KR101495651B1 - 빛에 의해 이합체 형성을 유도하는 융합단백질 및 그의 용도 - Google Patents

빛에 의해 이합체 형성을 유도하는 융합단백질 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 빛에 의해 이합체 형성을 유도하는 융합단백질 및 그의 용도에 관한 것으로서, 이합체를 형성하며 상기 이합체 형성에 의해 활성화되는 이합체 형성 활성화 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 PHR(photolyase homology region) 단백질이 연결된 융합단백질을 제공한다.

Description

빛에 의해 이합체 형성을 유도하는 융합단백질 및 그의 용도{Fusion proteins capable of inducing protein dimerization by light and uses thereof}
본 발명은 융합단백질 및 그의 용도에 관한 것으로서, 더 상세하게는 빛에 의해 이합체 형성을 유도하는 융합단백질 및 그의 용도에 관한 것이다.
화합물 유도체에 의한 이합체 형성(chemical inducers of dimerization, CID)은 낮은 분자량의 유기 분자를 이용하여 세포의 단백질 활성을 연구하는 방법을 말한다. FK506, 사이클로스포린(Cyclosporin) 및 라파마이신(Rapamycin) 등의 자연 산물 및 이들의 합성 파생물이 FKBP12(FK506-binding protein 12)의 이뮤노필린(immunophilin) 도메인, 사이클로필린(cyclophilin) 및 FKBP-라파마이신 연관 단백질(FKBP-rapamycin associated protein, FRAP)의 FKBP12-라파마이신-결합(FKBP12-rapamycin-binding, FRB) 도메인과 결합하는 특성을 이용하여(Crabtree et al., Trends. Biochem. Sci., 21:418-422, 1996), 연구 대상이 되는 단백질에 이뮤노필린 도메인 등을 융합시킨 후, 라파마이신과 같은 화합물을 처리하여 연구 대상 단백질의 이합체 형성을 유도시켜 상기 단백질이 매개하는 신호전달 기작을 연구하였다. 이러한 CID의 특성을 이용하여 T-세포 수용체(Spencer et al., Science, 262:1019-1024, 1993; Pruschy et al., Chem. Biol., 1:163-172, 1994), Fas 수용체(Belshaw et al., Chem. Biol., 3:731-738, 1996; Spence et al., Curr. Biol., 6:839-847, 1996), 카데린(Cadherin)(Yap et al., Cur.r Biol., 7:308-315, 1997), 및 에리스로포이에틴(erythropoietin) 수용체(Blau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:3076-3081, 1997) 매개의 신호 전달과정이 연구된 바 있으며, 세포 내 단백질인 Src(Spencer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:9805-9809, 1995), Sos(Holsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:9810-9814, 1995), Raf(Luo et al., Nature, 383:181-185, 1996), 및 Zap(Graef et al., EMBO J., 16:5618-5628, 1997)의 신호전달 기전이 연구된 바 있다.
그러나, 종래의 이합체 형성 단백질의 신호전달 및 이합체 형성을 유도에 사용하고 있는 CID 방법은 이합체 형성을 유도하는‘유도체(inducer)’화합물 및 이와 결합하는 ‘단백질’의 종류가 매우 한정적이며, 화합물에 의한 이합체 형성과 이에 따른 신호전달 활성 수준을 조절하는데 어려움이 있으며, 유도체(inducer) 자체가 이합체 형성뿐만 아니라 세포 혹은 생체 내의 다양한 신호전달 과정에 관여할 수 있으므로 활용에 한계가 있다. 또한, 비가역적인 반응을 유발한다는 단점이 있으며, 신규 유도체 및 상기 유도체에 의하여 이합체를 형성하는 단백질을 연구 개발하는데 있어서 비용 및 시간이 많이 소요되는 문제가 있다.
본 발명은 상기 문제점을 포함한 다양한 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 시험관내 조건은 물론 생체 내(in vivo) 조건에서도 사용가능하고, 빛에 의하여 선택적이면서 가역적으로 다양한 이합체 형성 단백질의 신호전달 및 활성을 조절할 수 있는 융합단백질 및 그의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 이합체를 형성하며 상기 이합체 형성에 의해 활성화되는 이합체 형성 활성화 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 PHR(photolyase homology region) 단백질이 연결된 융합단백질이 제공된다.
상기 융합단백질에 있어서, 상기 이합체 형성 활성화 단백질은 수용체 타이로신 인산화효소(Receptor Tyrosine Kinase, RTK) 단백질, 단백질 공역 수용체(G-protein coupled receptor, GPCR) 단백질, 톨 유사 수용체(Toll-like receptor, TLR) 단백질, 핵 수용체(Nuclear receptor) 단백질, Fas 수용체 단백질, NOD-유사 수용체(NOD-like receptor, NLR) 단백질, 트롬보포이에틴 수용체(Thrombopoietin receptor, Tpo) 단백질, 에리스로포이에틴 수용체(erythropoietin receptor, Epo) 단백질, 인테그린(integrin), 카데린(cadherin), c-Abl, 14-3-3 단백질, 세포사멸 도메인을 포함하는 Fas-관련 단백질(Fas-Associated protein with Death Domain, FADD), 디네인(Dynein), 키네신(kinesin), 마이오신Ⅴ(myosinⅤ), 마이오신Ⅵ(myosin Ⅵ), 마이오신Ⅶ(myosinⅦ), 마이오신Ⅹ(myosinⅩ), PECAM-1(Platelet endothelial cell adhesion molecule), NANOG, 배아번역개시인자 2 인산화효소(eukaryotic translation initiation factor-2 kinase, EIF-2 kinase), Src, Sos(Son of Sevenless), Vav 단백질, 제타 체인 연관 단백질 인산화 효소 70(Zeta-chain-associated protein kinase 70, ZAP70), Raf, Bax 단백질(Bcl-2-associated X protein, Bax), 케스페이즈(caspase) 1, 3, 8 및 9, IKK(IκB kinase), 및 T 세포 수용체 제타 체인(T cell receptor zeta chain)일 수 있다.
상기 융합단백질에 있어서, 상기 수용체 타이로신 인산화효소(Receptor Tyrosine Kinase, RTK) 단백질은 표피성장인자 수용체(Epidermal growth factor receptor, RTK 클래스 I), 인슐린 수용체(Insulin Receptor, RTK 클래스 II), 혈소판 유래 성장인자 수용체(Platelet-derived growth factor receptor, RTK 클래스 III), 섬유아세포증식인자 수용체(Fibroblast growth factor receptor, RTK 클래스 IV), 혈관내피세포성장인자 수용체(Vascular endothelial cell growth factor receptor, RTK 클래스 V), 간세포 성장인자 수용체(Hepatocyte growth factor receptor, RTK 클래스 VI), TRK 수용체(Tropomyosin-receptor-kinase receptor, RTK 클래스 VII), EPH 수용체(RTK 클래스 VIII), AXL 수용체(RTK 클래스 IX), LKT 수용체(RTK 클래스 X), TIER 수용체(RTK 클래스 XI), 수용체 타이로신 인산화 효소-유사 오펀 수용체(receptor tyrosine kinase-like orphan receptors, RTK 클래스 XII), 디스코이딘 도메인 수용체(Discoidin domain receptor, RTK 클래스 XIII), RET 수용체(RTK 클래스 XIV), KLG 수용체(RTK 클래스 XV), RYK 수용체(related to receptor tyrosine kinase, RTK 클래스 XVI), 및 MuSK 수용체(Muscle-Specific Kinase Receptor, RTK 클래스 XVII)일 수 있다.
상기 융합단백질에 있어서, 상기 핵 수용체(Nuclear receptor) 단백질은 갑상샘 호르몬 수용체(Thyroid hormone receptor), 레티노산 수용체(Retinoic acid receptor), 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체(Peroxisome proliferator-activated receptor), Rev-ErbA, RAR-관련 오펀 수용체(RAR-related orphan receptor), 간 X 수용체 유사체(Liver X receptor-like), 비타민 D-수용체 유사체(Vitamin D receptor-like), 2개의 DNA 결합 도메인을 갖고 있는 핵 수용체(Nuclear receptor with two DNA binding domains), 간세포 핵인자-4(Hepatocyte nuclear factor-4), 레티노이드 X 수용체(Retinoid X receptor), 고아핵수용체(Testicular receptor), TLX/PNR, COUP/EAR, 에스트로겐 수용체(Estrogen receptor), 에스트로겐 연관 수용체(Estrogen related receptor), 3-케노스테로이드 수용체(3-Ketosteroid receptors), NGFIB, NURR1, NOR1, SF1, LRH1, DAX, 및 SHP일 수 있다.
상기 융합단백질에 있어서, 상기 PHR(photolyase homology region) 단백질은 종래에는 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는 것으로 알려졌으나, 본 발명자에 의해 광조사에 의해 동형 이합체를 형성하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, PHR은 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 뿐만 아니라 동형 이합체도 형성할 수 있는 단백질이다.
