KR102063924B1 - Cyr2 단백질 연장 및 형광 단백질 태깅을 이용한 빛 기반 단백질 클러스터링 방법 - Google Patents

Abstract

단백질의 호오 올리고머라이제이션(homo-oligomerization)은 다양한 생물분야 에서 중요한 분자적 기작이다. 따라서 단백질의 호모-올리고머라이제이션을 조절할 수 있는 능력은 다양한 세포적 상황들을 조절하고 조사할 수 있게 한다. 이러한 목표를 달성하기 위하여, 애기장대 유래 크립토크롬 2(cryptochrome 2, CRY2)이 파란색 빛에 의한 시공간적 단백질 호오-올리고머라이제이션을 조절하기 위해 사용되었다. 하지만 CRY2 단백질의 정확한 작동 기작이 알려지지 않아, 이를 널리 활용하는데 방해가 되는 실정이다. 본 발명에서 발명자들은 빠르고, 효과적인 CRY2 클러스터링에 중요한 요소들을 발견하였으며, 다양한 형광 단백질과 매우 짧은 펩타이드에 기반한 엔지니어된 CRY2 단백질을 이용하여 빠르고 효과적인 타겟 단백질의 호모-올리고머라이제이션을 유도할 수 있는 시스템을 개발하였다. 뿐만 아니라, 기존에 개발된 빛에 의한 단백질 결합 도구들과 본 발명의 시스템을 비교하여, 본 발명의 시스템이 훨씬 다양한 분야에서 높은 효율로 이용될 수 있다는 것을 확인하였다. 본 발명은 새로운 빛에 의해 조절되는 단백질 클러스터링 툴박스를 제공할 뿐만 아니라, CRY-2 기반의 새로운 옵토제닉 모듈의 개발을 위한 가이드라인을 제공한다.

Description

CRY2 단백질 연장 및 형광 단백질 태깅을 이용한 빛 기반 단백질 클러스터링 방법{Optogenetic protein clustering through fluorescent protein tagging and extension of CRY2}

단백질의 호모-올리고머라이제이션(homo-oligomerization)은 다양한 생물분야 에서 중요한 분자적 기작이다. 따라서 단백질의 호모-올리고머라이제이션을 조절할 수 있는 능력은 다양한 세포적 상황들을 조절하고 조사할 수 있게 한다. 이러한 목표를 달성하기 위하여, 애기장대 유래 크립토크롬 2(cryptochrome 2, CRY2)이 파란색 빛에 의한 시공간적 단백질 호모-올리고머라이제이션을 조절하기 위해 사용되었다. 하지만 CRY2 단백질의 정확한 작동 기작이 알려지지 않아, 이를 널리 활용하는데 방해가 되는 실정이다. 본 발명에서 발명자들은 빠르고, 효과적인 CRY2 클러스터링에 중요한 요소들을 발견하였으며, 다양한 형광 단백질과 매우 짧은 펩타이드에 기반한 엔지니어된 CRY2 단백질을 이용하여 빠르고 효과적인 표적 단백질의 호모-올리고머라이제이션을 유도할 수 있는 시스템을 개발하였다. 뿐만 아니라, 기존에 개발된 빛에 의한 단백질 결합 도구들과 본 발명의 시스템을 비교하여, 본 발명의 시스템이 훨씬 다양한 분야에서 높은 효율로 이용될 수 있다는 것을 확인하였다. 본 발명은 새로운 빛에 의해 조절되는 단백질 클러스터링 툴박스를 제공할 뿐만 아니라, CRY-2 기반의 새로운 옵토제닉 모듈의 개발을 위한 가이드라인을 제공한다.

단백질의 호모-올리고머라이제이션은 세포막 수용체, 인산화효소 및 전사인자와 같은 신호전달 경로 단백질 조절하는 필수적인 분자 메커니즘이다 Ali, M.H. et al., Bioorg Med Chem, Vol. 13, pp. 5013-5020, 2005; Hashimoto, K. et al., Phys Biol Vol. 8, 035007, 2011).따라서 단백질 호모-올리고머라이제이션을 조절할 수 있는 합성 도구는 다양한 생물학적 이벤트를 연구하는데 매우 높은 가치를 지니고 있다. 일정 조건하에 단백질 호모-올리고머라이제이션을 유도하는 가장 널리 사용되는 접근법은 화학적으로 유도된 호모-접합(homo-association) 시스템이다(Fegan, A. et al., Chem Rev, Vol. 110, pp. 3315-3336, 2010).다만 낮은 시공간적 해상도와 다양성과 같은 화학 물질의 단점 때문에 단백질 활성의 동적 성질을 연구하는 데 사용하는 것이 제한되어 있다. 상기 단점을 해결하기 위한 하나의 방법은 CRY2의 광 유도 호모-올리고머라이제이션 특성을 통해 특정 시간 및 공간에서 표적단백질의 올리고머라이제이션을 조절하기 위해 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 크립토크롬 2(cryptochrome 2, CRY2)를 도입하는 것이다(Bugaj, L.J. et al., Nat Methods, Vol. 10, pp. 249-252, 2013; Chang, K.Y. et al., Nat Commun Vol. 5, pp. 4057, 2014; Kim, N. et al. Chem Biol, Vol. 21, pp. 903-912, 2014; Kyung, T. et al., Nat Biotechnol, Vol. 33, pp. 1092-1096, 2015; Nguyen, M.K. et al., Nat Chem Biol, Vol. 12, pp. 431-436, 2016; Taslimi, A. et al. Nat Commun, Vol. 5, pp. 4925, 2014).

하지만, CRY2 단백질의 클러스터링은 특정 조건 - CRY2 단백질의 농도 및 태깅(tagging) 단백질의 종류 -하에서만 가능하다고 알려져 있다(Taslimi, A. et al., Nat Commun Vol. 5, pp. 4925, 2014; Lee, S. et al. Nat Methods Vol. 11, pp. 633-636, 2014; Che, D.L. et al., ACS Synth Biol Vol. 4, pp. 1124-1135, 2015). 더욱이 CRY2 구조로 알려져 있지 않기 때문에, CRY2 클러스터링 도구가 다른 연구그룹에 의해 연구되었지만, 어떤 요소가 중요한 결정 인자이며, CRY2가 융합된 표적 단백질의 클러스터링이 어떻게 효과적으로 생성될 수 있는지에 대해서는 여전히 불확실하다.

본 발명에서는 CRY2-기반 올리고머라이제이션의 효율에 융합 단백질 또는 태그가 어떤 영향을 미치는지 확인하였으며, 이에 기반하여 파란색 빛에 반응하여 표적 단백질의 강력하고 효과적인 올리고머라이제이션을 달성하는 새로운 CRY2 모듈을 개발하였다. 공통의 백본 구조를 포함하나, 올리고머 상태가 상이한 다양한 형광 단백질(FPs)을 이용하여 CRY2에 융합되는 단백질의 4차 구조가 CRY2 클러스터링의 효율에 영향을 미친다는 것을 확인하였다. 또한, 새롭게 동정한 짧은 펩타이드를 태깅하는 새로운 CRY2 클러스터링 시스템(CRY2clust)를 개발하였으며, 이는 빛에 반응하여 살아있는 세포에서 미세한 세포 신호 전달을 효과적으로 조절할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서는 융합 단백질 또는 태그가 CRY2 클러스터링의 효율에 어떤 영향을 미치는 지를 확인하였으며, 표적 단백질의 기능의 제어를 효과적으로 수행하기 위한 CRY2 클러스터링의 중요한 결정요인을 확인하였다.

