KR20210038580A - 새로운 결합 특이성을 항체에 부여하는 초범용법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 목적은, 펩티드 서열을 항체에 삽입함으로써, 항체에 다른 결합 활성을 부여하기 위한, 효율적 또한 범용적인 방법을 제공하는 것이다. 본 발명은 항체의 Fc 영역에, 당해 항체가 인식하는 제1 표적 분자와는 다른 제2 표적 분자에 대한 결합능을 갖는 환상 펩티드의 내부 펩티드 서열을 삽입함으로써, 항체에 제2 표적 분자에 대한 결합능을 부여하는 방법을 제공한다.

Description

새로운 결합 특이성을 항체에 부여하는 초범용법

본 발명은 새로운 결합 특이성을 항체에 부여하는 초범용법 등에 관한 것이다.

항체의 기능은, 본질적으로 표적 분자로서, 단 하나의 항원 분자에 특이적으로 결합하는 것이다. 단백질 공학적 방법에 의해 얻어지는 개변형 항체로서, 2개 이상의 다른 항원 분자를 인식하는 항체(다중 특이성 항체: MsAb)가 있다.

MsAb는, 1개의 항체가 2개 이상의 표적 분자에 동시에 결합하므로, 암 세포와 림프구와 같은 이종 세포끼리를 가교하여 항암 작용을 발휘하는 의약으로서 이용할 수 있다. 또한, 항체 고유의 제1 결합 특이성을 갖는 항체에, 제2 결합 특이성을 부여함으로써, MsAb를 원하는 조직이나 세포에 집적시키는 것도 가능하다.

게다가, 예를 들어 면역 체크 포인트 저해 항체와 아포토시스 유도 항체로, 본래라면 2개의 항체를 병용해야 하는 경우에도, MsAb를 사용함으로써, 2개의 항체의 투여를 1개의 항체의 투여로 대체하는 것이 가능하여, 비용을 저감하는 효과도 기대할 수 있다.

이와 같이, MsAb는 항체 의약의 개발에 있어서 매우 중요시되고 있다.

MsAb로서, 2개의 항원 인식 Fab 영역을 다른 항체 유래의 것으로 조합하는 형태의 이중 특이성 항체(BsAb)에 대하여, Fab 영역 이외의 장소에 제2 결합 특이성을 매립함으로써 IgG형 BsAb를 창생한 것이 Fcab라고 불리는 기술이다(비특허문헌 1).

Fcab에 있어서, 2개의 Fab 영역은 본래의 항체 상태 그대로이기 때문에, 항체가 본래 갖는 제1 결합 특이성에 관해서는, 야생형 IgG 항체와 마찬가지로 2가의 결합이 보증된다.

Fcab에 있어서, 제2 결합 특이성은, Fc 영역의 특정 루프 구조를 랜덤화하고, 그 중에서 표적 분자에 대한 친화성을 획득한 것을 선택한다고 하는 방법으로 얻어지고 있다. 이 경우, 본래의 IgG 항체에 비하여 Fc 영역 내의 복수의 영역에서 합계 30잔기 이하 정도의 아미노산 변이를 갖게 되는데, 제2 결합 특이성은 Fab 영역과는 독립적인 Fc 영역에 부여되기 때문에, 일단 결합 특이성을 갖는 Fc 서열을 입수할 수 있다면, 그것을 복수의 항체(의 Fab)와 조합함으로써 다양한 BsAb를 창성할 수 있을 가능성이 있다.

그러나, 랜덤화 루프 라이브러리로부터의 특이적인 결합제의 선택은 일반적으로 성공 확률이 매우 낮아, 방대한 시행 착오를 필요로 하며, 나아가 대부분의 경우, 약한 결합제 서열을 바탕으로 인공 분자 진화 등에 의해 단계를 거쳐 실용 레벨에 견디는 친화성 결합제를 탐색한다고 하는 공정이 필요하게 된다. 또한, 이와 같이 하여 IgG 항체에 부여할 수 있는 새로운 결합 특이성은 일반적으로 하나이다. 따라서, 제3, 제4 결합 특이성 부여를 실현한 예는 없다.

BsAb의 제조를 목적으로 하는 것은 아니지만, 일반적으로 체내에서의 안정성이 낮은 생리 활성 펩티드에 대하여, 체내 수명을 연장시키는 등의 목적으로 항체의 Fc 영역을 이용하는 기술도 개시되어 있다.

예를 들어, 표적 단백질에 대하여 특이적인 결합 펩티드를 안정화하는 방법으로서, 특허문헌 1에는, 해당 펩티드가 천연 아미노산만으로 구성되어 있는 경우에는, Fc 영역의 말단에 부가하는 형태로 융합물로서 유전자 재조합에 의해 발현 생산하는 것이 개시되어 있다. 그러나, 당해 방법에서는, Fc 영역의 말단에 부가하기 때문에, 표적에 대한 높은 결합 친화성과 특이성을 담보하기 위한 펩티드 고유의 3차원 구조를 제어하는 것은 일반적으로 불가능하다.

또한, 특허문헌 2에서는, Fc 영역의 루프 구조에 펩티드를 삽입하는 기술이 개시되어 있다. 그러나, 펩티드의 삽입 부위로서 Fc 영역의 루프 구조상 많은 부위를 검증하였음에도 불구하고, 삽입된 펩티드가 충분한 활성을 유지하고 있었던 것은, 특정 1개소(L139/T140)에 삽입된 경우뿐이며, 다른 부위에 삽입된 경우에는, 융합 펩티드의 대장균에 있어서의 발현이나 표적 분자에 대한 결합 활성에 문제가 있음이 개시되어 있다(실시예 13, 표 12 내지 표 14). 또한, 그러한 한정된 Fc 영역의 루프 구조에 대하여, 어떠한 생리 활성 펩티드를 삽입하면 그 활성을 재현할 수 있을까에 관한 조건은 명시되어 있지 않아, 방대한 수가 존재하는 천연 및 비천연(인공적)의 표적 결합성 펩티드 중에서 높은 성공률로 MsAb의 창성에 이바지하는 것을 선택하기는 곤란하다.

국제 공개 제2001/083525호 국제 공개 제2006/036834호

Protein Eng Des Sel. 2010; 23(4): 289-297

상술한 바와 같이, 항체에 대하여 생리 활성 펩티드 등을 도입하는 기술은 알려져 있기는 하지만, 항체에 다른 결합 특이성을 부여할 수 있는 효율적 또한 범용적인 방법은 존재하고 있지 않은 것이 현 상황이다.

그래서, 본 발명은 상기 종래 기술이 갖는 문제를 감안하여 이루어진 것이며, 그 목적은, 펩티드 서열을 항체에 삽입함으로써, 항체에 다른 결합 활성을 부여하기 위한, 효율적 또한 범용적인 방법을 제공하는 데 있다. 또한, 본 발명은 당해 방법에 의해 얻어지는 개변형 항체를 제공하는 것도 목적으로 한다.

본 발명자들이 예의 검토한 결과, 펩티드 서열로서, 환상 펩티드의 내부 서열을 사용함으로써, 상기 과제를 해결할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 이하와 같다.

(1)

항체의 Fc 영역에, 당해 항체가 인식하는 제1 표적 분자와는 다른 제2 표적 분자에 대한 결합능을 갖는 환상 펩티드의 내부 펩티드 서열을 삽입함으로써, 항체에 제2 표적 분자에 대한 결합능을 부여하는 방법.

(2)

항체의 Fc 영역이 인간, 마우스, 래트, 토끼, 말 또는 개 유래인, (1)에 기재된 방법.

(3)

내부 펩티드 서열을 삽입하는 부위가 Fc 영역에 있어서의 분자 표면에 노출되어 있는 루프 부분인, (1) 또는 (2)에 기재된 방법.

(4)

환상 펩티드가 디스플레이형 탐색 시스템에 의해 얻어지는 환상 펩티드인, (1) 내지 (3) 중 어느 것에 기재된 방법.

(5)

항체의 Fc 영역에, 해당 항체가 인식하는 제1 표적 분자와는 다른 제2 표적 분자에 대한 결합능을 갖는 환상 펩티드의 내부 펩티드 서열이 삽입된, 제1 및 제2 표적 분자에 대한 결합능을 갖는 개변형 항체.

(6)

제1 및 제2 표적 분자에 대하여 동시에 결합하는, (5)에 기재된 개변형 항체.

(7)

제1 및 제2 표적 분자가 각각 다른 세포 표면 분자이며, 2개의 다른 세포 표면 분자와의 결합을 통하여 이종 세포끼리의 접착을 유도하는, (5) 또는 (6)에 기재된 개변형 항체.

본 발명에 따르면, 환상 펩티드의 내부 서열을, 항체에 삽입하는 펩티드 서열로서 사용하여 항체에 삽입함으로써, 항체에 다른 결합 활성을 자유롭게 부여할 수 있다.