아울러, 상기 융합단백질에 있어서, 형광단백질이 추가로 연결될 수 있다. 이때, 상기 형광단백질은 상기 융합단백질의 N-말단 또는 C-말단에 연결될 수 있고, 선택적으로는 상기 이합체 형성 활성화 단백질과 PHR(photolyase homology region) 단백질 사이에 위치할 수도 있다. 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)일 수 있다. 여기서, 상기 녹색형광단백질은 EGFP(enhanced green fluorescent protein), Emerald(Tsien, Annu. Rev. Biochem., 67: 509-544, 1998), Superfolder(Pedelacq et al., Nat. Biotech., 24: 79-88, 2006), GFP(Prendergast et al., Biochem., 17(17): 3448-3453, 1978), Azami Green(Karasawa, et al., J. Biol. Chem., 278: 34167-34171, 2003), TagGFP(Evrogen, Russia), TurboGFP(Shagin et al., Mol. Biol. Evol., 21(5): 841-850, 2004), ZsGreen(Matz et al., Nat. Biotechnol., 17: 969-973, 1999) 또는 T-Sapphire(Zapata-Hommer et al., BMC Biotechnol., 3:5, 2003)일 수 있고, 상기 황색형광단백질은 EYFP(enhanced yellow fluorescent protein, Tsien, Annu. Rev. Biochem., 67: 509-544, 1998), Topaz(Hat et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1: 627-633, 2002), Venus(Nagai et al., Nat. Biotechnol., 20(1): 87-90, 2002), mCitrine(Griesbeck et al., J. Biol. Chem., 276: 29188-29194, 2001), Ypet(Nguyet and Daugherty, Nat. Biotechnol., 23(3): 355-360, 2005), TagYFP(Evrogen, Russia), PhiYFP(Shagin et al., Mol. Biol. Evol., 21(5): 841-850, 2004), ZsYellow1(Matz et al., Nat. Biotechnol., 17: 969-973, 1999) 또는 mBanana(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004)일 수 있으며, 상기 적색형광단백질은 mRuby(Kredel et al., PLoS ONE, 4(2):e4391, 2009), mApple(Shaner et al., Nat. Methods, 5(6): 545-551, 2008), mStrawberry(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004), AsRed2(Shanner et al., Nat. Biotehcnol., 22: 1567-1572, 2004) 또는 mRFP(Campbell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(12): 7877-7882, 2002)일 수 있고, 상기 주황형광단백질은 Kusabira Orange(Karawawa et al., Biochem. J., 381(Pt 1): 307-312, 2004), Kusabira Orange2(MBL International Corp., Japan), mOrange(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004), mOrange2(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004), dTomato(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004), dTomato-Tandem(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004), TagRFP(Merzlyak et al., Nat. Methods, 4(7): 555-557, 2007), TagRFP-T(Shaner et al., Nat. Methods, 5(6): 545-551, 2008), DsRed(Baird et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 11984-11989, 1999) DsRed2(Clontech, USA), DsRed-Express(Clontech, USA), DsRed-Monomer(Clontech, USA) 또는 mTangerine(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004)일 수 있으며, 상기 청록색형광단백질은 ECFP(enhanced cyan fluorescent protein, Cubitt et al., Trends Biochem. Sci., 20: 448-455, 1995), mECFP(Ai et al., Biochem. J., 400(3): 531-540, 2006), mCerulean(Koushik et al., Biophys. J., 91(12): L99-L101, 2006), CyPet(Nguyet and Daugherty, Nat. Biotechnol., 23(3): 355-360, 2005), AmCyan1(Matz et al., Nat. Biotechnol., 17: 969-973, 1999), Midori-Ishi Cyan(Karawawa et al., Biochem. J., 381(Pt 1): 307-312, 2004), TagCFP(Evrogen, Russia) 또는 mTFP1(Ai et al., Biochem. J., 400(3): 531-540, 2006)일 수 있고, 상기 청색형광단백질은 EBFP(enhanced blue fluorescent protein, Clontech, USA), EBFP2(Ai et al., Biochemistry, 46(20): 5904-5910, 2007), Azurite(Mena et al., Nat. Biotechnol., 24: 1569-1571, 2006) 또는 mTagBFP(Subach et al., Chem. Biol., 15(10: 1116-1124, 2008)일 수 있고, 상기 원적색형광단백질은 mPlum(Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101: 16745-16749, 2004), mCherry(Shanner et al., Nat. Biotehcnol., 22: 1567-1572, 2004), dKeima-Tandem(Kogure et al., Methods, 45(3): 223-226, 2008), JRed(Shagin et al., Mol. Biol. Evol., 21(5): 841-850, 2004), mRaspberry(Shanner et al., Nat. Biotehcnol., 22: 1567-1572, 2004), HcRed1(Fradkov et al., Biochem. J., 368(Pt 1): 17-21, 2002), HcRed-Tandem(Fradkov et al., Nat. Biotechnol., 22(3): 289-296, 2004) 또는 AQ143(Shkrob et al., Biochem. J., 392: 649-654, 2005)일 수 있으며, 상기 테트라시스테인 모티프는 Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys(서열번호 1)의 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 Xaa는 시스테인을 제외한 아미노산일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 제공된다. 상기 벡터는 상기 융합단백질을 발현할 수 있는 재조합 발현벡터일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 벡터로 숙주 세포를 형질전환시킨 형질전환 숙주세포가 제공된다. 상기 형질전환 숙주세포는 상기 융합단백질을 세포질 내에 발현할 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 벡터로 형질전환되어 상기 융합단백질을 발현하는 비인간 형질전환 동물이 제공된다.
상기 비인간 형질전환 동물은 곤충류, 환형동물, 연체동물, 완족류, 선형동물, 강장동물, 해면류, 축색류, 척추동물일 수 있고 상기 척추동물은 어류, 양서류, 파충류, 조류 또는 포유류일 수 있으며, 상기 곤충류는 초파리(Drosophila)일 수 있고, 상기 선형동물은 예쁜꼬마선충(C. elegans)일 수 있으며, 상기 어류는 지브라피쉬(zebrafish)일 수 있고, 상기 포유류는 영장목, 식육목, 식충목, 설치목, 우제목, 기제목 또는 장비목일 수 있고, 상기 설치목은 래트 또는 마우스일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 벡터로 형질전환되어 상기 융합단백질을 발현하는 형질전환 식물이 제공된다. 상기 형질전환 식물은 겉씨식물 또는 속씨식물일 수 있고, 상기 속씨식물은 외떡잎 식물 또는 쌍떡잎 식물일 수 있으며, 상기 외떡잎 식물은 벼과, 나리과 또는 난초과일 수 있고, 상기 쌍떡잎 식물은 콩과, 박과, 국화과, 가지과, 장미과 또는 십자화과일 수 있으며, 상기 콩과는 대두, 녹두, 완두, 또는 팥일 수 있고, 상기 박과는 박, 수박, 호박, 오이, 멜론 또는 참외일 수 있으며, 상기 국화과는 국화, 상추, 민들레, 쑥갓 또는 쑥일 수 있고, 상기 가지과는 담배, 고추, 가지, 토마토일 수 있으며, 상기 장미과는 사과, 배, 복숭아, 장미 또는 딸기일 수 있고, 상기 십자화과는 무우, 배추, 유채, 갓, 고추냉이(horseradish) 또는 애기장대(Arabidopsis thaliana)일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 이합체를 형성하며 상기 이합체 형성에 의해 활성화되는 이합체 형성 활성화 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 PHR(photolyase homology region) 단백질이 연결된 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 제조된 형질전환 숙주세포를 준비하는 형질전환 숙주세포 준비단계; 및 상기 배양중인 형질전환 숙주세포에 상기 PHR 단백질의 이합체 형성을 유도할 수 있는 파장의 빛을 조사하는 광조사 단계를 포함하는 상기 이합체 형성 활성화 단백질을 가역적으로 활성화시키는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 이합체를 형성하며 상기 이합체 형성에 의해 활성화되는 이합체 형성 활성화 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 PHR(photolyase homology region) 단백질이 연결된 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터로 형질전환되어 상기 융합단백질을 발현하는 형질전환 식물 또는 비인간 형질전환 동물을 준비하는 형질전환 동물 준비단계; 및 상기 형질전환 식물 또는 비인간 형질전환 동물의 특정 기관 또는 조직에 상기 PHR 단백질의 이합체 형성을 유도할 수 있는 파장의 빛을 조사하는 광조사 단계를 포함하는 식물 또는 비인간 동물의 특정 기관 또는 조직에서의 상기 이합체 형성 활성화 단백질을 가역적으로 활성화시키는 방법이 제공된다.
상기 방법에 있어서, 상기 이합체 형성 활성화 단백질은 수용체 타이로신 인산화효소(Receptor Tyrosine Kinase, RTK) 단백질, 단백질 공역 수용체(G-protein coupled receptor, GPCR) 단백질, 톨 유사 수용체(Toll-like receptor, TLR) 단백질, 핵 수용체(Nuclear receptor) 단백질, Fas 수용체 단백질, NOD-유사 수용체(NOD-like receptor, NLR) 단백질, 트롬보포이에틴 수용체(Thrombopoietin receptor, Tpo) 단백질, 에리스로포이에틴 수용체(erythropoietin receptor, Epo) 단백질, 인테그린(integrin), 카데린(cadherin), c-Abl, 14-3-3 단백질, 세포사멸 도메인을 포함하는 Fas-관련 단백질(Fas-Associated protein with Death Domain, FADD), 디네인(Dynein), 키네신(kinesin), 마이오신Ⅴ(myosinⅤ), 마이오신Ⅵ(myosin Ⅵ), 마이오신Ⅶ(myosinⅦ), 마이오신Ⅹ(myosinⅩ), PECAM-1(Platelet endothelial cell adhesion molecule), NANOG, 배아번역개시인자 2 인산화효소(eukaryotic translation initiation factor-2 kinase, EIF-2 kinase), Src, Sos(Son of Sevenless), Vav 단백질, 제타 체인 연관 단백질 인산화 효소 70(Zeta-chain-associated protein kinase 70, ZAP70), Raf, Bax 단백질(Bcl-2-associated X protein, Bax), 케스페이즈(caspase) 1, 3, 8 및 9, IKK(IκB kinase), 및 T 세포 수용체 제타 체인(T cell receptor zeta chain)일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 숙주세포는 동물세포 또는 식물세포일 수 있고, 상기 동물세포는 곤충류, 환형동물, 연체동물, 완족류, 선형동물, 강장동물, 해면류, 축색류, 척추동물 유래의 것일 수 있고, 상기 척추동물은 어류, 양서류, 파충류, 조류 또는 포유류일 수 있으며, 상기 곤충류는 초파리(Drosophila melanogaster)일 수 있고, 상기 선형동물은 예쁜꼬마선충(C. elegans)일 수 있으며, 상기 어류는 지브라피쉬(zebrafish)일 수 있고, 상기 포유류는 영장목, 식육목, 식충목, 설치목, 우제목, 기제목 또는 장비목일 수 있고, 상기 설치목은 래트 또는 마우스일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 융합단백질은 추가로 형광단백질을 포함할 수 있다. 이때, 상기 형광단백질은 상기 융합단백질의 N-말단 또는 C-말단에 연결될 수 있고, 선택적으로는 상기 이합체 형성 활성화 단백질과 상기 PHR(photolyase homology region) 단백질 사이에 위치할 수 있다. 상기 형광단백질은 상술한 바와 같다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 이합체를 형성하며 상기 이합체 형성에 의해 활성화되는 이합체 형성 활성화 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 PHR(photolyase homology region) 단백질이 연결된 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 제조된 형질전환 숙주세포를 준비하는 형질전환 숙주세포 준비단계; 상기 배양중인 형질전환 숙주세포의 배지에 후보물질을 처리하는 후보물질 처리단계; 상기 배양중인 형질전환 숙주세포에 상기 PHR 단백질의 이합체 형성을 유도할 수 있는 파장의 빛을 조사하는 광조사단계; 및 후보물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 광조사에 의하여 상기 이합체 형성 활성화 단백질의 신호전달을 억제하는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 상기 이합체 형성 활성화 단백질의 신호전달 억제제 후보물질 스크리닝 방법이 제공된다.
