CN114231513B - 一种可抑制蛋白酶体psmb5亚基活性的短肽及其在抗立克次体感染中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可抑制蛋白酶体PSMB5亚基活性的短肽及其在抗立克次体感染中的应用。本发明提供了短肽的应用，所述短肽序列如SEQ ID No.1所示。该应用为（1）制备蛋白酶体β5亚基活性抑制剂；（2）抑制蛋白酶体β5亚基活性；（3）制备治疗立氏立克次体所致疾病的药物；（4）治疗立氏立克次体所致疾病；（5）制备抗立氏立克次体感染的药物；（6）抗立氏立克次体感染。

Description

一种可抑制蛋白酶体PSMB5亚基活性的短肽及其在抗立克次 体感染中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可抑制蛋白酶体PSMB5亚基活性的短肽及其在抗立克次体感染中的应用。

背景技术

人泛素蛋白酶体系统（Ubiquitin-proteasome system，UPS）是调节体内信号通路和免疫应答的关键因子，对于维持细胞稳态具有重要意义。其中真核细胞26S蛋白酶体（Proteasome）是由19S调节亚基和20S核心亚基组成的多亚基复合物，蛋白酶体 β5亚基（PSMB5亚基）是蛋白酶体20S核心亚基的组成部分，具有胰凝乳样蛋白酶活性，调控蛋白质体内稳态，在免疫应激下能够拓宽MHC-I 类抗原肽范围。

立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)作为一种革兰氏阴性染色的胞内寄生小杆菌，是斑点热群立克次体(spotted fever group rickettsia, SFGR)中毒力最强的一个种，为落基山斑点热(Rocky Mountain Spotted Fever, RMSF)的病原菌。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种用于体内实验和体外实验中均可抑制人蛋白酶体PSMB5亚基的胰凝乳样蛋白酶活性的短肽，该短肽还可抑制立氏立克次体在人上皮细胞系中的繁殖。

本发明提供了短肽（下述也称为CirB-30aa多肽）在如下任一中的应用，所述短肽序列如SEQ ID No.1所示，

（1）制备蛋白酶体 β5亚基活性抑制剂；

（2）抑制蛋白酶体 β5亚基活性；

（3）制备治疗立氏立克次体所致疾病的药物；

（4）治疗立氏立克次体所致疾病；

（5）制备抗立氏立克次体感染的药物；

（6）抗立氏立克次体感染。

可选地，根据上述的应用，所述立氏立克次体所致疾病为落基山斑点热。

本发明还提供了上述的短肽相关的生物材料在如下任一中的应用，

（1）制备蛋白酶体 β5亚基活性抑制剂；

（2）抑制蛋白酶体 β5亚基活性；

（3）制备治疗立氏立克次体所致疾病的药物；

（4）治疗立氏立克次体所致疾病；

（5）制备抗立氏立克次体感染的药物；

（6）抗立氏立克次体感染。

所述生物材料为如下任一种：

B1）编码上述短肽的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体；

B4）含有B2）所述表达盒的重组载体；

B5）含有B1）所述核酸分子的重组微生物；

B6）含有B2）所述表达盒的重组微生物；

B7）含有B3）所述重组载体的重组微生物；

B8）含有B4）所述重组载体的重组微生物。

可选地，根据上述的应用，B1）所述的核酸分子序列如SEQ ID No.2所示；B3）所述的重组载体序列如SEQ ID No.6所示。

可选地，根据上述的应用，所述立氏立克次体所致疾病为落基山斑点热。

抑制蛋白酶体 β5亚基活性具体可为抑制蛋白酶体 β5亚基（例如，人蛋白酶体 β5亚基）的胰凝乳样蛋白酶活性。抗立氏立克次体感染具体可为抑制立氏立克次体在宿主细胞（例如，人细胞）内生长繁殖。

上述的短肽也属于本发明的保护范围之内。

上述的生物材料也属于本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种药物，活性成分包括上述的短肽和/或上述的生物材料，所述药物具有如下任一用途：

（1）抑制蛋白酶体 β5亚基活性；

（2）治疗立氏立克次体所致疾病；

（3）抗立氏立克次体感染。

可选地，根据上述的药物，所述立氏立克次体所致疾病为落基山斑点热。

上述短肽可由如下方法制备：

(1)通过多肽合成的方法直接合成CirB的第91至120位，共30个氨基酸的序列（即SEQ ID No.1）；或

(2)将CirB的第91至120位氨基酸的编码基因（例如，序列如SEQ ID No.2所示）克隆至pLVX-IRES-RFP或其他真核表达载体上，并转染真核细胞表达该短肽。

申请人研究发现专性细胞内寄生菌——贝氏柯克斯体在感染真核宿主细胞过程中分泌到宿主细胞质中的效应蛋白CirB，可通过其第91至120位的30个氨基酸（CirB_91-120，即CirB-30aa）抑制人细胞蛋白酶体PSMB5亚基的胰凝乳样蛋白酶活性。