도 1은 실시예에서 사용한 환상 펩티드의 구조를 도시한다. 환상 펩티드를 나타내는 일반식에 있어서, S는 Cys의 티올기로부터 유래하는 황 원자를 의미한다. Xaa는 임의의 아미노산을 나타내고, s는 임의의 0 이상의 정수이다. Variable region(가변 영역)은 1문자 표기에 의해, 환상 펩티드의 내부 구조를 구성하는 아미노산 서열을 나타내고, 소문자로 나타낸 아미노산(w, y 등)은 각각, D체의 아미노산(D-Trp, D-Tyr)을 나타낸다. 서열 번호: 1 내지 5는, Variable region(가변 영역)으로서 나타내는 아미노산 서열 중, D체의 아미노산을 제외한 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2는 인간 IgG 유래 Fc 영역의 입체 구조를 도시한다(PDB ID:1FC1). Fc 영역을 구성하는 한쪽의 중쇄를 표면 모델로(안측), 다른 쪽의 중쇄를 리본 모델로 나타낸다(전방측). 새로운 특성을 부여할 수 있는 표재성 루프 구조는 리본 모델로 나타낸 중쇄에 있어서, 9개소의 흑색 Cα구로서 나타낸다.
도 3은 인간 IgG1의 힌지 영역 및 Fc 영역의 아미노산 서열을 도시한다(서열 번호: 6). 새로운 특이성을 부여할 수 있는 루프 구조는 흑색 배경으로 나타낸다. 아미노산 번호는 코티아(Chothia) 등의 번호 부여를 사용하였다. 밑줄을 그은 부분은, IgG 분자 중에서 Fc 영역과 Fab 영역을 잇는 힌지 영역을 나타낸다.
도 4는 Expi293F 세포로부터 발현ㆍ분비시킨 항 뉴로필린 1 항체(N1 IgG) 및 그의 환상 펩티드(플렉신 B1 결합 펩티드 mP6-9) 삽입 개변형 항체의 SDS-PAGE를 도시한다. 예를 들어, mP6-9_T1이라는 기재는, 도 2에 있어서의 T1 사이트에, 도 1에 있어서의 환상 펩티드의 mP6-9를 삽입하고 있는 것을 나타낸다.
도 5는 항 뉴로필린 1 항체(N1 IgG) 및 그의 환상 펩티드(플렉신 B1 결합 펩티드 mP6-9) 삽입 개변형 항체의, 플렉신 B1 발현 세포에의 결합을 FACS로 평가한 결과를 도시한다. 펩티드 삽입 전의 야성형 N1 IgG의 결합 히스토그램을 회색으로, mP6-9 삽입 개변형 항체(삽입 사이트는 각 패널 상부에 표시)의 결합 히스토그램을 굵은 실선으로 나타낸다.
도 6은 Expi293F 세포로부터 발현ㆍ분비시킨 항 뉴로필린 1 항체(N1 IgG) 및 그의 B1 사이트에 여러 가지 환상 펩티드를 삽입한 개변형 항체의 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 7은 항 뉴로필린 1 항체(N1 IgG) 및 그의 B1 사이트에 여러 가지 환상 펩티드를 삽입한 개변형 항체의, 환상 펩티드에 대응하는 제2 표적 분자에의 결합을 FACS로 평가한 결과를 도시한다. 대조군 세포에의 결합 히스토그램을 회색으로, 제2 표적 분자(mP6-9에 대해서는 플렉신 B1, aMD5에 대해서는 Met, A6-2f에 대해서는 EGFR, trkD5에 대해서는 TrkB)를 발현하는 세포에의 결합 히스토그램을 굵은 실선으로 나타낸다.
도 8은 Expi293F 세포로부터 발현ㆍ분비시킨 항 뉴로필린 1 항체(N1 IgG) 및 그의 환상 펩티드 삽입 개변형 항체의 SDS-PAGE(A)와, FACS에 의한 그들 대응 표적 분자에의 결합 히스토그램(B)을 도시한다. 표적 분자에의 결합은, 항체 없음의 히스토그램(대조군)의 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity)에 대하여 10배 이상의 시그널이 얻어졌을 때를 양성(+)으로 하고, 그 이외를 음성(-)으로 하였다.
도 9는 Expi293F 세포로부터 발현ㆍ분비시킨 항 PD-L1 항체(Ave IgG) 및 그의 환상 펩티드 삽입 개변형 항체의 SDS-PAGE(A)와, FACS에 의한 그들 대응 표적 분자에의 결합 히스토그램(B)을 도시한다. 표적 분자에의 결합은, 항체 없음의 히스토그램(대조군)의 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity)에 대하여 10배 이상의 시그널이 얻어졌을 때를 양성(+)으로 하고, 그 이외를 음성(-)으로 하였다.
도 10은 Expi293F 세포로부터 발현ㆍ분비시킨 항 CD3 항체(OKT3 IgG) 및 그의 환상 펩티드 삽입 개변형 항체의 SDS-PAGE(A)와, FACS에 의한 그들 대응 표적 분자에의 결합 히스토그램(B)을 도시한다. 표적 분자에의 결합은, 항체 없음의 히스토그램(대조군)의 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity)에 대하여 10배 이상의 시그널이 얻어졌을 때를 양성(+)으로 하고, 그 이외를 음성(-)으로 하였다.
도 11은 Expi293F 세포로부터 발현ㆍ분비시킨 항 트란스페린 수용체 항체(8D3 IgG) 및 그의 환상 펩티드 삽입 개변형 항체의 SDS-PAGE(A)와, FACS에 의한 그들 대응 표적 분자에의 결합 히스토그램(B)을 도시한다. 표적 분자에의 결합은, 항체 없음의 히스토그램(대조군)의 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity)에 대하여 10배 이상의 시그널이 얻어졌을 때를 양성(+)으로 하고, 그 이외를 음성(-)으로 하였다.
도 12는 Expi293F 세포로부터 발현ㆍ분비시킨 항 뉴로필린 1 항체(N1 IgG) 및 그의 환상 펩티드 삽입 개변형 항체의 FACS에 의한 그들 대응 표적 분자에의 결합 히스토그램을 도시한다. 표적 분자에의 결합은, 그들 분자를 일과성 발현시킨 세포에의 결합의 양성률이 10％를 초과하는 것을 양성(+)으로 하고, 그 이외를 음성(?)으로 하였다.
도 13은 본 발명의 개변형 항체가 2종의 표적 분자를 동시에 결합하는 것을 나타내는 샌드위치 측정계 원리(A)와, 그의 데이터(B)를 도시한다. 사용한 오리지널 항체와 제1 표적 분자(항원)의 알칼리포스파타아제(AP) 융합 단백질의 조합을 그래프 상단에, 마이크로타이터 플레이트에 코팅한 환상 펩티드에 대한 제2 표적 분자는 그래프 하단에, 첨가한 항체 또는 Addbody명과, 얻어진 AP 기질의 발색도(A405)를 중단에 각각 나타낸다.
도 14는 CD3/Met 이중 특이성 항체(OKT3-Addbody)에 의한 이종 세포의 접착 유도 시험의 원리(A)와, 그의 데이터(B, C)를 도시한다. (B)에 도시하는 형광 현미경상에서는 플레이트 상에 접착한 Met 발현 세포(적색 형광 색소 Dil로 라벨)와 CD3 발현 Jurkat 세포(녹색 형광 색소 DiO로 라벨)가 이종 세포 접착을 하고 있는 부분을 흰색 동그라미로 나타내고, 그의 계측 결과(n=10)를 (C)에 도시한다.

본 발명을 발명을 실시하기 위한 형태에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하의 발명을 실시하기 위한 형태에 한정되는 것은 아니며, 여러 가지 변형하여 실시할 수 있다.

본 발명은 항체의 Fc 영역에, 당해 항체가 인식하는 제1 표적 분자(항원이라고도 이해됨)와는 다른 제2 표적 분자에 대한 결합능(결합 특이성이라고도 함)을 갖는 환상 펩티드의 내부 펩티드 서열을 삽입함으로써, 항체에 제2 표적 분자에 대한 결합능을 부여하는 방법이다.

본 발명의 방법에 따르면, 특정 표적 분자를 인식하는 임의의 항체에 대하여 새로운 결합 특이성을 부여하는 것이 가능하고, 얻어지는 개변형 항체는, 본래의 항체의 제1 표적 분자에 대한 결합능뿐만 아니라, 새롭게 부여한 환상 펩티드의 제2 표적 분자에 대한 결합능도 갖게 된다.

즉, 본 발명의 방법에 있어서는, 환상 펩티드의 내부 서열을, 항체에 삽입하는 펩티드 서열로서 사용하여 항체에 삽입함으로써, 항체에 다른 결합 활성을 자유롭게 부여할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 있어서는, 표적 분자에 대하여 결합능을 갖는 것이 알려진 환상 펩티드를 자유롭게 선택할 수 있다.

본 발명에 있어서 사용되는 환상 펩티드로서는, 표적 분자에 대한 결합능을 갖는 것이 알려진 환상 펩티드라면, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 천연형의 환상 펩티드를 사용해도 되고, 비천연형의 환상 펩티드를 사용해도 된다.

여기서, 천연형의 환상 펩티드로서는, 천연에 존재하는 환상 펩티드나, 천연 아미노산에 의해 구성되는 환상 펩티드 등을 들 수 있으며, 비천연형의 환상 펩티드로서는, 비천연 아미노산을 사용하여 인공적으로 합성한 환상 펩티드 등을 들 수 있다.

천연형의 환상 펩티드를 단백질 상에 제시하는 경우에는, 아미노산 잔기끼리를 결합하는 어느 결합도, 분자 내 환상 구조를 형성하기 위한 화학 가교 구조로 할 수 있기 때문에, 어느 결합도 삽입하는 펩티드 서열로 하기 위해 분자 내 환상 구조(폐환 구조)를 절단하는 결합으로서 채용할 수도 있지만, 천연형 환상 펩티드에 있어서의 활성 부위라고 생각되는 영역을 보존하는 형태로, 항체에 환상 펩티드가 삽입된다.

본 발명에 있어서, 환상 펩티드는, 표적 분자에 대한 결합능을 갖지만, 당해 표적 분자는, 삽입되는 항체가 본래 갖는 결합능을 갖는 표적 분자와는 다르다.

본 발명에 있어서는, 항체의 표적 분자를 제1 표적 분자라고 하고, 환상 펩티드의 표적 분자를 제2 표적 분자라고 한다. 제1 표적 분자와 제2 표적 분자는 다르다.

또한, 2개 이상의 동종의 환상 펩티드를 사용할 수도 있지만, 2개 이상의 다른 환상 펩티드가 사용되는 경우, 제2 표적 분자에 대한 결합능을 갖는 환상 펩티드 이외의 환상 펩티드의 표적 분자로서, 제3 표적 분자, 제4 표적 분자, 혹은 제3 및 제4 표적 분자 이외의 표적 분자 등을 들 수 있다. 다른 환상 펩티드에 있어서는, 그들 환상 펩티드가 결합능을 갖는 표적 분자는 동일해도 되지만, 다른 것이 바람직하다.

환상 펩티드는, 4 이상의 아미노산 잔기에 의해 형성되는 환상 구조를 분자 내에 적어도 갖는 것을 의미한다. 4 이상의 아미노산 잔기에 의해 형성되는 환상 아미노산에 있어서의 환상 구조는, 직쇄상 펩티드에 있어서, 2 아미노산 이상 이격된 2개의 아미노산 잔기가 직접, 또는 링커 등을 통하여 결합함으로써 분자 내에 형성되는 폐환 구조이다.

2개의 아미노산 잔기가 2 아미노산 이상 이격되어 있는 것은, 2개의 아미노산 잔기 사이에 적어도 2개의 아미노산 잔기가 존재하고 있는 것과 동의이며, 2개의 아미노산 잔기는, 그 사이에 2개 이상의 아미노산을 통하여 결합하게 된다.

환상 구조에 있어서의 폐환 구조는 특별히 한정되지 않지만, 2개의 아미노산이 공유 결합함으로써 형성된다.

2개의 아미노산 사이의 공유 결합으로서는, 예를 들어 디술피드 결합, 펩티드 결합, 알킬 결합, 알케닐 결합, 에스테르 결합, 티오에스테르 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 포스포네이트에테르 결합, 아조 결합, C-S-C 결합, C-N-C 결합, C=N-C 결합, 아미드 결합, 락탐 가교, 카르바모일 결합, 요소 결합, 티오요소 결합, 아민 결합 및 티오아미드 결합 등을 들 수 있다.

2개의 아미노산이 아미노산의 주쇄에 있어서 결합하면, 펩티드 결합에 의해 폐환 구조가 형성되는데, 2개의 아미노산의 측쇄끼리, 측쇄와 주쇄의 결합 등에 의해, 2개의 아미노산 사이의 공유 결합은 형성되어도 된다.

환상 구조는, 직쇄상 펩티드의 N 말단과 C 말단의 아미노산의 결합에 한정되지 않으며, 말단의 아미노산과 말단 이외의 아미노산의 결합, 또는 말단 이외의 아미노산끼리의 결합에 의해 형성되어도 된다. 환상 구조를 형성하기 위해 결합하는 아미노산의 한쪽이 말단 아미노산이고, 다른 쪽이 비말단 아미노산인 경우, 환상 펩티드는, 환상 구조로부터의 쇄상의 분지쇄로서, 환상 구조에 직쇄의 펩티드가 꼬리와 같이 붙은 구조를 갖는다.

환상 구조를 형성하는 아미노산으로서는, 단백질성 아미노산에 추가하여, 인공의 아미노산 변이체나 유도체를 포함하며, 예를 들어 단백질성 L-아미노산, 아미노산의 특징인 당업계에서 공지된 특성을 갖는 화학적으로 합성된 화합물 등을 들 수 있다.

단백질성 아미노산(proteinogenic amino acids)은, 당업계에 주지된 3문자 표기에 의해 나타내면, Arg, His, Lys, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Cys, Gly, Pro, Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr 및 Val이다.

비단백질성 아미노산(non-proteinogenic amino acids)으로서는, 단백질성 아미노산 이외의 천연 또는 비천연의 아미노산을 의미한다.

비천연 아미노산으로서는, 예를 들어 주쇄의 구조가 천연형과 다른, α,α-2 치환 아미노산(α-메틸알라닌 등), N-알킬-α-아미노산, D-아미노산, β-아미노산, α-히드록시산이나, 측쇄의 구조가 천연형과 다른 아미노산(노르류신, 호모히스티딘 등), 측쇄에 여분의 메틸렌을 갖는 아미노산(「호모」아미노산, 호모페닐알라닌, 호모히스티딘 등) 및 측쇄 중의 카르복실산 관능기가 술폰산기로 치환되는 아미노산(시스테인산 등) 등을 들 수 있다. 비천연 아미노산의 구체예로서는, 국제 공개 제2015/030014호에 기재된 아미노산을 들 수 있다.