상기 방법에 있어서, 상기 후보물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 또는 혈장일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 숙주세포는 동물세포 또는 식물세포일 수 있고, 상기 동물세포는 곤충류, 환형동물, 연체동물, 완족류, 선형동물, 강장동물, 해면류, 축색류, 척추동물 유래의 것일 수 있고, 상기 척추동물은 어류, 양서류, 파충류, 조류 또는 포유류일 수 있으며, 상기 곤충류는 초파리(Drosophila melanogaster)일 수 있고, 상기 선형동물은 예쁜꼬마선충(C. elegans)일 수 있으며, 상기 어류는 지브라피쉬(zebrafish)일 수 있고, 상기 포유류는 영장목, 식육목, 식충목, 설치목, 우제목, 기제목 또는 장비목일 수 있고, 상기 설치목은 래트 또는 마우스일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 융합단백질은 추가로 형광단백질을 포함할 수 있다. 이때, 상기 형광단백질은 상기 융합단백질의 N-말단 또는 C-말단에 연결될 수 있고, 선택적으로는 상기 이합체 형성 활성화 단백질과 상기 PHR(photolyase homology region) 단백질 사이에 위치할 수 있다. 상기 형광단백질은 상술한 바와 같다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 동물 또는 식물의 세포 내에서 이합체 형성 단백질의 활성 및 신호전달을 특이적으로 그리고 가역적으로 조절할 수 있다. 물론 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 빛에 의해 이합체를 형성하는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질의 기전을 개략적으로 도시한 개요도이다:
DP: 이합체 형성 활성화 단백질(Dimerization protein);
PHR: 크립토크롬(cryptochrome) 단백질의 N-말단 부위로서, 포토라이아제 상동성 지역(photolyase homology region)을 의미함; 및
FP: 형광 단백질(fluorescent protein).
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질의 기전을 식물 빛 수용 단백질의 PHR과 형광 단백질이 융합된 단백질의 FRET 신호를 통해서 확인하는 실험을 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 3은 식물 빛 수용 단백질의 PHR과 YFP 또는 CFP 형광 단백질이 융합된 융합 단백질이 빛에 의하여 이합체 형성이 유도되는 것을 공초점현미경으로 촬영한 사진이다.
도 4는 상기 도 3에서 관찰한 융합단백질 사이의 FRET 신호 변화를 빛 자극 여부에 따른 YFP/CFP 비율로 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질을 세포 내에서 발현시킨 후 광조사에 의해 MAPK 신호전달이 활성화되는 것을 공초점현미경으로 촬영한 사진(a) 및 광유도 시간에 따른 핵/세포질의 형광 세기 비율의 변화량을 나타낸 그래프(b)이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질을 세포 내에서 발현시킨 후 광조사에 의해 PI3K 신호전달이 활성화되는 것을 공초점현미경으로 촬영한 사진(a) 및 광유도 시간에 따른 세포질의 형광 세기 변화량을 나타낸 그래프(b)이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질을 세포 내에서 발현시킨 후 광조사에 의해 칼슘신호전달이 가역적으로 활성화되는 것을 공초점현미경으로 촬영한 사진이다.
도 8은 상기 도 7에서 관찰한 칼슘신호전달 활성화를 광조사 시간에 따른 형광 세기 변화량으로 수치화한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질을 세포 내에서 발현시킨 후, TrkB 특이적 저해제를 처리하였을 때, 광조사에 의하여 칼슘신호전달이 활성화되지 않는 것을 공초점현미경으로 촬영한 사진이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질을 발현하는 세포(TrkB-PHR-YFP, R-GECO)와 이를 발현하지 않는 세포(R-GECO)를 혼합 배양하였을 때, 광조사에 의하여 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질을 발현하는 세포에서만 선택적으로 칼슘 신호전달과정이 활성화되는 것을 공초점현미경으로 촬영한 사진이다.
본 문서에서 사용되는 용어를 정의하면 하기와 같다.
본 문서에서 사용되는 용어 “이합체 형성 활성화 단백질(Dimerized activated protein)”은 이형 또는 동형 단백질의 상호 작용에 의하여 하나의 복합체(complex)를 형성하는 단백질로서, 세포막, 세포질 내에서 동형 또는 이형 이합체를 형성함으로써 활성화되는 모든 단백질을 의미한다. 예를 들어, 상기 이합체 형성 활성화 단백질은 수용체 타이로신 인산화효소(Receptor Tyrosine Kinase, RTK) 단백질, 단백질 공역 수용체(G-protein coupled receptor, GPCR) 단백질, 톨 유사 수용체(Toll-like receptor, TLR) 단백질, 핵 수용체(Nuclear receptor) 단백질, Fas 수용체, NOD-유사 수용체(NOD-like receptor, NLR) 단백질, 트롬보포이에틴 수용체(Thrombopoietin receptor, Tpo) 단백질, 에리스로포이에틴 수용체(erythropoietin receptor, Epo) 단백질과 같은 세포막에 존재하는 단백질; 인테그린(integrin), 카데린(cadherin), c-Abl, 14-3-3 단백질, 세포사멸 도메인을 포함하는 Fas-관련 단백질(Fas-Associated protein with Death Domain, FADD), 디네인(Dynein), 키네신(kinesin), 마이오신Ⅴ(myosinⅤ), 마이오신Ⅵ(myosin Ⅵ), 마이오신Ⅶ(myosinⅦ), 마이오신Ⅹ(myosinⅩ), PECAM-1(Platelet endothelial cell adhesion molecule), NANOG, 배아번역개시인자 2 인산화효소(eukaryotic translation initiation factor-2 kinase, EIF-2 kinase), Src, Sos(Son of Sevenless), Vav 단백질, 제타 체인 연관 단백질 인산화 효소 70(Zeta-chain-associated protein kinase 70, ZAP70), Raf, Bax 단백질(Bcl-2-associated X protein, Bax), 케스페이즈(caspase) 1, 3, 8 및 9, IKK(IκB kinase), 및 T 세포 수용체 제타 체인(T cell receptor zeta chain) 등과 같은 세포질 내에 존재하는 단백질일 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "이형이합체(heterodimer)"는 서로 다른 두 가지 단백질이 상호작용에 의해 하나의 복합체(complex)를 형성한 것을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "동형 이합체(homodimer)"는 같은 단백질이 서로 상호작용하여 하나의 복합체(complex)를 형성한 것을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 “수용체 타이로신 인산화효소(Receptor Tyrosine Kinase, RTK)”는 성장인자(Growth Factor), 사이토카인(Cytokine), 및 호르몬(Hormone) 등과 같은 다양한 펩티드와 결합하는 세포 표면의 수용체를 의미한다. AP20187 ‘유도체(inducer)’에 의하여 TrkA의 세포내 도메인이 이합체를 형성함에 따라 NGF의 생물학적 활성 유도 및 신호전달과정이 활성화되었다는 연구가 보고된 바 있다(Alfa, R. W. et al., J. Neurosci. Res., 87(12):2624~2631, 2009)
본 문서에서 사용되는 용어 “G 단백질 공역 수용체(G-protein coupled receptor, GPCR)”는 7TM(seven-transmembrane domain) 수용체, 칠중나선 수용체, 및 사문(serpentine) 수용체 등으로도 불리며, 세포막을 7회 관통하고 있으며 아미노말단이 세포 외에, 카르복실말단이 세포 내에 존재하는 구조를 갖고 있다. G단백결합수용체(G Protein-coupled receptor)는 많은 호르몬, 신경전달물질들의 다양한 신호를 전달하는 수용체 군으로 세포내의 cyclic AMP 농도 조절에서 유전자 발현에 이르기까지의 다양한 신호전달로 시각, 미각, 후각 등의 기능을 비롯하여 수많은 신경전달 물질과 호르몬의 다양한 생리반응에 관여하고 있다(백자현, Trends in Medical Research, 12(3), 2005).
본 문서에서 사용되는 용어 “톨 유사 수용체(Toll-like receptor, TLR)”는 선천성 면역에 있어서 주요한 역할을 수행하는 단백질로서, 세포막을 1회 관통하고 있으며, 미생물이 피부 또는 내장 점막 등을 침투하는 경우, TLR 단백질이 이를 인식하여 면역 세포 반응을 활성화 한다(Charlie Schmidt, J. Natl. Cancer. Inst., 98(9):574~575, 2006).
본 문서에서 사용되는 용어 “핵 수용체(Nuclear receptor) 단백질”은 세포내에 위치하며, 스테로이드 및 타이로이드 호르몬 및 특정 분자들을 인식하는 단백질을 의미한다. 이러한 분자들과 결합하여 세포의 발달, 항상성 및 대사를 조절한다고 알려져 있다. 또한, DNA와 직접 결합하여 유전자의 발현을 조절하는 전사인자로서의 역할을 수행한다고 알려져 있다(Evans RM., Science, 240(4854):889~95, 1988; Olefsky JM, J. Biol. Chem., 276(40):36863~4, 2001).