本发明实施例表明人工合成CirB-30aa多肽，可在体外实验中抑制纯化的人蛋白酶体PSMB5亚基的胰凝乳样蛋白酶活性；在人上皮细胞系（Hela）中转染表达CirB-30aa的真核表达质粒，可长时间抑制蛋白酶体PSMB5亚基胰凝乳样蛋白酶活性，且与已上市的PSMB5亚基抑制剂——硼替佐米相比，毒副作用更低；在人上皮细胞系（Hela）中转染表达CirB-30aa的真核表达质粒，可抑制立氏立克次体在宿主细胞内生长繁殖。

本发明提供了一种由30个氨基酸组成的短肽，合成该短肽可在体外实验中抑制人蛋白酶体PSMB5亚基的胰凝乳样蛋白酶活性；用编码该短肽的真核表达质粒转染人细胞系，可长时间抑制蛋白酶体PSMB5亚基胰凝乳样蛋白酶活性，进而抑制细胞内立氏立克次体的繁殖。

附图说明

图1为合成的短肽与纯化的人蛋白酶体共混后，短肽抑制人蛋白酶体PSMB5亚基的胰凝乳样蛋白酶活性的（A）时间依赖性检测和（B）剂量依赖性检测。

图2为质粒转染细胞的短肽表达效率检测（A）荧光检测和（B）Westernblot检测。

图3为质粒转染Hela细胞后，抑制人蛋白酶体PSMB5亚基的胰凝乳样蛋白酶活性的（A）剂量依赖检测（B）时间依赖检测和（C）硼替佐米对照。

图4为质粒转染Hela细胞后，细胞活力的（A）剂量依赖检测、（B）时间依赖检测和（C）硼替佐米对照。

图5为质粒转染细胞后，对细胞中立氏立克次体胞内繁殖的抑制效率检测。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

Hela细胞系购自南京科佰，货号CBP60232。Hela细胞采用DMEM培养基+10%（体积百分比）胎牛血清培养。

DMEM培养基购自美国Gibco公司，货号C11995500BT；胎牛血清购自美国Gibco公司，货号11875-093。

质粒pLVX-IRES-RFP、pLVX-IRES-RFP-CirB-30aa、pLVX-IRES-RFP-Cig57-30aa均由北京擎科生物科技有限公司合成。

动物细胞/组织胞质蛋白酶体富集试剂盒购自英文特生物技术公司，货号PT-040；20S蛋白酶体活性检测试剂盒（利用荧光底物Suc-LLVY-AMC特异性检测20S蛋白酶体PSMB5亚基的胰凝乳样蛋白酶体活性）购自Abcam公司，货号ab112154；细胞活性检测试剂盒(MTT) 购自Roche公司，货号11465007001；质粒提取试剂盒购自invitrogen公司，货号K210017；抗RFP蛋白抗体购自invitrogen公司，货号R10367；大肠杆菌Top10菌株购自天根生化科技有限公司，货号CB104；Western及IP细胞裂解液、蛋白酶抑制剂混合物、PMSF均购自碧云天生物技术有限公司，货号分别为：P0013、P1006、ST506；硼替佐米购自MedChemExpress公司，货号HY-10227。

立氏立克次体Sheila Smith株（Rickettsia rickettsii，Sheila Smithstrain）：在文献“Ellison DW, Clark TR, Sturdevant DE, Virtaneva K, Porcella SF,Hackstadt T. Genomic comparison of virulent Rickettsia rickettsii SheilaSmith and avirulent Rickettsia rickettsii Iowa. Infect Immun. 2008 Feb; 76(2): 542-50. Epub 2007 Nov 19”中公开，公众均可在法律法规允许的情况下，从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得。

实施例1、CirB-30aa短肽体外抑制人蛋白酶体PSMB5亚基的胰凝乳样蛋白酶活性测定

1. 人Hela细胞内蛋白酶体抽提和纯化

采用动物细胞/组织胞质蛋白酶体富集试剂盒对人Hela细胞内蛋白酶体抽提和纯化，具体方法如下。

(1) 将离心管柱及接收管套管放在冰上预冷。Buffer A 放置冰上预冷。

(2) 600g离心5min，收集4×10⁷个细胞，用预冷的PBS清洗细胞一次。用 450uLBuffer A 重悬细胞沉淀。涡旋大力振荡30s，迅速转移至离心管柱上。

(3) 盖上盖子，颠倒混匀几次，16000 g 离心 30s。（此步骤需离心机快速升速，10S 内到达 16000×g 可提高得率）

(4) 弃去离心管柱，涡旋震荡混匀，16000 g 离心30min，小心吸取 400ul 上清转移至一个新的 1.5ml 离心管中。离心所得沉淀主要是细胞核，大的细胞碎片，细胞器和细胞质膜。