환상 구조를 형성하는 아미노산의 수는 4 이상이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 5 이상, 8 이상, 10 이상이어도 되고, 30 이하, 25 이하, 20 이하, 15 이하여도 된다.

환상 구조를 형성하는 아미노산의 수로서는, 4 이상 30 이하인 것이 바람직하고, 4 이상 30 이하의 범위 내에서, 환상 구조를 형성하는 아미노산의 수를 5 이상, 8 이상, 10 이상으로 해도 되고, 25 이하, 20 이하, 15 이하로 해도 된다.

환상 구조를 형성하는 아미노산의 수는, 8 이상 20 이하로 해도 되고, 10 이상 20 이하로 해도 되고, 10 이상 15 이하로 해도 된다.

본 발명에 있어서 사용되는 환상 펩티드는, 공지된 펩티드 합성 기술을 이용하여 제조할 수 있는 환상 펩티드이다.

환상 펩티드의 제조 방법으로서는, 예를 들어 액상법, 고상법, 액상법과 고상법을 조합한 하이브리드법 등의 화학 합성법, 유전자 재조합법, 무세포 번역계에 의한 번역 합성법 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 환상 펩티드는, 디스플레이형 탐색 시스템에 의해 얻어지는 환상 펩티드인 것이 바람직하다. 디스플레이형 탐색 시스템에 의해, 표적 분자에 대한 결합능을 갖는 환상 펩티드를 선택할 수 있다.

환상 펩티드는, 일반적인 mRNA 디스플레이법에 의해 제조되는 펩티드여도 되고, TRAP법이나 RaPID법과 같은 mRNA 디스플레이법으로 제조되는 펩티드여도 되며, 또한 파지디스플레이법에 의해 제조되는 펩티드여도 된다. 또한, 이들 변법에 있어서 제조되는 펩티드여도 된다.

환상 펩티드는, 분자 내 환상 구조를 형성하기 위한 화학 가교 구조로서, 예를 들어 티오에테르 결합 또는 디술피드 결합을 포함한다.

통상, RaPID법이나 TRAP법과 같은 mRNA 디스플레이법이나 파지디스플레이법에 의해 선택되는 환상 펩티드는, 티오에테르 결합 또는 디술피드 결합과 같은 분자 내 환상 구조를 형성하기 위한 화학 가교 구조 이외의 구조가 생리 활성을 갖는 활성점인 경우가 많다.

그렇게 되면, 환상 펩티드의 티오에테르 결합 또는 디술피드 결합을, 루프 구조를 갖는 단백질과의 결합으로 치환함으로써, 통상 RaPID법이나 TRAP법과 같은 mRNA 디스플레이법이나 파지디스플레이법에 의해 얻어지는 환상 펩티드의 높은 특이성과 친화성을, 원하는 단백질의 원하는 루프 구조 내에 부여할 수 있다. 또한. 특별히 한정되는 것은 아니지만, 티오에테르 결합 또는 디술피드 결합을 분자 내 환상 구조로서 갖는 환상 펩티드를 융합함으로써, 환상 펩티드를 범용성을 갖고 융합시킬 수 있다.

RaPID법에 있어서는, 예를 들어 하기 표 1에 나타내는 관능기 1을 갖는 아미노산과, 대응하는 관능기 2를 갖는 아미노산이 환상화된 환상 펩티드로 할 수 있다.

관능기 1과 2는 어느 쪽이 N 말단측에 와도 되며, N 말단과 C 말단에 배치해도 되고, 한쪽을 말단 아미노산, 다른 쪽을 비말단 아미노산으로 해도 되고, 양쪽을 비말단 아미노산으로 해도 된다.

식 중, X₁은 탈리기이며, 탈리기로서는, 예를 들어 Cl, Br 및 I 등의 할로겐 원자를 들 수 있고, Ar은 치환기를 가져도 되는 방향환이다.

파지디스플레이법에 있어서는, Cys끼리 결합하여 환상화된 환상 펩티드로 할 수 있기 때문에, 관능기 1로서의 -SH와 관능기 2로서의 HS-에 의한 디술피드 결합을 갖는 환상 펩티드로 할 수 있다.

(A-1)의 관능기를 갖는 아미노산으로서는, 예를 들어 클로로아세틸화된 아미노산을 사용할 수 있다. 클로로아세틸화 아미노산으로서는, N-클로로아세틸-L-알라닌, N-클로로아세틸-L-페닐알라닌, N-클로로아세틸-L-티로신, N-클로로아세틸-L-트립토판, N-3-(2-클로로아세트아미도)벤졸-L-페닐알라닌, N-3-(2-클로로아세트아미도)벤졸-L-티로신, N-3-(2-클로로아세트아미도)벤졸-L-트립토판, β-N-클로로아세틸-L-디아미노프로판산, γ-N-클로로아세틸-L-디아미노부티르산, σ-N-클로로아세틸-L-오르니틴, ε-N-클로로아세틸-L-리신 및 이들에 대응하는 D-아미노산 유도체 등을 들 수 있다.

(A-1)의 관능기를 갖는 아미노산으로서는, N-클로로아세틸-L-트립토판 및 N-클로로아세틸-L-티로신이 적합하게 사용되며, D체인 것이 보다 적합하다.

또한, 본 명세서에 있어서, L체인 것을 명시하여 기재하는 경우가 있는데, L체여도 되고, D체여도 되는 것을 의미하며, 또한 L체와 D체의 임의의 비율에서의 혼합물이어도 된다. L체 및 D체인 것을 명시하여 기재하고 있지 않은 경우에 대해서도, L체여도 되고, D체여도 되는 것을 의미하며, 또한 L체와 D체의 임의의 비율에서의 혼합물이어도 된다.

(A-2)의 관능기를 갖는 아미노산으로서는, 예를 들어 시스테인, 호모시스테인, 머캅토노르발린, 머캅토노르류신, 2-아미노-7-머캅토헵탄산 및 2-아미노-8-머캅토옥탄산 등을 들 수 있다.

(A-2)의 관능기를 갖는 아미노산으로서는 시스테인이 적합하게 사용된다.

(A-1)의 관능기를 갖는 아미노산과 (A-2)의 관능기를 갖는 아미노산에 의한 환상화 방법은, 예를 들어 Kawakami, T. et al., Nature Chemical Biology 5, 888-890(2009); Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472(2009); Sako, Y. et al., Journal of American Chemical Society 130, 7932-7934(2008); Goto, Y. et al., ACS Chemical Biology 3, 120-129(2008); Kawakami T. et al, Chemistry & Biology 15, 32-42(2008), 및 국제 공개 제2008/117833호 등에 기재된 방법을 들 수 있다.

(B-1)의 관능기를 갖는 아미노산으로서는, 예를 들어 프로파르길글리신, 호모프로파르길글리신, 2-아미노-6-헵틴산, 2-아미노-7-옥틴산 및 2-아미노-8-노닌산 등을 들 수 있다.

4-펜티노일화나 5-헥시노일화된 아미노산을 사용해도 된다.

4-펜티노일화 아미노산으로서는, 예를 들어 N-(4-펜테노일)-L-알라닌, N-(4-펜테노일)-L-페닐알라닌, N-(4-펜테노일)-L-티로신, N-(4-펜테노일)-L-트립토판, N-3-(4-펜티노일아미도)벤졸-L-페닐알라닌, N-3-(4-펜티노일아미도)벤졸-L-티로신, N-3-(4-펜티노일아미도)벤졸-L-트립토판, β-N-(4-펜테노일)-L-디아미노프로판산, γ-N-(4-펜테노일)-L-디아미노부티르산, σ-N-(4-펜테노일)-L-오르니틴, ε-N-(4-펜테노일)-L-리신 및 이들에 대응하는 D-아미노산 유도체 등을 들 수 있다.

5-헥시노일화 아미노산으로서는, 4-펜티노일화 아미노산으로서 예시한 화합물에 있어서, 4-펜티노일기가 5-헥시노일기로 치환된 아미노산을 들 수 있다.

(B-2)의 관능기를 갖는 아미노산으로서는, 예를 들어 아지도알라닌, 2-아미노-4-아지도부탄산, 아지도프토노르발린, 아지도노르류신, 2-아미노-7-아지도헵탄산 및 2-아미노-8-아지도옥탄산 등을 들 수 있다.

아지도아세틸화나 3-아지도펜타노일화된 아미노산을 사용할 수도 있다.

아지도아세틸화 아미노산으로서는, 예를 들어 N-아지도아세틸-L-알라닌, N-아지도아세틸-L-페닐알라닌, N-아지도아세틸-L-티로신, N-아지도아세틸-L-트립토판, N-3-(4-펜티노일아미도)벤졸-L-페닐알라닌, N-3-(4-펜티노일아미도)벤졸-L-티로신, N-3-(4-펜티노일아미도)벤졸-L-트립토판, β-N-아지도아세틸-L-디아미노프로판산, γ-N-아지도아세틸-L-디아미노부티르산, σ-N-아지도아세틸-L-오르니틴, ε-N-아지도아세틸-L-리신 및 이들에 대응하는 D-아미노산 유도체 등을 들 수 있다.

3-아지도펜타노일화 아미노산으로서는, 아지도아세틸화 아미노산으로서 예시한 화합물에 있어서, 아지도아세틸기가 3-아지도펜타노일기로 치환된 아미노산을 들 수 있다.

(B-1)의 관능기를 갖는 아미노산과 (B-2)의 관능기를 갖는 아미노산에 의한 환상화 방법은, 예를 들어 Sako, Y. et al., Journal of American Chemical Society 130, 7932-7934(2008), 및 국제 공개 제2008/117833호 등에 기재된 방법을 들 수 있다.

(C-1)의 관능기를 갖는 아미노산으로서는, 예를 들어 N-(4-아미노메틸-벤조일)-페닐알라닌(AMBF) 및 3-아미노메틸티로신 등을 들 수 있다.

(C-2)의 관능기를 갖는 아미노산으로서는, 예를 들어 5-히드록시트립토판(WOH) 등을 들 수 있다.

(C-1)의 관능기를 갖는 아미노산과 (C-2)의 관능기를 갖는 아미노산에 의한 환상화 방법은, 예를 들어 Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472(2009) 및 국제 공개 제2008/117833호에 기재된 방법 등을 들 수 있다.

(D-1)의 관능기를 갖는 아미노산으로서는, 예를 들어 2-아미노-6-클로로-헥신산, 2-아미노-7-클로로-헵틴산 및 2-아미노-8-클로로-옥틴산 등을 들 수 있다.

(D-2)의 관능기를 갖는 아미노산으로서는, 예를 들어 시스테인, 호모시스테인, 머캅토노르발린, 머캅토노르류신, 2-아미노-7-머캅토헵탄산 및 2-아미노-8-머캅토옥탄산 등을 들 수 있다.

(D-1)의 관능기를 갖는 아미노산과 (D-2)의 관능기를 갖는 아미노산에 의한 환상화 방법은, 예를 들어 국제 공개 제2012/074129호에 기재된 방법 등을 들 수 있다.

(E-1)의 아미노산으로서는, 예를 들어 N-3-클로로메틸벤조일-L-페닐알라닌, N-3-클로로메틸벤조일-L-티로신, N-3-클로로메틸벤조일-L-트립토판 및 이들에 대응하는 D-아미노산 유도체 등을 들 수 있다.

(E-2)의 아미노산으로서는, 예를 들어 시스테인, 호모시스테인, 머캅토노르발린, 머캅토노르류신, 2-아미노-7-머캅토헵탄산 및 2-아미노-8-머캅토옥탄산 등을 들 수 있다.

(E-1)의 관능기를 갖는 아미노산과 (E-2)의 관능기를 갖는 아미노산에 의한 환상화 방법은, 예를 들어 (A-1)과 (A-2)의 환상화 방법이나 (D-1)과 (D-2)의 환상화 방법을 참고로 하여 행할 수 있다.