본 문서에서 사용되는 용어 “Fas 수용체 단백질”은 APO-1(apoptosis antigen 1), CD95(cluster of differentiation 95) 또는 종양 괴사인자 수용체 슈퍼패밀리 6(tumor necrosis factor receptor superfamily member 6)으로도 알려져 있으며, 인간의 경우 TNFRSF6 gene 유전자에 의해서 코딩되는 단백질을 의미한다(Lichter P, et al., Genomics, 14(1): 179~80, 1992; Inazawa J, et al., Genomics, 14(3): 821~2, 1992). FasL의 세포내 도메인의 올리고머화가 T 세포에서 FasL 매개의 신호전달을 활성화시킬 수 있다는 연구가 보고된 바 있다(Sun, M. et al., J. Immunol. 177(3):1481~1491, 2006).
본 문서에서 사용되는 용어 “NOD-유사 수용체(NOD-like receptor, NLR) 단백질”은 “nucleotide-binding and oligomerization domain-like receptors”의 약칭으로, 미생물 세포벽 성분 또는 위해 신호들을 감지하는 선천성 면역 체계(innate immune system)에 있어서 주요한 역할을 담당한다고 알려져 있다. CID 방법을 이용하여 NLR 단백질(HyNLR 타입 1)에 작용 케스페이즈(HyDD-Caspase)를 이동시켜 올리고머화(oligomerization)를 유도하여, NLR 단백질의 하위 신호전달 기작인 케스페이즈 활성을 유도시킨 연구 결과가 발표된 바 있다(Lange C. et al., Mol. Biol. Evol., 28(5):1687-702, 2011).
본 문서에서 사용되는 용어 “트롬보포이에틴 수용체(Thrombopoietin receptor, Tpo) 단백질”은 MGDF(megakaryocyte growth and development factor)로도 알려져 있으며, 혈소판 생성을 유도하는 세포 성장에 관여한다고 알려져 있다(Kaushansky K, N. Engl. J. Med., 354 (19): 2034-45, 2006). CID 방법을 이용하여 생체 내(in vivo) 생리 및 병리학적 과정을 관찰하기 위하여 마우스 트롬보포이에틴 수용체를 변형킨 동물 모델이 개발된 바 있다(Richard RE. et al., Mol. Ther., 10(4):730~40, 2004).
본 문서에서 사용되는 용어 “에리스로포이에틴 수용체(erythropoietin receptor, Epo) 단백질”은 적혈구 생성 또는 적혈구 세포 생산을 조절하는 당단백질 호르몬을 의미하며, Epo 수용체 단백질과 관련된 신호전달 기작을 연구한 예로서, 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 AP20187에 의해서 활성화되는 Epo 수용체를 이용하여 인슐린을 분비하는 베타 세포의 증식을 연구하는 방법이 발표된 바 있다(Kobinger, G. P. et al., Mol. Ther., 11(1):105~111, 2005).
본 문서에서 사용되는 용어 “인테그린(integrin)”은 세포 표면에 존재하여 피브로넥틴, 콜라겐등의 세포외 기질에 세포가 접착할 때 작용하는 수용체 단백질을 의미하며, 인테그린은 피브리노겐(fibrinogen) 결합, 세포골격 재배열, 세포 응집(aggregation) 및 이동에 관여한다는 것이 알려져 있다(Buensuceso C. et al., J. Biol. Chem., 25;278(17):15217~24, 2003).
본 문서에서 사용되는 용어 “카데린(cadherin)”은 세포를 조직 내에 잘 부착될 수 있도록 세포 부착에 있어서 중요한 역할을 수행하는 타입-1 막관통 단백질로서(Hulpiau P., et al., Int. J. Biochem. Cell Biol., 41(2): 349~69, 2009), FK1012에 의하여 c-cadherin의 올리고머화를 유도하였을 때, 세포내 부착 현상이 증가되는 현상이 관찰된 바 있다(Yap, A. S. et al., Curr. Biol., 7(5):308~315, 1997).
본 문서에서 사용되는 용어 “c-Abl”은 ABL1 원암 유전자(protooncogene)에 의하여 코딩되는 세포질 및 핵 단백질의 타이로신 인산화 효소로서, 세포 분화, 세포 분열, 세포 부착 및 스트레스 반응 등에 관여한다는 것이 알려져 있다(Kyono, W T., et al., J. Immunol., 161(10): 5555~63, 1998; Law, S. F., et al., Mol. Cell. Biol., 16(7): 3327~37, 1996; Cao et al., J. Biol. Chem., 278(32): 29667~75, 2003). AP1510 매개된 c-Abl의 이합체가 Abl+ 의 활성이 유도되는 연구 결과가 공개된 바 있다(Smith, K. M. et al., J. Biol. Chem. 276(26):24372~24379, 2001).
본 문서에서 사용되는 용어 “14-3-3 단백질”은 모든 진핵세포에서 발현되는 조절 분자로서, 인산화효소, 탈인산화효소 및 막관통 수용체 등과 같은 다양한 신호전달 단백질과 결합하며, 14-3-3 단백질의 N 말단이 동형 및/또는 이형 이합체를 형성하여 다양한 신호전달을 매개한다는 것이 알려져 있다(T. Obsil, et al., Cell, 105(2): 257-267, 2001; Ying H. Shen, et al., Molecular Biology of the Cell, 14, 4721~4733, 2003)
본 문서에서 사용되는 용어 “세포사멸 도메인을 포함하는 Fas-관련 단백질(Fas-Associated protein with Death Domain, FADD)”은 FADD 유전자에 의하여 코딩되는 단백질로서, 다양한 세포 표면 수용체와 결합하여 세포사멸 신호를 전달한다. C-말단의 세포사멸 도메인을 통하여 FADD 단백질은 TNFRSF6/Fas-수용체, TNFR, TNFRSF25, 및 TNFSF10/TRAIL-수용체로 이동하여 상기 수용체의 세포사멸 신호전달을 개시한다(Eberstadt M, et al., Nature 392 (6679): 941~5, 1998; Shu, H.B., et al, Immunity, 6(6):751-63, 1997). AP1510에 의하여 FADD 올리고머화를 유도하여 괴저성 세포 사멸에 있어서 FADD의 세포사멸 작용 도메인의 역할이 연구된 바 있다(Matsumura, H. et al., J. Cell Biol., 151(6):1247~1256, 2000).
본 문서에서 사용되는 용어 “디네인(Dynein)”은 미세소관 기반의 운동 단백질로서, 세포내 소기관 및 거대분자의 이동, 유사분열 및 세포 이동을 포함하는 다양한 세포내 주요 기능에 관여한다는 것이 알려져 있다(Vallee et al., J. Neurobiol., 58:189~200, 2004). 또한, Dynll1과 Dynlt1을 CID 방법에 의하여 이합체를 형성하였을 때, 화학적으로 유도되어 형성된 이합체 ‘트랩(trap)’에 의하여 디네인 기능이 억제된다는 것이 알려진 바 있다(Varma, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 107(8):3493~3498, 2010)
본 문서에서 사용되는 용어 “키네신(Kinesin), 마이오신(myosin)”은 세포내 이동 모터 단백질로서(Vale RD, Cell, 112(4), 467~80, 2003; Pollard, Thomas D. et al., The Journal of biological chemistry, 248(13): 4682~90, 1973), 이합체를 형성하여 기능을 수행한다고 알려져 있다. 마이오신의 경우 Ⅴ, Ⅵ, Ⅶ, 및 Ⅹ가 이합체로서 기능을 수행한다.
본 문서에서 사용되는 용어 “혈소판 내피 세포 부착 분자(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1, PECAM-1)”는 130-kD 막관통 당단백질로, 세포외 도메인 부분에 6개의 Ig 상동 도메인을 포함하고 있으며, 세포질 도메인 부분에는 면역수용체 타이로신-기반의 억제 모티프를 가지고 있는 것으로 알려져 있다(Tieming et al., The Journal of Cell Biology, 152(1), 65~73, 2001). PECAM-1은 다양한 혈관 및 혈액 세포, 단핵세포, 호중구(Stockinger et al., J. Immunol. 145: 3889~3897, 1990), T 림프구 일부 세포(Stockinger et al., Immunology. 75:53~58, 1992), 및 혈소판(Newman, New York Academy of Sciences, 165-174, 1994)에서 발현하는 것이 알려져 있다. PECAM-1은 백혈구의 경피내세포 이동(Schimmenti et al., J. Cell. Physiol., 153:417~428, 1992; Bird et al., Immunology, 80:553~560, 1993; Muller et al., J. Exp. Med., 178: 449~460, 1993; Vaporciyan et al., Science, 262:1580~1582, 1993; Liao et al., J. Exp. Med., 182:1337~1343, 1995; Christofidou-Solomidou et al., J. Immunol., 158:4872~4878, 1997), T 세포 활성(Zehnder et al., Blood., 85:1282~1288, 1995), 및 혈관 신생(DeLisser et al., Am. J. Pathol., 151:671~677, 1997; Zhou et al., Angiogenesis., 3:181~188, 1999) 등에 관여한다.
본 문서에서 사용되는 용어 “NANOG”는 분화되지 않은 배아 줄기 세포의 자가재생에 관여하는 전사인자를 의미하며, CID 방법을 이용하여 AxNanog 이합체 형성이 LIF 비의존적 자가 재생 및 증식이 유도된다는 것을 확인한 연구 결과가 발표되었다(Dixon, J. E. et al., Development, 137(18):2973~2980, 2010).
본 문서에서 사용되는 용어 “배아번역개시인자 2-알파 인산화효소(eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase, EIF2AK2)”는 단백질 인산화 효소 R(protein kinase R, PKR), 인터페론 유도, 2중 가닥 RNA-활성화 단백질 인산화 효소라고도 불리며, EIF2AK2 유전자에 의해서 암호화되는 효소를 의미한다(Williams BR, Oncogene, 18(45):6112~20, 1999; Garcia et al., Biochimie 89(6-7): 799~811, 2007).
본 문서에서 사용되는 용어 “Src”는 타이로신 인산화효소를 암호화하는 원암유전자(proto-oncogene)로서, 비수용체 타이로신 인산화효소 패밀리에 속하며(Anderson SK. et al., Mol. Cell. Biol. 5 (5): 1122-9, 1985), FKBP12 도메인과 융합된 Src가 FK1012에 의하여 세포질 내에 위치한 세포막으로 이동함에 따라 신호전달이 활성화되는 것을 CID 방법으로 연구한 결과가 알려져 있다(Spencer, D. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92(21):9805~9809, 1995).
