KR20070077140A - 단백질-단백질의 상호작용을 분석하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 부위-특이적 재조합과 BiFC(bimolecular fluorescence complementation) 분석이 동시에 가능한 벡터를 이용하여 세포내 단백질-단백질 상호작용(in vivo protein-protein interaction)을 빠르고 간편하게 분석하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 상기 벡터를 이용하여 분석을 원하는 두 단백질을 각각 형광 단백질의 N 말단 영역 및 형광 단백질의 C 말단 영역과 결합된 융합단백질 형태로 세포내에서 발현시키고 융합 단백질간의 상호작용 여부를 형광으로 측정하여 분석하는 방법에 관한 것이다.

단백질-단백질 상호작용, 부위-특이적 재조합, BiFC(bimolecular fluorescence complementation), 형광 단백질, YFP(yellow fluorescent protein)

Description

단백질-단백질의 상호작용을 분석하는 방법{Method for analyzing protein-protein interaction}

도 1은 빠른 클로닝과 세포내 단백질-단백질 상호작용 분석 목적으로 우리가 개발한 Destination 플라스미드 벡터의 구조이다. (A)는 YFP (yellow florescent protein)의 N-말단 조각 (a.a. 1-154)을 융합시킨 destination vector (B)는 YFP의 C-말단 조각 (a.a. 155-238)을 융합시킨 destination vector 이다. Destination 벡터는 분석대상 단백질 (예, 전사인자들의 POZ 도메인)들의 핵에서의 상호작용을 측정하기위하여, 핵에서 발현되도록 신호 펩타이드 유전자 (NLS, nuclear localization sequence)를 삽입하였고, 재조합 반응을 통한 재조합 발현 플라스미드를 만들기 위한 attR sites를 가지며 발현 플라스미드 선별시 유용한 ccdB 유전자와 크로람페니콜 항생제 항생제 저항성 유전자가 포함되어있는 reading frame A를 가지고 있다. FPIA-YN의 경우 YN 조각과 단백질 추적을 위해 Flag-tag가 삽입되었고 FPIA-YC의 경우 YC 조각과 HA-tag가 삽입되었다.

도 2는 새로 개발한 세포내 고속 단백질-단백질 상호작용 분석 시스템을 사용하여 한 실시예로서 POZ-도메인간의 단백질-단백질 상호작용을 조사한 결과이다. (A) CV-1 세포에서 POZ-도메인간의 단백질-단백질 상호작용 분석 (B) 293A 세포에서 POZ-도메인간의 단백질-단백질 상호작용 분석. 플라스미드들은 0.6㎍ 씩 Lipofectamine Plus (Invitrogen)를 이용하여 세포내로 도입하고, 24 시간 후에 Confocal microscope로 POZ-도메인들의 상호작용을 조사하였다. APM-1 POZ-도메인과 FBI-1 POZ-도메인은 homodimerization 및 heterodimerization을 잘 형성하여 형광를 보여준다. KL10 POZ-도메인은 약하게 homodimerization 및 다른 POZ-도메인들과의 heterodimer를 이루어 형광를 보여준다. 도 3은 Negative control으로 사용한 FPIA-YN, FPIA-YC의 단백질 수준에서의 발현을 Western blotting으로 보여주고 있다. (A) CV-1 세포들에 FPIA-YN을 도입시키고 24시간 후 세포추출물을 준비한 후,SDS-PAGE로 분리하고, HA-tag 인식 항체를 이용하여 FPIA-YN이 단백질로 잘 발현되고 있음을 증명하였다. (B) FPIA-YC 역시 CV-1 cells에 도입시킨 후 HA-tag 항체를 이용하여 단백질로 잘 발현되고 있음을 증명하였다. 플라스미드가 도입되지 않은 CV-1 세포들 과 pcDNA3.0이 도입된 CV-1 세포들이 대조군으로 사용되었다.

도 4는 Mammalian two-hybrid assay를 수행한 결과이다. (A) CV-1 세포들에 GAL4 또는 VP16과 융합된 형태의 POZ-도메인 단백질들과 pGal4UAS-luciferase 와 pCMV-lacZ 플라스미드들을 도입하였다. (B) 293A 세포들에 (A)에서와 동일한 플라스미드들을 도입시켰다. 도입 후 24시간이 경과한 후 luciferase reporter의 활성을 측정하였다.

도 5는 시험관내 단백질-단백질 상호작용을 분석한 결과이다. (A)는 실험에 사용된, [³⁵S]- methionine으로 표지된 POZ-도메인 단백질들의 양을 나타낸다. (B)는 GST 와 GST와 융합된 POZ-APM-1, POZ-FBI-1, POZ-KL10 단백질들과 [³⁵S]- methionine 으로 표지된 POZ-도메인 단백질들을 반응시킨 결과이다.

세포는 다양하고 복잡한 단백질-단백질 상호작용을 통하여 유전자 표현, 세포성장, 세포 주기, 대사, 신호전달 등의 여러 생물학적 기능을 수행함으로써 생명현상을 유지하고 있다. 따라서 세포내에서의 단백질-단백질 상호작용 및 상호작용의 기능을 이해하는 것은 생명현상들을 이해하는 초석이 되며 신약개발 및 질병 치료의 중요한 기반이 된다. 시험관내 또는 생체 내에서 단백질-단백질 상호작용을 조사하기 위한 방법으로는 친화성 크로마토그래피(affinity chromoatography), 공동면역침전(coimmunoprecipitation), 파아지 디스플레이(phage display), 투-하이브리드 어세이(two-hybrid assays), GST-융합 단백질 풀-다운(GST-fusion protein pull-down), 면역조직화학(immunohistochemistry)와 같은 기존의 방법들이 존재하지만, 이들 방법들은 여러 장점들도 있으나 빠르게 세포내 단백질-단백질 상호작용을 규명에 여러 단점들을 가지고 있다.