환 형성 아미노산으로서는, (A-1)의 관능기를 갖는 아미노산과 (A-2)의 관능기를 갖는 아미노산의 조합이 바람직하고, 탈리기로 H가 치환된 N-아세틸트립토판과 시스테인의 조합이 보다 바람직하고, N-할로아세틸-D-티로신 또는 N-할로로아세틸-D-트립토판, 적합하게는 N-클로로아세틸-D-티로신 또는 N-클로로아세틸-D-트립토판과 시스테인(Cys)의 조합이 더욱 바람직하다.

본 발명에 있어서는, 디스플레이형 탐색 시스템에 의해 얻어지는 환상 펩티드라면, 소정의 표적 분자에 대하여 결합능을 갖는 환상 펩티드로서 사용할 수 있다.

환상 펩티드는, RaPID법이나 TRAP법과 같은 mRNA 디스플레이법이나 파지디스플레이법에 의해 제조되는 환상 펩티드인 것이 적합하다.

RaPID법이나 TRAP법과 같은 mRNA 디스플레이법이나 파지디스플레이법에 의해 적합하게 제조할 수 있는, 관능기 1 및 관능기 2에 의해 형성되는 환상 펩티드인 것이 적합하다.

본 발명에 있어서, 환상 펩티드가 표적 분자에 대하여 결합능을 갖는다는 것은, 환상 펩티드가 표적 분자에 결합할 수 있으면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 통상 항체가 그 표적 분자에 대하여 나타내는 것과 동등한 친화성값(K_D값으로 약 1μM 이하)을 갖는 것이 바람직하다.

또한, 환상 펩티드가, 표적 분자에 결합능을 가짐과 함께, 저해제나 활성화제로서 기능해도 되고, 아고니스트 활성이나 안타고니스트 활성을 가져도 된다.

환상 펩티드에 대응하는 제2 표적 분자에 대한 결합 활성으로서, 본 발명의 개변형 항체는, 본래의 환상 펩티드에 있어서의 제2 표적 분자에 대한 결합 활성의, 바람직하게는 10％ 이상을 갖지만, 예를 들어 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 99％ 이상, 100％ 이상 가져도 된다.

표적 분자로서는, 제1 표적 분자여도, 제2 표적 분자여도, 또한 그들 이외의 표적 분자여도, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 세포 표면의 분자, 예를 들어 세포 접착 수용체, 사이토카인 수용체, 성장 인자 수용체, 면역 수용체, 시그널 분자 수용체, G 단백질 공액형 수용체, 트란스페린 수용체, 트랜스포터, 채널 분자, 혹은 가용성 분자, 예를 들어 성장 인자, 사이토카인, 시그널 분자, 트란스페린, 혈액 응고 인자, 세포 외 매트릭스 단백질 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서 사용되는 환상 펩티드에 대하여, RaPID법에 의해 제조되는 환상 펩티드를 예로 들어, 이하에 설명한다.

본 발명에 있어서, RaPID법에 의해 제조되는 환상 펩티드로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 이하의 일반식으로 표시되는 환상 펩티드를 들 수 있다.

상기 일반식으로 표시되는 환상 펩티드는, 예시로 되지만, 표 1에 기재된 관능기 1 및 관능기 2로서 (A)인 경우의 구조를 갖는다.

여기서, 일반식에 있어서, S는 Cys의 티올기로부터 유래하는 황 원자를 의미한다. Xaa는 임의의 아미노산을 나타내고, s는 임의의 0 이상의 정수이다. Variable region(가변 영역)은, 환상 아미노산을 구성하는 Cys 이외의 아미노산 서열을 나타낸다. Variable region(가변 영역)의 N 말단의 아미노산은, 상기 (A-1)의 관능기를 갖는 아미노산인 것이 바람직하다.

Variable region(가변 영역)의 아미노산 서열은, RaPID법에 의해 제조되는 환상 펩티드에 있어서의 부분 아미노산 서열이며, 환상 펩티드를 구성하는 한, 임의의 아미노산 서열일 수 있다.

환상 펩티드(Cyclic Peptide로서, 「CP」라고 기재하는 경우가 있음)로서, 상기 일반식으로 표시되는 펩티드가 사용되는 경우에는, Variable region의 N 말단의 아미노산 잔기를 CP_N이라고 하고, Cys를 CP_C라고 한다.

CP_N이, 예를 들어 비단백질성 아미노산인 N-할로로아세틸-D-트립토판인 경우에는, 단백질성 아미노산인 L-트립토판으로 치환하고, 예를 들어 비단백질성 아미노산인 N-클로로아세틸-D-티로신인 경우에는, 단백질성 아미노산인 L-티로신으로 치환하여 환상 펩티드가 융합되는 것이 적합하다. 또한, CP_N을 단백질성 아미노산인 Cys로 치환해도 된다. CP_C가, 예를 들어 Cys인 경우에는, CP_C를 결실시켜 환상 펩티드가 융합되는 것이 적합하고, 또한 CP_C가 Cys인 경우에, CP_C인 Cys도 융합시키는 경우에는, CP_N을 Cys로 치환하여 융합하는 것도 바람직하다. 일반식으로 표시되는 환상 펩티드가 삽입되는 경우, 원한다면 D-아미노산은 L-아미노산으로 치환되기는 하지만, 환상 펩티드의 환상 구조를 구성하는 아미노산 서열의 부분 아미노산 서열로서, Variable region(가변 영역)의 아미노산 서열이 항체에 삽입되는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서는, Variable region(가변 영역)의 아미노산 서열의 일부가, 예를 들어 CP_N이 비단백질성 아미노산인 경우에, 단백질성 아미노산으로 치환되어 있는 경우도, Variable region(가변 영역)의 아미노산 서열이 항체에 삽입되어 있다고 이해된다. Variable region(가변 영역)과 CP_C인 Cys가 함께 융합되어 있어도 된다.

RaPID법이나 TRAP법과 같은 mRNA 디스플레이법이나 파지디스플레이법에 의해 적합하게 제조할 수 있는 환상 펩티드를 항체에 삽입하는 경우에는, 구체적으로는 이하와 같은 개변을 행하는 것도 적합하다.

(1) RaPID법이나 TRAP법과 같은 mRNA 디스플레이법이나 파지디스플레이법에 있어서의 분자 내 환상 구조를 형성하기 위한 화학 가교 구조에 관여하는 아미노산 잔기, 예를 들어 표 1에 기재된 관능기를 갖는 아미노산 잔기이며, 구체적으로는 (A-1) 내지 (E-2)로서 기재되는 아미노산을 각각 치환 또는 삭제하여, 환상 펩티드의 내부 아미노산 서열을 항체에 삽입해도 된다.

구체적으로는, RaPID법에 의한 환상 펩티드에 있어서는, 관능기 1을 갖는 아미노산 잔기를 단백질성 아미노산으로 치환하고, 관능기 2를 갖는 아미노산 잔기를 각각 결실시켜 항체에 삽입한다. 관능기 1을 갖는 아미노산 잔기로서, D-아미노산 등의 비ㆍBR>^ 단백질성 아미노산이 사용되는 경우가 있다.

파지디스플레이법에 의한 환상 펩티드에 있어서는, 화학 가교 구조인 S-S 결합을 구성하는 Cys 잔기를 삭제하여, 항체에 삽입해도 된다.

보다 구체적으로는, RaPID법에 있어서, 관능기 1로서 (A-1)의 구조가 채용되고 있는 경우, 일반적으로 (A-1)의 구조를 갖는 아미노산으로서는 ClAc-D-Trp나 ClAc-D-Tyr이 사용되고 있는 경우가 많지만, 항체에의 삽입 시에는, 해당 아미노산 잔기를 L-Trp나 L-Tyr로 치환하는 것이 바람직하다. 또한, ClAc-D-Trp나 ClAc-D-Tyr을 결실시켜도 된다.

또한, (A-2)의 구조를 갖는 아미노산으로서는 Cys가 사용되고 있는 경우가 많지만, 항체에의 삽입 시에는, 해당 Cys 잔기를 결실시켜도 된다.

(2) (1)에 있어서, 환상 펩티드는 갖지 않지만, Ser, Gly 및 Cys와 같은 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 환상 펩티드와 항체의 링커 서열로서 사용하여, 환상 펩티드 유래의 아미노산 잔기와, 항체 유래의 아미노산 잔기 사이에 삽입해도 된다.

(3) 분자 내 환상 구조를 형성하기 위한 화학 가교 구조에 관여하는 아미노산 잔기를 L-Cys로 변환하고, 환상 펩티드를 항체에 삽입한 개변형 항체에 있어서, 디술피드 결합에 의해 가교 구조를 형성시킴과 함께, Ser 및 Gly와 같은 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 환상 펩티드와 항체의 결합에 있어서의 링커 서열로서 사용하여, 환상 펩티드 유래의 아미노산 잔기와, 항체 유래의 아미노산 잔기 사이에 삽입해도 된다.

링커 서열을 구성하는 아미노산 잔기의 수는, 1 이상의 아미노산 잔기이면 되며, 아미노산 잔기의 수는 특별히 한정되는 것은 아니다.

환상 펩티드의 내부 펩티드 서열이란, 환상 펩티드를 구성하는 펩티드 서열로서, 적어도 표적 분자에 대한 결합능을 갖는 영역을 포함하고 있으면 특별히 한정되지 않는다.

환상 펩티드의 1차 서열을 CP_N-(Xaa1)m-CP_C인 것으로 하여, 이하에 설명한다.

환상 펩티드로서는, CP_N-(Xaa1)m-CP_C로서 표시되는 아미노산 잔기 중, CP_N과 CP_C가, 적합하게는 공유 결합하여 환상 구조를 형성한다.

또한, 1차 서열에 있어서, 환상 펩티드를 형성할 수 있는 한, Xaa1은 임의의 아미노산 잔기이고, m은 2 이상의 임의의 정수이다.

환상 펩티드는, 분자 내 환상 구조 이외에도 환상 구조로부터의 쇄상의 분지쇄를 가져도 된다.

환상 펩티드의 내부 펩티드 서열이란, CP_N-(Xaa1)m-CP_C의 1차 서열 그 자체여도 되고, CP_N-(Xaa1)m-CP_C에 있어서의 아미노산 잔기의 일부가 치환 또는 결실되어 있어도 되며, CP_N-(Xaa1)m이 일부가 결실된 아미노산으로서 예시된다.

또한, 환상 펩티드의 내부 펩티드 서열은, CP_N-(Xaa1)m-CP_C로서 표시되는 m+2의 아미노산 잔기 중, 적어도 m+2의 아미노산 잔기의 일부를 포함하고 있으면 되며, CP_N-(Xaa1)m1, (Xaa1)m1-CP_C, (Xaa1)m1을 환상 펩티드의 내부 펩티드 서열로서 사용할 수 있다.

여기서, m1은 m 이하의 정수이다.

환상 펩티드의 내부 펩티드 서열을 항체에 삽입하는 경우에는, 원한다면 링커 서열을 통하여 항체에 삽입되어도 된다.

환상 펩티드가, 내부 펩티드 서열에 비단백질성 아미노산을 포함하는 경우에는, 비단백질성 아미노산은 단백질성 아미노산으로 치환되어 있는 것이 바람직하며, CP_N 및/또는 CP_C가 Cys인 경우에는, CP_N 및/또는 CP_C를 결실시켜도 되고, CP_C가 Cys인 경우에는, CP_N은 Cys로 치환하여 환상 펩티드가 삽입되어 있어도 된다.

환상 펩티드의 내부 펩티드 서열을 항체에 삽입할 때, 환상 펩티드로부터 유래하는 아미노산은, CP_N으로 결합되어 있어도 되고, CP_N으로 링커 서열을 통하여 결합되어 있어도 되고, CP_N으로부터 임의의 수로 표시되는 번째의 Xaa1로 결합되어 있어도 되고, CP_N으로부터 임의의 수로 표시되는 번째의 Xaa1로 링커 서열을 통하여 결합되어 있어도 된다. 그 중에서도 CP_N이 비단백질성 아미노산인 경우에는, CP_N을 단백질성 아미노산으로 치환하고, 원한다면 링커 서열을 통하여 결합되어 있어도 된다.