본 문서에서 사용되는 용어 “Sos(Son of Sevenless)”는 Ras 서브패밀리의 small GTPase에 기능을 수행하는 GEF(guanine nucleotide exchange factor)를 암호화하는 유전자들을 총칭하며, T 세포에서 FK1012를 유도체로 이용한 CID 방법에 의하여 세포막으로 이동되어, Ras를 활성화시킨 연구 결과가 발표된 바 있다(Holsinger, L. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92(21):9810~9814, 1995)
본 문서에서 사용되는 용어 “Vav 단백질”은 간 세포에 특이적으로 발현하고 간세포 분열 및 액틴 세포 골격의 재배열 및 전사 조절에 관여하며(Katzav S, et al., EMBO J., 8(8):2283~2290, 1989; Sheri L. Moores. et al., Mol. Cell. Biol., 20(17): 6364~6373, 2000), 세포내 신호전달 물질로 이용되는 다수의 구조 모티프(motif)를 가지고 있다(Sheri L. Moores. et al., Mol. Cell. Biol., 20(17): 6364~6373, 2000),
본 문서에서 사용되는 용어 “제타 체인 연관 단백질 인산화 효소 70(Zeta-chain-associated protein kinase 70, ZAP70)”는 T 세포 및 자연살해 세포의 막 표면 근처에서 주로 발현하는 단백질로서, T 세포 수용체 신호전달에 있어서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Wang H. et al, Cold Spring Harb Perspect Biol., 2(5):a002279, 2010). FK1012 또는 라파마이신을 이용하여 ZAP70을 세포막으로 이동시켰을 때 T 세포의 활성화가 유도되는 것을 확인함으로써 ZAP70의 기능을 연구한 사례가 알려진 바 있다(Graef IA. et al., EMBO J. 15;16(18):5618-28, 1997).
본 문서에서 사용되는 용어 “Raf” 단백질은 ‘RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase’의 약칭으로서, MAPK/ERK 신호전달 과정에 관여하며, 활성화된 Ras에 의하여 cRaf와 BRaf가 이형 이합체를 형성한다는 것이 알려진 바 있으며(Weber CK. et al., Cancer Res., 61(9):3595~8, 2001), c-Raf-1의 N 말단에 FKBP 단백질을 융합시켜, Raf의 이합체 형성을 통하여 활성화된다는 연구 결과가 발표된 바 있다(Zhijun Luo, et al., Nature, 383, 181~185, 1996)
본 문서에서 사용되는 용어 “Bax 단백질(Bcl-2-associated X protein, Bax)”은 BCL2 패밀리에 속하는 유전자에 의하여 코딩되는 단백질로서, 동형 또는 이형 이합체 형태로 세포사멸 촉진 또는 억제제로서 기능을 수행한다(Oltvai, Z. N., et al., Cell, 74(4):609~619, 1993).
본 문서에서 사용되는 용어 “케스페이즈(caspase)” 단백질은 시스테인 단백질분해효소(cysteine proteases) 패밀리에 속하는 단백질로서, 세포사멸(apoptosis), 괴사 및 감염에 있어서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Alnemri ES, et al., Cell, 87(2):171, 1996). AP1903을 유도체로 이용하는 CID 방법을 통하여, 케스페이 1 또는 3의 올리고머화가 Bcl-xL 비의존적인 방식으로 세포사멸(apoptosis)를 유도한다는 연구 결과가 알려져 있다(MacCorkle, R. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(7):3655~3660, 1998)
본 문서에서 사용되는 용어 “IKK(IκB kinase)” 단백질은 NF-κB 신호전달 기작의 상위 단계에 존재하는 효소 복합체로서, 세포의 감염 반응에 관여하는 것으로 알려져 있다(Hacker H et al., Sci STKE., 17;2006(357):re13, 2006). AP1510 매개의 IκB에 의하여 NF-κB가 활성화된다는 연구가 보고된 바 있다(Inohara, N. et al., J. Biol. Chem., 275(36):27823~27831, 2000).
본 문서에서 사용되는 용어 “T 세포 수용체 제타 체인(T cell receptor zeta chain)”은 T 세포 수용체 알파/베타 및 감마/델타 이형 이합체 및 CD-3 감마, 델타 및 입실론과 함께 T-세포 수용체-CD3 복합체를 형성하며(Li Y. et al., Hematology, 16(3):143-50, 2011) 세포 내 신호 전달 경로에 항원 인식을 결합에서 중요한 역할을 수행한다(Nambiar MP. et al., Arthritis Rheum., 48(7):1948~55, 2003). FK1012을 이용하여 T 세포 수용체 제타 체인의 올리고머화를 유도함으로써, 하위 단계의 신호전달을 활성화시켜 신호전달 기작을 연구한 결과가 알려져 있다(Pruschy, M. N. et al., Chem. Biol., 1(3):163~172, 1994).
본 문서에서 사용되는 용어 "광유도 이합체 형성 단백질(light-induced dimerized protein)"은 특정 파장의 빛을 조사할 경우 동형 이합체를 형성하거나 짝 단백질과 이형이합체(heterodimer)를 형성하는 단백질을 의미하고, “광유도 동형 이합체 형성 단백질은(light-induced homodimerized protein)”은 특정 파장의 빛을 조사할 경우 다른 짝 단백질이 없더라도 동형 이합체를 형성하는 단백질을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "짝 단백질(partner protein)"은 특정 파장의 빛을 조사할 경우 광유도 이형이합체 형성 단백질과 상호작용하여 이형이합체를 형성하는 대상 단백질을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "PHR"은 상기 CRY의 N-말단 부위로서 포토라이아제 상동성 지역(photolyase homology region)을 의미하며, 광조사시 상기 CIB 또는 CIBN과 상호작용한다(Kennedy et al., Nat. Methods, 7(12): 973-975, 2010).
본 문서에서 사용되는 용어 "테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)"는 Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys(서열번호 1)의 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, Xaa는 시스테인을 제외한 아미노산으로서, 상기 Xaa의 종류와 폴리펩티드의 길이에 따라, 형광패턴이 달라진다(Adams et al., J. Am. Chem. Soc., 124: 6063-6077, 2002).
본 문서에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된(operably linked to)"은 특정 폴리뉴클레오티드가 그 기능을 발휘할 수 있게 다른 폴리뉴클레오티드에 연결된 것을 의미한다. 즉, 특정 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결되었다는 것은 당해 프로모터의 작용에 의해 mRNA로 전사되고 당해 단백질로 번역까지 될 수 있게 연결되었다는 것을 의미하고, 특정 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 다른 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되었다는 것은 당해 특정 단백질이 다른 단백질과 융합단백질의 형태로 발현될 수 있게 연결되었다는 것을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "GECO"는 "Genetically Encoded Calcium indicators for Optical imaging(광학 영상화를 위해 유전학적으로 암호화된 칼슘 지시제)"의 약자로서, 칼모듈린의 칼슘 결합 도메인과 형광단백질의 융합단백질의 일종인 GCaMP3를 로저 캠벨(Roger Campbell) 박사 연구실에서 무작위 돌연변이를 통해 개발한 칼슘 센싱 단백질이며, "R-GECO"은 적색 형광단백질 기반의 칼슘 센싱 단백질로 칼슘 결합시 적색 형광이 약 16배 정도 증가하는 것으로 알려져 있다(Zhao et al., Science, 333(6051): 1888-1891, 2011).
본 문서에서 사용되는 “형질전환 식물” 또는 “형질전환 동물”은 외래 유전자를 게놈 내에 도입하여 상기 외래 유전자를 발현하거나 또는 특정 유전자가 발현되지 않도록 결손시킨 유전자 조작된 식물 또는 동물을 의미한다. 형질전환 동물의 경우 통상의 경우 생식세포를 유전자 조작하여 제조될 수 있으나, 체세포에 대한 유전자 조작 이후 핵치환에 의한 복제동물 제조방법으로 제조될 수 있고, 형질전환 식물의 경우 더 간단하게, 체세포를 외래 유전자를 포함하는 아그로박테리아로 감염시킨 후 탈분화 및 재분화의 과정을 거쳐서 제조될 수 있다. 상기 형질전환 동물 및 형질전환 식물의 제조방법은 당업계에 잘 알려져 있다(Jaenisch, R and B. Mintz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71(4): 1250-1254, 1974; Cho et al., Curr. Protoc. Cell Biol., 42: 19.11.1-19.11.22, 2009; Johnston, S. A. and D. C. Tang, Meth. Cell Biol., 43 Pt A: 353-365, 1994; Sasaki et al., Nature 459(7246): 523-527, 2009; Vaek et al., Nature, 328(6125): 33-37, 1987).
이하, 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하면 다음과 같다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 도면에 도시된 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 도면에서 도시된 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다. 또한 설명의 편의를 위하여 도면에서는 구성 요소들이 그 크기가 과장 또는 축소될 수 있다.
도 1은 빛에 의해 이합체를 형성하는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질의 기전을 개략적으로 도시한 개요도이다. 본 발명에서는 빛에 반응하여 동형이합체를 형성할 수 있는 식물 빛 수용 단백질의 PHR을 이합체 형성 단백질에 결합하여 빛 자극의 유무에 따라 이합체 형성 단백질의 이합체화를 조절함으로써 결과적으로 종래의 CID(Chemical Inducer of Dimerization) 방법을 대체하여 이합체 형성 단백질 관련 신호전달 과정을 조절할 수 있다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질의 기전을 식물 빛 수용 단백질의 PHR과 형광 단백질이 융합된 단백질의 FRET 신호를 통해서 확인하는 실험을 개략적으로 도시한 개요도이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질은 다양한 이합체 형성 단백질과 융합되어, 상기 이합체 형성 단백질이 연관된 신호전달 및 세포내 기능을 연구하는데 폭 넓게 적용될 수 있다. 이러한 원리를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 식물 빛 수용 단백질의 PHR과 형광 단백질이 융합된 단백질이 빛에 의하여 이합체를 형성하는지 FRET을 이용하여 관찰하였다. FRET을 이용하기 위하여 공여체(donor)의 방출 스펙트럼과 수용체의 흡수 파장이 중첩되는 형광 단백질을 선택하여 융합단백질을 제조한 후, 상기 융합단백질이 빛에 의하여 이합체를 형성한다면 수용체가 강한 형광을 나타내게 될 것이라는 가정 하에 실험을 수행하였다.