(5) 将 400uL 缓冲液 B 添加到 400µl 上清液的离心管中（缓冲液 B 与上清的比例为 1:1）。涡旋震荡 20S 混 匀。冰上孵育 10min。10000g，离心 10min，弃上清，留沉淀。

(6) 将离心管再次 10000g 离心，尽量将管壁残液去除干净。沉淀是富集的高纯度蛋白酶体，蛋白酶体很容易溶于水溶液。

(7) 用100 uL PBS 复溶蛋白酶体沉淀获得蛋白酶体。

2. 纯化的蛋白酶体与合成CirB-30aa短肽共混后蛋白酶体PSMB5亚基胰凝乳样蛋白酶活性检测

采用20S蛋白酶体活性检测试剂盒（利用荧光底物Suc-LLVY-AMC特异性检测20S蛋白酶体PSMB5亚基的胰凝乳样蛋白酶体活性）进行蛋白酶体PSMB5亚基活性检测。

（1）根据贝氏柯克斯体效应蛋白CirB-30aa序列（如SEQ ID No.1所示）合成多肽，以与CirB-30aa具有相同氨基酸极性和组成的效应蛋白Cig57-30aa序列（序列如SEQ IDNo.3所示）为对照多肽，用PBS缓冲液将上述多肽稀释至1mg/mL。

（2）在蛋白酶体活性检测96孔板中配置反应体系：步骤1获得的蛋白酶体0.001mg/mL；SDS 0.01%（体积百分比）；合成多肽（CirB-30aa或Cig57-30aa） 0.05, 0.1,0.2, 0.5, 1,10μM梯度稀释；Suc-LLVY-AMC 100μM；50mM Tris-HCl (pH8.0) 补足100μL。

对照组（normal或Ctrl）反应体系：步骤1获得的蛋白酶体 0.001mg/mL；SDS 0.01%（体积百分比）；Suc-LLVY-AMC 100μM；50mM Tris-HCl (pH8.0) 补足100μL。

震荡混匀后进行荧光值检测，从加入反应液起始至60min每5分钟检测一次（Ex:380nm; Em: 460nm）。

结果如图1所示。图1中的A为检测的荧光强度，荧光强度反应蛋白酶体PSMB5亚基胰凝乳样蛋白酶活性。在加入不同浓度的Cig57-30aa组别中，荧光强度随时间的延长呈现上升趋势，表明蛋白酶体PSMB5亚基胰凝乳样蛋白酶活性正常；而在分别加入浓度为0.5μM、1μM和10μM的CirB-30aa组别中，荧光强度随时间的延长并不呈现上升趋势，表明0.5μM以上浓度的CirB-30aa对蛋白酶体PSMB5亚基胰凝乳样蛋白酶活性具有抑制作用，并且这种抑制作用不随时间延长而缓解。图1中的B为反应液起始至30min时的荧光强度统计结果，加入浓度为10μM、1μM、0.5μM、0.2μM、0.1μM、 和0.05μM CirB-30aa组别的荧光强度分别约为对照组荧光强度的0.296±0.014、0.383±0.010、0.436±0.011、0.804±0.018、0.993±0.020、1.009±0.015倍。蛋白酶体PSMB5亚基胰凝乳样蛋白酶活性荧光强度在CirB-30aa加入剂量为0.5μM至10μM的组别显著低于对照组，表明0.5μM至10μM的CirB-30aa对蛋白酶体PSMB5亚基的胰凝乳样蛋白酶活性具有显著的抑制性。

实施例2、转染CirB-30aa真核表达质粒（pLVX-IRES-RFP）对蛋白酶体PSMB5亚基的胰凝乳样蛋白酶活性的抑制

1.构建pLVX-IRES-RFP -CirB-30aa、pLVX-IRES-RFP -Cig57-30aa真核表达质粒

将CirB-30aa的基因编码序列（如SEQ ID No.2所示）通过同源重组方式整合至pLVX-IRES-RFP质粒（序列如SEQ ID No.5所示）RFP基因羧基端，以Cig57-30aa的基因编码序列（如SEQ ID No.4所示）通过同源重组方式整合至pLVX-IRES-RFP质粒RFP基因羧基端为对照，通过转化大肠杆菌Top10菌株和Amp抗性筛选获得重组菌，利用质粒提取试剂盒大量提取重组质粒pLVX-IRES-RFP、pLVX-IRES-RFP-CirB-30aa、pLVX-IRES-RFP-Cig57-30aa。