이에 대하여, 공통의 백본 구조를 포함하나 서로 다른 올리고머 상태를 가지는 다양한 형광단백질(FPs)을 이용하여, CRY2에 융합되는 단백질의 서로 다른 올리고머 상태가 CRY2 클러스터링의 효율에 영향을 준다는 것을 증명하였다.

본 발명에 따르면, 융합 단백질 또는 태그가 CRY2 클러스터링의 효율에 어떤 영향을 미치는 지를 확인하였으며, 표적 단백질의 기능의 제어를 효과적으로 수행하기 위한 CRY2 클러스터링의 중요한 결정요인을 확인하였다. 이에 대하여, 공통의 백본 구조를 포함하나 서로 다른 올리고머 상태를 가지는 다양한 형광단백질(FPs)을 이용하여, CRY2에 융합되는 단백질의 서로 다른 올리고머 상태가 CRY2 클러스터링의 효율에 영향을 준다는 것을 증명하였다. 흥미롭게도 강력한 CRY2 클러스터링을 결정하기 위해 필요한 융합 단백질의 올리고머 상태 기준값(threshold)이 약한 2량체 에서 4량체 사이임을 확인할 수 있었다. CRY2 클러스터링의 효율은 또한 융합 위치에 크게 영향을 받았으며, 이는 CRY2 클러스터링의 효율을 결정하기 위해 태그가 부착된 단백질의 4차 구조뿐만 아니라, 다른 메커니즘이 존재할 수 있음을 암시한다. 한가지 가능한 설명은 CRY2PHR과 그 C-말단 태그의 결합된 폴딩 메커니즘을 통해 광할성화된 CRY2 구조가 안정화되는 것이다(Yu, X. et al., Plant Cell, Vol. 21, pp. 118-130, 2009). 비록 DsRed와 같은 다중 단백질을 태깅하여 클러스터링 효율을 향상 시킬수 있지만, 이러한 다중 단백질의 직접 융합은 어두운 상태에서 표적 단백질의 생물학적 기능을 저해할 가능성이 있다. 결론적으로, 이러한 결과가 특정 목적으로 CRY2를 사용하는 새로운 실험을 설계하기 위한 가이드라인과 CRY2가 어떻게 클러스터를 형성하는 지에 대한 증거를 제공할 것이다.

CRY2의 광 의존성 호모-올리고머라이제이션 특성을 연구하는 동안, 본 발명자들은 짧은 펩타이드를 발견하여 뛰어난 CRY2 클러스터링 시스템(CRY2clust)를 개발하였다. 본 발명자들은 또한, CRY2 내부의 C-말단 영역의 기능을 발견하여 올리고머라이제션을 위한 CRY2의 C-말단 부위의 잠재적인 사용법을 개발하였다. CRY2 서열의 9개 아미노산에 대한 순차적인 제거 및 변이 실험을 통해 CRY2clust 및 CRY2[1-507]이 CRY2 클러스터링을 향상시키는 유사한 기작을 가지는 것을 확인하였다; 빛에 의해 유도된 CRY2 클러스터링을 결정하기 위해서는 특정위치 아미노산 잔기의 소수성이 중요한 결정요소이다. 또한, 동시 번역 실험 및 특정 단백질의 상호작용을 시각화하는 Incell SMART-I 어세이(Lee, S. et al., Angew Chem Int Ed Engl, Vol. 50, pp. 8709-8713, 2011)를 분석한 결과, CRY2clust 및 CRY2[1-507]은 어두운 상태에서의 올리고머 상태의 변화에는 관여하지 않는다는 것을 확인하였다. CRY2clust 및 CRY2[1-507]의 클러스터링 효율의 증가 기작은 활성화된 CRY2PHR 구조의 안정화와 관련이 있을 수 있지만(Yu, X. et al., Plant Cell, Vol. 21, pp. 118-130, 2009), 정확한 기작을 밝히기 위해서는 추가적인 연구가 필요하다.

CRY2PHR 및 CRY2olig와 같은 기존에 개발된 CRY2 올리고머라이제이션 모듈과 비교하여, 본 발명에서 개발한 시스템의 이점은 결합 및 분리를 위한 빠른 동역학, 핵 스페클과 같은 세포 내 물질의 축적이 없는 빛 및 클러스터의 분포에 대한 높은 민감도이다. CRY2clust의 빠른 클러스터링은 동일한 광 조건하에서 이전에 보고된 CRY2 기반 광유전학적 모듈의 역동성을 향상시켰다. 따라서 본 발명의 시스템은 어두운 상태에서 표적의 신호전달을 혼란시키지 않으면서, 높은 해상도를 가지고, 비교적 빠른 세포 반응을 조작할 수 있다.

요약하자면, 본 발명의 광유전학적 클러스터링 모듈은 빠르고 효과적인 단백질의 호모-올리고머라이제션을 유도하여 in vitro 및 in vivo에서의 빠른 신호전달 동역학의 조절 및 연구가 가능하다. 또한, 효과적인 CRY2 클러스터링을 위한 결정요인 및 CRY2의 C-말단 영역의 역할과 같은 본 발명의 새로운 발연은 CRY2 광 유도 호모-올리고머라이제이션 및 고차원 클러스터 형성 메커니즘을 이해하는데 도움이 될 것이다. 본 발명의 향상된 CRY2 모듈이 광유전학적 클러스터링 툴박스의 다양성을 확대하고, 사용자의 특정 실험목적을 위해 정확한 방법을 설계할 수 있게 할 것으로 기대한다.

