 조직, 또는 세포에 도입하는 융합단백질 도입 단계; 및 상기 융합단백질이 도입된 개체, 조직, 또는 세포에 상기 자극-유도 이합체 형성 단백질의 자극-유도 이합체 형성을 유도할 수 있는 자극을 가하는 자극단계를 포함하는 상기 항체 유사체의 활성화 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 항체 유사체의 비활성 제1단편에 자극-유도 이합체 형성 단백질이 연결된 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드 및 상기 항체 유사체 비활성 제1단편과 결합시 항원 결합능을 회복하는 항체 유사체의 비활성 제2단편에 상기 광유도 이합체 형성 단백질과 상기 자극을 가할 때 이합체를 형성할 수 있는 자극-유도 이합체 형성 짝 단백질이 연결된 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드를 개체, 조직 또는 세포에 형질도입하는 유전자 형질도입 단계; 및 상기 제1폴리뉴클레오티드 및 제2폴리뉴클레오티드가 형질도입된 비인간 개체, 조직 또는 세포에 상기 자극-유도 이합체 형성 단백질의 자극-유도 이합체 형성을 유도할 수 있는 자극을 가하는 자극단계를 포함하는 상기 항체 유사체의 활성화 방법이 제공된다.
상기 방법에 있어서, 상기 항체 유사체는 Fab, F(ab')2, Fab', VHH, monobody, VLR, Affibody, Affilin, Affimer, Affitin, Alphabody, Anticlin, Avimer, DARpin, Fynomoer 또는 Kunitz domain peptide일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 융합단백질은 형광단백질을 추가로 포함할 수 있다.
이때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)일 수 있다. 여기서, 상기 녹색형광단백질은 EGFP(enhanced green fluorescent protein), Emerald, Superfolder, GFP, Azami Green, TagGFP, TurboGFP, ZsGreen 또는 T-Sapphire일 수 있고, 상기 황색형광단백질은 EYFP(enhanced yellow fluorescent protein), Topaz, Venus, mCitrine, Ypet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1 또는 mBanana일 수 있으며, 상기 적색형광단백질은 mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2 또는 mRFP일 수 있고, 상기 주황형광단백질은 Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem, TagRFP, TagRFP-T, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer 또는 mTangerine일 수 있으며, 상기 청록색형광단백질은 ECFP(enhanced cyan fluorescent protein), mECFP, mCerulean, CyPet, AmCyan1, Midori-Ishi Cyan, TagCFP 또는 mTFP1일 수 있고, 상기 청색형광단백질은 EBFP(enhanced blue fluorescent protein), EBFP2, Azurite 또는 mTagBFP일 수 있고, 상기 원적색형광단백질은 mPlum, mCherry, dKeima-Tandem, JRed, mRaspberry, HcRed1, HcRed-Tandem 또는 AQ143일 수 있으며, 상기 테트라시스테인 모티프는 Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys(서열번호 1)의 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 Xaa는 시스테인을 제외한 아미노산일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 자극은 리간드 또는 빛일 수 있고, 자극-유도 이합체 형성 단백질은 상기 자극일 경우 리간드-유도 이합체 형성 단백질이고, 상기 리간드-유도 이합체 형성 단백질과 이합체를 형성하는 단백질은 리간드-유도 이합체 형성 짝 단백질이며, 상기 자극이 빛일 경우 광-유도 이합체 형성 단백질이고, 상기 광-유도 이합체 형성 단백질과 이합체를 형성하는 단백질은 광-유도 이합체 형성 짝 단백질이다.
상기 리간드-유도 이합체 형성 단백질은 FKBP(FK506 Binding Protein), CalcineurinA, Cyp-Fas, FRB(FKBP-rapamycin-biding protein), GyrB, GAI(gibberellin insensitive), GID1(gibberellin insensitive dewarf 1), Snap-tag 또는 HaloTag일 수 있다.
상기 리간드-유도 이합체 형성 짝 단백질은 상기 리간드-유도 형성 단백질이 FKBP일 경우, FKBP, Calcineurine, Cyp-Fas 또는 FRB일 수 있고, 상기 리간드-유도 형성 단백질이 CalcineurinA, Cyp-Fas 또는 FRB일 경우 상기 리간드-유도 형성 짝 단백질은 FKBP이며, 상기 리간드-유도 형성 단백질이 GyrB일 경우, 상기 리간드-유도 형성 짝 단백질은 GyrB이며, 상기 리간드-유도 형성 단백질이 GAI일 경우, 상기 리간드-유도 이합체 형성 짝 단백질은 GID1이고, 반대로 상기 리간드-유도 형성 단백질이 GID1일 경우 상기 리간드-유도 이합체 형성 짝 단백질은 GAI이며, 상기 리간드-유도 이합체 형성 단백질이 Sanp-tag일 경우 상기 리간드-유도 이합체 형성 짝 단백질은 Halo Tag이고, 반대로 상기 리간드-유도 형성 단백질이 Halo Tag일 경우 상기 리간드-유도 이합체 형성 짝 단백질은 Snap-tag이다.
상기의 경우, FKBP와 FKBP 간의 동형이합체 형성을 유도하는 리간드는 FK1012이고, FKBP와 CalcieurinA 간의 이형이합체 형성을 유도하는 리간드는 FK506이며, FKBP와 Cyp-Fas 간의 이형이합체 형성을 유도하는 리간드는 FKCsA이고, FKBP와 FRB 간의 이형이합체 형성을 유도하는 리간드는 라파마이신이며, GyrB와 CyrB 사이의 동형이합체 형성을 유도하는 리간드는 쿠메르마이신(Coumermycin)이고, GAI와 GID1 사이의 이형이합체 형성을 유도하는 리간드는 지베렐린(Gibberellin)이며, Snap-tag와 Halo Tag 사이의 이형이합체 형성을 유도하는 리간드는 HaXS이다.
상기 방법에 있어서, 상기 광유도 이합체 형성 단백질은 광유도 이형이합체 형성 단백질 및/또는 광유도 동형이합체 형성단백질일 수 있다. 상기 광유도 이형이합체 형성 단백질은 CIB(cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix protein), CIBN(N-terminal domain of CIB), Phy(phytochrome), PIF(phytochrome interacting factor), FKF1(Flavin-binding, Kelch repeat, F-box 1), GIGANTEA, CRY(chryptochrome), PHR(phytolyase homolgous region), nMag 또는 pMag 또는 일 수 있고, 상기 동형이합체 형성 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다. 종래에는 CRY 또는 PHR은 광조사와 무관하게 동형이합체를 형성하는 것으로 알려졌으나, 본 발명자에 의해 광조사에 의해 동형이합체를 형성하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, CRY 또는 PHR은 광조사에 의해 이형이합체를 형성할 뿐만 아니라 동형이합체도 형성할 수 있는 단백질이다.