도 3은 식물 빛 수용 단백질의 PHR과 YFP 또는 CFP 형광 단백질이 융합된 융합 단백질이 빛에 의하여 이합체 형성이 유도되는 것을 공초점현미경으로 촬영한 사진이다. 도 3은 상기 도 2에서 개략적으로 도시한 실험에 따라 빛에 의하여 이합체 형성이 유도되는지, PHR-YFP 컨스트럭트와 PHR-CFP 컨스트럭트로 HeLa 세포를 공형질전환시킨 후 공초점현미경으로 관찰한 결과, 빛이 조사됨에 따라 FRET 신호가 증가하는 것이 관찰되었다. 이러한 결과는 광조사에 의하여 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질의 이합체 형성이 조절될 수 있음을 입증하는 것이다.
도 4는 상기 도 3에서 관찰한 융합단백질의 FRET 신호의 변화를 YFP/CFP 비율로 나타낸 그래프이다. 빛 조사에 의하여 FRET 신호가 증가하는 것을 그래프를 통해서 다시 한번 확인할 수 있으며, 이는 도 3에서 관찰된 바와 일치한다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질을 세포 내에서 발현시킨 후 광조사에 의해 MAPK 신호전달이 활성화되는 것을 공초점현미경으로 촬영한 사진(a) 및 시간에 따른 핵/세포질의 형광 세기 비율의 변화량을 나타낸 그래프(b)이다. 광조사에 의하여 RTK가 활성화되어, 이의 하부 단계인 MAPK 신호전달이 정상적으로 활성화되는지를 확인하기 위하여, TrkB-PHR-YFP 컨스트럭트와 ERK-mCherry 컨스트럭트를 제조하였다. 상기 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터로 세포를 형질전환한 후, 광조사를 한 결과 핵/세포질 형광 세기 비율이 광조사 후부터 시간에 따라 점진적으로 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 MAPK 신호전달이 활성화될 때 세포질에 존재하던 ERK가 핵 내부로 이동함에 따라 관찰되는 현상으로, 광조사에 의하여 TrkB-MAPK 신호전달이 활성화되었음을 입증하는 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질을 세포 내에서 발현시킨 후 광조사에 의해 PI3K 신호전달이 활성화되는 것을 공초점현미경으로 촬영한 사진(a) 및 시간에 따른 세포질의 형광 세기 비율 변화량을 나타낸 그래프(b)이다. 광조사에 의하여 RTK가 활성화되어, 이의 하부 단계인 PI3K 신호전달이 정상적으로 활성화되는지를 확인하기 위하여, TrkB-PHR-YFP 컨스트럭트와 mCherry-PHakt 컨스트럭트를 제조하였다. 상기 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터로 세포를 형질전환한 후, 광조사를 한 결과 세포질 형광 세기 비율이 광조사 후부터 시간에 따라 점진적으로 감소하고, 형광이 세포막으로 이동하는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 PI3K 신호전달이 활성화될 때 Akt의 PH 도메인이 세포막으로 이동하여 PIP3와 직접 접촉하여 관찰되는 현상으로, TrkB-PI3K 신호전달 과정이 활성화되었음을 입증하는 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질을 세포 내에서 발현시킨 후 광조사에 의해 칼슘신호전달이 활성화되는 것을 공초점현미경으로 촬영한 사진이다. 광조사에 의하여 RTK가 활성화되어, 이의 하부 단계인 칼슘 신호전달이 정상적으로 활성화되는지를 확인하기 위하여, TrkB-PHR-YFP 컨스트럭트를 제조하고 R-GECO 컨스트럭트를 구입하였다. 상기 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터로 세포를 형질전환한 후, 광조사를 한 결과, 광조사에 의하여 세포질 전반적으로 형광의 세기가 급격히 증가하며, 세포 내 칼슘의 유입이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 광조사를 중단하였을 때에는 형광의 세기가 감소되는 것이 관찰되었는데, 이러한 결과는 광조사에 의하여 칼슘신호전달의 활성이 가역적으로 조절될 수 있음을 입증한 것이다.
도 8은 도 7에서 관찰한 칼슘신호전달 활성화를 시간에 따른 형광 세기 변화로 수치화한 그래프이다. 도 7에서 공초점현미경 사진으로 관찰된 칼슘 유입정도를 빛이 조사되지 않을 때를 기준("1")값으로 하여 형광의 세기를 임의의 수치로 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질을 세포 내에서 발현시킨 후, TrkB 특이적 저해제를 처리하였을 때, 광조사에 의하여 칼슘신호전달이 활성화되지 않는 것을 공초점현미경으로 촬영한 사진이다. 광조사에 의하여 TrkB 신호전달만이 특이적으로 활성화된다는 것을 입증하기 위하여, TrkB-PHR-YFP 컨스트럭트와 R-GECO 컨스트럭트를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포에 TrkB 특이적인 저해제를 처리한 후, 광조사를 하였다. 그 결과, TrkB 특이적 저해제인 K252a를 처리한 군에서는 광조사 전후의 칼슘 신호전달에 변화가 없는 것이 관찰되었다. 반면, K252a를 처리하지 않은 대조군에서는 광조사 유무에 따라 칼슘 신호전달에 변화가 관찰되었다. 이는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질이 TrkB 특이적인 신호전달 과정만을 활성화시킨다는 것을 입증한 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질을 발현하는 세포(TrkB-PHR-YFP, R-GECO)와 이를 발현하지 않는 세포(R-GECO)를 혼합 배양하였을 때, 광조사에 의하여 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질을 발현하는 세포에서만 선택적으로 칼슘 신호전달과정이 활성화되는 것을 공초점현미경으로 촬영한 사진이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질을 시험관 내(in vitro)에서 뿐만이 아니라, 조직 수준 또는 동물모델과 같은 생체 내(in vivo)에서 적용 가능성을 입증하고자, 상술한 바와 같이 2종류의 세포를 혼합배양한 후, 광조사하였다. 그 결과 도 7에 나타난 바와 같이 TrkB-PHR-YFP를 발현하는 세포에서만 특이적으로 칼슘 신호전달이 활성화되는 것을 관찰할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질이 조직, 동물 모델에서 단백질의 이합체 형성을 가역적이며, 특이적으로 조절할 수 있으며, 이에 따라 이합체 형성 단백질과 관련된 세포 내 신호전달 과정, 유전자 발현 연구 및 동물 모델의 행동 실험 등에 적용할 수 있음을 알 수 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 벡터의 제작
1-1: PHR-YFP 컨스트럭트의 제작
CRY2(GenBank 등록번호: NM_100320) PHR 부분(1-498)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 EGFP-N1을 바탕으로 제조한 mCitrine-N1 벡터의 mCitrine N-말단에 상응하는 부위에 삽입하여, PHR-YFP 컨스트럭트를 제작하였다.
1-2: PHR-CFP 컨스트럭트의 제작
CRY2(GenBank 등록번호: NM_100320) PHR 부분(1-498)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 EGFP-N1을 바탕으로 제조한 mCerulean-N1 벡터의 다중클로닝 부위에 프레임에 맞도록 삽입하여, PHR-CFP 컨스트럭트를 제작하였다.
1-3: TrkB-PHR-YFP 컨스트럭트의 제작
CRY2(GenBank 등록번호: NM_100320) PHR 부분(1-498)을 TrkB(GenBank 등록번호: NM_001163168)의 C-말단에 연결한 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조한 후, 이를 EGFP-N1을 바탕으로 제조한 mCitrine-N1 벡터의 mCitrine N-말단에 상응하는 부위에 삽입하여, TrkB-PHR-YFP 컨스트럭트를 제작하였다.
1-4: ERK-mCherry 컨스트럭트의 제작
ERK(GenBank 등록번호: NM_011952)의 full length에 상응하는 폴리뉴클레오티드를 pmCherry-N1 벡터(Clontech, USA)의 다중클로닝 부위에 프레임에 맞도록 삽입하여, ERK-mCherry 컨스트럭트를 제작하였다.
1-5: mCherry-PHAkt 컨스트럭트의 제작
Akt(GenBank 등록번호:NM_001014431)의 PH 도메인(aa 2-147)에 상응하는 폴리뉴클레오티드를 pmCherry-C1 벡터(Clontech, USA)의 다중클로닝 부위에 프레임에 맞도록 삽입하여, mCherry-PHAkt 컨스트럭트를 제작하였다.
실험예 1: 광유도에 의한 이합체 형성 확인
본 발명의 융합 단백질이 CID(Chemical Inducer of Dimerization) 방법을 대체하여 다양한 이합체 형성 단백질에 적용 가능한지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 상기 실시예 1-1 및 1-2에서 각각 제조된 형광 단백질이 융합된 PHR-YFP 컨스트럭트와 PHR-CFP 컨스트럭트가 광조사에 의하여 이합체 형성이 유도될 수 있는지 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조된 PHR-YFP 컨스트럭트와 PHR-CFP 컨스트럭트로 HeLa 세포를 공형질전환시킨 후, 상기 세포를 10% FBS를 함유한 DMEM 배지에서 37℃, 10% CO2 조건에서 배양하다가, 파장 457 nm의 빛의 조사 전후로 공초점현미경 이미지를 수득하는 한편(도 3), 조사 전후의 YFP/CFP 형광의 비율을 계산하였다(도 4). 그 결과, 도 3에 관찰된 바와 같이 광조사에 의하여 세포에서 FRET 신호의 증가가 관찰되었다. 이는 PHR-YFP 컨스트럭트와 PHR-CFP 컨스트럭트가 이합체를 형성하게 되면, 상기 컨스트럭트 사이의 거리가 가까워지고 이에 따라 FRET 현상에 의하여 YFP 형광의 세기가 증가됨에 따라 관찰되는 결과로서, 광조사에 의하여 이합체 형성이 유도될 수 있음을 입증한 결과이다(도 3).