도 1은 광-유도 CRY2 클러스터링 효율에서 FP 태그의 4차 구조의 역할을 확인한 것으로, (a)는 CRY2 클러스터링의 효율과 FPs의 4차구조의 관계를 나타내는 개념도로, 오른쪽은 본 발명에서 사용한 FPs의 특징을 나타낸 것이고, (b)는 FP-레이블된 CRY2PHR을 발현하는 플라스미드가 주입된 HeLa 세포의 형광이미지로, 스케일 바는 10μm이묘, (c)는 클러스터된 세포의 퍼센트를 정량화한 것으로, **P = 2.03x10-5; ***P = 4.11x10-17 (EYFP), 5.44x10-12 (mCitrine), 4.87x10-46 (DsRed)는 Students two-tailed t-test로 측정한 결과이고, (d)는 클러스터를 포함하는 세포에서 클러스터의 비율을 정량화한 것으로, 전체 클러스터 강도(IC)를 전체 세포의 전체 형광(IW)으로 나눈 값을 계산한 것이며, 값들은 +- s.e.m.의 평균으로 나타내었다(n = 122, 81, 127, 100, 188, 193, 223, 163, 174, 113, 140, 171, 187, 142 세포, 3회의 독립적인 실험). **P = 8.36x10-6; ***P = 6.74x10-20 (EYFP), 1.66x10-13 (mCitrine), 4.87x10-46 (DsRed)는 Students two-tailed t-test로 측정하였다.
도 2는 C-말단이 확장될 경우, 광 유도 CRY2 클러스터링이 향상되는 것을 확인한 결과로, (a)는 CRY2PHR[아미노산 1-498](서열번호 1)의 C-말단을 확장한 CRY2 변이체의 서열을 개시한 것으로, 9개의 아미노산을 확장한 CRY2clust(파란색 박스)(서열번호 2 내지 6) 또는 천연 CRY2[아미노산 1-507](서열번호 7)을 개시하였고, 변이된 잔기는 빨간색으로 표시하였고, (b)는 mcherry-CRY2clust의 가역적인 클러스터링을 나타내는 세포의 형광이미지로, 아래쪽 패널은 상단 왼쪽 이미지의 노란색 선에 해당하는 kymograph이며, (c)는 클러스터 비율의 변화를 측정한 저속 그래프로서, b 및 c의 노란색 및 파란색 화살표는 빛을 비춘 시작 지점을 의미하고, (d)는 광 자극시, 각각의 mCherry로 표지된 CRY2 변이체를 발현하는 세포의 형광이미지로, 세포를 20초 간격으로 5분 동안 빛을 조사하여 측정하였으며, (e)는 클러스터 비율을 정량화한 결과로서, 값들은 +- s.e.m.의 평균으로 나타내었고, (n = 72, 99, 91, 76, 98, 88, 97 개의 세포들이고, 3회의 독립적인 실험을 수행하였음). **P = 3.45x10-8; ***P = 5.57x10-14, ****P = 9.42x10-62 (CRY2PHR), 1.32x10-69 (CRY2clust (L7K)), 9.97x10-70 (CRY2clust (L7D)))는 Students two-tailed t-test로 측정하였으며, 스케일 바는 20μm이다.
도 3은 CRY2 기반 클러스터링 모듈의 특징을 비교한 것으로 (a)는 각각의 컨스트럭트를 발현하는 세포를 파란색 빛에 1초간 노출시킨 뒤 찍은 형광이미지 사진으로, 오른쪽 패널은 왼쪽 이미지의 노란색 선에 해당하는 kymograph로서, 노란색 화살표는 광 노출 지점을 의미하고, (b)는 CRY2olig 또는 CRY2clust를 발현하는 세포의 핵(위 패널) 및 세포질(아래 패널)에서의 클러스터 크기 분포를 측정한 결과이며, (c)는 결합시 및 분해시 기본 클러스터 비율에서 절반 까지 도달하는데 걸리는 시간(T1/2)를 측정한 것이고(n = 29, 35, 34 세포들), (d)는 OptoSTIM1 또는 OptoSTIM1 (CRY2clust)와 R-GECO1을 동시에 발현하는 세포의 형광 이미지로, 오른쪽 패널은 왼쪽 사진의 노란 선에 해당하는 부분의 kymograph이며, (e)는 각각의 컨스트럭트를 발현하는 세포에서 R-GECO1dl 광 조사 후, 절반의 형광을 나타낼 때까지 걸린 시간을 측정한 결과로서(n = 62, 75 cells). **P = 3.65x10-10는 Students two-tailed t-test로 측정하였고, (f)는 각각의 광 유전학적 Raf1 모듈을 발현하는 세포에 광 조사 후, ERK2/EGFP의 핵/세포질 비율을 측정한 평균값으로(n = 32, 48 세포들) 각 값들은 +- s.e.m.의 평균으로 표시하였으며, 스케일 바는 20 μm이다.
도 4는 서로 다른 종류의 형광 단백질을 융합하여 CRY2 클러스터링의 효율을 뛰어 넘음을 확인한 것으로, 각각의 형광 단백질과 융합된 CRY2 컨스트럭트를 발현하는 HeLa 세포들을 10분간 20초 간격으로 광 조사 후 형광 이미지를 측정하였고, 스케일바는 20μm이다.
도 5는 CRY2 클러스터링에 형광 단백질(FP)의 융합 사이트가 미치는 영향을 확인한 것으로, (a)는 CRY2PHR N-말단 또는 C-말단에 연결된 각각의 형광 단백질을 발현하는 HeLa 세포의 형광 이미지로서, 푸른색 빛을 5분간 20초 간격으로 광 조사 후, 측정하였고, 스케일 바는 20μm이며, (b)는 클러스터를 함유하는 세포의 클러스터 비율을 정량화 한 것으로, 전체 클러스터 세기(IC)를 세포의 전체 형광 세기(IW)로 나눈 값을 계산하였고, 계산값은 +- s.e.m.의 평균으로 표시하였으며, **P = 0.0009; ***P = 5.89 x 10.16 (mCitrine), 1.58 x 10.24 (Ypet)는 Students two-tailed t-test로 측정하였다.
도 6은 CRY2PHR의 N-말단 또는 C-말단에 펩타이드가 융합되었을 때, CRY2PHR의 클러스터링에 미치는 효과를 확인한 것으로, mCherry 표지된 CRY2PHR에 9개 아미노산 잔기의 펩타이드를 CRY2PHR N-말단 또는 C-말단에 연결한 컨스트럭를 발현하는 HeLa 세포에 푸른색 빛을 20초 간격으로 5분간 조사한 다음, 형광 이미지를 측정하였으며, 스케일 바는 50μm이다.
도 7은 C-말단이 순차적으로 삭제된 CRY2clust 변이체의 광 유도 클러스터링을 확인한 것으로 (a)는 CRY2clust의 C-말단 서열을 표시한 것으로, 9개의 아미노산 잔기는 파란색 박스로 표시하였고, (b)는 C-말단이 순차적으로 결실되고, mCherry로 표지된 CRY2clust 변이체들을 발현하는 HeLa 세포에, 20초 간격으로 10분간 광 조사 후, 측정한 형광이미지로, 스케일바는 20μm이며, (c)는 광 유도 CRY2 클러스터링을 유도하는데 있어서, CRY2clust C-말단의 7 내지 9개 아미노산이 중요하다는 것을 나타내는 클러스터 비율 정량화 결과로서, Ic는 전체 클러스트의 세기를 의미하고, IW는 전체 세포의 세기를 의미하며, 값들은 +- s.e.m.의 평균으로 표시하였고, ****P = 1.48 x 10-91; NS는 Students two-tailed t-test 결과 중요하지 않음을 나타낸다.
도 8은 어두운 상태에서 CRY2PHR 또는 CRYclust의 호모-올리고머라이제이션 정도를 측정한 것으로, (a)는 람파마이신 및 광을 조사하였을 대의 세포막(PM) 또는 미토콘드리아(Mito)에 존재하는 CRY2PHR 변이체의 위치를 측정하는 방법을 나타낸 개략도이고, (b)는 람파마이신 및 광 조사하기 전과 후에 Lyn-FRB, FKBP-mIFPCRY2PHR 변이체 (CRY2PHR and CRY2clust) 및 mCherry-CRYPHR 변이체를 동시에 발현하는 HeLa 세포의 총 내부반사 형광 현미경(TIRFM) 이미지로서, 스케일 바는 50μm이며, (c)는 람파마이신 및 광 조사 전과 후의 CRY2PHR의 미토콘드리아 위치의 형광이미지이고, (d)는 람파마이신 및 광 조사 전과 후의 CRY2clust의 미토콘드리아 위치의 형광이미지이다.