또한, 환상 펩티드의 내부 펩티드 서열을 항체에 삽입할 때, 환상 펩티드로부터 유래하는 아미노산은, CP_C로 결합되어 있어도 되고, CP_C로 링커 서열을 통하여 결합되어 있어도 되고, CP_C로부터 임의의 수로 표시되는 번째의 Xaa1로 결합되어 있어도 되고, CP_C로부터 임의의 수로 표시되는 번째의 Xaa1로 링커 서열을 통하여 결합되어 있어도 된다. 그 중에서도 CP_C를 결실시켜, CP_C로부터 세어 1번째의 Xaa1로, 즉 CP_C와 결합하는 Xaa1로, 원한다면 링커 서열을 통하여 결합되어 있어도 된다.

본 발명에 있어서, 환상 펩티드의 내부 펩티드 서열이 삽입되는 항체로서는, 특별히 한정되는 것은 아니다.

항체는 면역 글로불린이라고도 불리며, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE의 5종류로 분류된다.

본 발명에 있어서, 환상 펩티드가 삽입되는 항체로서는 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE 중 어느 것이어도 되지만, IgG가 적합하게 사용된다.

IgG로서는 다수의 서브클래스가 알려져 있다. IgG의 서브클래스로서, 예를 들어 인간에서는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 4종류의 서브클래스가, 마우스에서는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3의 4종류가, 래트에서는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c의 4종류가 알려져 있지만, 어느 것이어도 된다.

항체는, 본질적으로 표적 분자로서, 단 하나의 항원 분자에 특이적으로 결합하기 때문에, 항체가 인식하는 항원이 본 발명에 있어서의 제1 표적 분자라고 할 수 있다.

항체는, 각각 항원을 인식하는 부위라고 할 수 있는 가변 영역과, 그 이외의 부분인 정상 영역을 갖는 중쇄와 경쇄를 2개씩 갖는다.

항체를 단백질 분해 효소인 파파인 소화하였을 때, H쇄-H쇄를 연결하는 디술피드 결합(힌지 부위)의 사이가 절단되고, 항체는 3개의 단편으로 나뉘어지며, N 말단측의 2개의 단편을 Fab 영역, C 말단측의 단편을 Fc 영역이라고 한다.

일반적으로 Fc 영역은, 동일한 서브클래스라면 항체 사이에서 그 구조가 동일하다.

본 발명에 있어서 사용되는 항체는, N 말단측의 2개의 단편인 Fab 영역을 적어도 1개와, Fc 영역을 포함한다. Fab 영역을 2개 포함하는 항체인 경우, 2개의 Fab 영역은 동일해도 되고, 달라도 되며, Fab 영역이 다른 경우, 항체가 인식하는 표적 분자는 동일해도 되고 달라도 된다.

Fab 영역이 다르고, 항체가 인식하는 표적 분자가 다른 경우, 항체의 표적 분자는, 제1 표적 분자로서 2종의 표적 분자(제1 표적 분자와 그것과 다른 표적 분자)에의 결합능을 유지하게 되는데, 환상 펩티드가 갖는 제2 표적 분자에의 결합능은, 제1 표적 분자에의 결합능과 다르지만, 제1 표적 분자와 다른 표적 분자에의 결합능이어도 되기는 하지만, 항체의 표적 분자로 되는 제1 표적 분자 및 그것과 다른 표적 분자에의 결합능과 다른 것이 바람직하다. 환상 펩티드가 제2 표적 분자 이외의 표적 분자에의 결합능을 갖고 있는 경우, 제3, 제4, 혹은 그들 이외의 표적 분자도 제1 표적 분자와 마찬가지로 항체가 인식하는 표적 분자와 달라도 된다.

본 발명에 있어서는, 환상 펩티드의 내부 펩티드 서열은 항체의 Fc 영역에 삽입된다.

본 발명에 있어서는, 환상 펩티드의 내부 펩티드 서열을 삽입하기 위해, 항체의 Fc 영역에 있어서의 삽입 부위가 특별히 한정되는 것은 아니지만, 항체가 제1 표적 분자에의 결합능을 유지한 채, 환상 펩티드의 제2 표적 분자에의 결합능을 부여하기 위해서는, Fc 영역에 있어서의 분자 표면에 노출되어 있는 루프 부분인 것이 적합하다.

루프 부분은, Fc 영역에 있어서, 2개의 β 스트랜드 사이를 연결하는 폴리펩티드쇄 영역이며, 절곡 구조를 갖고, 항체 분자 표면에 노출되어 있는 구조인 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서는, 항체에 환상 펩티드를 삽입할 때, 환상 펩티드로부터 유래하는 아미노산 잔기와 항체로부터 유래하는 아미노산 잔기의 결합은 공유 결합인 것이 바람직하다.

또한, 환상 펩티드로부터 유래하는 아미노산 잔기와, 항체로부터 유래하는 아미노산 잔기 사이에, 링커로 되는 펩티드쇄가 삽입되어 있어도 된다.

환상 펩티드의 내부 펩티드 서열이 삽입되는 루프 부분은, 항체의 Fc 영역에 있어서의 루프 구조에 있어서, 특별히 한정되는 것은 아니며, 범용성을 갖고 루프 구조 중의 임의의 부위를 선택해도 된다.

루프 구조에 있어서의 임의의 부위란, 환상 펩티드를 삽입하기 위한 2개의 아미노산 잔기가 루프 구조 내에서 선택되는 부위인 것을 의미한다.

특별히 한정되는 것은 아니지만, 도 2 및 도 3을 사용하여 설명한다.

도 2는, 인간 IgG 유래 Fc 영역의 입체 구조를 도시한다. Fc를 구성하는 한쪽의 중쇄를 표면 모델로(안측), 다른 한쪽을 리본 모델로 나타내고 있다(전방측).

본 발명에 있어서, 환상 펩티드의 삽입 부위로서, 적합하게 선택되는 루프 부분을 도 2에 있어서 도시하는데, T1 내지 T3, M1 내지 M3, B1 내지 B3으로서 나타내는 부분이 당해 부분이다.

도 3은, 인간 IgG1 유래 Fc 영역의 아미노산 서열을 도시하며, 환상 펩티드의 삽입 부위로서 적합하게 선택되는 루프 부분을 흑색 배경으로 나타내고 있다.

적합하게 선택되는 루프 부분은, 서열 번호: 7로 나타내는 인간 IgG1 유래 Fc 영역의

T1(SHEDP, 서열 번호: 8): 267 내지 271위치

T2(YNST, 서열 번호: 9): 296 내지 299위치

T3(NKALPAP, 서열 번호: 10): 325 내지 331위치

M1(VDGV, 서열 번호: 11): 279 내지 282위치

M2(KGQ, 서열 번호: 12): 340 내지 342위치

M3(SDGS, 서열 번호: 13): 400 내지 403위치

B1(TKNQ, 서열 번호: 14): 359 내지 362위치

B2(SNG, 서열 번호: 15): 383 내지 385위치

B3(QQGNV, 서열 번호: 16): 418 내지 422위치

를 적합하게 들 수 있다.

T1을 예로 들면, 267 내지 271위치는, 서열 번호: 6에 있어서는 47위치 내지 51위치에 상당하고, 서열 번호: 7에 있어서는 28위치 내지 32위치에 상당한다. 즉, T2 내지 T3, M1 내지 M3, B1 내지 B3으로서 나타내는 부분은, 서열 번호: 6에 있어서는 220 감소시킨 위치의 아미노산이 대응하고, 서열 번호: 7에 있어서는 239 감소시킨 위치의 아미노산이 대응한다.

또한, 환상 펩티드의 삽입 부위는, 아미노산 잔기의 위치에 의해 표시되는 루프 구조 내로부터 선택되는 부위여도 된다. T1을 예로 들면, 루프 구조 내로부터 선택되는 부위로서 267위치와 268위치, 268위치와 269위치, 269위치와 270위치, 270위치와 271위치, 267위치와 269위치, 268위치와 270위치, 269위치와 271위치, 267위치와 270위치, 268위치와 271위치, 267위치와 271위치가 선택될 수 있고, 이들 선택된 아미노산 잔기의 위치가 항체에 있어서의 환상 펩티드의 내부 아미노산 서열의 삽입 부위여도 된다.

인간 IgG1 이외의 항체에 있어서는, 서열 번호: 6 또는 서열 번호: 7로 나타내는 아미노산 서열과 얼라인먼트하여, T1 내지 T3, M1 내지 M3, B1 내지 B3으로서 나타내는 부분에 대응하는 부분을 환상 펩티드의 삽입 부위로 할 수 있다.

보다 적합하게는, 서열 번호: 7로 나타내는 인간 IgG1 유래 Fc 영역의 루프 부분에 있어서,

T1(SH*EDP): 267 내지 271위치

T2(Y*NST): 296 내지 299위치

T3(NKALP*AP): 325 내지 331위치

M1(VD*GV): 279 내지 282위치

M2(K*GQ): 340 내지 342위치

M3(SD*GS): 400 내지 403위치

B1(TK*NQ): 359 내지 362위치

B2(S*NG): 383 내지 385위치

B3(QQ*GNV): 418 내지 422위치

*표시를 붙인 아미노산 잔기 사이의 위치가 환상 펩티드를 삽입하는 데 보다 적합한 부위이다.

환상 펩티드의 내부 펩티드 서열이 삽입됨으로써 환상 펩티드로부터 유래하는 아미노산 잔기, 혹은 링커의 아미노산 잔기와 결합하는 항체의 루프 부분의 2개의 아미노산 잔기는, 루프 구조에 있어서 인접해 있어도 되고, 불연속이며, 항체의 Fc 영역에 있어서, 2개의 아미노산 잔기의 사이에 1 내지 15아미노산 잔기가 존재하는 관계에 있는 아미노산 잔기여도 된다.

본 발명에 있어서는 특별히 한정되지 않지만, 적합하게 삽입 부위로서 선택되는 루프 부분에 다른 환상 펩티드로부터 유래하는 내부 펩티드 서열을 삽입함으로써, 항체가 갖는 고유의 결합능에 추가하여, 환상 펩티드가 결합능을 갖는 제2, 제3, 제4, 제1 내지 제4 이외와 같은 표적 분자에 대한 결합 특이성을 부여할 수 있다.

다중 특이성 항체를 얻기 위해, 본래의 기존 항체는 어떠한 형태여도 되며, 제2 표적 분자에 대한 결합능이 알려져 있다면 환상 펩티드도 어떠한 환상 펩티드여도 된다.

사용하는 항체와, 삽입하는 환상 펩티드의 내부 펩티드 서열, 및 그의 삽입 부위는 어떠한 조합도 가능하기 때문에, 여러 가지 항원에 결합하는 항체 및 환상 펩티드를 준비해 두면, 원하는 다중 특이성을 가진 개변형 항체를 매우 간편하게 창생할 수 있다.

본 발명에 의해 얻어지는 다중 특이성 항체는, 단일 IgG 항체를 2종류 병용한 항체 의약과 동등한 효능을 갖는 것이나, 다른 세포 상의 표적 분자를 동시에 인식하여 이종 세포의 가교를 유도하는 것 등, 다양한 의약으로서 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서 사용되는 항체로서는, 특별히 한정되는 것은 아니며, 마우스 항체, 래트 항체, 토끼 항체, 말 항체, 개 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 완전 인간 항체 등을 들 수 있다.