단백질 친화성 크로마토그래피(Protein affinity chromatography)의 경우, 정제된 단백질이 준비되어야하는 어려움이 있다. 또한 단백질 간 상호작용 확인이 시험관 내에서 일어나므로, 세포내에서는 상호작용하지 않는 단백질들이 컬럼을 통과하는 동안 정전기적 상호작용에 의하여 결합하는 것처럼 보일 수 있는 false-positive 결과를 도출 할 수 있다. 공동면역침전의 경우 정제된 민감성이 높은 항 체가 필요하며 이 항체는 세포내에서 존재하는 단백질의 형태를 인식할 수 있는 것이어야 한다. 따라서 항체의 민감성과 특이성이 낮은 경우 단백질들 간 상호작용을 증명하기 힘들다. 파아지 디스플레이의 경우 단백질이 파아지의 캡시드나 외막 단백질과 융합된 형태로 발현되므로 발현할 수 있는 단백질의 크기가 제한되어있다. 포유류 세포의 많은 단백질들이 번역 과정 이후 여러 변형(modification)들을 거치게 되나 파아지에서는 진핵세포에서 만들어지는 단백질과 동일한 폴딩 및 번역 후 변형을 거치지 못하므로 단백질의 변형을 연구하기 어렵다. 한가지의 단백질도 여러 변형을 거침으로써 다양한 단백질들과 상호작용하여 세포 내 기능을 수행하기 때문에 어떠한 변형을 거치느냐 및 다양한 변형 이후 상호작용하는 짝들을 연구하는 것은 복잡한 세포의 기능조절을 이해하는 초석이 된다. 하지만 파아지 디스플레이를 이용하여 상호작용을 연구하는 경우 포유류 세포에서 일어나는 다양한 변형이 일어나지 못하므로 여러 변형을 거친 후 상호작용 하게 되는 단백질 간 상호작용 연구에 어려움이 있다. 투-하이브리드 스템은 주로 효모와 포유류 세포에서 많이 사용되는데 효모의 경우 목적 단백질들이 진핵세포에서와 동일하게 만들어지고 폴딩(folding) 및 변형이 일어나야 한다. 포유류 세포를 이용한 투-하이브리드 시스템의 경우 단백질의 합성 후 폴딩이나 변형이 제대로 일어나지만 단백질의 상호작용을 DNA 결합 도메인을 이용하여 핵에서 전사활성화를 통하여 상호작용을 확인하므로, 세포질에서의 상호작용하는 단백질 간 상호작용의 경우 세포질에서 상호작용을 확인하기가 힘들다. 또한 단백질 간 상호작용이 리포터 유전자를 충분히 활성화시키지 못하는 경우, 상호작용하여 오히려 전사를 억제하는 경우 등에서 대조군과 활성화 정도의 차이가 크지 않아 상호작용을 증명하기 어려운 단점이 있다. 면역조직화학은 시료의 준비 과정 중 파라핀 및 포르말린으로 고정하는 과정을 거치게 되는데 이 과정 중 세포가 영향을 받을 수 있으며, 민감한 항체가 요구되고, 단지 목적 단백질들이 존재하는 세포 내 위치들을 염료들로 염색 후 이들 결과를 토대로 단백질들의 위치로 이들 간 상호작용을 추측하게 되므로 정확한 단백질-단백질 간 상호작용을 연구하기 힘들다. GST 풀-다운 어세이는 박테리아에서 목적 단백질들을 발현시키고 정제하는 과정을 거치게 되는데 단백질들을 수용성으로 발현시키는 과정이 쉽지 않으며 발현시킨 단백질이 포유류세포에서 발현되는 것과 다른 구조를 가질 수도 있다. 또한 정제과정 도중 및 정제 후 단백질의 분해가 일어날 수 있으므로 지속적인 단백질 상태가 모니터링 되어야 한다. 또한 단백질 간 결합이 사용하는 버퍼의 조성에 의하여 큰 영향을 받는다. 따라서 적절한 버퍼의 조성 연구가 수반되어야하며 시험관내 실험이므로 생체 내 상호작용과 다른 결과를 얻을 수 있다.

기존 방법의 단백질-단백질 상호작용을 분석하는 방법이 가지는 클로닝 과정에서의 시간 소요, 정제된 항원 특이적 항체의 필요성, 실험 수행 과정에서 세포 파괴와 같은 과정 중의 오염 및 세포의 환경변화, 단백질 정제 과정의 어려움, 고비용 등과 같 한계성을 극복하여 고속으로 간편하고 정확하게 단백질간 상호작용을 분석하기 위한 새로운 분석 시스템이 요구되고 있다.

이런 배경하에, 본 발명자는 빠른 시간 내에 다수의 단백질들의 상호작용을 세포내에서 연구하기 위한 새로운 방법을 개발하기 위하여 노력한 결과, 제한효소 및 리가제를 사용하지 않고 재조합 반응을 이용하는 클로닝 방법과 FRET 기술을 동시에 적용할 경우, 단백질-단백질 상호작용을 세포의 조건과 가장 유사한 상태에서 단백질간의 상호작용을 시각화하여 빠르고 편리하게 관찰할 수 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 단백질을 형광 단백질의 N 말단과 융합된 융합 단백질 또는 형광 단백질의 C 말단과 융합된 융합 단백질 형태로 발현시키는 부위-특이적 재조합이 일어나는 벡터를 이용하여 세포내 단백질-단백질 상호작용(in vivo protein-protein interaction)을 확인하는 방법을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 세포내 단백질-단백질 상호작용 분석용 벡터를 제공하기 위함이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 세포내 단백질-단백질 상호작용(in vivo protein-protein interaction)을 분석하는 방법에 관한 것이다.

보다 구체적인 양태로서, (ⅰ)형광 단백질의 N 말단 영역과 융합된 융합 단백질의 형태로 발현시키는 벡터와 형광 단백질의 C 말단 영역과 융합된 융합 단백질 형태로 발현시키는 벡터 각각에, 목적 단백질을 코딩하는 핵산 또는 분석 대상 단백질을 코딩하는 핵산을 도입하는 단계;

상기 벡터는 DNA 서열 교환(exchange)을 위한 DNA 재조합 서열(DNA recombination sequence) 쌍을 포함하는 부위-특이적 재조합이 일어나는 벡터로, 프로모터 하부에 핵 위치 시그널 (nuclear localization signal)을 포함한다.

(ⅱ)상기 단계에서 준비한 목적 단백질을 발현하는 벡터 및 분석 대상 단백질을 발현하는 벡터를 세포에 형질전환시키고 배양하는 단계;

(ⅲ)목적 단백질과 분석 대상 단백질 간의 상호작용을 형광 단백질의 형광으로 측정하는 단계; 를 포함하는 세포내 단백질-단백질 상호작용(in vivo protein-protein interaction)을 분석하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법은 부위-특이적 재조합을 이용한 클로닝과 BiFC(bimolecular fluorescence complementation) 분석이 동시에 가능한 벡터를 사용한다는 것이 관건으로 작용한다.

부위 특이적 재조합을 이용한 클로닝 시스템은 많은 유전자들의 고효율의 빠른 클로닝 및 실험 목적에 맞는 다양한 플라스미드 벡터로의 쉬운 클로닝의 위해 도입되었다. 이 시스템은 람다 파지가 숙주의 DNA로 침투 할 때와 숙주의 DNA 로부터 빠져 나올 때 일어나는 일련의 재조합 현상을 이용한 것이다. 람다 재조합 반응은 용원화일 때와 용균화 일 때 각각 다른 효소에 의해 촉매되며 이들 효소는 특정 서열을 인식하여 자르고 DNA를 공유결합 시킬 수 있다. 용원화에서는 bacteriophage l intergrase (Int)와 E. coli integration host factor (IHF) protein (BP clonase enzyme mix)가 작용하고, 용균화일 때는 bacteriophage l intergrase (Int)와 excisionase (Xis), E. coli integration host factor (IHF) protein (LR clonase enzyme mix) 가 작용한다. 부위 특이적 재조합 시스템에서는 이러한 원리를 이용한 BP 반응과 LR 반응으로 이루어져 있으며 BP 반응은 attB 서열을 가지는 기질과 attP 서열을 가지는 기질 (donor 벡터)이 BP clonase enzyme mix에 의해 촉매되어 attL 서열이 만들어지고 attB 사이트와 융합되었던 목적 유전자가 들어간 entry clone이 만들어진다. LR 반응은 attL 서열을 가진 기질(entry clone)을 attR 서열을 가진 기질의 재조합 반응으로 attB 서열을 가지는 expression clone을 생성하는 과정으로 이 반응은 LR clonase enzyme mix에 의해 촉매된다. 이 과정을 통하여 entry clone에 들어있던 유전자가 destination 벡터로 옮겨지게 되어 최종적으로 attB 사이트를 가지는 expression clone을 생성한다. 이러한 Gateway 시스템을 클로닝에 사용하여 많은 유전자들의 클로닝을 고효율로 빠르게 달성할 수 있다.