质粒DNA提取步骤如下：

(1) 将获取的大肠杆菌按照1/100的比例分别接种至200ml含Amp的LB培养基中，37℃ 200rpm/min过夜孵育。

(2) 4000g离心5min菌体，弃去上清。

(3) 用10ml含RNaseA的悬浮缓冲液R3液重悬菌体，混匀后加入10ml裂解缓冲液L7。混匀后裂解5min，加入10ml沉淀缓冲液N3并混匀。

(4) 将滤筒放入Maxi柱内，加入30ml平衡缓冲液EQ1，待液体依靠重力全部排出后，将上一步制备的液体倒入柱内，直至液体全部排出，弃去液体。

(5) 弃掉滤筒，柱内加入50ml洗涤缓冲液W8，液体完全流出后弃去液体。

(6) 柱内加入15ml洗脱缓冲液E4，收集流出液体，并加入10.5ml异丙醇。

(7) 混匀后12000g 4℃ 离心30min，小心弃去上清，加入5ml 70%乙醇重悬质粒DNA，12000g 4℃离心5min，小心弃去上清。

(8) 晾干质粒DNA沉淀，用200μl TE缓冲液溶解质粒DNA，测量浓度后-40℃保存。

pLVX-IRES-RFP-CirB-30aa序列如SEQ ID No.6所示，第4092-4181位为CirB-30aa的基因编码序列。pLVX-IRES-RFP-Cig57-30aa如SEQ ID No.7所示，第4092-4181位为Cig57-30aa的基因编码序列。

表达质粒转染细胞

(1) 以4×10⁴个/孔/100μL的Hela细胞铺96孔板，过夜培养；(2) 待细胞汇合率达到70%时，使用Lipofectamine3000进行细胞转染，具体步骤为：1）将5μL的Opti-MEM Medium与0.15μL的Lipofectamine 3000试剂进行混合；2）用5μL的Opti-MEM Medium将0.1μg，0.01μg和0.001μg的pLVX-IRES-RFP-CirB-30aa质粒DNA分别稀释至不同浓度，再与0.2μL的P3000进行混合；3）将1）与2）体系进行混合获得混合液，室温放置15分钟，将10μl混合液分别转染至每孔细胞。

(3) 以pLVX-IRES-RFP-Cig57-30aa质粒转染细胞为对照，步骤同pLVX-IRES-RFP-CirB-30aa质粒转染（即步骤（2））。

(4) 以pLVX-IRES-RFP质粒转染细胞为空白对照，步骤同pLVX-IRES-RFP-CirB-30aa质粒转染（即步骤（2））。

转染pLVX-IRES-RFP-CirB-30aa质粒的蛋白表达荧光检测和Westernblot检测

(1) pLVX-IRES-RFP、pLVX-IRES-RFP-CirB-30aa和pLVX-IRES-RFP-Cig57-30aa质粒转染细胞24h、48h、72h后，在荧光显微镜下用红光通道观察RFP-CirB-30aa和RFP-Cig57-30aa表达情况。

(2) pLVX-IRES-RFP、pLVX-IRES-RFP-CirB-30aa和pLVX-IRES-RFP-Cig57-30aa质粒转染细胞24h后，弃掉细胞培养液，每孔100μL胰酶消化细胞，收集细胞于1.5mL离心管中，3000rpm离心2min，收集细胞沉淀，之后加入1mL 预冷的PBS进行清洗，重复三次。

(3) 期间按照Western及IP细胞裂解液/蛋白酶抑制剂/PMSF为100/1/1的体积比例配制细胞裂解液，按照每孔（96孔板）10μL加入离心管中，重悬步骤（2）清洗后的细胞，于冰上孵育20分钟获得细胞悬液。

(4) 将细胞悬液于4℃，6000 r/min离心20min。

(5) 弃掉步骤（4）离心的沉淀，在上清中加入6×SDS loading buffer，煮沸10min，置于冰上冷却获得蛋白样品。

(6) 用SDS-PAGE分离蛋白样品，并用抗RFP蛋白的抗体检测RFP-CirB-30aa蛋白和RFP-Cig57-30aa蛋白表达情况。

结果如图2所示。图2中的A为部分荧光检测结果，转染0.1μg（每孔/96孔板）pLVX-IRES-RFP、pLVX-IRES-RFP-CirB-30aa和pLVX-IRES-RFP-Cig57-30aa质粒24h，48h，72h后，细胞均出现大量红色荧光，表明RFP-Cig57-30aa、RFP-CirB-30aa蛋白均成功表达。图2中的B为部分Westernblot检测结果，抗RFP蛋白的抗体（α-RFP）可分别识别细胞转染0.1μg（每孔/96孔板）pLVX-IRES-RFP、pLVX-IRES-RFP-Cig57-30aa、pLVX-IRES-RFP-RFP-CirB-30aa样品中的RFP蛋白，且识别的RFP-Cig57-30aa、RFP-CirB-30aa分子量比识别的RFP分子量稍大，表明Cig57-30aa、CirB-30aa成功与RFP嵌合表达。