상기 방법에 있어서, 상기 광유도 이합체 형성 단백질은 광유도 이형이합체 형성 단백질 또는 광유도 동형이합체 형성 단백질일 수 있고, 상기 광유도 이형이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY, PHR, nMag 또는 pMag일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY, PHR, nMag 또는 pMag일 수 있고, 상기 광유도 이형이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 반대로 상기 광유도 이형이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN일 수 있고, 상기 광유도 이형이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1이고, 상기 광유도 이형이합체 형성 단백질이 nMag이 경우 pMag이고, 반대로 상기 광유도 이형이합체 형성 단백질이 pMag일 경우, nMag이다. 한편, 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 광유도 이형이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사에 의해 동형이합체를 형성할 수 있다. 이 경우 상기 광 조사에 의해 동형이합체를 형성할 수 있는 광유도 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 광유도 이형이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사에 의해 동형이합체를 형성할 수 있다. 이 경우 상기 광 조사에 의해 동형이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
본 발명자들은 항체 유사체인 scFv 및 nanobody(VHH)의 3차 구조에 대한 예측을 기반으로 CDR 부분의 구조에 영향을 주지 않는 linker 또는 비-CDR loop 부분에서 절단이 되도록 GFP 또는 GCN4 펩타이드에 특이적으로 결합하는 재조합 항체 유사체 단편들(제1단편 및 제2단편)을 고안한 후 이들 단편들의 제1단편의 C-말단에 광유도 이합체 단백질인 nMag 및 형광단백질을 연결된 제1융합단백질, 그리고 제2단편의 N 말단에 형광단백질 및 상기 광유도 이합체 형성 단백질의 짝 단백질인 pMag가 연결된 제2융합단백질을 각각 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 각각 제조한 후, 상기 폴리뉴클레오티드들을 발현벡터에 클로닝하여 재조합 발현벡터를 제조한 다음, HeLa 세포에 공형질감염시켜서, 상기 융합단백질들을 발현시켰다. 단순히 발현만 시킨 경우에는 상기 융합단백질들은 항원을 전혀 검출하지 못하였다. 그러나 상기 세포에 상기 광유도 이합체 형성을 유도할 수 있는 488 nm 파장의 빛을 조사한 결과, 핵내 또는 세포질에 존재하는 항원을 정확하게 검출함을 확인하였다(도 7 내지 9 참조).
이는 본 발명의 융합단백질들이 광조사에 따라 표적이 되는 항원에 결합하고 이를 검출하는데 사용될 수 있음을 입증하는 것이다.
아울러, 본 발명자들은 광유도 이합체 형성 단백질 외에도 리간드에 의해 이합체를 형성할 수 있는 FKBP 및 FRB를 상술한 항체 유사체가 쪼개진 단편에 연결한 융합단백질을 고안한 후 이들 융합단백질들을 각각 발현하도록 고안된 유전자 컨스트럭트를 제조한 후 HeLa 세포에 공형질도입하고, FKBP 및 FRB 사이의 이합체 형성을 유도할 수 있는 리간드인 라파마이신의 처리시 이합체 형성에 따른 항원 결합 능력이 회복됨을 실험적으로 입증하였다(도 10 및 11 참조). 따라서, 본 발명의 융합단백질 및 이를 이용한 방법에 의하면, 세포 내의 항원을 일시적으로 그리고 국지적으로 검출하거나 불활성화시킬 수 있어, 본 발명은 특정 단백질의 기능의 연구나 특정 단백질의 저해를 통한 질병의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하면 다음과 같다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 도면에 도시된 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 도면에서 도시된 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다. 또한 설명의 편의를 위하여 도면에서는 구성 요소들이 그 크기가 과장 또는 축소될 수 있다.
도 1은 일반적 항체(Antibody)의 구조와 항체로 사용할 수 있는 부분에 대한 설명을 개략적으로 도시한 개요도이다. 항체 단백질의 분자 구조는 서로 비슷하기는 하지만 크게 IgG, IgM, IgA, IgD, IgM 등 다섯 종류로 구별된다. 이중 가장 대표적인 IgG의 단백질 구조는 아미노산 400여개의 큰 사슬 단백질(heavy chain) 과 아미노산 200여개의 작은 사슬 단백질(light chain) 2개로 구성되고 매우 안정적인 구조를 형성하고 있다. 항원의 말단에는 한 개의 가변지역(variable region)이 있고 큰 사슬과 작은 사슬의 가변 두 개가 합쳐져서 항원과 작용하는 항원 결합 부위를 형성한다. 이 항원 결합 부위는 한 개의 IgG 항체에 두 개가 존재하고 이들은 항원과 다중 결합을 통하여 항원과의 친화도를 증가시킨다. 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역 안에는 항체마다 아미노산 서열이 특히 다른 세 개의 고변이 지역(hypervariable region)이 각각 존재하는데, 이 부분은 항원과 직접적으로 결합하는 부위이기 때문에 상보성 결정지역(complementarity determining regions, CDRs)이라고 한다. 이외에도, Fab 부위만 활용한 Fab 항체 조각, 또는 가변영역만 활용하는 scFv(single chain variable fragment), 항체의 불변영역(Fc)에 단백질을 융합시키는 융합단백질 형태로도 개발되고 있으며, 최근 낙타과 동물의 항체의 고유의 구조에 기반하여(낙타과 동물의 항체는 중쇄 두 가닥으로만 구성되어 있음) 중쇄(Heavy chain)의 가변영역만을 활용하는 단일 도메인 항체인 나노바디(Nb 또는 VHH) 제작이 전개되고 있다.
도 2는 세포내에서 발현된 scFv와 nanobody가 각 항원에 결합하는 것을 확인한 형광현미경 사진으로 도 2A는 GFP-αTubulin의 융합단백질(좌) 항-튜블린 intrabody(scFv) Tubulin-mCherry 융합단백질(우)을 공발현시킨 세포에 대한 형광현미경 사진이고, 도 2B는 GFP-히스톤2B(H2B) 융합단백질(좌) 및 항-GFP nanobody(VHH)-mCherry 융합단백질을 각각 공발현시킨 세포에 대한 형광현미경 사진이다. 상기 도 2에서 나타난 바와 같이, GFP-αTubulin 융합단백질 및 항-Tubulin-mCherry 융합단백질의 경우 동일 세포에서 공발현시켰을 경우, 동일한 패턴의 형광이 나타났으며, 핵내 histone 2B를 영상화하기 위해 제작된, GFP-H2B 융합단백질 및 GFP를 검출하기 위해 구축된 항-GFP nanobody-mCherry 융합단백질 역시 동일 세포내에 공발현시켰을 때 동일한 형광패턴을 나타냈다. 이는, 본 발명의 일 실시예에서 사용한 intrabody 및 nanobody가 표적 단백질에 특이적으로 결합하여 검출하는데 적합한 항체 유사체임을 보여주는 결과이다.