FRET 기술은 상호작용하는 두 단백질들이 (A와 B) 생체 내에서 접근시 여기파장과 에너지 발산파장이 낮은 형광물질 (공여자)이 에너지 여기파장이 높은 수여자에게 에너지를 전달하게 되고 이러한 에너지 전도로 인하여 수여자가 발산하는 에너지 파장의 형광을 측정하여 단백질-단백질 상호작용의 여부를 측정하는 것이다. 즉 공여자의 여기파장을 조사 후 수여자의 발산파장을 측정함으로써 이들 간의 상호작용 유무를 세포 내에서 형광 현미경이나 Confocal 현미경으로 관찰할 수 있다. BiFC 는 FRET 테크놀로지의 원리에 기초한 응용 기술로, FRET은 서로 다른 형광 단백질 두 가지를 이용하는 반면 BiFC 는 하나의 형광 단백질을 두 조각 (N-말단 부분과 C-말단 부분)으로 나누거나 서로 다른 형광 단백질들의 조각을 각각 단백질에 융합시킨 후 단백질 간 상호작용이 존재하는 경우 형광 단백질들이 재구성 (reconstruction)을 통하여 에너지 전도 현상을 이용한다는 점에서 차이가 난다.

본 발명자는 부위 특이적 재조합을 이용하는 클로닝과 BiFC 분석을 동시에 적용할 경우 단백질-단백질 상호작용을 빠르게 간편하고 수행할 수 있다는 것에 착안하여 이를 가능하게 하는 하기와 같은 특징을 가지는 벡터를 제조하였다.

첫째, 본 발명의 벡터는 분석하고자 하는 단백질을 형광 단백질과 융합 단백질 형태로 발현시키는 벡터이다. 상호작용을 분석하고자 하는 단백질은 형광 단백질의 N 말단 영역 또는 C 말단 영역과 펩타이드 결합의 통하여 하나의 폴리펩타이드로 발현되는 융합 단백질 형태로 발현된다. 이 때, 단백질은 형광 단백질의 C 말단 또는 N 말단 모두에 결합될 수 있으므로, (형광단백질 말단 영역)-단백질 또는 단백질-(형광단백질 말단 영역)의 형태로 발현될 수 있다. 바람직하게는 단백질이 형광단백질 말단 영역의 앞쪽에 위치하는 형태로 발현시키는 벡터이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 형광 단백질은 YFP(yellow fluorescent protein), GFP(green fluorescent protein), enhanced GFP, BFP(blue fluorescent protein), CFP(cyan fluorescent protein) 등을 예시할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시에서는 YFP를 사용하였다. 1 - 154에 해당하는 영역과 155-238에 해당하는 영역을 각각 N 말단 영역과 C 말단 영역으로 사용하였다.

둘째, 본 발명의 벡터는 단백질을 코딩되는 핵산이 도입되는 부위의 전과 후에 DNA 재조합 서열을 포함하여, 단백질을 코딩하는 핵산이 부위 특이적 재조합 방법으로 벡터에 도입되는 벡터이다. DNA 재조합 서열은 특별히 제한되지 않으나, 본 발명의 구체적인 실시에서는 attR 서열을 벡터에 이용하였다.

셋째, 본 발명의 벡터는 프로모터 하부에 핵 위치 시그널(nuclear localization signal) 을 포함하여, 단백질의 핵에서의 단백질 상호작용의 분석이 가능하도록 하였다. 본 발명의 구체적인 실시에서는, PPKKRKV (P는 프롤린, K는 라이신, R은 아르기닌 및 V는 발린) 서열을 핵 위치 시그널로 사용하였다.

넷째, 본 발명의 벡터는 융합단백질을 코딩하는 서열의 하부에 태그(tag)를 코딩하는 서열을 추가로 포함하여 세포내 융합단백질의 추적이 가능하게 하였다. 사용될 수 있는 태그는 특별히 제한되지 않는다. 글루타치온-에스 전이효소(glutathione-S transferase; GST), 말토오스 결합 단백질(maltose binding protein: MBP), 인테인(intain), 티오레독신(thioredoxine), 디하디로폴레이트 리덕타제(dihydrofolate reductase: DHFR), 셀룰로즈 결합 도메인(celluose binding domain: CBD), 말토즈 결합 단백질(maltose binding protein: MBP), 갈락토즈-결합 단백질(galactose-binding protein), 칼모듈린 결합 단백질(calmodulin binding protein: CBP), 플래그 태그(Flag tag), HA 등을 예시할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시에서는 플래그 태그(Flag tag) 또는 HA 태그를 사용하였다.

다섯째, 융합 단백질은 포유 동물 세포에서 높은 발현 효율을 보이는 프로모터에서 발현되도록 제조되었다. 본 발명의 구체적인 양태에서는 CMV 프로모터를 사용하였다.

본 발명의 구체적인 실시에서는, 형광 단백질의 N 말단 영역과 융합된 융합 단백질 형태로 발현시키는 벡터로 도 1A에 개시된 pFPIA-YN 벡터를, 형광 단백질의 C 말단 영역과 융합된 융합 단백질 형태로 도 1B에 개시된 pFPIA-YC 벡터를 제조하 였다.

pFPIA-YN 벡터와 pFPIA-YC 벡터를 포유동물세포에 형질전환하여 배양하여 단백질을 세포내에서 발현시키고 세포에서의 형광을 측정함으로써, 단백질-단백질 상호작용을 정확하게 분석가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 방법은 세포의 물리적, 화학적 환경과 가장 유사한 상태에서 단백질 간 상호작용을 측정할 수 있고 이들 단백질들의 세포내 위치도 관찰할 수 있다는 장점을 가진다. 또한 항체를 필요로 하지 않으며 단백질 간의 상호작용에 중요하게 작용하는 부분에 대한 구조적인 정보가 필요하지 않으므로, 잘 알려지지 않은 단백질 간 상호작용 연구에 매우 유용하다는 장점을 가진다.

또한, 본 발명에 따른 분석 방법은 시료 준비 후 24-48 시간 안에 수십-수백개 단백질간의 상호작용의 유무, 상호작용의 정도를 조사할 수 있는 매우 효율적인 분석 시스템으로, 본 발명의 분석 방법을 이용하여 단백질 상호작용에 영향을 미치는 새로운 화합물, 라이간드, 펩타이드의 스크리닝에 응용될 수 있다.