转染pLVX-IRES-RFP-CirB-30aa的细胞蛋白酶体PSMB5亚基的胰凝乳样蛋白酶活性检测

采用20S蛋白酶体活性检测试剂盒进行蛋白酶体PSMB5亚基胰凝乳样蛋白酶活性检测。在“2. pLVX-IRES-RFP-CirB-30aa表达质粒转染细胞”中转染不同量质粒（0.1μg，0.01μg，0.001μg）；“2. pLVX-IRES-RFP-CirB-30aa表达质粒转染细胞”中质粒转染处理后的不同时间点（24h，48h，72h）进行蛋白酶体活性的检测。

硼替佐米施用：

(1) 以4×10⁴个/孔/100μL的Hela细胞铺96孔板，过夜培养；(2) 待细胞汇合率达到70%时，将硼替佐米按照不同的浓度稀释在细胞培养液中（0μM，0.1μM，1μM，10μM），并替换步骤（1）原有的细胞培养液，处理不同的时间（6h，12h，24h）后进行蛋白酶体活性的检测。

对照（Normal）：

对照组细胞正常培养，不进行任何处理。

蛋白酶体活性的检测方法具体如下。

(1) LLVY-R110底物储存液配制：首先取25μLDMSO加入到LLVY-R110底物整瓶中，配制成400×的储存液。

(2) 蛋白酶体活性检测工作液配置：将25 µL的400× LLVY-R110底物储存液加入到10mL试剂盒配备的Assay Buffer中混匀，稀释成1×工作液。

(3) 将1×工作液按照每孔100μL加入到培养细胞的96孔板中，在37℃避光反应8小时。

(4) 利用机器读取荧光值（Ex/Em=490/525nm）。

结果如图3所示。图3中的A为质粒转染处理后的24h的荧光强度，荧光强度反应蛋白酶体PSMB5亚基胰凝乳样蛋白酶活性，在加入不同用量（0.1μg，0.01μg）的pLVX-IRES-RFP-CirB-30aa (荧光强度分别为131745.633±620.038、277384.633±2821.751) 转染24小时组别中，荧光强度显著低于pLVX-IRES-RFP-Cig57-30aa (荧光强度分别为343548.300±2068.797、479072.300±4586.068) 和pLVX-IRES-RFP (荧光强度分别为432339.967±1760.213、570876.967±5711.704) 组。图3中的B为用量0.01μg质粒转染处理后的不同时间点的荧光强度，在加入0.01μg的pLVX-IRES-RFP-CirB-30aa转染24，48，72小时组别中，蛋白酶体PSMB5亚基胰凝乳样蛋白酶活性荧光强度分别为277384.633±2821.751、271778.633±3818.627、220326.300±3280.031，均显著低于pLVX-IRES-RFP-Cig57-30aa(荧光强度分别为479072.3±4586.068、491662.3±1792.594、428294.2±2108.584) 和pLVX-IRES-RFP (荧光强度分别为570876.967±5711.704、511849.633±3339.003、432339.967±1760.213) 组的荧光强度。图3中的C为不同浓度（0.1μM，1μM，10μM）的硼替佐米施用6，12，24小时对胰凝乳样蛋白酶活性抑制的对照。

结果表明在人上皮细胞系（Hela）中转染表达CirB-30aa的真核表达质粒，可长时间抑制蛋白酶体PSMB5亚基胰凝乳样蛋白酶活性。

转染pLVX-IRES-RFP-CirB-30aa质粒对细胞活力影响检测

采用细胞活性检测试剂盒 (MTT)，分别在“2. pLVX-IRES-RFP-CirB-30aa表达质粒转染细胞”中转染不同量质粒（0.1μg，0.01μg，0.001μg）；“2. pLVX-IRES-RFP-CirB-30aa表达质粒转染细胞”中质粒转染处理后的不同时间点（24h，48h，72h）； “4. 转染pLVX-IRES-RFP-CirB-30aa的细胞蛋白酶体PSMB5亚基的胰凝乳样蛋白酶活性检测”中施用不同浓度的硼替佐米 (0μM，0.1μM，1μM，10μM) 处理后的不同时间点 (6，12，24h)进行细胞活性的检测。

对照（Ctrl或Normal）与“4. 转染pLVX-IRES-RFP-CirB-30aa的细胞蛋白酶体PSMB5亚基的胰凝乳样蛋白酶活性检测”中设置对照的方法相同。

检测细胞活性的方法具体如下。

(1)首先在96孔板培养细胞的每孔（100μl培养液）中加入10μl MTT labelingreagent，使其终浓度为0.5mg/ml（MTT labeling reagent使用前用0.2μm滤膜过滤）。