도 3은 단백질 분할(split)을 통한 항체 단편들의 비활성화 유도를 개략적으로 도식화한 개요도들이다. 항체 단편은 항체 분자에서 항원 결합능을 나타내는 Fc 부분을 제외한 항원 결합 도메인들을 말하며, 도3에서는 예시적으로 Fab, 단일사슬 가변단편(single-chain variable fragment, scFv, intrabody) 및 3세대 항체단편(single domain)인 VHH(Nanobody)을 제시하였다. 그러나, 상기 세 가지 활성단편은 예시적인 것에 불과하며, 상술한 다양한 항체 유사체가 사용될 수 있다.
도 4는 항체 단편들의 비활성화를 유도하기 위한 단백질 분할(split) 위치를 나타내는 것으로서, 도 4A는 항-αTubulin intrabody의 구조 및 잠재적 분할 위치로 두 항체 단편(VH 및 VL)을 인위적으로 연결한 링커 부분을 나타내는 개요도이고, 도 4B는 상보 결정기인 CDR1, CDR2, 및 CDR3를 갖는 GFP 단일 도메인 항체(nanobody)의 구조 및 서열을 나타내는 개요도로서, 상기 도 4A 및 4B에서 초록색 역삼각형은 잠재적 분할 부위를 나타낸다.
도 5는 단백질 분할(split)을 통해 비활성화된 항체 단편의 광-유도 활성화 과정을 개략적으로 도식화한 개요도이다. 도 5에 도시된 바와 같이 비활성화된 항체단편 및 광유도 이합체 형성 단백질을 포함하는 각각의 융합단백질에 상기 광유도 이합체 형성 단백질의 이합체 형성을 유도할 수 있는 파장의 빛을 조사하면 광유도 이합체 형성 단백질의 이합체 형성에 따라, 상기 항체 단편들이 활성 단편의 3차원 구조를 갖추게 됨으로써, 항원에 결합을 하게 된다. 상기와 같은 과정은 광조사를 중단함으로써 가역적으로 수행될 수 있다는 장점이 존재한다.
도 6는 단백질 분할(split)을 통해 비활성화된 항체 단편의 리간드-유도 활성화 과정을 개략적으로 도식화한 개요도이다. 도 6에 도시된 바와 같이 비활성화된 항체단편 및 리간드-유도 이합체 형성 단백질을 포함하는 각각의 융합단백질에 상기 리간드-유도 이합체 형성 단백질의 이합체 형성을 유도할 수 있는 리간드를 처리하면 리간드-유도 이합체 형성 단백질의 이합체 형성에 따라, 상기 항체 단편들이 활성 단편의 3차원 구조를 갖추게 됨으로써, 항원에 결합을 하게 된다. 상기와 같은 과정은 리간드 처리를 중단하고 배지를 교체함으로써 가역적으로 수행될 수 있다.
도 7은 광조사를 이용하여 분할된 항-GFP nanobody(VHH) 활성화를 유도한 결과를 나타내는 것으로서, 도 7A는 대조군으로 mCherry-VHHGFP 컨스트럭트 및 GFP-H2B 컨스트럭트를 공형질감염시킨 HeLa 세포를 촬영한 형광현미경 사진(좌측) 및 본 발명의 분할된 N-term VHHGFP-nMagH-mCherry 컨스트럭트(제1단편) 및 iRFP-pMagH-C-term VHHGF 컨스트럭트(제2단편)를 상기 GFP-H2B 컨스트럭트와 함께 공형질감염시킨 HeLa 세포의 광조사 전후의 형광현미경 사진(우측)이고, 도 7B는 일련의 형광현미경 사진 광조사 시간 경과에 따른 세포질 대비 핵의 형광세기의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 8은 광조사를 이용하여 분할된 항-GFP nanobody(VHH) 활성화를 유도한 결과를 나타내는 것으로서, 도 8A는 대조군으로 mCherry-VHHGFP 컨스트럭트 및 TOMM20-EGFP 컨스트럭트를 공형질감염시킨 HeLa 세포를 촬영한 형광현미경 사진(좌측) 및 본 발명의 분할된 N-term VHHGFP-nMagH-mCherry 컨스트럭트(제1단편) 및 iRFP-pMagH-C-term VHHGFP 컨스트럭트(제2단편)를 상기 TOMM20-EGFP 컨스트럭트와 함께 공형질감염시킨 HeLa 세포의 광조사 전후의 형광현미경 사진(우측)이고, 도 8B는 일련의 형광현미경 사진 광조사 시간 경과에 따른 동일 위치에서의 EGFP 신호(녹색형광) 대비 적색형광의 일치정도를 나타낸 그래프이다.
도 9는 분할된 항-GCN4 scFv 활성화를 유도한 결과를 나타내는 것으로서, 도 8A는 대조군으로 scFvGCN4-fuRed 컨스트럭트 및 Mito-GFP-24XGCN4pep 컨스트럭트를 공형질감염시킨 HeLa 세포를 촬영한 형광현미경 사진(좌측) 및 본 발명의 분할된 N-term scFvGCN4-nMagH-fuRed 컨스트럭트(제1단편), iRFP-pMagH-C-term scFvGCN4 컨스트럭트 및 상기 Mito-GFP-24XGCN4pep 컨스트럭트를 함께 공형질감염시킨 HeLa 세포의 광조사 전후의 형광현미경 사진(우측)이고, 도 8B는 일련의 형광현미경 사진 광조사 시간 경과에 동일 위치에서의 EGP 신호(녹색형광) 대비 적색형광의 일치정도(Pearson Correlation Coefficiency)를 나타낸 그래프이다.