상기 (ⅱ)단계에서, 단백질을 발현하는 벡터를 세포에 형질전환시키는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 칼슘(CaPO4)) 침전, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민, 폴리아민 기반한(polyamine based) 형질전환 방법 등을 예시할 수 있다.

상기, (ⅲ) 단계에서 형광은 형광 현미경, 콘포컬 현미경 등을 이용하여 측정할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 세포내 단백질-단백질 상호작용 분석을 위한 도 1A에 개시된 pFPIA-YN 및 도 1B에 개시된 pFPIA-YC 벡터에 관한 것이다.

pFPIA-YN 및 pFPIA-YC 벡터는 부위-특이적 재조합을 이용한 클로닝과 BiFC(bimolecular fluorescence complementation) 분석이 동시에 가능하여 세포내 단백질-단백질 상호작용을 분석에 효과적으로 이용될 수 있는 벡터로, 상기한 바와 같은 특징을 가진다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제공한다. 그러나 하기 의 실시예는 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 발명이 하기의 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.

실시예 1 :

(1) FPIA - YN 과 FPIA - YC 벡터 제작

FPIA-YN은 핵 위치 시그널(Nuclear localization signal: NLS)을 포함하는 5' primer와 flag tag를 포함하는 3' primer를 이용하여 invitrogen 에서 destination vector 제작용으로 판매하는 readingframe A 와 YN 조각이 이미 클로닝되어있는 벡터로부터 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하여 준비한 다음 XhoI 과 ApaI 을 이용하여 pcDNA3의 MCS(Multiple cloning sites)를 통하여 pcDNA에 서브클로닝하였다.

FPIA-YC 는 핵 위치 시그널을 포함하는 5' primer와 HA tag를 포함하는 3' primer 를 이용하여 invitrogen 에서 destination vector 제작용으로 판매하는 readingframe A 와 YC 조각이 이미 클로닝되어있는 벡터로부터 PCR을 수행하여 준비한 다음 HindIII 과 XbaI 을 이용하여 pcDNA3의 Multiple cloning sites(MCS)를 통하여 pcDNA에 subcloning 하였다. YFP N-terminal 조각(YN)과 YFP C-termial 조각(YC)은 미시건 대학의 Kerppola 박사로부터 제공받았다. FPIA vector 제작에 이용된 올리고뉴클레오타이드의 서열은 다음의 표 1과 같다.

FPIA vector 제작에 사용한 oligonucleotide 서열

Name of Oligonucleotide	Oligoncleotidr sequence
FPIA-YN sense	5'GATCCTCGAGACCATGGCTCCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTACTTGCGGCCGCGAATTCA 3'
antisense	5'GATCGGGCCCTCACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCGGCCATGATATAGACGTT3'
FPIA-YC sense	5'GATCAAGCTTACCATGGCTCCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTACTTATGGCCATGGAGGCC 3'
antisense	5'GATCTCTAGATCAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTACTTGTACAGCTCGTCCAT 3'

준비된 FPIA-YN 과 FPIA-YC 는 attB 사이트를 포함하는 각각의 유전자 PCR산물과 pDONR 벡터와 BP clonase^TM Enzyme Mix II 로 촉매된 BP reaction을 통하여 얻어진 entry clone과 LR clonase^TM Enzyme Mix II를 이용하여 LR reaction을 통하여 mammalian expression vector를 만드는데 사용되었다. BP reaction 과 LR reaction은 invitogen에서 제공하는 프로토콜에 따라 수행되었으며 실험에 사용된 모든 플라스미드들은 서열분석으로 확인되었다. BP 와 LR 재조합을 통하여, M-1 POZ (a.a 124), FBI-1 POZ (a.a 129) 와 KL10 POZ (a.a 134) 발현 클론이 생성되었다. POZ 도메인 발현 플라스미드의 준비에 사용된 올리고뉴클레오타이드 서열은 표 2에 제시되었다. 이러한 플라스미드는 APM-1, FBI-1, KL10의 POZ 도메인간의 호모다이머 및 헤테로다이머 형성을 관찰하는데 사용되었다.

포유류 발현 클론 생산에 사용된 올리고뉴클레오타이드 서열

Name of Oligonucleotide	Oligoncleotide sequence
APM-1 POZ domain expression clone sense	5'GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCTGACAATGACATTGATGAG 3'
antisense	5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGCCTCCGGGCTCCATGAT 3'
FBI-1POZ domain expression clone sense	5'GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCTGCCGGCGGCGTGGACGGC 3'
antisense	5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTGCCGGTCCAGGAG 3'
KL10 POZ domain expression clone sense	5'GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCTGAGAGCACCGC 3'
antisense	5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCACACAGCTCCGACTTGAG 3'

포유류 투-하이브리드 어세이를 위하여, Gal4-fused APM-1 POZ (EcoRI/BamHI (a.a 124)), FBI-1 POZ (a.a 129) 과 KL10 POZ (EcoRV/BamHI (a.a 134)) 및 VP16- fused APM-1 POZ (EcoRI/NheI (a.a 124)), FBI-1 POZ (a.a 129) 과 KL10 POZ (BamHI/NheI (a.a 134)) 도메인을 발현하는 발현 플라스미드는 pCMX-Gal4 (Sadowski and Ptashne, 1989) 또는 pCMX-VP16 융합 발현 플라스미드로 클로닝되었다. 사용된 올리고뉴클레오타이드는 표 3에 제시되었다.

Gal4-fused, VP16-fused 및 GST-fused POZ 준비에 사용된 올리고뉴클레오타이드 서열

Name of Oligonucleotide	Oligoncleotied sequences
GAL4 mAPM-1 POZ domain sense	5'GGATCGAATTCGCCAATGACATTGATGAGCTG 3'
antisense	5'GATCGGATCCTAGGGCTCCGGGCTCCATGAT 3'
VP16 APM-1 homolog POZ sense	5'GATCGGATCCGCCAATGACATTGATGAG 3'
antisense	5'GATCGATAGCTAGGCCTCCGGGCTCCATGAT 3'
GAL4 KLHL10 POZ sense	5'GATCGATATCGAGAGCACCGCTGCCTCC 3'
antisense	5'GATCGGATCCTAGACACAGCTCCGACTTGAG 3'
VP16 KLHL10 POZ sensee	5'GATCGGATCCGAGAGAGCACCGCTGCCTCC 3'
antisense	5'GATCGCTAGCTAGACACAGCTCCGACTTGAG 3'
pGEX4T1 mAPM-1 POZ domain sense	5'GATCGGATCCACCATGGCCAATGACATTGATGAGCTG 3'
antisense	5'GATCGTCGACGCCTCCGGGCTCCATGATCTC 3'
pGEX4T1 KLHL10 POZ domain sense	5'GATCGGATCCACCATGGAGATGGAGAGCACCGCTGCC 3'
antisense	5'GATCGTCGACACACAGCTCCGACTTGAGGAA 3'

실시예 2 : 세포 배양 및 살아있는 세포(living cells)에서의 형광 이미지 분석

CV-1(African green monkey kidney cells)와 293A(human kidney cells)는 10$ % FBS(fetal bovine serum)를 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle medium)에서 유지하였다. 세포를 총 1.2 ㎍ 의 YN 및 YC 융합 단백질 발현 플라스미드 DNA (0.6 ㎍의 POZ-YC plasmid, 0.6 ㎍의 POZ-YN plasmid)를 리포펙타민 Plus^TMreagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 공동-형질전환시켰다. 24시간 후에, 배지를 제거하고 OPTI-MEM (Inviatrogen)으로 세척하였다. 형광 (YFP)과 DIC 이미지를 Carl Zwiss LSD 510 콘포걸 현미경으로 (Carl Zwiss, Deutschland, Germany) 수집하였다.