도 9는 광 유도 CRY2 클러스터링에 있어서, CRY2clust의 C-말단 7qjsWo 위치의 Leu 아미노산 잔기의 소수성의 중용성을 확인한 것으로, (a)는 CRY2clust 변이체의 푸른색 광 조사에 따른 클러스터링을 측정한 형광이미지로, mCherry로 표지된 각각의 CRY2clust 변이체를 20초 간격으로 10분간 푸른색 광을 조사한 다음 측정한 것으로, 스케일 바는 50μm이며, (b)의 회색 박스는 CRY2clust 변이체의 클러스터 비율을 통합적으로 나타낸 것이고, 파란색 선은 샘플의 소수성 정도를 나타낸 것으로서, Ic는 전체 클러스터 세기를 나타내고, IWsms 전체 세포의 세기를 나타내며, 값들은 +- s.e.m.의 평균으로 표시하였고, **P = 1.69 x 10-6 (L7A); ***P = 2.78 x 10-14 (L7N), 3.87 x 10-20 (L7Q); ****P = 3.84 x 10-118 (L7K), 8.37 x 10-121 (L7D); NS는 Students two-tailed t-test에 의해 중요하지 않음을 의미한다.
도 10은 CRY2PHR 도메인 C-말단에 있는 CRY2 내부 서열에 의해 CRY2의 광 유도 클러스터링이 증가함을 확인한 것으로, (a)는 애기장대 유래 CRY2 단백질의 아미노산 서열을 나타낸 것으로 PHR 도메인(녹색 박스) 및 CCE(Cryptochrome C-terminal Extension) 도메인을 나타내고 있고, (b)는 야생형 CRY2 단백질 C-말단의 PHR 도메인을 순차적으로 확장한 CRY2 변이체를 발현하는 HeLa 세포에 푸른색 광을 20초 간격으로 10분간 조사한 다음, 형성되는 클러스터를 측정한 형광 이미지로 스케일 바는 50μm이며, (c)는 PHR 도메인 C-말단의 9개 아미노산 잔기의 확장이 CRY2 클러스터링을 향상시킨다는 것을 확인한 결과로서, Ic는 전체 클러스터의 세기, IW는 전체 세포의 세기를 나타내고, 값들은 +- s.e.m.으로 표시하였으며, **P = 3.08 x 10-8는 Students two-tailed t-test로 측정한 값을 의미한다.
도 11은 광 유도 CRY2 클러스터링에 있어서 507번째 위치의 Phe가 가지는 소수성의 중요성을 확인한 결과로서, (a)는 mCherry 표지된 CRY2[1-507] 변이체를 발현하는 HeLa 세포에 푸른색 광을 20초 간격으로 10분간 조사한 다음 CRY2 [1-507] 변이체의 클러스터링을 확인한 형광 이미지로, 스케일 바는 50μm이며, (b)의 회색 박스는 CRY2[1-507] 변이체의 클러스터 비율을 통합적으로 나타낸 것이고, 파란색 선은 샘플의 소수성 정도를 나타낸 것으로서, Ic는 전체 클러스터 세기를 나타내고, IWsms 전체 세포의 세기를 나타내며, 값들은 +- s.e.m.의 평균으로 표시하였고, ***P = 1.95 x 10-16 (F507L); ****P = 3.87 x 10-30 (F507W), 5.18 x 10-37 (F507A), 4.06 x 10-25 (F507T), 4.2 x 10-37 (F507H), 5.95 x 10-38 (F507D); NS는 Students two-tailed t-test에 의해 중요하지 않음을 의미한다.
도 12는 광 자극에 따른 CRY2olig 및 CRY2clust 클러스터의 핵 이동 패턴을 측정한 결과로서, (a)는 mCherry-CRY2olig 또는 mCherry-CRY2clust를 발현하는 플라스미드를 가지는 HeLa 세포에 1초간 푸른색 광을 조사한 다음 핵에서 생성되는 클러스터의 분포를 확인한 형광 이미지로, 파란색 화살표는 광 조사 시점을 의미하고, (b)는 핵 내 존재하는 각각의 CRY2 클러스터링 모듈의 클러스터 패턴을 구조 조명 현미경(Structured illumination microscopy, SIM)으로 관찰한 이미지이며, (c)는 각각의 CRY2 클러스터링 모듈과 EGFP-SC35의 코-로컬라이제이션 분석을 수행한 결과를 나타낸 것으로, 값들은 +- s.e.m.의 평균으로 표시하였고, ***P = 7.53x10-16는 Students two-tailed t-test로 측정한 값을 의미하며, 스케일 바는 (a)는 10μm, (b)는 5μm 및 (b 내부 사각형)은 1 μm를 의미한다.
도 13은 T1/2과 CRY2olig 및 CRY2clust의 발현 레벨과의 상관관계를 분석한 것으로, 각각의 CRY2 클러스터링 모듈을 포함하는 세포가 세포가 최대 클러스터 비율의 절반에 도달하기 까지 걸리는 시간(T1/2)를 각 모듈의 mCherry 형광 세기(a.u.)에 따라 측정하여 스캐터 그래프로 나타냈으며, 비록 CRY2olig 및 CRY2clust(삽입 그래프)의 클러스터링 동력학이 발현 레벨에 의존적이지만, CRY2clust는 낮은 농도에서도 CRY2olig에 비하여 클러스터 형성 동력학이 훨씬 빠른 것을 확인할 수 있다.
도 14는 CRY2 클러스터 모듈들의 발현 레벨과 클러스터 효율의 상관관계를 분석한 것으로, 각각의 mCherry 표지된 CRY2 클러스터링 모듈들의 mCherry 형광 세기(a.u.)을 측정하여 각 세포의 클러스터 비율을 스캐터 그래프로 나타냈으며, 점선은 추세선을 나타내고, 모든 CRY2 클러스터링 모듈들에서 클러스터 효율은 발현 레벨과 양의 상관관계가 있는 것으로 나타났으며, Ic는 전체 클러스터 세기를, IW는 전체 세포의 세기를 의미한다.
도 15는 다른 레이저 세기에서 CRY2olig 및 CRYclust의 광 민감성을 비교한 결과로, (a)는 mCherry-CRY2olig 또는 mCherry-CRY2clust를 발현하는 HeLa 세포에 서로 다른 세기의 488nm 레이저를 조사한 후, 클러스터 형성을 측정한 형광 이미지로, 스케일 바는 20μm이며, (b)는 (a)에 개시된 레이저 세기에 따른 클러스터 비율을 정량화한 것으로, Ic는 전체 클러스터 세기를 IW는 전체 세포의 세기를 의미하며, 값들은 +- s.e.m의 평균값으로 표시하였고, *P = 0.003 (90 μW mm-2), 0.01 (210 μW mm-2)는 students two-tailed t-test에서 측정한 값이다.
도 16은 CRY2 클러스터링을 향상시키는데 있어서 표적 단백질의 융합 사이트의 효과를 확인한 것으로, mCherry-CRY2clust 또는 CRY2clust-mCherry 발현 플라스미드가 감염된 HeLa 세포에 푸른색 광을 20초 간격으로 5분간 조사한 다음, 측정한 형광 이미지이며, 스케일 바는 20μm이다.
도 17은 서로 다른 CRY2 클러스터링 모듈들에 적용된 OptoSTIM1 변이체들의 칼슘 이온 주입의 효율 및 동역학을 측정한 결과로서, (a)는 오리지널 OptoSTIM1에 의한 R-GECO1 형광 세기의 변화를 나타내는 시간 경과 그래프이며, (b)는 OptoSTIM1(CRY2clust)에 의한 R-GECO1 형광 세기의 변화를 나타내는 시간 경과 그래프로서, 회색 선은 각각의 개별 세포의 변화를 나타내고, 빨간 선은 R-GECO1의 형광 세기의 평균 값을 나타낸다.
도 18은 CRY2clust를 적용하여 광 유전학적 Raf1 신호전달 경로 활성화의 향상을 확인한 것으로, (a)는 ERK KTR-융합Red와 mCerulean 표지된 Raf1-CRY2PHR 또는 Raf1-CRY2clust를 동시에 발현하는 HeLa 세포의 ERK KTR 센서의 전이를 표준화하여 정량화한 것으로, 세포질에서의 ERK KTR 형광 세기를 핵에서의 ERK KTR 형광 세기로 나누어 계산하였고, 파란색 선은 광 조사 시점을 의미하며, 회색 선은 각 세포들의 전이 동력학을 의미하고, 빨간색 선은 평균 전이 동력학을 의미하며, (b)는 기본 ERK KTR의 세포질/세포내 비율을 나타내는 그래프로, 회색 원은 Raf1-CRY2PHR을 의미하고, 노란색 박스는 Raf1-CRY2clust를 의미하며, 검은색 선은 +- s.e.m의 평균을 나타낸다.
도 19는 어두운 상태에서 CRY2PHR 변이체들의 호모-상호작용을 분석한 결과로, (a)는 어두운 상태에서 세포내 환경에서의 CRY2PHR 변이체들의 호모-결합을 분석한 InCell SMART-i 어세이 결과이며, (b)는 각각의 FKBP 융합 컨스트럭트와 FRB-FT를 발현하는 HeLa 세포의 형광 이미지로, 스케일 바는 20μm이다.