도 10은 라파마이신를 처리하여 분할된 항-GFP nanobody(VHH) 활성화를 유도한 결과를 나타내는 것으로서, 도 10A는 대조군으로 mCherry-VHHGFP 컨스트럭트 및 TOMM20-EGFP 컨스트럭트를 공형질감염시킨 HeLa 세포를 촬영한 형광현미경 사진(좌측) 및 본 발명의 분할된 융합단백질들을 암호화하는 N-term VHHGFP-FRB-fuRed-P2A-FKBP-C-term VHHGF 컨스트럭트를 상기 TOMM20-EGFP 컨스트럭트와 함께 공형질감염시킨 HeLa 세포의 광조사 전후의 형광현미경 사진(우측)이고, 도 10B는 일련의 형광현미경 사진 라파마이신 처리 시간 경과에 따른 동일 위치에서의 EGP 신호(녹색형광) 대비 적색형광의 일치정도(Pearson Correlation Coefficiency)를 나타낸 그래프이다.
도 11은 라파마이신을 이용하여 분할된 항-actin nanobody(VHH) 활성화를 유도한 결과를 나타내는 것으로서, 라파마이신 처리시 세포 내재적 항원인 actin이 존재하는 위치로 항-actin nanobody가 집결함을 나타내고 있다.
상기 도면에 대한 설명에서 나타난 바와 같이, 본 발명자들은 다양한 항체 유사체를 반으로 쪼갠 후, 쪼개진 항체 유사체 단편에 광 또는 리간드-유도 이합체 형성 단백질과 상기 이합체 형성 단백질과 짝을 이루는 짝 단백질을 연결하는 융합단백질을 고안한 후 이를 항원을 발현하는 세포에 공형질 감염시킨 후 상기 이합체 형성 단백질의 이합체를 형성할 수 있는 광조사 또는 리간드를 처리할 경우, 광조사 또는 리간드 처리 전에는 불활성화되어 세포 전반에 걸쳐 발현되고 있던 항체 유사체 단편들이 광조사 또는 리간드 처리에 의해 이합체를 형성하면서 항원이 위치하고 있는 정확한 위치에서 활성화되어 항원과 특이적으로 결합함을 최초로 실험적으로 입증하였다. 이는 단일쇄 항체 단편인 nanobody 또는 scFv 또는 이중쇄 항체 단편이긴 하나 경쇄 유래 단편과 중쇄 유래 단편이 공유결합에 의해 결합되어 있어야만 기능을 발휘하는 Fab를 각각의 분할 단백질로 발현시킨 후 이를 빛 또는 리간드에 의해 서로 상호작용하는 단백질의 자극-유도 이합체 형성에 편승하여 상호작용하도록 할 경우 애초에 단일한 단백질로 발현된 것과 마찬가지로 항원을 인식하는 항체 유사체로서의 기능을 정상적으로 할 수 있음을 최초로 입증한 것이다. 따라서, 이는 본 발명의 시스템이 nanobody(VHH) 및 scFv 뿐만 아니라 다른 활성 항체단편(또는, 항체 유사체)에도 포괄적으로 적용될 수 있음을 시사하는 것이다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: N-term V H HGFP - nMagH - mCherry 컨스트럭트 및 iRFP - pMagH -C-term V H HGFP 컨스트럭트의 제작
VHHGFP 컨스트럭트는 Chromotek사로부터 구매를 하였고, 상기 VHHGFP 컨스트럭트 중에서 VHHGFP의 1 내지 65번 아미노산으로 구성된, N-말단 단편(N-term VHHGFP, 서열번호 2)을 암호화하는 핵산서열, (GGGGS)2 링커 및 nMagH(서열번호 3)을 암호화하는 핵산을 pmCherry 컨스트럭트의 mCherry의 N-말단쪽에 삽입함으로써 N-term VHHGFP-nMagH-mCherry 컨스트럭트를 제조하였다. 상기 nMagH을 암호화하는 핵산서열은 Kawano 등이 개시한 내용을 기반으로 합성하였다(Kawano et al., Nat. Comm., 6: 6256, 2015). 한편, 상기 VHHGFP 컨스트럭트로부터 전장 VHHGFP(서열번호 4)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 mCherry 컨스트럭트에 삽입하여 VHHGFP-mCherry 컨스트럭트를 제조하여 양성 대조군으로 사용하였다.
한편, 본 발명자들은 piRFP 컨스트럭트(Addgene 31857)를 구입하여 iRFP 유전자의 3'-말단에 pMagH(서열번호 5), (GGGGS)2 링커 및 VHHGFP의 66-117 아미노산으로 구성된 C-term VHHGFP(서열번호 6)이 순차적으로 연결된 융합단백질을 암호화하는 핵산서열을 연결함으로써, iRFP-pMagH-C-term VHHGFP 컨스트럭트를 제조하였다.
실시예 2: N-term scFvGCN4-nMagH-fuRed 컨스트럭트 및 iRFP-pMagH-C-term scFvGCN4 컨스트럭트의 제작
pHR-scFv-GCN4-sfGFP-GB1-NLS-dWPRE 컨스트럭트는 Addgene으로부터 구매하였고, 상기 pHR-scFv-GCN4-sfGFP-GB1-NLS-dWPRE로부터 scFV-GCN4를 암호화하는 핵산서열 중 아미노산 1 내지 196로 구성되는 N-term scFvGCN4(서열번호 7) 해당되는 핵산서열을 PCR로 증폭하여 상기 실시예 1에서 제조한 N-term VHHGFP-nMagH-mCherry 컨스트럭트의 제조 방법과 동일하게 N-term scFVGCN4-nMagH-fuRed 컨스트럭트를 제조하였다.
아울러, 상기 실시예 1에서 제작한 iRFP-pMagH-C-term VHHGFP 컨스트럭트의 C-term VHHGFP 대신에 상기 실시예 2에서 사용한 pHR-scFv-GCN4-sfGFP-GB1-NLS-dWPRE 컨스트럭트로부터 scFv-GCN4의 197 내지 247번째 아미노산으로 구성되는 C-term scFvGCN4(서열번호 8)을 암호화하는 핵산서열을 PCR로 증폭하여 삽입함으로써 iRFP-pMagH-C-term scFvGCN4 컨스트럭트를 제작하였다.
실시예 3: N-term V H HGFP-FRB-fuRed-P2A-FKBP-C-term V H HGFP 컨스트럭트의 제작
상기 실시예 1에서 제작한 N-term VHHGFP-nMagH-mCherry 컨스트럭트에서 nMagH-mCherry를 제거하고, 여기에 FRB(서열번호 9)-fuRed(서열번호 10)-P2A(서열번호 11)-FKBP(서열번호 12) 그리고 C-term VHHGFP(서열번호 6)가 순차적으로 연결된 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 삽입함으로써 N-term VHHGFP-FRB-fuRed-P2A-FKBP-C-term VHHGFP 컨스트럭트를 제조하였다. 상기 폴리뉴클레오티드는 각각의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 연결할 수 있도록 중첩된 프라이머를 제조하여 PCR함으로써 제조하였다.