(2)포유류 투- 하이브리드 리포터 어세이

CV-1(African green monkey kidney cells )와 293A(human kidney cells)를 10% FBS, 100 units/ml의 스트렙토마이신, 및 100 units/ml 의 페니실린 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 포함하는 DMEM에서 배양하였다. 세포를 6-웰 조직 배양 플레이트에 2 ml 의 DMEM에서 10⁵cells/well의 밀도로 접종하였다. 24시간 키운 후, Gal4 융합된 POZ 도메인 발현 플라스미드 (0.4㎍), VP16 융합된 POZ 도메인 플라스미드 (0.4㎍), pG5 루시퍼라제 리포터 플라스미드 (0.2㎍) 및 -갈 리포터 플라스미드(0.2㎍)를 제조사의 설명서에 따라 OPTI-MEM (Invitrogen)의 리포펙타민 Plus^TMreagent (Invitrogen)를 이용하여 일시적으로(transiently) 형질전환하였다. 3시간 후에, 세포에 신선한, complete DMEM을 제공하여 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 수집하고 100 ㎕의 1x 리포터 라이시스 버퍼 (Promega, Madison, WI, USA)에서 라이시스하고, 1분 동안 볼텍스(vortexed)하고 15분 동안 얼음에 두고, 4°C에서 15분간 12,000 rpm에서 원심분리하엿다. 루시퍼라제 리포터 어세이는 5 ㎕의 세포 추출물을 루미노미터(luminometer )(Microplate Luminometer LB 96V, EG&G Berthold, CA, USA)에서 50 ㎕의 루시퍼라제 어세이 제제 (Promega)를 이용하여 수행하였다. 어세이는 3번 이상 반복하였다.

(3)인 비트로 단백질-단백질 상호작용 어세이

상기 실시예에서 준비된 pGEX4T1 APM-1 POZ, pGEX4T3 FBI-1 POZ, 및 pGEX4T1 KLHL-10 POZ 발현 플라스미드를 E.coli BL21 (DE 3)로 형질전환하였다. 재조합 GST-융합 단백질을 제조하기 위하여, E.coli BL21를 37°C에서 0.5 mM IPTG(isopropyl-1-thio-b-D-galactopyranoside)로 4 시간동안 배양하여 세포에서의 단백질 발현을 유도하였다. 세포를 원심분리하여 수집하였다. 수집된 세포를 HEMG buffer (40 mM HEPES (pH7.9), 100 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 5 mM MgCl_{2 ,} 0.1% Nonidet P-40, 10% Glycerol, 1.5 mM dithioreitol 과 1 tablet/50 ml 의 protease inhibitor mixture (Roche, Mannheim, Germany))에서 재현탁하고 초음파 (cycle: 0.5, amplitude: 50% (Dr. Hielscher GmbH /UP 400s, Teltow, Germany)로 4번 라이시스하였다. 라이세트(lysates)를 다시 4°C 에서 15 분 13,000 rpm으로 원심분리하여 상층액을 취하였다. 상층액을 glutathione-agarose 4B bead affinity column (Peptron, Daejeon, Korea)에 넣고 통과시키고 이를 2 번 수행하였다. Agarose-bound GST 또는 GST fusion protein을 차가운 HEMG 버퍼로 5번 세척하고, 4°C에서 1분간 3,000 rpm에서 원심분리하여 수집하였다. 그 후, agarose-bound GST protein을 HEMG 버퍼에서 [³⁵S] methionine-labeled POZ domains 과 함게 4°C에서 쉐이킹(shaking)하면서 밤새 배양하였다. [³⁵S] methionine-labeled POZ domains을 NT Quick-coupled Transcripton/Translation System을 이용하여 준비하였다. 아가로즈-단백질 복합체를 1 ml의 차가운 HEMG 버퍼로 5번 세척하고, 결합된 단백질을 15% SDS-PAGE에 전개하엿다. 젤을 건조시키고(Hoefer Scientific Instruments, San Fransisco, CA, USA) image-intensifying screen (Kodak, Pochester, NY, USA)상에서 X-ray 필름에 노출하였다.

실시예 2 : FPIA - YN 과 FPIA - YC 벡터를 이용한 단백질-단백질 상호작용 분석

BTB/POZ 도메인은 약 120개의 아미노산으로 이루어진 단백질-단백질 상호작용 motif로 대부분의 경우 단백질의 N-말단에 존재하면 많은 전사인자(주로 C₂H₂ zinc finger)와 actin binding 단백질, shao-type potassium channel 등에서 나타난다. BTB/POZ domain 단백질들은 발생과정, 암 발생, 세포사멸, 전사과정 등의 과정에 중요하게 작용하는 것으로 알려져 있다. 또한 BTB/POZ domain은 homodimer, heterodimer, oligomer 형성에 관여하는 것으로 알려져 있으나, BTB/POZ domain간의 상호작용과 이러한 상호작용이 어떤 생물학적 의미를 지니는가에 대해서는 잘 연구되어 있지 않다. BTB/POZ domain간의 상호작용을 연구하기위하여 우선 사람의 182개의 BTB/POZ domain 단백질들을 Crustral Wide 프로그램을 이용하여 아미노산의 유사성을 바탕으로 계통수를 제작하였다. POZ 도메인 단백질들은 31개의 소그룹으로 분류되었고 여러 소그룹 중 FBI-1과 POZ 도메인의 아미노산 서열이 가장 유사한 APM-1과 KL10을 선택하여 이들 단백질들의 BTB/POZ domain간 상호작용 유무를 조사하였다.