또한, YFP, CFP 각각의 신호의 형광의 세기 측정을 통해서 YFP/CFP 비율을 측정하였으며, 그 결과 도 4에 나타난 바와 같이 광조사에 의하여 신호가 약 1.15배 증가하였다. 이러한 결과는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 단백질이 광조사에 의하여 이합체를 형성함에 따라 FRET 반응에 의하여 YFP 형광의 세기가 증가되었다는 것을 나타내는 결과이다. 이러한 결과는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 단백질이 광조사에 의하여 이합체 형성을 조절할 수 있다는 점을 입증한 결과로서, 이러한 원리를 이용하여 다양한 이합체 형성 단백질에 적용하여 세포 내 신호전달 및 유전자 발현을 가역적으로 조절하는데 이용할 수 있음을 의미한다.
실험예 2: 광유도에 의한 TrkB 하위단계 신호전달의 활성화 확인
광유도에 의하여 본 발명의 융합 단백질들의 신호전달이 정상적으로 활성화될 수 있는지 확인하기 위하여, 이합체를 형성하는 TrkB 단백질 및 이의 하위단계 신호전달의 활성화를 상기 실시예 1-3 내지 1-5에서 제조한 벡터를 이용하여 확인하였다.
우선, MAPK 신호전달이 활성화되는지 확인하기 위하여 상기 실시예 1-3 및 1-4에서 각각 제조한 TrkB-PHR-YFP 컨스트럭트와 ERK-mCherry 컨스트럭트로 HeLa 세포를 공형질전환시킨 후, 10% FBS를 함유한 DMEM 배지에서 37℃, 10% CO2 조건에서 배양하다가, 파장 488 nm의 빛의 조사 전후로 공초점현미경 이미지를 수득하는 한편(도 5a), 시간에 따른 핵과 세포질의 형광 세기 변화를 각각 측정한 후, 핵/세포질 형광세기 비율의 변화량의 비를 구하였다(도 5b). 그 결과, 광조사에 따라 핵에서의 형광세기가 강해지는 것이 관찰되었는데, 이는 활성화된 ERK가 핵 내부로 이동하기 때문이다. 이러한 결과는 TrkB의 하위 단계인 MAPK 신호전달이 광조사에 의하여 활성화되었음을 의미한다.
이어, 본 발명자들은 광조사에 의하여 본 발명의 융합 단백질이 이합체를 형성하면서 정상적으로 하위단계의 신호를 활성화할 수 있는지 입증하기 위하여 TrkB의 대표적인 하부 단계 신호전달인 PI3K의 활성 여부를 관찰하였다. 상기 실시예 1-3 및 1-5에서 각각 제조한 TrkB-PHR-YFP 컨스트럭트와 mCherry-PHAkt 컨스트럭트로 HeLa 세포를 공형질전환시킨 후, 10% FBS를 함유한 DMEM 배지에서 37℃, 10% CO2 조건에서 배양하다가, 파장 488 nm의 빛의 조사 전후로 공초점현미경 이미지를 수득하는 한편(도 6a), 시간에 따른 세포질에서의 형광세기 변화를 측정하였다(도 6b). 그 결과, 광조사 이후 mCherry-PHAkt 컨스트럭트의 형광이 세포막으로 점진적으로 이동하는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 PI3K 신호전달이 활성화될 때 Akt의 PH 도메인이 세포막으로 이동하여 PIP3와 직접 접촉하여 관찰되는 현상으로, TrkB-PI3K 신호전달 과정이 활성화되었음을 의미한다.
아울러, 본 발명자들은 TrkB의 대표적인 하부 단계 신호전달인 칼슘 신호전달의 활성 여부를 관찰하였다. 상기 실시예 1-3에서 제조한 TrkB-PHR-YFP 컨스트럭트와 R-GECO 컨스트럭트(Addgene, plasmid 32444: CMV-R-GECO1)로 HeLa 세포를 공형질전환시킨 후, 10% FBS를 함유한 DMEM 배지에서 37℃, 10% CO2 조건에서 배양하다가, 파장 488 nm의 빛의 조사 전후로 공초점현미경 이미지를 수득하는 한편(도 7), 세포질에서의 R-GECO 형광세기를 측정하였다(도 8). 상기 R-GECO는 TrkB 하부 신호전달과정인 칼슘 신호전달 과정을 모니터링 할 수 있는 바이오센서로서, R-GECO가 발현하는 형광 세기를 광조사 유무에 따른 세포 내 칼슘 양의 증감을 확인하는데 이용하였다. 그 결과, 광조사에 의하여 R-GECO의 형광이 세포질 내에 전반적으로 증가하였으나 광조사를 제거하였을 때에는 감소하는 것이 관찰되었다. 또한, 도 8에 나타난 바와 같이 반복적으로 광조사를 하였을 때, 다시 세포질 전반에 R-GECO의 형광이 강하게 발현되는 것이 관찰되었다. 이러한 결과는 광조사에 의하여 가역적으로 TrkB의 활성이 유도될 수 있음을 의미한다.
이러한 결과는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 단백질이 광조사에 의하여 이합체 형성을 조절할 수 있음을 TrkB를 예시로 입증한 것이다. 즉, TrkB 관련 신호전달 기작, 세포의 발생, 성장 및 분화과정 및 동물 모델의 행동 실험뿐만 아니라, 종래의 CID에 의하여 유도된 다양한 이합체 활성에 적용할 수 있음을 알 수 있다.
실험예 3: 광유도에 의한 TrkB 특이적인 신호전달 활성화 확인
본 발명자들은 광조사에 의하여 TrkB 특이적인 신호전달 과정만이 활성화되어, 이의 하부 단계에만 영향을 미친다는 것을 확인하기 위하여, TrkB 특이적인 저해제를 전처리한 후, 광유도에 의한 하부 단계 신호전달 과정 중 칼슘 신호전달의 활성 여부를 관찰하기 위하여, R-GECO 컨스트럭트(Addgene, plasmid 32444: CMV-R-GECO1)를 이용하였다.
구체적으로 상기 실시예 1-3에서 제조한 TrkB-PHR-YFP 컨스트럭트와 R-GECO 컨스트럭트로 HeLa 세포를 공형질전환시킨 후, 10% FBS를 함유한 DMEM 배지에서 37℃, 10% CO2 조건에서 배양하다가, TrkB의 특이적 저해제로 알려진 K252a를(100 nM)을 30분 동안 처리한 후, 파장 488 nm의 빛의 조사 전후로 공초점현미경 이미지를 수득하였다. 이에 대한 대조군으로는 DMSO를 동일한 시간동안 처리한 후, 파장 488 nm의 빛의 조사 전후로 공초점현미경 이미지를 수득하여 비교하였다(도 9). 그 결과, 대조군과 TrkB 특이적 저해제인 K252a 처리군에서 TrkB-PHR-YFP의 발현이 정상적으로 관찰되었으나, K252a를 전처리한 세포에서는 광조사 전후의 R-GECO의 형광의 세기에 변화가 없었다. 그러나, K252a를 전처리하지 않은 대조군에서는 광조사의 유무에 따라 R-GECO 형광 세기에 변화가 관찰되었다. 이러한 결과는 본 발명의 융합단백질이 RTK 신호전달만을 특이적으로 활성화시킨다는 것을 입증하는 것이다.
아울러, 본 발명자들은 본 발명의 광조사에 의하여 활성이 유도되는 융합단백질을 조직 수준에 적용할 수 있는지 확인하고자, 실시예 1-3의 컨스트럭트와 R-GECO 컨스트럭트(Addgene, plasmid 32444: CMV-R-GECO1)를 동시에 발현하는 세포와, R-GECO 컨스트럭트만을 발현하는 세포를 2:1의 비율로 혼합 배양하였다. 상기 실시예 1-1와 R-GECO 컨스트럭트를(1:1)의 비율(각각 300 ng)로 혼합한 후 형질전환된 HeLa 세포에 파장 488 nm의 빛의 조사 전후, 공초점현미경 이미지를 수득하였다(도 10). 그 결과, TrkB-PHR-YFP와 R-GECO가 동시에 발현되는 세포(도 10의 화살표)에서만 광조사에 의하여 R-GECO의 형광 세기가 변화되었다. 이는 다양한 종류의 세포들이 섞여 있는 조직 수준에 본 시스템을 적용할 경우, 광조사에 의하여 TrkB-PHR-YFP를 발현하는 세포에서만 선택적이고 가역적으로 신호전달과정을 활성화시킬 수 있음을 입증하는 것이다.
요약하면, 본 발명에서는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 단백질은 광조사에 의하여 단백질의 이합체 형성을 유도할 수 있으며, 이러한 이합체 형성은 가역적이며 국부적으로 광조사에 의하여 조절되며, 융합된 이합체 형성 단백질 신호전달 기작 특이적인 활성이 유도할 수 있음을 확인하였다. 즉, 본 발명의 일 실시예는 이합체 형성 단백질 가운데 TrkB 단백질을 예시적으로 사용한 것이며, 종래의 CID을 대체하여 다양한 이합체 형성 단백질이 관련된 신호전달, 세포 내 기능 연구 및 동물 모델의 행동 실험에 적용할 수 있음을 입증한 것이다.