실시예 4: N-term V H HActin-FRB-fuRed-P2A-FKBP-C-term V H HActin 컨스트럭트의 제작
VHHActin 컨스트럭트는 Chromotek사로부터 구매를 하였고, 상기 VHHActin 컨스트럭트 중에서 VHHActin의 1 내지 64번 아미노산으로 구성된, N-말단 단편(N-term VHHActin, 서열번호 13)을 암호화하는 핵산서열 및 VHHActin의 65 내지 122 아미노산으로 구성된 C-a말단 단편(C-term VHHActin, 서열번호 14)을 암호화하는 핵산서열을 각각 상기 실시예 5에서 제작한 N-term VHHGFP-FRB-fuRed-P2A-FKBP-C-term VHHGFP 컨스트럭트의 N-term VHHGFP 및 C-term VHHGFP 대신에 삽입하여 N-term VHHActin-FRB-fuRed-P2A-FKBP-C-term VHHActin 컨스트럭트을 제조하였다.
실시예 5: N-term V H HActin-nMagH-mCherry 컨스트럭트 및 iRFP-pMagH-C-term V H HActin 컨스트럭트의 제작
상기 실시예 1에서 사용한 N-term VHHGFP-nMagH-mCherry 컨스트럭트의 N-term VHHGFP 대신에 상기 실시예 4에서 사용한 N-term VHHActin을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 삽입함으로써 N-term VHHActin-nMagH-mCherry 컨스트럭트를 제작하였고, 실시예 1에서 사용한 iRFP-pMagH-C-term VHHGFP 컨스트럭트에서 C-term VHHGFP 대신에 실시예 4에서 사용한 C-term VHHActin을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 삽입함으로써 iRFP-pMagH-C-term VHHActin 컨스트럭트를 제조하였다.
실험예 1: 분할 V H H에 대한 광유도 활성화
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제조된 N-term VHHGFP-nMagH-mCherry 컨스트럭트 및 iRFP-pMagH-C-term VHHGFP 컨스트럭트를 HeLa 세포에 공형질감염시켰다. 이 때 항원인 GFP가 HeLa 세포에서 발현되지 않기 때문에, 항원을 발현시키기 위해 GFP-H2B 컨스트럭트(Kanda et al., Curr. Biol., 8: 377-385, 1998) 또는 TOMM20-EGFP 컨스트럭트(Komatsu et al., Nat, Methods, 7(3): 206-208, 2010)와 함께 공형질감염시켰다. 양성 대조군으로는 실시예 1에서 제조한 VHHGFP-mCherry 컨스트럭트와 GFP-H2B 컨스트럭트 또는 TOMM20-EGFP 컨스트럭트를 사용하였다.
형질감염 후 nMagH과 pMagH 사이의 이합체 형성을 유도하는 488 nm 파장의 빛을 가하자, GFP-H2B를 공발현시킨 HeLa 세포의 경우 GFP가 발현되어 있는 핵쪽으로 VHHGFP가 결집하여 활성화됨을 확인할 수 있었다(도 7A). 도 7B는 광조사 후 시간의 경과에 따른 세포질 대비 핵에서의 형광의 강도의 비율을 나타낸 그래프이다. 도 7B에서 나타난 바와 같이 시간이 경과할 수록 핵 내에서의 형광의 강도가 점점 강해짐을 확인할 수 있다. 이는, 비활성 상태이던 분할 VHHGFP가 광조사에 의한 nMag와 pMag의 상호작용에 따라 활성형의 VHHGFP로 변환되어 핵내에 존재하는 GFP에 특이적으로 결합하였음을 의미하는 것이다.
한편, 항원인 GFP를 세포질내 미토콘드리아에서 발현시키기 위해 TOMM20-EGFP를 공발현시킨 HeLa 세포에서는 광조사 후 세포 전반에 편재되어 있던 mCherry에 의한 형광이 미토콘드리아 쪽으로 이동함을 알 수 있었다(도 8A). 도 8B는 도 8A의 결과에서 동일 장소에서의 GFP에 의한 형광과 mCherry에 의한 형광의 상관관계를 비율로 나타낸 그래프이다. 도 8B에서 나타난 바와 같이, 시간의 경과에 따라 녹색형광과 적색형광의 상관관계가 더 높아짐을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 분할 나노바디가 광조사에 의해 이합체를 형성할 뿐만 아니라 항체 유사체로서의 나노바디의 활성을 회복한다는 점을 입증하는 것이다.
아울러, 본 발명자들은 VHH의 C-말단 단편을 포함하는 컨스트럭트에서 상기 VHH의 C-말단 단편의 위치가 미치는 영향에 대하여 조사하기 위해 VHHGFP C-말단 단편의 위치를 N-말단의 위치에 오도록 한 컨스트럭트(C-term VHHGFP-pMagH-iRFP)를 제작하여 분석하였는데, 비록 상기 실시예 1에서 제조한 iRFP-pMagH-C-term VHHGFP 컨스트럭트에 비해서 활성화 정도는 다소 떨어졌지만 마찬가지로 분할 VHH를 충분히 활성화시킬 수 있음을 확인하였다(데이터는 미제시). 따라서, 분할 항체 유사체 단편의 융합단백질 내에서의 구체적인 위치는 크게 중요하지 않다.
실험예 2: 분할 scFv에 대한 광유도 활성화
본 발명자들은 nanobody(VHH) 뿐만 아니라 단일쇄 항체 유사체 단편인 scFv 역시 분할 및 광유도 이합체 형성 단백질과의 융합단백질을 만들어 광유도 활성화가 가능한지 조사하기 위해 VHH 대신에 scFv가 사용된 상기 실시예 2에서 제조된 N-term scFVGCN4-nMagH-mCherry 컨스트럭트 및 iRFP-pMagH-C-term scFvGCN4 컨스트럭트를 이용하여 분석을 수행하였다.