각각의 유전자들은 attB 부위를 포함하는 형태로, PCR 증폭을 통하여 준비하고 pDONR 벡터와 BP 반응을 통하여 entry clone을 만들었다. 이 반응은 BP clonase 효소를 이용하였고 E. coli DH5a 균주를 이용하여 형질전환시켰다. entry clone의 선별은 pDONR 벡터에 존재하는 Kanamycin (Km)의 저항성을 이용하여 Km 50 ㎍/ml이 포함된 고체 배지에서 저항성을 가지고 성장하는 콜로니들을 선별하였다. Km에 저항성을 가지고 자란 콜로니들은 BP 반응 이후 반응 부산물로 ccdB/크로람페니콜 저항 유전자가 빠져나가므로 크로람페니콜 항생제 저항성은 가지지 않는 특성을 이용하여 크로람페니콜 170㎍/ml이 포함된 고체배지에서 다시 한번 선별되었다. 두 번의 선별 과정을 거친 entry clone들은 우리가 개발한 독창적인 destination 벡터와 LR clonase를 이용하여 LR 반응 을 통한 expression clone 생산에 사용되었다. LR 반응이 일어나면 attR 부위를 가지는 entry clone과 destination 벡터의 attP 부위와 재조합 반응을 통하여 entry clone에 있는 목적 유전자가 destination 벡터로 옮겨지고 attB 부위가 생성되는 expression clones가 생성된다. Expression 클론은 재조합 반응의 부산물로 생기는 ccdB/크로람페니콜 저항 유전자와 destination 벡터의 Amp 저항성을 이용하여 선별되었다. LR 반응의 반응물들은 E.coli DH5a로 형질 전환시킨 후 Amp 50㎍/ml을 포함하는 고체배지에서 자라는 콜로니들을 1차 선별한 후 이 콜로니들이 크로람페니콜 170㎍/ml이 포함된 고체배지에서 성장하지 못하는지 확인한 후 염기서열 분석을 통하여 expression clone으로 확립되었다.

이렇게 만들어진 expression clone들은 African green monkey kidney cells (CV-1) 과 human kidney cells (293A) 에 transfection 시키고 24시간 후 세포 내에서 POZ-도메인 단백질 간 상호작용을 compocal 현미경을 통하여 관찰 하였다. 상호작용이 존재하는 경우에 YN과 YC가 YFP로 재구성되어 YFP 고유의 에너지 발산 파장에서 방출되는 빛을 측정함으로써 상호작용을 확인하였다. 그 결과 APM-1과 FBI-1은 형광을 핵 부위에서 보임에 따라 homodimer 및 heterodimer를 잘 이루는 것을 관찰할 수 있었으나 KL10의 경우에는 약한 homodimerization 및 heterodimerization을 이룸을 알 수 있었다.

융합된 YN 또는 YC 조각에 의한 상호작용의 변화가 있는지 알아보고자 동일한 상호작용 짝을 YN, YC로 치환하여 보았으나 어떠한 YFP 조각에 융합되는지에 상관없이 동일한 상호작용 결과를 얻었다. 대조군으로 사용된 Jun-Fos는 이미 상호작용함이 잘 알려진 짝이고 FPIA-YN과 FPIA-YC는 YN 조각과 YC 조각은 존재하지만 세포 내에서 상호작용 할 수 있는 POZ-도메인은 없으므로 단지 YN과 YC가 가까운 거리에 의한 비 특이적인 형광을 발하지 않음을 증명하기 위한 대조군으로 사용되었다. Fos-Jun은 상호작용하여 강한 형광을 발하였으나 FPIA-YN과 FPIA-YC는 빛을 발하지 않음을 관찰 할 수 있었다. YFP로 재구성 되지 못하여 빛을 발하지 않은 FPIA-YN과 FPIA-YC는 단백질 수준에서는 세포내에서 잘 발현됨을 확인하기 위하여 Western blotting을 수행하였다. 각각의 FPIA-YN은 Flag-tag이 융합되어있고, FPIA-YC는 HA-tag가 융합되어있으므로 anti-Flag-tag 항체와 anti-HA-tag 항체를 이용하여 세포 내에서 단백질이 잘 발현되고 있음을 확인하였다 (도 4).

새로운 검색 방법을 이용하여 얻어진 결과를 기존의 단백질-단백질 상호작용 검색 방법인 mammalian two-hybrid assay 결과와 비교하여 보았다 (도 5). 각각의 유전자들을 GAL4- 또는 VP16이 융합된 형태의 플라스미드로 클로닝하여 CV-1 세포와 293A 세포들에 0.4 ㎍씩, reporter 유전자인 pCMV-luciferase 와 pCMV-LacZ 각각 0.2 ㎍ (합계 1.2㎍)으로 transfection하였다. 24시간 후 cell lysate로 만들어 reporter 유전자들의 활성화 정도를 측정한 결과, APM-1과 FBI-1 POZ-도메인들은 새로운 분석 방법에서 얻어진 결과와 동일하게 homodimer 및 다른 POZ-도메인 단백질들과 heterodimer를 이룸을 알 수 있었으나 KL10의 경우 대조군과 reporter 유전자의 활성 정도가 유사하거나 낮아 homodimerization 및 heterodimerization을 증명하기 힘들었다. Mammalian two-hybrid assay는 reporter 유전자의 활성화 정도를 측정하여, 단백질간의 상호작용을 분석하므로 약한 상호작용은 강력한 reporter 유전자의 활성화를 일으키지 못하여 대조군과 비교시 상호작용이 있음에도 불구하고 상호작용을 규명하기가 힘든 단점이 있다. 따라서 우리가 새로이 개발한 단백질 상호작용 분석 시스템에서 얻어진 결과를 in vitro에서 직접적인 단백질간의 상호작용 여부를 GST 융합 단백질 pull-down assay를 통하여 확인하였다. GST가 융합된 형태의 POZ 도메인 단백질들과 [³⁵S]-methionine 으로 표지시킨 POZ-도메인 단백질들을 준비하였다. GST-POZ-도메인 단백질들은 pGEX4T 벡터를 이용하여 E. coli BL21 균주에 IPTG를 이용하여 발현시킨 후 glutathione-agarose 4B bead에 결합시켜 affinity 컬럼을 준비한 후 TNT Quick-coupled Transcripton/Translation System을 이용하여 준비한 [³⁵S]-methionine 으로 표지된 POZ-도메인 단백질들을 넣어주어, POZ-도메인 단백질들의 homodimerization과 heterodimerization을 조사하였다. 그 결과 APM-1, FBI-1, KL10 POZ-도메인 단백질 모두 homodimer 및 다른 POZ-도메인들과 heterodimer를 잘 이룸을 관찰할 수 있었다.

이러한 결과들을 바탕으로 새로이 개발된 고속 단백질-단백질 상호작용 분석시스템이 mammalian two hybrid assay 시스템과 같이 reporter 유전자의 활성화 측정으로 상호작용을 판별하는 연구방법이 가지는 단점을 극복하여 약한 상호작용도 연구 할 수 있는 고감도 분석 방법임을 알 수 있었다. 본 발명의 가장 큰 장점은 수많은 목적 유전자들의 상호작용을 검색하기 위해 다음의 3 단계만이 필요다는 점이다. attB 부위를 가지는 목적 유전자 (PCR 산물 또는 attB 부위를 가지는 플라스미드로 cloning 된 유전자) 준비, BP 반응과 LR 반응 수행, expression 클론을 적정 세포에 trnasfection 시키고 24시간 후 형광 현미경이나 Conpocal 현미경으로 관찰하기만 하면 되는 간단한 과정이다. 실험자의 능력에 따라 수많은 유전자들 사이의 상호작용을 동시에 빠르게 검색할 수 있다. 또한 이러한 과정들을 거쳐 3-7일 이내에 단백질-단백질 상호작용을 검색할 수 있어 시간적 측면에서 수많은 단백질들 중 상호작용 짝을 찾고자 할 때 매우 유용하다. 따라서 본 발명은 고속으로 대량의 단백질-단백질 상호작용 연구를 가능하게 하는 유용한 방법들 중 하나이다.