환상 펩티드를 삽입하는 항체의 Fc 영역은 인간, 마우스, 래트, 토끼, 말 및 개 중 어느 유래인 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서의 항체의 Fc 영역에 대한 환상 펩티드의 내부 펩티드 서열의 삽입에 대하여, 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명에 있어서, 항체의 Fc 영역에 존재하는 환상 펩티드의 내부 펩티드 서열과 결합하는 2개의 아미노산 잔기 중, N 말단측에 위치하는 아미노산 잔기를 AB_N, C 말단측의 아미노산 잔기를 AB_C라고 하는 경우, 환상 펩티드가 삽입되는 내부 펩티드 서열은, AB_N과 결합되어 있어도 되고, AB_N과 링커 서열을 통하여 결합되어 있어도 된다.

또한, 환상 펩티드가 삽입되는 내부 펩티드 서열은, AB_C와 결합되어 있어도 되고, AB_C와 링커 서열을 통하여 결합되어 있어도 된다.

AB_N과 AB_C는, Fc 영역에 있어서 루프 구조로서 연속되어 있어도 되고, 불연속이어도 된다.

불연속인 경우, AB_N과 AB_C 사이에 1 내지 5아미노산 잔기를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서는, 환상 펩티드를 항체의 Fc 영역에 삽입하여, 항체에 삽입하는 환상 펩티드가 갖는 표적 분자에 대한 결합능을 부여하는데, 환상 펩티드를 항체의 Fc 영역에 삽입시키기 위해서는, 통상의 유전자 공학 기술을 이용하여 행할 수 있다.

본 발명에 있어서는, 환상 펩티드를 항체의 Fc 영역에 삽입시키는 방법과 함께, 환상 펩티드를, 항체의 Fc 영역에 삽입시켜 환상 펩티드의 내부 펩티드 서열이 삽입된 개변형 항체 및 그의 제조 방법도 제공한다.

본 발명에 있어서의 개변형 항체의 제조 방법은,

환상 펩티드로서, 삽입하는 항체가 인식하는 제1 표적 분자와는 다른 제2 표적 분자에 대한 결합능을 갖는 환상 펩티드를 선택하고, 적합하게는 디스플레이형 탐색 시스템에 의해 얻어지는 환상 펩티드를 선택하고,

선택한 환상 펩티드의 아미노산 서열로부터, 항체에 삽입하는 내부 아미노산 서열을 선택하고, 해당 내부 아미노산 서열에 상당하는 염기 서열을 선택하고,

항체의 Fc 영역에 있어서 내부 아미노산 서열을 삽입하는 2개의 아미노산 잔기를 선택하고,

항체의 Fc 영역의 아미노산 서열에 상당하는 염기 서열을 선택하고, 필요에 따라, 당해 2개의 아미노산 잔기 사이에 존재하는 아미노산 잔기에 상당하는 염기 서열을 삭제하고, 선택된 환상 펩티드의 내부 아미노산 서열에 상당하는 염기 서열을 삽입하여 도입한 염기 서열을 갖는 핵산을 준비하고,

해당 핵산을 번역하는, 개변형 항체의 제조 방법이다.

선택된 환상 펩티드의 내부 아미노산 서열에 상당하는 염기 서열을 삽입하여 도입한 염기 서열로 할 때, 링커에 상당하는 염기 서열을 삽입하여 도입해도 된다.

환상 펩티드로서는, RaPID법이나 TRAP법과 같은 mRNA 디스플레이법 또는 파지디스플레이법에 의해 선택되는 환상 펩티드를 사용하는 것이 바람직하고, mRNA 디스플레이법에 의한 것이 보다 바람직하며, mRNA 디스플레이법 등에 따르면, 환상 펩티드 중, 삽입해야 할 내부 아미노산 서열의 염기 서열을 용이하게 이해할 수 있다.

항체의 Fc 영역에 있어서의 환상 펩티드를 삽입하는 부위를 구성하는 2개의 아미노산 서열에 상당하는 염기 서열을 선택하고, 해당 선택된 염기 서열 사이에 존재하는 염기를 필요에 따라 삭제하는 방법이나, 선택된 환상 펩티드의 내부 아미노산 서열에 상당하는 염기 서열을 삽입하여 도입한 염기 서열(원한다면 링커에 상당하는 염기 서열도 포함함)을 갖는 핵산을 준비하는 방법은, 특별히 한정되는 것은 아니며, 종래 공지된 방법을 원용하여 실시할 수 있다.

또한, 준비된 핵산의 번역 방법은, 본 발명이 속하는 기술 분야에 있어서, 이미 주지의 사항이므로, 그들 주지의 방법을 적절하게 적용하여 핵산의 번역을 행하면 된다.

본 발명에 의해 얻어지는 개변형 항체는, 항체의 Fc 영역에, 해당 항체가 인식하는 제1 표적 분자와는 다른 제2 표적 분자에 대한 결합능을 갖는 환상 펩티드의 내부 펩티드 서열이 삽입된, 제1 및 제2 표적 분자에 대한 결합능을 갖는다.

제1 및 제2 표적 분자에 대하여 동시에 결합하는 것이 바람직하고, 제1 및 제2 표적 분자에 대하여 동시에 결합하며, 또한 제1 및 제2 표적 분자가, 각각 다른 세포 표면 분자인 경우에는, 본 발명의 개변형 항체는 2개의 다른 세포 표면 분자와의 결합을 통하여 이종 세포끼리의 접착을 유도하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서는, 예를 들어 암 세포의 항원을 제1 표적으로 하고, T 림프구나 NK 세포 상의 항원을 제2 표적으로 함으로써, 본 발명의 개변형 항체는, 암 세포에 대한 면역 공격을 유도하고, 암을 특이적 또한 효과적으로 상해, 죽일 수 있다. 또한, 예를 들어 치료용 항체를 뇌 내에 보내 주기 위해 혈액뇌관문을 통과시키기 위해, 뇌의 혈관에 발현하고 있는 분자(트란스페린 수용체 등)를 제2 표적으로 해도 된다.

본 발명은

(1) 원래의 기존 항체(제1 결합 특이성을 규정함)의 IgG형이나 항원 특이성을 선택하지 않고,

(2) 항체 자신의 부분 랜덤 서열 라이브러리를 바탕으로 한 선택 공정을 포함하지 않고,

(3) 최종 산물인 개변형 항체의 제조 공정과 효율이 원래의 야생형 항체와 동등하고,

(4) RaPID법 등에서 고친화성으로 결합하는 환상 펩티드가 얻어지는 대상인 한, 어떠한 단백질이라도 다중 특이성의 표적으로 하는 것이 가능하고, 또한

(5) 동시에 최대 9개의 독립된 추가 결합 특이성을 기존 항체에 부여할 수 있다고 하는 특성을 갖는다.

실시예

이하, 실시예를 나타내어 구체적으로 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

표적 단백질에 대한 고친화성의 환상 펩티드는, 국제 공개 제2011/049157호 및 일본 특허 공개 제2013-46637호 공보 등에 기초하여 RaPID 시스템을 실시함으로써 얻었다. 인간 유래의 수용체인 플렉신 B1, Met, EGF 수용체, 및 TrkB에 대하여 각각 특이적으로 결합하는 환상 펩티드를 사용하였다. 환상 펩티드의 구조를 도 1에 도시한다.

도 1에 있어서, 각각의 환상 펩티드 유래의 가변부 서열을 항체의 Fc 영역에 삽입하였다. 단, 아미노산 서열의 N 말단 아미노산으로서 w 및 y로 소문자로 나타내는 D-아미노산은, 각각 L-아미노산으로 치환하여 혹은 결실시켜 Fc 영역에 도입하였다. 삽입 시에는, 상기 가변부 서열을 사이에 끼우는 형태로 0 내지 4잔기의 링커 서열을 추가하였다.

[실시예 1] 뉴로필린 1 항체에 대한 플렉신 B1 결합 특이성의 부여

1. 펩티드 삽입의 디자인

표적 결합 활성을 유지한 채 환상 펩티드의 내부 서열을 항체의 Fc 영역에 제시하기 위해, 항체의 Fc 영역의 입체 구조를 참고로 삽입 부위를 탐색하였다. Fc 영역 중에서 분자 표면에 노출되고, 2차 구조 부분을 연결하는 루프 부분을 9개소 선택하였다. 선택한 루프 부분을 도 2에 도시한다. 선택한 루프는, Fc 영역의 힌지에 가까운 Top 부분으로부터 3개소(T1 내지 T3), Middle 부분으로부터 3개소(M1 내지 M3), 그리고 Bottom 부분으로부터 3개소(B1 내지 B3)이다. 그들 전체 Fc 아미노산 서열 상에서의 위치를 도 3에 도시한다.

2. 이중 특이성 항체의 조제

펩티드 삽입의 토대로 되는 항체는 뉴로필린 1에 대한 N1 항체(클론 별명 YW64.3)를 사용하였다(Liang et al. J. Mol. Biol. 2007). N1 항체의 중쇄 가변부를 인간 IgG1 중쇄 정상부를 코딩하는 DNA에 연결하고, 이것을 발현 벡터 p3XFLAG-CMV-14(시그마 알드리치사제)에 도입하였다. 경쇄에 대해서는 그 전체 길이를 코딩하는 DNA를 동일한 p3XFLAG-CMV-14 벡터에 도입하였다.

N1 중쇄 발현 벡터를 바탕으로, 도 3에 도시하는 Fc 영역 내의 9개의 루프 구조의 중앙 부근(*)에, mP6-9 펩티드 서열을 삽입한 발현 벡터를 제작하였다. 삽입 서열 부분은 extension PCR법을 사용하여 증폭하였다. 이와 같이 하여 얻어지는 펩티드 삽입형 항체는 각각 N1 IgG(mP6-9_T1)과 같이 「항체명(환상 펩티드명_ 삽입 사이트)」로 표기하기로 하였다.

Expi293F 세포(써모피셔 사이언티픽사제)를 3mL의 Expi293 Expression Medium(써모피셔 사이언티픽사제)을 사용하여, 세포가 3×10⁶cells/mL가 되도록 파종하였다. 그 후, 통상법에 따라, ExpiFectamine 293 Reagent(써모피셔 사이언티픽사제)를 사용하여, 1.5㎍씩의 항체 경쇄 및 항체 중쇄(혹은 그의 삽입체) 발현용 벡터를 Expi293F 세포에 유전자 도입하였다.

유전자 도입 후, 37℃, 8％ CO₂ 조건 하, 125rpm에서 세포를 18시간 진탕 배양하였다. 그 후, ExpiFectamime 293 Transfection Enhance er 1 및 ExpiFectamime 293 Transfection Enhancer 2(써모피셔 사이언티픽사제)를 각각 15μL, 150μL 첨가하고, 37℃, 8％ CO₂ 조건 하, 125rpm에서 3일간 진탕 배양하고, 배양 상청을 회수하였다.

회수한 배양 상청 0.3mL에 단백질 A-세파로오스(써모피셔 사이언티픽사제)를 30μL 첨가하고, 2시간 회전 혼화하였다. 원심 분리에 의해 세파로오스를 침전시켜 상청을 제거하고, 1mL의 트리스 완충 식염수(TBS, 20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH7.5)로 3회 세파로오스를 세정하고, SDS 샘플 버퍼 20μL를 첨가하여 95℃에서 2분간 가열하여 시료를 용출시켰다. 용출된 시료의 5μL를 환원 조건 하에서 전기 영동에 제공하고, 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하였다.

전기 영동의 결과를 도 4에 도시한다. 도 4에 있어서, 샘플 번호는 동그라미 숫자로 나타낸다. N1 IgG(샘플 번호 1)는 중쇄와 경쇄에 상당하는 밴드가 예상되는 분자량(50kDa 및 25kDa)의 위치에 밴드가 보이고, 모든 펩티드 삽입형 항체(샘플 번호 2 내지 10)의 중쇄는 그보다 약간 높은 분자량을 나타내며, 전체의 아미노산 길이로서 16 내지 17잔기 긴 것에 호응하고 있었다. 모두 펩티드 삽입이 없는 N1 IgG로 손색없는 양의 삽입형 항체가 Expi293F 세포로부터 발현ㆍ분비되고 있음이 확인되었다.