(2)而后将96孔板置于37℃ 5%CO₂的细胞培养箱中孵育4h。

(3)按照每孔100μl将Solubilization buffer逐孔加入到96孔板中，37℃ 5%CO₂孵育过夜。

(4) 利用机器读取96孔板在570nm波长处的吸光值（参比波长为650nm）。

结果如图4所示，以不进行任何操作的细胞孔作为对照组（Ctrl或Normal），处理组的细胞相对活力值与之相近表明施用试剂对细胞毒性越小，反之表明施用试剂对细胞毒性越大。图4中的A为质粒转染处理后的24h的细胞相对活力值统计，加入不同用量（0.1μg，0.01μg，0.001μg）的pLVX-IRES-RFP-CirB-30aa (细胞相对活力值分别为1.044±0.006、1.262±0.004、1.137±0.051)、pLVX-IRES-RFP-Cig57-30aa (细胞相对活力值分别为1.020±0.053、1.090±0.006、1.100±0.011) 转染24小时与无任何处理的细胞 (细胞相对活力值分别为1.000±0.024、1.116±0.004、1.147±0.003) 在细胞存活状况中未发现明显差异。图4中的B为用量0.01μg质粒转染处理后的不同时间点的细胞相对活力值统计，质粒转染处理后的不同时间点24，48，72小时中，转染pLVX-IRES-RFP-CirB-30aa (细胞相对活力值分别为1.082±0.003、0.860±0.007、0.755±0.014) 、pLVX-IRES-RFP-Cig57-30aa (细胞相对活力值分别为0.934±0.005、0.934±0.003、0.752±0.012) 、pLVX-IRES-RFP (细胞相对活力值分别为0.957±0.003、0.824±0.003、0.725±0.009) 质粒的细胞与无任何处理的细胞 (细胞相对活力值分别为1.000±0.006、0.986±0.002、0.869±0.004)在细胞存活状况中未发现明显差异。图4中的C为不同浓度（0μM，0.1μM，1μM，10μM）的硼替佐米分别施用6 h(细胞相对活力值分别为1.012±0.01197599、0.983±0.046、0.983±0.027、0.704±0.006) ，12h (细胞相对活力值分别为0.964±0.014、0.877±0.020、0.540±0.042、0.287±0.015) ，24h (细胞相对活力值分别为0.999±0.009、0.835±0.038、0.349±0.020、0.205±0.003) 的细胞相对活力值统计，发现与无任何处理的细胞组相比，随着硼替佐米处理细胞浓度与时长的增加，细胞生存数明显下降。表明转染pLVX-IRES-RFP-CirB-30aa、pLVX-IRES-RFP-Cig57-30aa对细胞无明显毒性，而硼替佐米处理6小时以上对细胞具有明显的毒副作用。

实施例3、CirB-30aa在抑制立氏立克次体胞内增殖中的应用

1.pLVX-IRES-RFP-CirB-30aa质粒转染Hela细胞：

转染步骤同实施例二，组别为pLVX-IRES-RFP-CirB-30aa转染组、pLVX-IRES-RFP-Cig57-30aa转染组、pLVX-IRES-RFP转染组，各质粒DNA用量为0.01μg。未转染对照组细胞正常培养，不进行转染操作。

2.立氏立克次体感染pLVX-IRES-RFP-CirB-30aa转染细胞的生长检测

（1）转染后36h换液，并用立氏立克次体（MOI=1）感染细胞，将细胞置于33 °C，5%CO2培养箱内静置培养，约4h后，用1ml的PBS缓冲液清洗每孔3次，再加入1ml含1%FBS的细胞培养液。

（2）于立氏立克次体感染后4天收取各组细胞各3孔，使用DNeasy® Blood ＆Tissue Kit（QIAGEN GmbH）试剂盒按说明书提取总DNA；采用TapMan Universal PCRMaster Mix试剂进行实时荧光定量PCR技术分析细胞内的立氏立克次体体量变化。

实时荧光定量PCR检测所用引物探针具体如下。

R.r-DL-ompB-F：TGAAGATACTACCTTAGGGTTCATCACTA；

R.r-DL-ompB-R：ACCGGCATTAAGCGTAAGGTT；

R.r-DL-ompB-probe：TGTTGTTCATAACGCTCAC。

20μl实时荧光定量PCR反应体系为：TaqMan® Universal PCR Master Mix (2X)10μl；

Forward and reverse primers 3.75μl；Probe 1.25μl；总DNA模板 2μl；RNase-free water 3μl。

实时荧光定量PCR反应条件为：50℃ 2min；95℃ 10min；95℃ 15sec，60℃ 1min，40循环。

结果如图5所示，在转染0.01μg用量的pLVX-IRES-RFP-CirB-30aa组别中 (基因拷贝数为3.779±0.865×10⁷) ，立氏立克次体菌载量显著低于转染pLVX-IRES-RFP-Cig57-30aa (基因拷贝数为6.894±0.279×10⁷) 细胞、转染pLVX-IRES-RFP (基因拷贝数为6.384±0.163×10⁷) 细胞和未转染对照组 (基因拷贝数为6.562±0.249×10⁷)；表明CirB-30aa显著抑制了细胞内立氏立克次体的繁殖。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种可抑制蛋白酶体PSMB5亚基活性的短肽及其在抗立克次体感染中的应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Glu Thr Gln Pro Ile Glu Thr Leu Thr Phe Lys Arg Thr Ser Phe