단백질-단백질 상호작용의 분석은 기초과학, 의-과학 응용기술의 개발에 필수적인 기술이다. 현재 게놈 기술, 프로테옴 기술의 발달로 나오는 유전정보, 단백질의 종류가 엄청나게 쏟아지고 있어, 연구개발이 병목현상에 직면하고 있다. 기존 기술로는 과학자들이 평생을 걸려도 처리하기엔 너무나 많은 후보 유전자, 단백질들을이 존재한다. 생물정보학과 같은 실리콘 소프트웨어 기술이 어느 정도 도움을 줄 수 있으나, 실험적인 확실한 증거를 제시할 수는 없다. 본 발명은 단백질들의 in vivo 상호작용을 세포 내에서 빠르게 규명하고, 상호작용의 회로도를 작성하여 이로부터 유추되는 핵심 타겟 단백질과 그들에 의하여 조절되는 세포기능 연구를 가속화시킬 수 있을 것으로 생각된다. 최근에는 단백질들의 번역과정 이후의 변화가 세포 기능 조절에 중요하게 작용함이 밝혀지고 있는데 단백질들의 인산화, 유비퀴틴화, 수모화, 당질화 등의 변화도 새로 개발된 고속의 상호작용 시스템을 이용하여 분석이 가능하며, 이러한 분석 결과들을 기초로 하여 단백질의 다양한 기능적 변화를 밝혀냄으로써 다양한 질병의 발병 기전을 이해하는데 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다. 본 발명은 나아가 이 기술을 다양한 분야의 연구자들이 활용하게 하여 생물학 의-과학적 연구에 가속도를 붙이는데 기여할 수 있다.

<110> Industry-AcademicCooperation Foundation, Yonsei University <120> Method for analyzing protein-protein interaction <150> KR10-2006-0006539 <151> 2006-01-20 <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 7734 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pFPIA-YN vector <400> 1 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420 attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600 tcgctattac 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caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 6540 attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac 6600 gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc 6660 ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag 6720 taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt 6780 ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag 6840 ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca 6900 gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact 6960 ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca 7020 gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg 7080 tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc 7140 atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg 7200 gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca 7260 tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 7320 atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc 7380 agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 7440 ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 7500 tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 7560 aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat 7620 tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa 7680 aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtc 7734 <210> 2 <211> 7491 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pFPIA-YC vector <400> 2 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420 attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840 ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gcttaccatg 900 gctcctccaa aaaagaagag aaaggtactt atggccatgg aggcccgaat tatcacaagt 960 ttgtacaaaa aagctgaacg agaaacgtaa aatgatataa atatcaatat attaaattag 1020 attttgcata aaaaacagac tacataatac tgtaaaacac aacatatcca gtcatattgg 1080 cggccgcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat aatgtgtgga 1140 ttttgagtta ggatccgtcg agattttcag gagctaagga agctaaaatg gagaaaaaaa 1200 tcactggata taccaccgtt gatatatccc aatggcatcg taaagaacat tttgaggcat 1260 ttcagtcagt tgctcaatgt acctataacc agaccgttca gctggatatt acggcctttt 1320 taaagaccgt aaagaaaaat aagcacaagt tttatccggc ctttattcac attcttgccc 1380 gcctgatgaa tgctcatccg gaattccgta tggcaatgaa agacggtgag ctggtgatat 1440 gggatagtgt tcacccttgt tacaccgttt tccatgagca aactgaaacg ttttcatcgc 1500 tctggagtga ataccacgac gatttccggc agtttctaca catatattcg caagatgtgg 1560 cgtgttacgg tgaaaacctg gcctatttcc ctaaagggtt tattgagaat atgtttttcg 1620 tctcagccaa tccctgggtg agtttcacca gttttgattt aaacgtggcc aatatggaca 1680 acttcttcgc ccccgttttc accatgggca aatattatac gcaaggcgac aaggtgctga 1740 tgccgctggc gattcaggtt catcatgccg tttgtgatgg cttccatgtc ggcagaatgc 1800 ttaatgaatt acaacagtac tgcgatgagt ggcagggcgg ggcgtaaacg cgtggatccg 1860 gcttactaaa agccagataa cagtatgcgt atttgcgcgc tgatttttgc ggtataagaa 1920 tatatactga tatgtatacc cgaagtatgt caaaaagagg tatgctatga agcagcgtat 1980 tacagtgaca gttgacagcg acagctatca gttgctcaag gcatatatga tgtcaatatc 2040 tccggtctgg taagcacaac catgcagaat gaagcccgtc gtctgcgtgc cgaacgctgg 2100 aaagcggaaa atcaggaagg gatggctgag gtcgcccggt ttattgaaat gaacggctct 2160 tttgctgacg agaacagggg ctggtgaaat gcagtttaag gtttacacct ataaaagaga 2220 gagccgttat cgtctgtttg tggatgtaca gagtgatatt attgacacgc ccgggcgacg 2280 gatggtgatc cccctggcca gtgcacgtct gctgtcagat aaagtctccc gtgaacttta 2340 cccggtggtg catatcgggg atgaaagctg gcgcatgatg accaccgata tggccagtgt 2400 gccggtctcc gttatcgggg aagaagtggc tgatctcagc caccgcgaaa atgacatcaa 2460 aaacgccatt aacctgatgt tctggggaat ataaatgtca ggctccctta tacacagcca 2520 gtctgcaggt cgaccatagt gactggatat gttgtgtttt acagcattat gtagtctgtt 2580 ttttatgcaa aatctaattt aatatattga tatttatatc attttacgtt tctcgttcag 2640 ctttcttgta caaagtggtg atgatctctc gaggtaccgc ggccgcacgt ccggcgtgca 2700 aaatcccgaa cgacctgaaa cagaaagtca tgaaccacga caagcagaag aacggcatca 2760 aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact 2820 accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga 2880 gctaccagtc cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg 2940 agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag tacccatacg 3000 atgttccaga ttacgcttga tctagataac taagggccct attctatagt gtcacctaaa 3060 tgctagagct cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 3120 cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata 3180 aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt 3240 ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt 3300 gggctctatg gcttctgagg cggaaagaac cagctggggc tctagggggt atccccacgc 3360 gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac 3420 acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt 3480 cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg gggcatccct ttagggttcc gatttagtgc 3540 tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc 3600 gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact 3660 cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg 3720 gattttgggg atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc 3780 gaattaattc tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccaggc 3840 aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc 3900 aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccatagt 3960 cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc 4020 ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctctg cctctgagct 4080 attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa agctcccggg 4140 agcttgtata tccattttcg gatctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat 4200 tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta 4260 tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca 4320 ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcagga 4380 cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga 4440 cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct 4500 cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg 4560 gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga 4620 gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca 4680 tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgcgcatgc ccgacggcga 4740 ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg 4800 cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc 4860 gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt 4920 gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga 4980 gttcttctga gcgggactct ggggttcgaa atgaccgacc aagcgacgcc caacctgcca 5040 tcacgagatt tcgattccac cgccgccttc tatgaaaggt tgggcttcgg aatcgttttc 5100 cgggacgccg gctggatgat cctccagcgc ggggatctca tgctggagtt cttcgcccac 5160 cccaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc 5220 acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta 5280 tcttatcatg tctgtatacc gtcgacctct agctagagct tggcgtaatc atggtcatag 5340 ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc 5400 ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc 5460 tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa 5520 cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg 5580 ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg 5640 ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag 5700 gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 5760 gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 5820 taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 5880 accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca atgctcacgc 5940 tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 6000 cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 6060 agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 6120 gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca 6180 gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 6240 tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt 6300 acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct 6360 cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc 6420 acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa 6480 acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta 6540 tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc 6600 ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat 6660 ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta 6720 tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt 6780 aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt 6840 ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg 6900 ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc 6960 gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc 7020 gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg 7080 cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga 7140 actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta 7200 ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct 7260 tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag 7320 ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga 7380 agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat 7440 aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt c 7491 <210> 3 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPIA-YN sense primer <400> 3 gatcctcgag accatggctc ctccaaaaaa gaagagaaag gtacttgcgg ccgcgaattc 60 a 61 <210> 4 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPIA-YN antisense primer <400> 4 gatcgggccc tcacttgtcg tcatcgtctt tgtagtcggc catgatatag acgtt 55 <210> 5 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPIA-YC sense primer <400> 5 gatcaagctt accatggctc ctccaaaaaa gaagagaaag gtacttatgg ccatggaggc 60 c 61 <210> 6 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPIA-YC antisense primer <400> 6 gatctctaga tcaagcgtaa tctggaacat cgtatgggta cttgtacagc tcgtccat 58 <210> 7 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APM-1 POZ domain expression clone sense primer <400> 7 gggacaagtt tgtacaaaaa agcaggctct gacaatgaca ttgatgag 48 <210> 8 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APM-1 POZ domain expression clone antisense primer <400> 8 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc gcctccgggc tccatgat 48 <210> 9 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FBI-1POZ domain expression clone sense primer <400> 9 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc tgccggcggc gtggacggc 49 <210> 10 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FBI-1POZ domain expression clone antisense primer <400> 10 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ctgccggtcc aggag 45 <210> 11 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KL10 POZ domain expression clone sense primer <400> 11 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc tgagagcacc gc 42 <210> 12 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KL10 POZ domain expression clone antisense primer <400> 12 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc acacagctcc gacttgag 48 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAL4 mAPM-1 POZ domain sense primer <400> 13 ggatcgaatt cgccaatgac attgatgagc tg 32 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAL4 mAPM-1 POZ domain antisense primer <400> 14 gatcggatcc tagggctccg ggctccatga t 31 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP16 APM-1 homolog POZ sense primer <400> 15 gatcggatcc gccaatgaca ttgatgag 28 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP16 APM-1 homolog POZ antisense primer <400> 16 gatcgatagc taggcctccg ggctccatga t 31 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAL4 KLHL10 POZ sense primer <400> 17 gatcgatatc gagagcaccg ctgcctcc 28 <210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAL4 KLHL10 POZ antisense primer <400> 18 gatcggatcc tagacacagc tccgacttga g 31 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP16 KLHL10 POZ sense primer <400> 19 gatcggatcc gagagagcac cgctgcctcc 30 <210> 20 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP16 KLHL10 POZ antisense primer <400> 20 gatcgctagc tagacacagc tccgacttga g 31 <210> 21 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGEX4T1 mAPM-1 POZ domain sense primer <400> 21 gatcggatcc accatggcca atgacattga tgagctg 37 <210> 22 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGEX4T1 mAPM-1 POZ domain antisense primer <400> 22 gatcgtcgac gcctccgggc tccatgatct c 31 <210> 23 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGEX4T1 KLHL10 POZ domain sense primer <400> 23 gatcggatcc accatggaga tggagagcac cgctgcc 37 <210> 24 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGEX4T1 KLHL10 POZ domain antisense primer <400> 24 gatcgtcgac acacagctcc gacttgagga a 31