3. 뉴로필린 1 항체에 대한 플렉신 B1 결합능의 부여

Fc 상의 여러 위치에 mP6-9 펩티드를 삽입한 N1 IgG에 대하여, 환상의 mP6-9 펩티드가 갖고 있었던 플렉신 B1에 대한 결합능을 유지하고 있는지 여부를 조사하기 위해, 유동 세포 분석에 의한 결합 시험을 행하였다. N1 IgG 및 9종류의 mP6-9 펩티드 삽입체의 발현 상청을, 플렉신 B1 안정 발현 세포(Cell Chem. Biol, 2016, 23, 1341-1350에 기재)와 반응시켜, 결합한 IgG를 AlexaFluor488 표지 염소 항인간 IgG 2차 항체(ThermoFisher사제)로 염색하고, EC800형 유동 세포 분석기(SONY사제)로 분석하였다.

유동 세포 분석의 결과를 도 5에 도시한다. 미개변의 N1 항체는 플렉신 B1 안정 발현 세포에 대하여 백그라운드 레벨의 약간의 결합을 하는 것에 머물렀지만(패널 1, 도면에서는 동그라미 숫자로 나타냄), mP6-9를 삽입한 모든 N1 항체는 그의 1.5 내지 10배의 결합량을 나타내어, 이들 항체가 모두 뉴로필린 1에 더하여 새롭게 플렉신 B1에 대한 결합 특이성을 획득하였음이 나타났다.

[실시예 2] 뉴로필린 1 항체에 대한 여러 가지 결합 특이성의 부여

1. 펩티드 삽입의 디자인과 항체의 조제

펩티드 삽입 위치로서는 실시예 1에 나타낸 「B1 루프」를 채용하고, 여기에 도 1에 도시한 4종류의 환상 펩티드의 내부 서열을 실시예 1의 방법에 따라 삽입한 발현 벡터를 사용하여, 재조합 항체의 조제와 그의 발현 평가도 실시예 1과 마찬가지로 행하였다.

전기 영동의 결과를 도 6에 도시한다. 도 6에 있어서, 샘플 번호는 동그라미 숫자로 나타낸다. N1 IgG(샘플 번호 1)는 중쇄와 경쇄에 상당하는 밴드가 예상되는 분자량(50kDa 및 25kDa)의 위치에 밴드가 보이고, 모든 펩티드 삽입형 항체(샘플 번호 2 내지 10)에 있어서 중쇄는 N1 IgG(샘플 번호 1)의 그보다 약간 높은 분자량을 나타내고, 전체의 아미노산 길이로서 17 내지 21잔기 긴 것에 호응하고 있었다. 모두 펩티드 삽입이 없는 N1 IgG로 손색없는 양의 환 삽입형 항체가 Expi293F 세포로부터 발현ㆍ분비되고 있음이 확인되었다.

2. 뉴로필린 1 항체에 대한 여러 가지 결합능의 부여

여러 가지 펩티드를 삽입한 N1 IgG에 대하여, 각각의 환상 펩티드가 갖고 있던 분자 결합능을 유지하고 있는지 여부를 조사하기 위해, 유동 세포 분석에 의한 결합 시험을 행하였다. N1 IgG의 4종류의 펩티드 삽입체의 발현 상청을, 대조군의 HEK293 세포(mock cell) 혹은 여러 가지 수용체를 발현하는 세포와 반응시켜, 결합한 IgG를 AlexaFluor488 표지 염소 항인간 IgG 2차 항체(ThermoFisher사제)로 염색하고, EC800형 유동 세포 분석기(SONY사제)로 분석하였다.

유동 세포 분석의 결과를 도 7에 도시한다. 사용한 수용체 발현 세포는, 플렉신 B1 안정 발현 세포(패널 1, 도면에서는 동그라미 숫자로 나타냄), Met 안정 발현 세포(패널 2), EGFR 일과성 발현 세포(패널 3), TrkB 일과성 발현 세포(패널 4)이다. 모든 펩티드 삽입형 N1 항체에 있어서, 대조군 세포에 비하여 각각의 표적 분자를 발현하는 세포에 대하여 명확하게 증대된 결합 히스토그램이 얻어졌다는 점에서, 펩티드의 삽입에 의해 환상 펩티드 결합제의 결합 특성을 뉴로필린 1 항체에 새롭게 부여할 수 있음이 나타났다.

[실시예 3] 여러 가지 항체에 대한 여러 가지 결합 특이성의 부여

1. 이중 특이성 항체의 조제

실시예 1 및 2에서 사용한 뉴로필린 1 항체 외에, 2종의 인간 IgG1형 항체(인간 PD-L1 항체 Avelumab 및 인간 CD3 항체 OKT3)와 1종의 마우스 IgG1형 항체(마우스 트란스페린 수용체 항체 8D3)를 사용하여 펩티드 삽입형 이중 특이성 항체를 제작하였다. Avelumab, OKT3, 8D3의 가변부 아미노산 서열은 각각 WO2013079174A1, Arakawa et al, J Biocheme 1996, Boado et al, Biotech Bioeng. 2008에 기재된 것을 이용하고, 대응하는 DNA를 합성하여 실시예 1과 마찬가지로 중쇄와 경쇄를 발현 벡터 p3XFLAG-CMV-14(시그마 알드리치사제)에 도입하였다. 단, 8D3에 대해서는, 중쇄 및 경쇄의 정상 영역은 마우스 IgG1 유래의 것을 사용하였다.

2. 뉴로필린 1 항체를 바탕으로 한 이중 특이성 항체의 평가

N1 IgG의 B1 루프에 Met 결합성 펩티드 서열(aMD5) 및 EGF 수용체 결합 서열(A6-2f)을 삽입한 항체의 재조합 발현을, 실시예 2에 나타낸 방법으로 행하였다. 전기 영동의 결과를 도 8의 (A)에 도시한다. 펩티드 삽입체는 미삽입의 N1 항체와 동일 정도의 발현 효율을 나타내었다. 이들 표적 분자에의 결합은 실시예 2와 마찬가지의 유동 세포 분석으로 평가하였다.

유동 세포 분석의 결과를 도 8의 (B)에 도시한다. 그 결과, N1 항체의 제1 결합 특이성인 뉴로필린 1에 대한 결합은, 뉴로필린 1을 일과성 발현시킨 HEK 세포에 대하여 동등하게 관찰되어(2단째의 패널), 펩티드 삽입에 의해 오리지널 결합 특성이 상실되지 않음이 나타났다. 또한, aMD5 혹은 A6-2f 펩티드를 B1 루프에 삽입한 변이형 항체는, 각각 Met(3단째의 패널) 및 EGF 수용체 발현 세포(4단째의 패널)에 있어서 강한 양성 시그널을 나타내어, 이중 특이성 항체가 구축되었음을 확인할 수 있었다.

3. PD-L1 항체 Avelumab를 바탕으로 한 이중 특이성 항체의 평가

Avelumab IgG의 B1 혹은 B2 루프에 플렉신 B1 결합성 펩티드 서열(mP6-9), Met 결합성 펩티드 서열(aMD5) 및 EGF 수용체 결합 서열(A6-2f)을 삽입한 항체의 재조합 발현을, 실시예 2에 나타낸 것과 동일한 방법으로 행하였다. 전기 영동의 결과를 도 9의 (A)에 도시한다. 펩티드 삽입체는 미삽입의 Avelumab 항체와 동일 정도의 발현 효율을 나타내었다. 이들 표적 분자에의 결합은 실시예 2와 마찬가지의 유동 세포 분석으로 평가하였다.

유동 세포 분석의 결과를 도 9의 (B)에 도시한다. 그 결과, Avelumab 항체의 제1 결합 특이성인 PD-L1에 대한 결합은, PD-L1을 항상적으로 발현하는 세포주(인간 유방암 세포 MDA-MB-231)에 대하여 동등하게 관찰되어(2단째의 패널), 펩티드 삽입에 의해 오리지널 결합 특성이 상실되지 않음이 나타났다. 또한, mP6-9, aMD5 혹은 A6-2f 펩티드를 B1 혹은 B2 루프에 삽입한 변이형 항체는, 각각 Plexin B1 안정 발현 세포(3단째의 패널), Met 안정 발현 세포(4단째의 패널) 및 EGF 수용체 일과성 발현 세포(5단째의 패널)에 있어서 강한 양성 시그널을 나타내어, 이중 특이성 항체가 구축되었음을 확인할 수 있었다.

4. CD3 항체 OKT3을 바탕으로 한 이중 특이성 항체의 평가

OKT3 IgG의 B2 루프에 플렉신 B1 결합성 펩티드 서열(mP6-9) 혹은 Met 결합성 펩티드 서열(aMD4)을 삽입한 항체의 재조합 발현을, 실시예 2에 나타낸 것과 동일한 방법으로 행하였다. 전기 영동의 결과를 도 10의 (A)에 도시한다. 펩티드 삽입체는 미삽입의 OKT3 항체와 동일 정도의 발현 효율을 나타내었다. 이들 표적 분자에의 결합은 실시예 2와 마찬가지의 유동 세포 분석으로 평가하였다.

유동 세포 분석의 결과를 도 10의 (B)에 도시한다. 그 결과, OKT3 항체의 제1 결합 특이성인 인간 CD3에 대한 결합은, CD3을 항상적으로 발현하는 세포주(Jurkat 세포)에 대하여 동등하게 관찰되어(2단째의 패널), 펩티드 삽입에 의해 오리지널 결합 특성이 상실되지 않음이 나타났다. 또한, mP6-9 혹은 aMD4 펩티드를 B2 루프에 삽입한 변이형 항체는, 각각 Plexin B1 안정 발현 세포(3단째의 패널), Met 안정 발현 세포(4단째의 패널)에 있어서 강한 양성 시그널을 나타내어, 이중 특이성 항체가 구축되었음을 확인할 수 있었다.

5. 트란스페린 수용체 항체 8D3을 바탕으로 한 이중 특이성 항체의 평가

마우스 IgG1인 8D3 항체에 대해서는, 마우스 중쇄에서 B1 내지 B3에 상당하는 루프 위치를 도 3을 참고로 특정하고, 실시예 1과 마찬가지의 방법에 의해 플렉신 B1 결합성 펩티드 서열(mP6-9)을 삽입한 발현 벡터를 조제한 후, 경쇄(마우스 kappa쇄)의 발현 벡터와 함께 Expi293F 세포에 트랜스펙션하였다. 상청 중에 발현 분비된 재조합 항체는 단백질 G-세파로오스(써모피셔 사이언티픽사제)를 사용하여 침강시켜, 전기 영동에 의해 분석하였다.

전기 영동의 결과를 도 11의 (A)에 도시한다. 펩티드 삽입체는 미삽입의 8D3 항체와 동일 정도의 발현 효율을 나타내었다. 이들 표적 분자에의 결합을 평가하기 위해, 유동 세포 분석에 의한 결합 시험을 행하였다. 8D3 IgG 및 3종류의 펩티드 삽입체의 발현 상청을, 여러 가지 수용체를 발현하는 세포와 반응시켜, 결합한 마우스 IgG를 AlexaFluor488 표지 염소 항 마우스 IgG 2차 항체(ThermoFisher사제)로 염색하고, EC800형 유동 세포 분석기(SONY사제)로 분석하였다.

유동 세포 분석의 결과를 도 11의 (B)에 도시한다. 그 결과, 8D3 항체의 제1 결합 특이성인 마우스 트란스페린 수용체에 대한 결합은, TfR을 일과성으로 발현하는 세포(TfR cells)에 대하여 동등하게 관찰되어(2단째의 패널), 펩티드 삽입에 의해 오리지널 결합 특성이 상실되지 않음이 나타났다. 또한, mP6-9 펩티드를 B1 내지 B3 루프에 삽입한 변이형 항체는, Plexin B1 안정 발현 세포(3단째의 패널)에 있어서 강한 양성 시그널을 나타내어, 이중 특이성 항체가 구축되었음을 확인할 수 있었다.