광 유도 CRY2 클러스터링의 효율에 FT 태그의 4차구조가 미치는 영향

선행문헌에 광 유도 CRY2 클러스터링은 CRY2에 융합하는 표적 단백질에 영향을 받는다는 것이 개시되어 있으므로, 본 발명자들은 CRY2에 융합하는 단백질의 올리고머 상태가 CRY2 클러스터링에 중요한 인자인지를 확인하고자 하였다(도 1a). CRY2 클러스터링의 효율과 태깅 단백질의 4차 구조와의 연관성을 조직적으로 분석하기 위하여, 본 발명자들은 구조적으로 잘 정의된 FPs를 사용하였으며(Shaner, N.C., et al., Nat Methods, Vol. 2, pp. 905-909, 2005), 상기 FPs는 동일한 백본 구조를 가지지만 올리고머 상태는 다른 특징을 나타낸다(도 1a). 14개의 FP 후보(도 1a)를 CRY2의 광 라이에이지 유사 지역(CRY2PHR, a.a. 1-498)에 융합시켰다. 어두운 상태에서는 대부분의 CRY2PHR-융합 FPs는 세포질에 분포하는 것을 확인하였다. 광 조사후, 이합체 형태의 EYFP 및 Ypet 단백질 및 삼합체 형태의 DsRed가 융합된 CRY2PHR 단백질은 획기적은 클러스터 형성을 나타내는 것을 확인하였다(Shaner, N.C., et al., Nat Methods, Vol. 2, pp. 905-909, 2005; Strack, R.L. et al. Nat Methods, Vol. 5, pp. 955-957, 2008; 도 1b, 도 4). 서로 다른 FPs가 융합된 CRY2PHR의 클러스터 효율을 비교하기 위하여 클러스터된 세포의 퍼센트(도 1c) 및 클러스터 비율(도 1d)을 분석하였다. 그 결과, EYFP, Ypet 및 DsRed가 다른 FPs가 태그된 융합 단백질 보다 뛰어난 클러스터 비율을 나타내는 것을 확인하였다. 전반적으로 상기 결과는 클러스터링 효율과 융합되는 FP의 다원성의 정도가 양의 상관관계가 있음을 의미하지만, 본 발명자들은 단위체 형태의 mCitrine이 융합된 CRY2PHR 역시 광 유도 호모-올리고머라이제이션을 수행한다는 것을 확인하였다. 대부분의 FPs의 올리고머 상태가 in vitor 조건(Shaner, N.C., et al., Nat Methods, Vol. 2, pp. 905-909, 2005)에서 특정되었고, 어떤 FPs는 생리학적 조건에서 단위체 형태를 나타낸 다는 점이 보고된 바 있으므로(Zacharias, D.A. et al., Science, Vol. 296, pp. 913-916, 2002; Costantini, L.M. et al., Traffic, Vol. 13, pp. 643-649, 2012), 상기 결과는 어떤 FPs는 세포 내부 환경에서는 다른 4차 구조를 가지는 가능성을 포함하고 있다.

또한, 본 발명자들은 CRY2PHR 클러스터링에 있어서 FP가 융합하는 사이트의 효과를 확인하였다. 흥미롭게도, N-말단, C-말단 어디를 연결하든 높은 클러스터링 효율을 나타내는 DsRed를 제외하고는, CRY2의 C-말단에 FP를 연결할 경우(CRY2PHR-FPs), CRY2의 N-말단에 연결하는 경우(FPs-CRY2PHR)보다 높은 클러스터링 효율을 나타내는 것을 확인하였다(도 5). 이는 CRY2에 결합하는 태그의 4차 구조뿐만 아니라 다른 추가적인 요소가 CRY2 클러스터링의 효율에 영향을 미친다는 것을 의미한다.