Claims (11)

1. (ⅰ)형광 단백질의 N 말단 영역과 융합된 융합 단백질의 형태로 발현시키는 벡터와 형광 단백질의 C 말단 영역과 융합된 융합 단백질 형태로 발현시키는 벡터 각각에, 목적 단백질을 코딩하는 핵산 또는 분석 대상 단백질을 코딩하는 핵산을 도입하는 단계;

   상기 벡터는 DNA 서열 교환(exchange)을 위한 DNA 재조합 서열(DNA recombination sequence) 쌍을 포함하는 부위-특이적 재조합이 일어나는 벡터로, 프로모터 하부에 핵 위치 시그널(nuclear localization signal)을 포함한다.

   (ⅱ)상기 단계에서 준비한 목적 단백질을 발현하는 벡터 및 분석 대상 단백질을 발현하는 벡터를 세포에 형질전환시키고 배양하는 단계;

   (ⅲ)목적 단백질과 분석 대상 단백질 간의 상호작용을 형광 단백질의 형광으로 측정하는 단계;

   를 포함하는 세포내 단백질-단백질 상호작용(in vivo protein-protein interaction)을 분석하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 형광단백질이 YFP(yellow fluorescent protein), GFP(green fluorescent protein), enhanced GFP, BFP(blue fluorescent protein) 또는 CFP(cyan fluorescent protein)인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 벡터의 DNA 재조합 서열이 attR인 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 벡터의 핵 위치 시그널이 PPKKRKV를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 방법,

   상기에서 P는 프롤린, K는 라이신, R은 아르기닌 및 V는 발린을 나타낸다.
5. 제1항에 있어서, 벡터의 융합단백질을 코딩하는 서열의 하부에 태그(tag)를 코딩하는 서열을 추가로 포함하는 벡터.
6. 제5항에 있어서, 태그가 플래그 태그(Flag tag) 또는 HA 태그인 벡터.
7. 제1항에 있어서, 상기 벡터가 포유 동물 세포에서 발현 효율이 높은 프로모터를 포함하는 벡터.
8. 제7항에 있어서, 프로모터가 CMV 프로모터인 벡터.
9. 제1항 내지 8항의 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 중 형광 단백질의 N 말단 영역과 융합된 융합 단백질 형태로 발현시키는 벡터가 도 1A에 개시된 pFPIA-YN 벡터이고 형광 단백질의 C 말단 영역과 융합된 융합 단백질 형태로 발현시키는 벡터가 도 1B에 개시된 pFPIA-YC 벡터인 방법.
10. 제1항에 있어서, (ⅲ) 단계에서 형광을 형광 현미경 또는 콘포컬 현미경으로 측정하는 것인 방법.
11. 세포내 단백질-단백질 상호작용 분석을 위한 도 1A에 개시된 pFPIA-YN 및 도 1B에 개시된 pFPIA-YC 벡터.

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