본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Fusion proteins capable of inducing protein dimerization by light and uses thereof <130> PD12-0306 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tetracystein motif <400> 1 Cys Cys Xaa Xaa Cys Cys 1 5

Claims (23)

  1. 수용체 타이로신 인산화효소(Receptor Tyrosine Kinase, RTK) 단백질, 단백질 공역 수용체(G-protein coupled receptor, GPCR) 단백질, 톨 유사 수용체(Toll-like receptor, TLR) 단백질, 핵 수용체(Nuclear receptor) 단백질, Fas 수용체, NOD-유사 수용체(NOD-like receptor, NLR) 단백질, 트롬보포이에틴 수용체(Thrombopoietin receptor, Tpo) 단백질, 에리스로포이에틴 수용체(erythropoietin receptor, Epo) 단백질, 인테그린(integrin), 카데린(cadherin), c-Abl, 14-3-3 단백질, 세포사멸 도메인을 포함하는 Fas-관련 단백질(Fas-Associated protein with Death Domain, FADD), 디네인(Dynein), 키네신(kinesin), 마이오신Ⅴ(myosinⅤ), 마이오신Ⅵ(myosin Ⅵ), 마이오신Ⅶ(myosinⅦ), 마이오신Ⅹ(myosinⅩ), PECAM-1(Platelet endothelial cell adhesion molecule), NANOG, 배아번역개시인자 2 인산화효소(eukaryotic translation initiation factor-2 kinase, EIF-2 kinase), Src, Sos(Son of Sevenless), Vav 단백질, 제타 체인 연관 단백질 인산화 효소 70(Zeta-chain-associated protein kinase 70, ZAP70), Raf, Bax 단백질(Bcl-2-associated X protein, Bax), 케스페이즈(caspase) 1, 3, 8 및 9, IKK(IκB kinase), 및 T 세포 수용체 제타 체인(T cell receptor zeta chain)로 구성되는 군으로부터 선택되는 이합체를 형성하며 상기 이합체 형성에 의해 활성화되는 이합체 형성 활성화 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 PHR(photolyase homology region) 단백질이 연결된 융합단백질.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 수용체 타이로신 인산화효소(Receptor Tyrosine Kinase, RTK) 단백질은 표피성장인자 수용체(Epidermal growth factor receptor, RTK 클래스 I), 인슐린 수용체(Insulin Receptor, RTK 클래스 II), 혈소판 유래 성장인자 수용체(Platelet-derived growth factor receptor, RTK 클래스 III), 섬유아세포증식인자 수용체(Fibroblast growth factor receptor, RTK 클래스 IV), 혈관내피세포성장인자 수용체(Vascular endothelial cell growth factor receptor, RTK 클래스 V), 간세포 성장인자 수용체(Hepatocyte growth factor receptor, RTK 클래스 VI), TRK 수용체(Tropomyosin-receptor-kinase receptor, RTK 클래스 VII), EPH 수용체(RTK 클래스 VIII), AXL 수용체(RTK 클래스 IX), LKT 수용체(RTK 클래스 X), TIER 수용체(RTK 클래스 XI), 수용체 타이로신 인산화 효소-유사 오펀 수용체(receptor tyrosine kinase-like orphan receptors, RTK 클래스 XII), 디스코이딘 도메인 수용체(Discoidin domain receptor, RTK 클래스 XIII), RET 수용체(RTK 클래스 XIV), KLG 수용체(RTK 클래스 XV), RYK 수용체(related to receptor tyrosine kinase, RTK 클래스 XVI), 및 MuSK 수용체(Muscle-Specific Kinase Receptor, RTK 클래스 XVII)인, 융합단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 핵 수용체(Nuclear receptor) 단백질은 갑상샘 호르몬 수용체(Thyroid hormone receptor), 레티노산 수용체(Retinoic acid receptor), 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체(Peroxisome proliferator-activated receptor), Rev-ErbA, RAR-관련 오펀 수용체(RAR-related orphan receptor), 간 X 수용체 유사체(Liver X receptor-like), 비타민 D-수용체 유사체(Vitamin D receptor-like), 2개의 DNA 결합 도메인을 갖고 있는 핵 수용체(Nuclear receptor with two DNA binding domains), 간세포 핵인자-4(Hepatocyte nuclear factor-4), 레티노이드 X 수용체(Retinoid X receptor), 고아핵수용체(Testicular receptor), TLX/PNR, COUP/EAR, 에스트로겐 수용체(Estrogen receptor), 에스트로겐 연관 수용체(Estrogen related receptor), 3-케노스테로이드 수용체(3-Ketosteroid receptors), NGFIB, NURR1, NOR1, SF1, LRH1, DAX, 및 SHP인, 융합단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    형광단백질을 추가적으로 포함하는, 융합단백질.
  6. 청구항 6은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제5항에 있어서,
    상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)인, 융합단백질.
  7. 제1항 및 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항의 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  8. 제7항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  9. 제8항의 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환 숙주세포.
  10. 제8항의 벡터로 형질전환되어 상기 융합단백질을 발현할 수 있는 비인간 형질전환 동물.
  11. 제8항의 벡터로 형질전환되어 상기 융합단백질을 발현할 수 있는 형질전환 식물.
  12. 이합체를 형성하며 상기 이합체 형성에 의해 활성화되는 이합체 형성 활성화 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 PHR(photolyase homology region) 단백질이 연결된 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 제조된 형질전환 숙주세포를 준비하는 형질전환 숙주세포 준비단계; 및
    상기 배양중인 형질전환 숙주세포에 상기 PHR 단백질의 동형 이합체 형성을 유도할 수 있는 파장의 빛을 조사하는 광조사 단계를 포함하는 상기 이합체 형성 활성화 단백질을 가역적으로 활성화시키는 방법.
  13. 이합체를 형성하며 상기 이합체 형성에 의해 활성화되는 이합체 형성 활성화 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 PHR(photolyase homology region) 단백질이 연결된 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터로 형질전환되어 상기 융합단백질을 발현하는 형질전환 식물 또는 비인간 형질전환 동물을 준비하는 형질전환 동물 준비단계; 및
    상기 형질전환 식물 또는 비인간 형질전환 동물의 특정 기관 또는 조직에 상기 PHR 단백질의 동형 이합체 형성을 유도할 수 있는 파장의 빛을 조사하는 광조사 단계를 포함하는 식물 또는 비인간 동물의 특정 기관 또는 조직에서의 이합체 형성 단백질을 가역적으로 활성화시키는 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    상기 이합체 형성 활성화 단백질은 수용체 타이로신 인산화효소(Receptor Tyrosine Kinase, RTK) 단백질, 단백질 공역 수용체(G-protein coupled receptor, GPCR) 단백질, 톨 유사 수용체(Toll-like receptor, TLR) 단백질, 핵 수용체(Nuclear receptor) 단백질, Fas 수용체, NOD-유사 수용체(NOD-like receptor, NLR) 단백질, 트롬보포이에틴 수용체(Thrombopoietin receptor, Tpo) 단백질, 에리스로포이에틴 수용체(erythropoietin receptor, Epo) 단백질, 인테그린(integrin), 카데린(cadherin), c-Abl, 14-3-3 단백질, 세포사멸 도메인을 포함하는 Fas-관련 단백질(Fas-Associated protein with Death Domain, FADD), 디네인(Dynein), 키네신(kinesin), 마이오신Ⅴ(myosinⅤ), 마이오신Ⅵ(myosin Ⅵ), 마이오신Ⅶ(myosinⅦ), 마이오신Ⅹ(myosinⅩ), PECAM-1(Platelet endothelial cell adhesion molecule), NANOG, 배아번역개시인자 2 인산화효소(eukaryotic translation initiation factor-2 kinase, EIF-2 kinase), Src, Sos(Son of Sevenless), Vav 단백질, 제타 체인 연관 단백질 인산화 효소 70(Zeta-chain-associated protein kinase 70, ZAP70), Raf, Bax 단백질(Bcl-2-associated X protein, Bax), 케스페이즈(caspase) 1, 3, 8 및 9, IKK(IκB kinase), 및 T 세포 수용체 제타 체인(T cell receptor zeta chain)인, 방법.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 숙주세포는 동물세포 또는 식물세포인, 방법.
  16. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    상기 융합단백질은 형광단백질을 추가로 포함하는, 방법.
  17. 청구항 17은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제16항에 있어서,
    상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)인, 방법.
  18. 이합체를 형성하며 상기 이합체 형성에 의해 활성화되는 이합체 형성 활성화 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 PHR(photolyase homology region) 단백질이 연결된 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 제조된 형질전환 숙주세포를 준비하는 형질전환 숙주세포 준비단계;
    상기 배양중인 형질전환 숙주세포의 배지에 후보물질을 처리하는 후보물질 처리단계;
    상기 배양중인 형질전환 숙주세포에 상기 PHR 단백질의 동형 이합체 형성을 유도할 수 있는 파장의 빛을 조사하는 광조사단계; 및
    후보물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 광조사에 의하여 상기 이합체 형성 활성화 단백질의 신호전달을 억제하는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 상기 이합체 형성 활성화 단백질의 신호전달 억제제 후보물질 스크리닝 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 이합체 형성 활성화 단백질은 수용체 타이로신 인산화효소(Receptor Tyrosine Kinase, RTK) 단백질, 단백질 공역 수용체(G-protein coupled receptor, GPCR) 단백질, 톨 유사 수용체(Toll-like receptor, TLR) 단백질, 핵 수용체(Nuclear receptor) 단백질, Fas 수용체, NOD-유사 수용체(NOD-like receptor, NLR) 단백질, 트롬보포이에틴 수용체(Thrombopoietin receptor, Tpo) 단백질, 에리스로포이에틴 수용체(erythropoietin receptor, Epo) 단백질, 인테그린(integrin), 카데린(cadherin), c-Abl, 14-3-3 단백질, 세포사멸 도메인을 포함하는 Fas-관련 단백질(Fas-Associated protein with Death Domain, FADD), 디네인(Dynein), 키네신(kinesin), 마이오신Ⅴ(myosinⅤ), 마이오신Ⅵ(myosin Ⅵ), 마이오신Ⅶ(myosinⅦ), 마이오신Ⅹ(myosinⅩ), PECAM-1(Platelet endothelial cell adhesion molecule), NANOG, 배아번역개시인자 2 인산화효소(eukaryotic translation initiation factor-2 kinase, EIF-2 kinase), Src, Sos(Son of Sevenless), Vav 단백질, 제타 체인 연관 단백질 인산화 효소 70(Zeta-chain-associated protein kinase 70, ZAP70), Raf, Bax 단백질(Bcl-2-associated X protein, Bax), 케스페이즈(caspase) 1, 3, 8 및 9, IKK(IκB kinase), 및 T 세포 수용체 제타 체인(T cell receptor zeta chain)인, 방법.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 후보물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 또는 혈장인, 방법.
  21. 제18항에 있어서,
    상기 숙주세포는 동물세포 또는 식물세포인, 방법.
  22. 제18항에 있어서,
    상기 융합단백질은 형광단백질을 추가로 포함하는, 방법.
  23. 청구항 23은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제22항에 있어서,
    상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)인, 방법.
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