짧은 펩타이드의 융합에 의한 우수한 CRY2 클러스터링

다양한 FPs와 융합한 CRY2PHR을 제작하는 과정에서, 매우 짧은 펩타이드(9 개의 잔기)가 대체로 광 유도 CRY2 클러스터링을 향상시킨다는 것을 발견하였다(도 2a). 본 발명자들의 실험 조건하에서, mCherry-CRY2PHR은 클러스터를 거의 형성하지 않았지만(도 1, 도 2c; 도 3 및 도 4), CRY2PHR의 C-말단에 9개 잔기를 확장한 CRY2clust의 경우, 푸른색 광을 조사하자 마자 획기적으로 빠른(1초 안에) 클러스터 형성을 나타내는 것을 확인하였다(도 2b,c).

CRY2clust의 클러스터링 향상을 나타내는 펩타이드의 중요 결정요인을 찾기 위하여, 본 발명자들은 먼저 CRY2PHR의 펩타이드 융합 사이트의 효과를 확인하고자 하였다. FP 융합 결과와 유사하게, CRY2PHR의 C-말단에 펩타이드를 융합할 경우에만 빠른 클러스터링 효과가 나타나는 것을 확인하였다(도 6). 또한, CRY2clust의 C-말단의 길이에 대한 효과를 확인하기 위하여 각 말단을 순차적으로 결실시킨 변이체를 HeLA 세포에서 발현시켰다. 어두운 상태에서 클러스터 형성을 나타내는 변이체는 없었으며, 광 조사 후, CRY2clust(Δ8-9) 및 (Δ9) 변이체가 대부분의 세포에서 CRY2clust와 유사한 빠른 클러스터링을 나타내는 것을 확인하였다(도 7). 이는 향상된 CRY2 클러스터링 효율을 위해서는 앞선 7개의 아미노산 잔기가 필수적이라는 것을 의미한다.

올리고머릭 FPs에 대한 클러스터링 향상 결과에 따라, 본 발명자들은 어두운 상태에서 CRY2의 다가성에 CRY2clust가 영향을 미치는지 확인하고자 하였다. 이를 위해 본 발명자들은 CRY2PHR 및 CRY2clust와 같은 CRY2PHR 변이체들을 세포막(PM) 또는 미토콘드리아(Mito)에서 람파마이신 및 광 조사시 같이 이동하는 지를 확인하였다(도 8a). 어두운 상태에서 람파마이신을 처리할 경우, FKBP-FRB의 이합체 형성은 FKBP가 융합된 CRY2PHR 변이체를 PM 또는 Mito로 이동시키고, CRY2PHR 변이체가 호모-올리고머라이제션을 수행할 경우, FKBP-융합된 CRY2PHR 변이체와 함께 이동할 것으로 예상하였다. 그 결과, 본 발명자들은 mCherry-CRY2PHR 변이체의 동시 이동을 거의 관찰하지 못했으나, 광 자극이 가해질 경우, mCherry-CRY2PHR 변이체가 PM 또는 Mito에 획기적으로 축적되는 것을 확인하였다. 특히, 광 의존성 CRY2clust의 PM에서의 축적은 CRY2PHR 보다 훨씬 효과가 높은 것을 확인하였으며, 이는 CRY2clust의 뛰어난 클러스터링 효과와 일치한다(도 8). 따라서, 상기 결과는 CRY2clust가 어두운 상태의 세포 내 환경에서 다합체의 가능성은 거의 없다는 것을 의미한다.

CRY2 클러스터링의 향상에 있어서 처음 7개의 아미노산이 필요하다는 결과가 있기 때문에, 클러스터링 효율의 향상을 유도하는 CRY2clust의 기작을 탐구하기 위하여, 본 발명자들은 CRY2clust C-말단의 7번째 위치에 있는 아미노산 류이신(Leu)의 성질이 CRY2 클러스터링에 영향을 미치는지 확인하고자 하였다. 본 발명자들은 상기 아미노산을 다른 종류의 아미노산으로 치환하였다: 소수성 아이소류이신(L7I) 및 알라닌(L7A), 극성이 없는 아스파라긴(L7N) 및 글루타민(L7Q), 염기성의 라이신(L7K) 및 산성의 아스파르트산(L7D)(도 2a). 소수성 잔기로 치환되었을 경우(L7I, L7A), CRY2 클러스터링 효율에는 아무런 영향이 없었다. 이에 반해, 류이신을 극성이 없는 아미노산(L7N, L7Q) 및 극성 잔기(L7K, L7D)로 치환했을 경우에는 클러스터링 형성이 급격하게 감소하는 것을 확인하였다(도 2d,e; 도 9). 흥미롭게도, 7번째 아미노산의 소수성 정도(imley, W.C. et al., Nat Struct Biol, Vol. 3, pp. 842-848, 1996)가 클러스터링 효율과 높은 연관성이 있음을 확인하였다(도 9b). 순차적인 결실 변이체 분석의 결과에 따라(도 7 및 9), 본 발명자들은 CRY2clust C-말단의 7번째 아미노산의 소수성이 CRY2 클러스터링의 뛰어남을 결정하는데 중요한 결정 요소임을 확인하였다.

클러스터링에 대한 CRY2의 내재 C-말단의 가려진 역할 확인

CRY2는 두 개의 도메인으로 구성된 것으로 알려져 있으나(PHR 및 CCE(cryptochrome C-terminal extension) 도메인, 도 10a), CRY2를 이용한 대부분의 광 유전학적 연구에서는 PHR 도메인이 그 자신과 이루는 호모-상호작용만이 이용되어왔다. 하지만 전체 길이의 CRY2 역시 푸른색 광에 반응하여 식물에서 핵 내 바디를 형성하여 클러스터를 만드는 것으로 알려져 있다(Yu, X. et al., Plant Cell, Vol. 21, pp. 118-130, 2009; Mas, P. et al., Nature, Vol. 408, pp. 207-211, 2000). CRY2 클러스터링 효율이 CRY2PHR의 C-말단을 펩타이드로 확장시킬 경우 증가하기 때문에 본 발명자들은 CRY2PHR의 C-말단을 야생형 CRY2 서열로 확장했을 경우에도 CRY2 클러스터링 효과를 비슷하게 낼 수 있는 지 확인하고자 하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 CRY2PHR을 순차적으로 아미노산을 추가하고, mCherry로 표지하여 확장하였다. 놀랍게도, PHR 지역 C-말단에 9개의 아미노산이 확장된 단 하나의 변이체 mCherry-CRY2 [1-507] 만이 광 유도 CRY2 클러스터링의 효율을 증가시키는 것을 확인하였다(도 2d,e; 도 10 b,c).