구체적으로 실시예 2에서 제조된 N-term scFVGCN4-nMagH-mCherry 컨스트럭트 및 iRFP-pMagH-C-term scFvGCN4 컨스트럭트를 항원인 GCN4를 세포질에서 발현하도록 고안된 mito-GFP-24XGCN4-pep 컨스트럭트와 함께 HeLa 세포에 공형질감염시켰다. 상기 mito-GFP-24XGCN4-pep 컨스트럭트는 Tanenbaum 등에 기재된 유전자 컨스트럭트 Mito-mCherry-24XGCN4pep의 mCherry를 EGFP로 치환함으로써 제조하였다(Tanenbaum et al., Cell, 159: 635-646, 2014). 상기 컨스트럭트에서 Mito는 미토콘드리아 표적 신호서열이고 24XGCNpep은 전사인자인 GCN4에서 coiled-coil 방식으로 자기조립이 되는 22 a.a. 크기의 단편 24 개를 나란히 연결한 컨스트럭트이다. 이 때, 양성대조군으로는 scFvGCN4-fuRed 컨스트럭트를 사용하였고, 상기 scFvGCN4-fuRed 컨스트럭트는 상기 실시예 2에서 사용한 pHR-scFv-GCN4-sfGFP-GB1-NLS-dWPRE 컨스트럭트와 pFusionRed-N 컨스트럭트(Evrogen, RUSSIA)를 이용하여 제작하였다.
그 결과, 도 9A에 나타난 바와 같이, 분할된 scFv 역시 광조사에 의해 광유도 이합체 형성 단백질의 이합체 형성에 의해 활성을 회복하여 미토콘드리아에 위치한 항원에 특이적으로 결합함을 확인할 수 있었다. 도 9B는 동일 위체에서의 GFP 형광에 대한 적색 형광의 상관관계를 비율로 나타낸 그래프이다. 도 9B에서 나타난 바와 같이 광조사 후 시간이 경과함에 따라 녹색형광 위치에서 적색형광의 강도가 증가함을 알 수 있었다. 이는 scFv 역시 분할 후 광조사에 의해 복합체를 형성할 때 비활성 상태에서 활성상태로 변환됨을 입증하는 것이다.
실험예 3: 리간드에 의한 분할 V H H의 활성화
본 발명자들은 광조사 외에 리간드에 의해 이합체를 형성하는 리간드-유도 이합체 형성 단백질을 분할 VHH에 융합하여 세포 내에서 발현시킨 후 리간드 처리시 광유도와 유사하게 항원결합능이 회복되는지 조사하였다.
구체적으로 실시예 3에서 제조된 N-term VHHGFP-FRB-fuRed-P2A-FKBP-C-term VHHGFP 컨스트럭트를 TOMM20-EGFP 컨스트럭트와 함께 HeLa 세포에 공형질감염시켰다. 상기 N-term VHHGFP-FRB-fuRed-P2A-FKBP-C-term VHHGFP 컨스트럭트는 VHHGFP의 N-말단 단편(제1단편)과 VHHGFP의 C-말단 단편(제2단편)을 하나의 폴리펩티드로 발현시킨 후 리보좀에서 번역시 P2A 부위에서 절단됨으로써 두 단편을 각각 포함하는 융합단백질들의 형태로 발현되도록 고안한 것으로서, 이와는 달리 상기 실시예 1 a및 2와 같이 별도의 컨스트럭트로 제작한 후 세포에 공형질감염시켜도 무방하다. 실제 본 발명자들은 각각의 컨스트럭트로 제1단편과 제2단편을 발현시켜도 유사한 결과가 도출됨을 확인하여였다(데이터는 제시하지 않음).
공형질감염 이후, HeLa 세포에 0.1 μM의 라파마이신(Rapamycin)을 처리한 후 시간의 경과에 따라 형광의 분포 빛 강도의 변화를 형광현미경으로 관찰하였다. 그 결과 도 10A에서 나타난 바와 같이, 라파마이신 처리 후 EGFP가 발현된 세포질에서 적색형광의 강도가 증가함을 확인할 수 있었다. 도 10B에서 나타난 바와 같이, 시간의 경과에 따라 동일 위치에서 녹색 형광에 대한 적색형광의 상관관계가 증가함을 확인하였다. 상기 결과로부터 광유도 외에도 리간드를 이용해서도 분할 항체 유사체의 활성화가 가능함을 알 수 있었다.
실험예 4: 광조사 및 리간드를 이용한 내재적 단백질의 검출
GFP는 원래 HeLa에 내재하지 않는 단백질이기 때문에, 본 발명의 시스템이 실제 세포 내에 내재하고 있는 단백질을 검출하는데 사용될 수 있는지 확인하기 위하여 본 발명자들은 실시예 3에서 제조된 N-term VHHActin-FRB-fuRed-P2A-FKBP-C-term VHHActin 컨스트럭트를 HeLa 세포에 형질감염시켰다. 그런 다음 형질감염된 HeLa 세포에 라파마이신을 처리한 후, 시간의 경과에 따른 세포내의 형광의 형태 및 강도를 분석하였다.
그 결과 도 11A 에서 나타난 바와 같이, 시간이 경과함에 따라 적색 형광이 액틴이 위치하고 있는 세포질에서 섬유상으로 나타났다.
아울러, 본 발명자들은 리간드 유도 외에 광유도에 의한 이합체 형성에 의해서 내재적 단백질의 가역적 검출이 가능한지 확인하기 위해, 상기 실시예 5에서 제조된 N-term VHHActin-nMagH-mCherry 컨스트럭트 및 iRFP-pMagH-C-term VHHActin 컨스트럭트를 HeLa 세포에 공형질감염시킨 후, 488 nm 파장의 빛을 조사한 후 시간의 경과에 따른 세포내의 형광의 형태 및 강도를 분석하였다. 그 결과 도 11B에 나타난 바와 같이, 광조사에 의해 광유도 이합체 형성 단백질의 이합체 형성에 의해 항-actin VHH가 활성을 회복하여 세포내 존재하는 액틴의 위치에 특이적으로 분포하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 시스템이 세포 내재적 단백질의 검출에도 사용가능함을 입증하는 것이다.
본 발명은 작은 단편 항체 유사체인 Fab, scFv, nanobody 등을 더 작은 비활성 단편으로 분할한 후, 이들을 각각 자극-유도 이합체 형성 단백질과의 융합단백질 파트너로 하여 세포나 조직, 개체에 형질도입하고, 광조사 또는 리간드에 의해 상기 이합체 형성 단백질의 이합체를 형성시킬 경우 상기 비활성 단편의 재조합에 의해 항원결합능이 회복 가능하다는 점을 최초로 규명한 것으로서, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 세포생물학 및 생화학의 연구용도는 물론 세포내 표적단백질을 대상으로 한 단백질 치료제 및 항체 유전자 치료법의 개발에 매우 효율적으로 활용될 수 있다.