6. 뉴로필린 1 항체를 바탕으로 한 다중 특이성 항체의 평가

지금까지 개별적으로 시도해 온 여러 가지 특이성의 부여를, 1개의 항체에 대하여 동시에 2개 이상 행한 것의 활성을 평가하였다. N1 IgG를 사용하여, 그 여러 가지 루프에 플렉신 B1 결합성 펩티드 서열(mP6-9), Met 결합성 펩티드 서열(aMD4) 및 EGF 수용체 결합 서열(A6-2f)을 여러 가지 조합으로 삽입한 항체의 재조합 발현을, 실시예 2에 나타낸 방법으로 행하고, 이들 표적 분자에의 결합을 5.까지와 마찬가지의 유동 세포 분석으로 평가하였다.

유동 세포 분석의 결과를 도 12에 도시한다. 그 결과, N1 항체의 제1 결합 특이성인 뉴로필린 1에 대한 결합은, 뉴로필린 1을 일과성 발현시킨 HEK 세포에 대하여 동등하게 관찰되어(2단째의 패널), 펩티드 삽입에 의해 오리지널 결합 특성이 상실되지 않음이 다시 나타났다. 또한, mP6-9, aMD4 혹은 A6-2f 펩티드를 삽입한 변이형 항체는, 각각 Plexin B1(3단째의 패널), Met(4단째의 패널), 그리고 EGF 수용체(5단째의 패널)를 각각 일과성으로 발현시킨 HEK 세포에 대하여 강한 양성 시그널을 나타내고, 게다가 그의 결합은 삽입 사이트나 동시에 삽입한 다른 펩티드의 존재에 의존하지 않았다. 결과로서, 이들 개변형 항체는, 본래의 단일 항원 특이성에 추가하여, 1종류의 펩티드를 삽입하면 이중 특이성, 2종류의 펩티드를 삽입하면 삼중 특이성, 그리고 3종류의 펩티드를 삽입하면 사중 특이성이 획득됨을 확인할 수 있었다.

[실시예 4] 펩티드 삽입형 IgG의 2표적 동시 결합능의 확인

1. 샌드위치형 분자간 가교 시험의 원리와 표적 항원의 조제

펩티드 삽입형 IgG에 대하여, 제1 및 제2 결합 특이성의 개별적인 평가는 실시예 3까지 나타내었는데, 펩티드 삽입형 IgG가 2개의 표적에 동시에 결합할 수 있음을 나타내기 위해, 샌드위치 ELISA 타입의 분석계를 구축하였다. 원리를 도 13의 (A)에 도시한다. 먼저 Protein Exp. Purification, 2014, 95, 240-247에 기재된 방법에 준하여, 3종류의 제2 표적 항원ㆍBR>I 모두 1회 막 관통형의 수용체)의 세포 외 영역의 C 말단에 PA 태그(와코 쥰야쿠 고교사제)가 부가된 융합 단백질을 코딩하는 컨스트럭트를 작성하고, 이것을 발현 벡터 pcDNA3.1(써모피셔 사이언티픽사제)에 도입하였다. 이 벡터를 사용하여 실시예 1과 마찬가지의 방법에 의해 Expi293F 세포에서 일과성 발현시켜, 가용성 수용체 단편인 Plexin B1-PA, Met-PA 및 EGFR-PA를 각각 포함하는 배양 상청을 조제하고, 그것들을 단백질 A 세파로오스를 사용하여 정제하였다. 제1 항원측은, AP 융합 발현 벡터인 pAPtag-5(GenHunter사)를 사용하여 AP의 N 말단(뉴로필린 1 및 PD-L1) 혹은 C 말단(트란스페린 수용체)에 그 세포 외 영역의 서열을 융합하고, 실시예 1과 마찬가지의 방법에 의해 Expi293F 세포에서 일과성 발현시켜, 가용성 수용체-AP 융합물인 Nrp-1ec-AP, PD-L1ec-AP 및 AP-TfRec를 각각 포함하는 배양 상청을 조제하였다.

2. 샌드위치형 결합 시험

펩티드 삽입형 IgG에 의한 표적 분자간의 가교는, 도 13의 (A)에 도시하는 원리에 기초하여, 이하의 프로토콜에 따라 평가하였다.

(1) 10㎍/mL로 희석한 정제 제2 표적 항원 용액 50μL를 96웰 플레이트에 첨가하여 4℃, 16시간 정치하였다.

(2) 아스피레이터로 흡인하고, 트리스 완충 식염수(TBS; 20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 7.5)의 5％ 탈지유를 200μL/well 첨가하여 실온에서 1시간 정치하였다.

(3) 여러 가지 Addbody 발현 상청을 50μL 첨가하여 실온에서 1시간 정치하였다.

(4) 200μL/well의 TBS로 3회 세정하였다.

(5) AP 융합 제1 표적 항원을 발현하는 상청을 50μL 첨가하여 실온에서 30분 정치하였다.

(6) 200μL/well의 TBS로 4회 세정하였다.

(7) 발색 기질(포스파타아제 기질, 시그마 알드리치사제)을 100μL/well로 첨가하고, 실온에서 5 내지 60분 정치 후, 각 well 중의 용액의 405nm의 흡광도를 측정하였다.

결과를 도 13의 (B)에 도시한다. 뉴로필린 항체 N1, PD-L1 항체 Avelumab 및 트란스페린 수용체 항체 8D3 전부에 있어서, 펩티드 삽입형 IgG는 각각의 제2 표적 항원을 고정화한 플레이트에 캡처되고, 나중에 첨가한 제1 표적 항원-AP 융합 단백질을 결합하여 기질을 발색시켰다(회색 바). 한편, 펩티드 삽입을 하고 있지 않은 플레인 IgG는 양성 시그널을 제공하지 않았다(흑색 바). 이것은, 각 Addbody가 제1 및 제2 표적에 대하여 개별적으로가 아니라, 동시에 결합할 수 있는 것을 나타내고 있다.

[실시예 5] 펩티드 삽입형 IgG에 의한 이종 세포간 접착의 유도

1. 이종 세포간 접착 시험의 원리와 세포의 조제

펩티드 삽입형 IgG의 제1 및 제2 표적 분자가, 다른 세포 상에 존재하는 수용체일 때, 펩티드 삽입형 IgG는 이종 세포간의 근접 및 접착을 유도하는 효과를 기대할 수 있다. 이것을 조사하기 위해, CD3 항체인 OKT3의 B2 루프에 Met 결합제인 aMD4 펩티드 서열을 삽입한 OKT3(aMD4_B2)을 사용하여, 도 14의 (A)에 도시하는 바와 같은 원리에 기초한 실험을 행하였다. CD3 발현 세포로서는 인간 급성 T 세포성 백혈병 유래 세포주 Jurkat를 사용하고, Met 발현 세포로서는 인간 Met 수용체를 안정적으로 고발현하는 차이니즈 햄스터 난소 세포(Met-CHO 세포)를 사용하였다. Met-CHO 세포를 적색 형광 색소 DiD(Biotium사제)로 표지하고, 96웰 플레이트에 파종하여 10％ 혈청 삽입 배지 중에서 3시간 배양, 접착시켰다. Jurkat 세포는 녹색 형광 색소 Neuro DiO(Biotium사제)로 표지 후, 실시예 3과 동일한 방법으로 조제한 야생형 OKT3 혹은 펩티드 삽입형 OKT3(aMD4_B2) 발현 상청과 빙상에서 30분간 반응시키고, 1회 세정한 후에 상기 Met-CHO 세포 상에 파종하였다. 1mg/ml의 BSA를 포함하는 무혈청 배지 중에서 17시간 배양한 후, 200μL/well의 무혈청 배지에서 2회 세정하고, 디지털 형광 현미경(BZ-X700, 키엔스사제)으로 형광 및 위상차 화상을 기록하였다.

결과의 사진을 도 14의 (B)에 도시한다. 적색 형광 화상(여기 파장 620nm, 형광 파장 700nm)에서는 플레이트에 접착한 Met-CHO 세포가, 녹색 형광 화상(여기 파장 470nm, 형광 파장 525nm)에서는 플레이트 혹은 Met-CHO 세포 상에 접착한 Jurkat 세포가 각각 가시화되어 있다. 양쪽 화상을 오버레이하여, 이종 세포끼리의 접착 부위(즉 적색과 녹색의 세포가 겹쳐 있는 부분)를 흰색 동그라미로 마크하였다. 또한, 복수의 웰로부터 합계 10개의 시야를 선택하고, Met-CHO 세포에 접착된 Jurkat 세포의 단위 면적당 수를 정량한 그래프를 도 14의 (C)에 도시한다. 이에 의해, 펩티드 삽입형 OKT3이 Met-CHO 세포 상의 Met 분자와 Jurkat 세포 상의 CD3 분자를 동시에 인식하고, 그 상호 작용에 의해 양쪽 세포 사이를 가교하고 있음이 나타났다.

SEQUENCE LISTING <110> The University of Tokyo Osaka University <120> A highly versatile method for granting new binding specificity to antibody <130> T0529AKP0012 <150> JP2018-144345 <151> 2018-07-31 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of cyclic peptide mP6-9 <400> 1 Arg Pro Tyr Ile Glu Arg Trp Thr Gly Arg Leu Ile Val 1 5 10 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of cyclic peptide aMD4 <400> 2 Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of cyclic peptide aMD5 <400> 3 Trp Tyr Tyr Ala Trp Asp Gln Thr Tyr Lys Ala Phe Pro 1 5 10 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of cyclic peptide A6-2f <400> 4 Ala Ser Phe Pro Glu Glu Leu Asp Glu Trp Tyr Val Ala Tyr Gly 1 5 10 15 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of cyclic peptide trkD5 <400> 5 Arg Gln Ala Ser Pro Lys Phe Thr Phe Trp Ser 1 5 10 <210> 6 <211> 227 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 7 <211> 208 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 1 5 10 15 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 20 25 30 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 35 40 45 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 50 55 60 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 65 70 75 80 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 85 90 95 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 100 105 110 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 115 120 125 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 130 135 140 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 145 150 155 160 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 165 170 175 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 180 185 190 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 195 200 205 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ser His Glu Asp Pro 1 5 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Tyr Asn Ser Thr 1 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 1 5 <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Val Asp Gly Val 1 <210> 12 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Lys Gly Gln 1 <210> 13 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ser Asp Gly Ser 1 <210> 14 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Thr Lys Asn Gln 1 <210> 15 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Ser Asn Gly 1 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gln Gln Gly Asn Val 1 5

Claims (7)

1. 항체의 Fc 영역에, 당해 항체가 인식하는 제1 표적 분자와는 다른 제2 표적 분자에 대한 결합능을 갖는 환상 펩티드의 내부 펩티드 서열을 삽입함으로써, 항체에 제2 표적 분자에 대한 결합능을 부여하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 항체의 Fc 영역이 인간, 마우스, 래트, 토끼, 말 또는 개 유래인 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 내부 펩티드 서열을 삽입하는 부위가 Fc 영역에 있어서의 분자 표면에 노출되어 있는 루프 부분인 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 환상 펩티드가 디스플레이형 탐색 시스템에 의해 얻어지는 환상 펩티드인 방법.
5. 항체의 Fc 영역에, 해당 항체가 인식하는 제1 표적 분자와는 다른 제2 표적 분자에 대한 결합능을 갖는 환상 펩티드의 내부 펩티드 서열이 삽입된, 제1 및 제2 표적 분자에 대한 결합능을 갖는 개변형 항체.
6. 제5항에 있어서, 제1 및 제2 표적 분자에 대하여 동시에 결합하는 개변형 항체.
7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 제1 및 제2 표적 분자가, 각각 다른 세포 표면 분자이고, 2개의 다른 세포 표면 분자와의 결합을 통하여 이종 세포끼리의 접착을 유도하는 개변형 항체.

Images