CRY2 클러스터링에 있어서 CRY2clust의 소수성이 중요한 요소인 것이 밝혀졌으므로, 본 발명자들은 CRY2의 507번째 위치에 존재하는 페닐알라닌(Phe)의 방향족 소수성 성질이 필수적인 요소일 것으로 예상하였다. 이를 실험하기 위하여 다른 방향족 소수성의 트립토판(F507W) 및 타이로신(F507Y), 지방족 소수성의 류이신(F507L) 및 알라닌(F507A), 전하가 없는 극성의 트레오닌(F507T) 및 전하를 가지는 히스티딘(F507H) 및 아스파르트산(F507D)로 각각 치환하였다(도 11). 다른 치환기와는 달리 다른 방향족 소수성 잔기(F507Y 또는 F507W)로 치환한 경우에는 야생형 CRY2 [1-507]보다 심지어 뛰어난 CRY2 클러스터링 효율을 나타내는 것을 확인하였다. 특히, 히스티딘은 방향족 고리를 가지지만 소수성은 적은데, 히스티딘으로 치환할 경우(F507H)에는 광 유도 CRY2 클러스터링 활성이 저해되어 CRY2 클러스터링을 향상시키는데 있어서 소수성이 중요함을 나타내었다. CRY2clust 특성평과와 유사하게, 507번재 위치에 존재하는 아미노산의 소수성이 클러스터 형성의 양과 높은 연관이 있다는 것을 확인하였다. 결론적으로 본 발명자들은 CRY2clust와 CRY2 [1-507]은 CRY2 클러스터링에 있어서 동일한 기작을 가질 가능성이 높다고 분석하였다.

CRY2 기반 클러스터링 시스템의 특성 비교

본 발명에 앞서, CRY2 클러스터링 향상에 관한 두 가지의 광 유전학적 시스템이 공개되었다: 세포막-결합 CRY2PHR(Che, D.L. et al., ACS Synth Biol, Vol. 4, pp. 1124-1135, 2015) 및 E490G 변이를 가지는 CRY2olig(Taslimi, A. et al., Nat Commun, Vol. 5, pp. 4925, 2014)이다. 세포막 결합형 CRY2PHR의 경우, CRY2PHR의 막 이동이 CRY2의 높은 지역적 농도를 유도하게 하여 클러스터 형성을 촉진한다. 하지만, 세포질 내 CRY2PHR의 낮은 클러스터링 효과는 이 시스템의 장벽으로 남아있다. 세포질 내 CRY2 클러스터링의 동역학을 연구하기 위하여, 본 발명자들은 기존의 CRY2olig와 CRY2PHR의 세포질 내 클러스터링 성능을 본 발명 조건에서 확인하고자 하였다. 각 CRY2 클러스터링 시스템이 도입된 HeLa 세포에 푸른색 빛을 1초간 조사하였다. mCherry 표지된 야생형 CRY2PHR을 제외한 모든 CRY2 클러스터링 시스템은 핵과 세포질 내에서 높은 광-유도 클러스터링을 나타내었으며 형성된 클러스터는 광이 사라질 경우 분해되는 것을 확인하였다(도 3a). 세포질과 핵에서 형성된 CRY2clust의 클러스트는 그 크기가 비슷한 반면, CRY2olig에 의해 형성된 클러스터는 기존에 공지된 바와 같이 핵 내의 특정 위치에서 집중적으로 축적되는 것을 확인하였다(도 3b; 도 12a, Taslimi, A. et al., Nat Commun, Vol. 5, pp. 4925, 2014). CRY2olig의 핵에서의 클러스터 패턴은 다른 인자보다 pre-mRNA 스플라이싱 인자가 농축되는 핵 스페클과 유사하였다(Lamond, A.I. et al., Nat Rev Mol Cell Biol , Vol. 4, pp. 605-612, 2003; Spector, D.L., Cell, Vol. 127, pp. 1071, 2006).핵에 위치하는 CRY2 클러스터가 핵 스페클과 함께 이동하는 지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 핵 스플라이싱 마커인 EGFP 표지된 SC35 스플라이싱 팩터를 mCherry 표지된 CRY2olig 또는 CRY2clust와 함께 발현시켰다. 구조 조명 현미경(Structured illumination microscopy, SIM)을 이용한 결과, CRY2clust와 비교하여 CRY2olig 클러스트는 EGFP-SC35와 함께 이동한다는 것을 확인할 수 있었다(도 12b,c; Fu, X.D. et al., Nature Vol. 343, pp. 437-441, 1990).

다음으로, 본 발명자들은 CRY2 클러스터링 도구들의 클러스터 조립 및 분해 동역학(kinetics)를 비교하였다. 그 결과, CRY2clust가 다른 도구에 비해 빠른 동역학을 나타내는 것을 확인하였다(도 3a,c; 도 12a). 기존에 공지된 바와 같이, CRY2 클러스터의 조립 효율 및 동역학은 모든 CRY2 클러스터링 모듈에서 그것의 세포 내 농도와 연관이 있다(Taslimi, A. et al., Nat Commun, Vol. 5, pp. 4925, 2014). 흥미롭게도, CRY2clust의 클러스터링은 그것의 세포내 농도와는 상관없이, 심지어는 발현 레벨이 낮은 상태에서도 빠르고 효과적으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다(도 13, 도 14). 이는 광 자극에 대한 CRY2clust의 높은 민감성 때문이다(도 15).

CRY2clust 적용을 통한 CRY2 기반 광 유전학적 시스템 개선

CRY2clust가 다양하게 응용되기 위해서는 표적 결합 사이트인 CRY2clust의 N-말단 또는 C-말단의 mCherry 중 어느 하나로 한정되는 것은 바람직하지 않다. mCherry가 어느 사이트에 결합되더라도 CRY2clust의 클러스터링 능력은 저해되지 않았기 때문에(도 16), 다양한 표적 단백질의 기능조절을 위해 CRY2clust를 이용할 수 있다. 예를 들어, Ca²⁺ 조절용 광 유전학적 시스템인 OptoSTIM1의 CRY2PHR의 C-말단을 OptoSTIM1(CRY2clust)로 확장하여 HeLa 세포에서 발현시켰다(Kyung, T. et al., Nat Biotechnol, Vol. 33, pp. 1092-1096, 2015). 푸른색 광을 조사할 경우, CRY2PHR 변이체(CRY2PHR 및 CRY2clust)를 포함하는 OptoSTIM1 단백질들이 붉은색 형광의 Ca²⁺ 센서인 R-GECO1 형광을 빠르게 유도하는 것을 확인하였다(도 3d; 도 17; Zhao, Y. et al., Science, Vol. 333, pp. 1888-1891, 2011). CRY2clust의 빠른 클러스터링 동역학과 일치하게, OptoSTIM1(CRY2clust)는 오리지널 OptoSTIM1보다 두 배 더 빠르게 세포내 Ca²⁺ 레벨의 변화를 유도하는 것을 확인하였다(도 3d,e; 도 17). 여기서, 표적 단백질은 R-GECO1 이며, 융합단백질은 STIM1-CRY2clust이다. 응용성을 더 확인하기 위하여 본 발명자들은 단백질 인산화 효소의 활성을 조절하는 광 유전학 시스템인 Raf1-CRY2PHR에 CRY2clust를 적용하였다(Wend, S. et al., ACS Synth Biol, Vol. 3, pp. 280-285, 2014). mCherry 표지된 Raf1-CRY2PHR 또는 Raf1-CRY2clust를 ERK2-EGFP와 함께 HeLa 세포에서 발현시켰다. 광 조사시 ERK2가 세포질에서 핵으로 이동하여 Raf1 신호전달 경로가 양 시스템에서 작동하는 것을 확인하였다. 여기서 표적 단백질은 ERK2이며, 융합 단백질은 Raf1-CRY2clust이다. OptoSTIM1 케이스와 마찬가지로, Cry2clust를 적용한 Raf1 시스템이 오리지널보다 더 빠른 ERK2의 전이를 유도하는 것을 확인하였다(도 3f). 이러한 현상은 FusionRed-ERK KTR 센서에 적용했을 때, Raf1-CRY2clust의 더욱 빠른 비활성화 동력학을 통해 추가적으로 확인할 수 있었다(도 18a; Regot, S. et al., Cell, Vol. 157, pp. 1724-1734, 2014). 참고로, Raf1-CRY2PHR 및 Raf1-CRY2clust의 기본 ERK 활성화 레벨에서는 아무런 차이가 없었으며(도 18b), 이는 CRY2clust가 어두운 상태에서의 CRY2PHR의 호모 결합 정도를 변화시키지 않는다는 것과 일치하는 결과이다. 따라서, 이러한 결과는 CRY2clust가 일반적으로 다양한 신호전달 이벤트를 높은 시간적 해상도로 조절하면서 기본적인 활성에는 영향을 주지 않는다는 것을 의미한다.