본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예 및 실험예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> Institute for Basic Science <120> Antibody analogue capable of being activated reversibly and uses thereof <130> PD15-5266 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tetracystein motif <400> 1 Cys Cys Xaa Xaa Cys Cys 1 5 <210> 2 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal of VHHGFP <400> 2 Met Asp Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Val Asn 20 25 30 Arg Tyr Ser Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu 35 40 45 Trp Val Ala Gly Met Ser Ser Ala Gly Asp Arg Ser Ser Tyr Glu Asp 50 55 60 Ser 65 <210> 3 <211> 150 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nMagHigh1 <400> 3 His Thr Leu Tyr Ala Pro Gly Gly Tyr Asp Ile Met Gly Tyr Leu Asp 1 5 10 15 Gln Ile Gly Asn Arg Pro Asn Pro Gln Val Glu Leu Gly Pro Val Asp 20 25 30 Thr Ser Cys Ala Leu Ile Leu Cys Asp Leu Lys Gln Lys Asp Thr Pro 35 40 45 Ile Val Tyr Ala Ser Glu Ala Phe Leu Tyr Met Thr Gly Tyr Ser Asn 50 55 60 Ala Glu Val Leu Gly Arg Asn Cys Arg Phe Leu Gln Ser Pro Asp Gly 65 70 75 80 Met Val Lys Pro Lys Ser Thr Arg Lys Tyr Val Asp Ser Asn Thr Ile 85 90 95 Asn Thr Ile Arg Lys Ala Ile Asp Arg Asn Ala Glu Val Gln Val Glu 100 105 110 Val Val Asn Phe Lys Lys Asn Gly Gln Arg Phe Val Asn Phe Leu Thr 115 120 125 Ile Ile Pro Val Arg Asp Glu Thr Gly Glu Tyr Arg Tyr Ser Met Gly 130 135 140 Phe Gln Cys Glu Thr Glu 145 150 <210> 4 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHHGFP <400> 4 Met Asp Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Val Asn 20 25 30 Arg Tyr Ser Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu 35 40 45 Trp Val Ala Gly Met Ser Ser Ala Gly Asp Arg Ser Ser Tyr Glu Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Arg Asn Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Asn Val Asn Val Gly Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 150 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pMagHigh1 <400> 5 His Thr Leu Tyr Ala Pro Gly Gly Tyr Asp Ile Met Gly Tyr Leu Arg 1 5 10 15 Gln Ile Arg Asn Arg Pro Asn Pro Gln Val Glu Leu Gly Pro Val Asp 20 25 30 Thr Ser Cys Ala Leu Ile Leu Cys Asp Leu Lys Gln Lys Asp Thr Pro 35 40 45 Ile Val Tyr Ala Ser Glu Ala Phe Leu Tyr Met Thr Gly Tyr Ser Asn 50 55 60 Ala Glu Val Leu Gly Arg Asn Cys Arg Phe Leu Gln Ser Pro Asp Gly 65 70 75 80 Met Val Lys Pro Lys Ser Thr Arg Lys Tyr Val Asp Ser Asn Thr Ile 85 90 95 Asn Thr Met Arg Lys Ala Ile Asp Arg Asn Ala Glu Val Gln Val Glu 100 105 110 Val Val Asn Phe Lys Lys Asn Gly Gln Arg Phe Val Asn Phe Leu Thr 115 120 125 Met Ile Pro Val Arg Asp Glu Thr Gly Glu Tyr Arg Tyr Ser Met Gly 130 135 140 Phe Gln Cys Glu Thr Glu 145 150 <210> 6 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal of VHHGFP <400> 6 Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val Ala Gly Met Ser Ser Ala Gly Asp 1 5 10 15 Arg Ser Ser Tyr Glu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 20 25 30 Asp Asp Ala Arg Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro 35 40 45 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Val Asn Val Gly Phe Glu Tyr 50 55 60 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 65 70 75 <210> 7 <211> 196 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal of scFvGCN4 <400> 7 Met Gly Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 1 5 10 15 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala 20 25 30 Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Leu Phe Lys Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Leu 85 90 95 Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu 100 105 110 Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly 145 150 155 160 Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 165 170 175 Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp 180 185 190 Tyr Asn Ser Ala 195 <210> 8 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal of scFvGCN4 <400> 8 Leu Lys Asp Arg Phe Ile Ile Ser Lys Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val 1 5 10 15 Tyr Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Asp Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr 20 25 30 Cys Val Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 35 40 45 Val Ser Ser 50 <210> 9 <211> 93 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FRB <400> 9 Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg 1 5 10 15 Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu 20 25 30 Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr 35 40 45 Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp 50 55 60 Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala 65 70 75 80 Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys 85 90 <210> 10 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion Red(fuRed) <400> 10 Met Val Ser Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Pro Met Lys Leu Tyr Met 1 5 10 15 Glu Gly Thr Val Asn Asn His His Phe Lys Cys Thr Ser Glu Gly Glu 20 25 30 Gly Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Met Arg Ile Lys Val Val Glu 35 40 45 Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Thr Ser Phe Met 50 55 60 Tyr Gly Ser Arg Thr Phe Ile Lys His Pro Pro Gly Ile Pro Asp Phe 65 70 75 80 Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Val Thr Thr 85 90 95 Tyr Glu Asp Gly Gly Val Leu Thr Ala Thr Gln Asp Thr Ser Leu Gln 100 105 110 Asp Gly Cys Leu Ile Tyr Asn Val Lys Val Arg Gly Val Asn Phe Pro 115 120 125 Ala Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Leu Gly Trp Glu Ala Ser 130 135 140 Thr Glu Thr Met Tyr Pro Ala Asp Gly Gly Leu Glu Gly Ala Cys Asp 145 150 155 160 Met Ala Leu Lys Leu Val Gly Gly Gly His Leu Ile Cys Asn Leu Glu 165 170 175 Thr Thr Tyr Arg Ser Lys Lys Pro Ala Thr Asn Leu Lys Met Pro Gly 180 185 190 Val Tyr Asn Val Asp His Arg Leu Glu Arg Ile Lys Glu Ala Asp Asp 195 200 205 Glu Thr Tyr Val Glu Gln His Glu Val Ala Val Ala Arg Tyr Ser Thr 210 215 220 Gly Gly Ala Gly Asp Gly Gly Lys 225 230 <210> 11 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBP <400> 11 Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro 1 5 10 15 Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp 20 25 30 Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe 35 40 45 Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala 50 55 60 Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr 65 70 75 80 Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr 85 90 95 Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu 100 105 <210> 12 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P2A <400> 12 Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 13 <211> 64 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal of VHHActin <400> 13 Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Thr Gln Ala 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Leu Ile Phe Ser 20 25 30 Ala Phe Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu 35 40 45 Phe Val Gly Gly Ile Asn Trp Arg Gly Ser Thr Asn Tyr Gly Asp Phe 50 55 60 <210> 14 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal of VHHActin <400> 14 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val 1 5 10 15 Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 20 25 30 Cys Ala Ala Arg Met Val His Lys Thr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Glu 35 40 45 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Arg Ser 50 55

Claims (22)

  1. Fab, F(ab')2, Fab', VHH, monobody, VLR, Affibody, Affilin, Affimer, Affitin, Alphabody, Anticlin, Avimer, DARpin, Fynomoer 및 Kunitz domain peptide로 구성된 군으로부터 선택되는 항체 유사체의 비활성 제1단편에 자극-유도 이합체 형성 단백질이 연결된 융합단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1단편은 상기 항체 유사체를 적절한 지점에서 절단하여 생성된 단편인, 융합단백질.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 적절한 지점은 CDR을 제외한 상기 항체 유사체의 분자간 이황화 결합, 링커(linker) 부분, 비-CDR 루프 부분 또는 힌지(hinge) 부분인, 융합단백질.