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SEQUENCE LISTING <110> INSTITUTE FOR BASIC SCIENCE <120> Optogenetic protein clustering through fluorescent protein tagging and extension of CRY2 <130> P17-B132 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 498 <212> PRT <213> CRY2PHR [1-498] <400> 1 Met Lys Met Asp Lys Lys Thr Ile Val Trp Phe Arg Arg Asp Leu Arg 1 5 10 15 Ile Glu Asp Asn Pro Ala Leu Ala Ala Ala Ala His Glu Gly Ser Val 20 25 30 Phe Pro Val Phe Ile Trp Cys Pro Glu Glu Glu Gly Gln Phe Tyr Pro 35 40 45 Gly Arg Ala Ser Arg Trp Trp Met Lys Gln Ser Leu Ala His Leu Ser 50 55 60 Gln Ser Leu Lys Ala Leu Gly Ser Asp Leu Thr Leu Ile Lys Thr His 65 70 75 80 Asn Thr Ile Ser Ala Ile Leu Asp Cys Ile Arg Val Thr Gly Ala Thr 85 90 95 Lys Val Val Phe Asn His Leu Tyr Asp Pro Val Ser Leu Val Arg Asp 100 105 110 His Thr Val Lys Glu Lys Leu Val Glu Arg Gly Ile Ser Val Gln Ser 115 120 125 Tyr Asn Gly Asp Leu Leu Tyr Glu Pro Trp Glu Ile Tyr Cys Glu Lys 130 135 140 Gly Lys Pro Phe Thr Ser Phe Asn Ser Tyr Trp Lys Lys Cys Leu Asp 145 150 155 160 Met Ser Ile Glu Ser Val Met Leu Pro Pro Pro Trp Arg Leu Met Pro 165 170 175 Ile Thr Ala Ala Ala Glu Ala Ile Trp Ala Cys Ser Ile Glu Glu Leu 180 185 190 Gly Leu Glu Asn Glu Ala Glu Lys Pro Ser Asn Ala Leu Leu Thr Arg 195 200 205 Ala Trp Ser Pro Gly Trp Ser Asn Ala Asp Lys Leu Leu Asn Glu Phe 210 215 220 Ile Glu Lys Gln Leu Ile Asp Tyr Ala Lys Asn Ser Lys Lys Val Val 225 230 235 240 Gly Asn Ser Thr Ser Leu Leu Ser Pro Tyr Leu His Phe Gly Glu Ile 245 250 255 Ser Val Arg His Val Phe Gln Cys Ala Arg Met Lys Gln Ile Ile Trp 260 265 270 Ala Arg Asp Lys Asn Ser Glu Gly Glu Glu Ser Ala Asp Leu Phe Leu 275 280 285 Arg Gly Ile Gly Leu Arg Glu Tyr Ser Arg Tyr Ile Cys Phe Asn Phe 290 295 300 Pro Phe Thr His Glu Gln Ser Leu Leu Ser His Leu Arg Phe Phe Pro 305 310 315 320 Trp Asp Ala Asp Val Asp Lys Phe Lys Ala Trp Arg Gln Gly Arg Thr 325 330 335 Gly Tyr Pro Leu Val Asp Ala Gly Met Arg Glu Leu Trp Ala Thr Gly 340 345 350 Trp Met His Asn Arg Ile Arg Val Ile Val Ser Ser Phe Ala Val Lys 355 360 365 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Ser Ile Pro Asp Gly His Glu Leu Asp Arg Leu Asp Asn Pro 405 410 415 Ala Leu Gln Gly Ala Lys Tyr Asp Pro Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln 420 425 430 Trp Leu Pro Glu Leu Ala Arg Leu Pro Thr Glu Trp Ile His His Pro 435 440 445 Trp Asp Ala Pro Leu Thr Val Leu Lys Ala Ser Gly Val Glu Leu Gly 450 455 460 Thr Asn Tyr Ala Lys Pro Ile Val Asp Ile Asp Thr Ala Arg Glu Leu 465 470 475 480 Leu Ala Lys Ala Ile Ser Arg Thr Arg Glu Ala Gln Ile Met Ile Gly 485 490 495 Ala Ala Ala Arg Asp Pro Pro Asp Lys Asp Asn 500 505 <210> 6 <211> 507 <212> PRT <213> CRY2clust(L7D) <400> 6 Met Lys Met Asp Lys Lys Thr Ile Val Trp Phe Arg Arg Asp Leu Arg 1 5 10 15 Ile Glu Asp Asn Pro Ala Leu Ala Ala Ala Ala His Glu Gly Ser Val 20 25 30 Phe Pro Val Phe Ile Trp Cys Pro Glu Glu Glu Gly Gln Phe Tyr Pro 35 40 45 Gly Arg Ala Ser Arg Trp Trp Met Lys Gln Ser Leu Ala His Leu Ser 50 55 60 Gln Ser Leu Lys Ala Leu Gly Ser Asp Leu Thr Leu Ile Lys Thr His 65 70 75 80 Asn Thr Ile Ser Ala Ile Leu Asp Cys Ile Arg Val Thr Gly Ala Thr 85 90 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Claims (6)

1. 서열번호 2 내지 서열번호 7 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 CRY2 변이체.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. a) 제1항의 CRY2 변이체의 N-말단 또는 C-말단에 표적 단백질을 결합한 융합 단백질을 발현시키는 단계; 및
   b) 푸른색 광을 조사하는 단계;
   를 포함하는 표적 단백질의 광 유전학적 활성 조절 방법.
   
6. 제1항의 CRY2 변이체의 N-말단 또는 C-말단에 표적 단백질이 결합된 융합 단백질을 포함하는 표적 단백질의 광 유전학적 활성 조절용 키트.

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