  4. Fab, F(ab')2, Fab', VHH, monobody, VLR, Affibody, Affilin, Affimer, Affitin, Alphabody, Anticlin, Avimer, DARpin, Fynomoer 및 Kunitz domain peptide로 구성된 군으로부터 선택되는 항체 유사체 비활성 제1단편과 결합시 항원 결합능을 회복하는 항체 유사체의 비활성 제2단편에 자극-유도 이합체 형성 단백질과 상기 자극을 가할 때 이합체를 형성할 수 있는 자극-유도 이합체 형성 짝 단백질이 연결된 융합단백질.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 제1단편 및 제2단편은 상기 항체 유사체를 적절한 지점에서 절단하여 생성된 단편인, 융합단백질.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 적절한 지점은 CDR을 제외한 상기 항체 유사체의 분자간 이황화 결합, 링커(linker) 부분, 비-CDR 루프 부분 또는 힌지(hinge) 부분인, 융합단백질.
  7. 제1항 또는 제4항에 있어서,
    상기 자극-유도 이합체 형성 단백질은 광유도 이합체 형성 단백질 또는 리간드-유도 이합체 형성 단백질인, 융합단백질.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 자극-유도 이합체 형성 짝 단백질은 광유도 이합체 형성 짝 단백질 또는 리간드-유도 이합체 형성 짝 단백질인, 융합단백질.
  9. 제1항 또는 제4항에 있어서,
    형광단백질을 추가적으로 포함하는, 융합단백질.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)인, 융합단백질.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 광유도 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY, PHR, nMag 또는 pMag인, 융합단백질.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 광유도 이합체 형성 짝 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY, PHR, nMag 또는 pMag인, 융합단백질.
  13. 제7항에 있어서,
    상기 리간드-유도 이합체 형성 단백질은 FKBP(FK506 Binding Protein), CalcineurinA, Cyp-Fas, FRB(FKBP-rapamycin-biding protein), GyrB, GAI(gibberellin insensitive), GID1(gibberellin insensitive dewarf 1), Snap-tag 또는 HaloTag인, 융합단백질.
  14. 제8항에 있어서,
    상기 리간드-유도 이합체 형성 짝 단백질은 FKBP(FK506 Binding Protein), CalcineurinA, Cyp-Fas, FRB(FKBP-rapamycin-biding protein), GyrB, GAI(gibberellin insensitive), GID1(gibberellin insensitive dewarf 1), Snap-tag 또는 HaloTag인, 융합단백질.
  15. 제1항의 융합단백질 및 제4항의 융합단백질을 포함하는 항원 검출용 조성물.
  16. 제1항의 융합단백질 또는 제4항의 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  17. 제16항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
  18. 제17항에 있어서,
    발현벡터인, 재조합 벡터.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. Fab, F(ab')2, Fab', VHH, monobody, VLR, Affibody, Affilin, Affimer, Affitin, Alphabody, Anticlin, Avimer, DARpin, Fynomoer 및 Kunitz domain peptide로 구성된 군으로부터 선택되는 항체 유사체의 비활성 제1단편에 자극-유도 이합체 형성 단백질이 연결된 제1융합단백질 및 상기 항체 유사체 비활성 제1단편과 결합시 항원 결합능을 회복하는 항체 유사체의 비활성 제2단편에 상기 자극-유도 이합체 형성 단백질과 상기 자극을 가할 때 이합체를 형성할 수 있는 자극-유도 이합체 형성 짝 단백질이 연결된 제2융합단백질을 인간을 제외한 개체에 생체내 도입하거나, 개체로부터 분리된 조직, 또는 세포에 시험관내 도입하는 융합단백질 도입 단계; 및
    상기 융합단백질이 도입된 인간을 제외한 개체, 개체로부터 분리된 조직, 또는 세포에 상기 자극-유도 이합체 형성 단백질 및 상기 자극-유도 이합체 형성 짝 단백질의 이합체 형성을 유도할 수 있는 자극을 가하는 자극단계를 포함하는 상기 항체 유사체의 활성화 방법.
  22. Fab, F(ab')2, Fab', VHH, monobody, VLR, Affibody, Affilin, Affimer, Affitin, Alphabody, Anticlin, Avimer, DARpin, Fynomoer 및 Kunitz domain peptide로 구성된 군으로부터 선택되는 항체 유사체의 비활성 제1단편에 자극-유도 이합체 형성 단백질이 연결된 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드 및 상기 항체 유사체 비활성 제1단편과 결합시 항원 결합능을 회복하는 항체 유사체의 비활성 제2단편에 상기 자극-유도 이합체 형성 단백질과 상기 자극을 가할 때 이합체를 형성할 수 있는 자극-유도 이합체 형성 짝 단백질이 연결된 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드를 인간을 제외한 개체에 생체내 도입하거나, 개체로부터 분리된 조직, 또는 세포에 시험관내 형질도입하는 유전자 형질도입 단계; 및
    상기 제1폴리뉴클레오티드 및 제2폴리뉴클레오티드가 형질도입된 비인간 개체, 개체로부터 분리된 조직 또는 세포에 상기 자극-유도 이합체 형성 단백질 및 상기 자극-유도 이합체 형성 짝 단백질의 이합체 형성을 유도할 수 있는 자극을 가하는 자극단계를 포함하는 상기 항체 유사체의 활성화 방법.
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