1 5 10 15

Tyr Glu Gly Leu Arg Arg Arg Pro Gly Leu Ala Trp Glu Ser

20 25 30

<210> 2

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tctgaaaccc agcccatcga gaccctgacc ttcaagagaa caagcttcta cgagggcctg 60

cgcagacgcc ccggcctggc ttgggaaagc 90

<210> 3

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ser Thr Met Leu Thr Ser Ala Ala Arg Glu Gln Trp Glu Ala Gln Glu

1 5 10 15

Glu Arg Leu Pro Lys Leu Ala Leu Leu Glu Ala Glu Gln Arg

20 25 30

<210> 4

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaaccatgt taacaagtgc ggcccgggag cagtgggaag ctcaagagga acggctaccg 60

aaactggctc tcttagaagc agagcaacga 90

<210> 5

<211> 8139

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60

cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120

tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180

ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240

agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300

agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360

ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420

cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480

gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540

tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600

agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 660

cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 720

caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780

aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 840

aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 900

caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct 960

gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat 1020

cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 1080

ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 1140

aagcggccgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag 1200

tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc 1260

aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg 1320

gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc 1380

cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc 1440

gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct 1500

ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 1560

actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca 1620

gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt 1680

aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt 1740

ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta 1800

tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1860

actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct 1920

cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga 1980

cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccttt aaaagaaaag 2040

gggggattgg ggggtacagt gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca acagacatac 2100

aaactaaaga attacaaaaa caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg 2160

acagcagaga tccagtttat cgataagctt gggagttccg cgttacataa cttacggtaa 2220

atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 2280

ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 2340

aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 2400

tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 2460

ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 2520

agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 2580

ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta 2640

acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa 2700

gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc 2760

tccatagaag acaccgactc tactagagga tctatttccg gtgaattcct cgagactagt 2820

tctagagcgg ccgcggatcc cgcccctctc cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa 2880

gccgcttgga ataaggccgg tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc atattgccgt 2940

cttttggcaa tgtgagggcc cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg 3000

gtctttcccc tctcgccaaa ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc 3060

ctctggaagc ttcttgaaga caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc 3120

ccccacctgg cgacaggtgc ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa 3180

aggcggcaca accccagtgc cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc 3240

tcacctcaag cgtattcaac aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg 3300

gatctgatct ggggcctcgg tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaacg 3360

tctaggcccc ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatatgg 3420

cctcctccga ggacgtcatc aaggagttca tgcgcttcaa ggtgcgcatg gagggctccg 3480

tgaacggcca cgagttcgag atcgagggcg agggcgaggg ccgcccctac gagggcaccc 3540

agaccgccaa gctgaaggtg accaagggcg gccccctgcc cttcgcctgg gacatcctgt 3600

cccctcagtt ccagtacggc tccaaggcct acgtgaagca ccccgccgac atccccgact 3660

acttgaagct gtccttcccc gagggcttca agtgggagcg cgtgatgaac ttcgaggacg 3720

gcggcgtggt gaccgtgacc caggactcct ccctgcagga cggcgagttc atctacaagg 3780

tgaagctgcg cggcaccaac ttcccctccg acggccccgt aatgcagaag aagaccatgg 3840

gctgggaggc ctccaccgag cggatgtacc ccgaggacgg cgccctgaag ggcgagatca 3900

agatgaggct gaagctgaag gacggcggcc actacgacgc cgaggtcaag accacctaca 3960

tggccaagaa gcccgtgcag ctgcccggcg cctacaagac cgacatcaag ctggacatca 4020

cctcccacaa cgaggactac accatcgtgg aacagtacga gcgcgccgag ggccgccact 4080

ccaccggcgc ctaaacgcgt ctggaacaat caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga 4140

ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg 4200

cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc 4260

tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc 4320

actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt 4380

tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt 4440

gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg 4500

aagctgacgt cctttccatg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg 4560

tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg 4620

ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt 4680

tgggccgcct ccccgcctgg aattaattct gcagtcgaga cctagaaaaa catggagcaa 4740

tcacaagtag caatacagca gctaccaatg ctgattgtgc ctggctagaa gcacaagagg 4800

aggaggaggt gggttttcca gtcacacctc aggtaccttt aagaccaatg acttacaagg 4860

cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag aaaagagggg actggaaggg ctaattcact 4920

cccaacgaag acaagatatc cttgatctgt ggatctacca cacacaaggc tacttccctg 4980

attagcagaa ctacacacca gggccagggg tcagatatcc actgaccttt ggatggtgct 5040

acaagctagt accagttgag ccagataagg tagaagaggc caataaagga gagaacacca 5100

gcttgttaca ccctgtgagc ctgcatggga tggatgaccc ggagagagaa gtgttagagt 5160

ggaggtttga cagccgccta gcatttcatc acgtggcccg agagctgcat ccggagtact 5220

tcaagaactg ctgatatcga gcttgctaca agggactttc cgctggggac tttccaggga 5280

ggcgtggcct gggcgggact ggggagtggc gagccctcag atcctgcata taagcagctg 5340

ctttttgcct gtactgggtc tctctggtta gaccagatct gagcctggga gctctctggc 5400

taactaggga acccactgct taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg 5460

tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg 5520

tggaaaatct ctagcagtag tagttcatgt catcttatta ttcagtattt ataacttgca 5580

aagaaatgaa tatcagagag tgagaggcct tgacattgct agcgtttacc gtcgacctct 5640

agctagagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc 5700

acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga 5760

gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg 5820

tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg 5880

cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 5940

gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga 6000

aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 6060

gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 6120

aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 6180

gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 6240

ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 6300

cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 6360

ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 6420

actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 6480

tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 6540

gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 6600

ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 6660

cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 6720

ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt 6780

tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc 6840

agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc 6900

gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata 6960

ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg 7020

gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc 7080

cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct 7140

acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa 7200

cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt 7260

cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca 7320

ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac 7380

tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca 7440

atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt 7500

tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc 7560

actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca 7620

aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata 7680

ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc 7740

ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc 7800

cgaaaagtgc cacctgacgt cgacggatcg ggagatcaac ttgtttattg cagcttataa 7860

tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca 7920

ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctgga tcaactggat 7980

aactcaagct aaccaaaatc atcccaaact tcccacccca taccctatta ccactgccaa 8040

ttacctgtgg tttcatttac tctaaacctg tgattcctct gaattatttt cattttaaag 8100

aaattgtatt tgttaaatat gtactacaaa cttagtagt 8139

<210> 6

<211> 8232

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60

cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120

tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180

ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240

agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300

agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360

ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420

cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480

gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540

tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600

agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 660

cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 720

caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780

aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 840

aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 900

caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct 960

gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat 1020

cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 1080

ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 1140

aagcggccgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag 1200

tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc 1260

aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg 1320

gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc 1380

cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc 1440

gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct 1500

ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 1560

actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca 1620

gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt 1680

aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt 1740

ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta 1800

tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1860

actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct 1920

cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga 1980

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<211> 8232

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa 7860

aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtcgacgga 7920

tcgggagatc aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac 7980

aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat 8040

caatgtatct tatcatgtct ggatcaactg gataactcaa gctaaccaaa atcatcccaa 8100

acttcccacc ccatacccta ttaccactgc caattacctg tggtttcatt tactctaaac 8160

ctgtgattcc tctgaattat tttcatttta aagaaattgt atttgttaaa tatgtactac 8220

aaacttagta gt 8232

Claims (9)

1.短肽在如下任一中的应用，所述短肽序列如SEQ ID No.1所示，

（1）制备蛋白酶体β5亚基活性抑制剂；

（2）制备治疗立氏立克次体所致疾病的药物；

（3）制备抗立氏立克次体感染的药物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述立氏立克次体所致疾病为落基山斑点热。

3.短肽相关的生物材料在如下任一中的应用，所述短肽序列如SEQ ID No.1所示，

（1）制备蛋白酶体β5亚基活性抑制剂；

（2）制备治疗立氏立克次体所致疾病的药物；

（3）制备抗立氏立克次体感染的药物；

所述生物材料为如下任一种：

B1）编码所述短肽的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体；

B4）含有B2）所述表达盒的重组载体；

B5）含有B1）所述核酸分子的重组微生物；

B6）含有B2）所述表达盒的重组微生物；

B7）含有B3）所述重组载体的重组微生物；

B8）含有B4）所述重组载体的重组微生物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：

B1）所述的核酸分子序列如SEQ ID No.2所示；

B3）所述的重组载体序列如SEQ ID No.6所示。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述立氏立克次体所致疾病为落基山斑点热。

6.权利要求1中所述的短肽。

7.权利要求3或4中所述的生物材料。

8.一种药物，其特征在于：活性成分包括权利要求6所述的短肽和/或权利要求7所述的生物材料，所述药物具有如下任一用途：

（1）抑制蛋白酶体β5亚基活性；

（2）治疗立氏立克次体所致疾病；

（3）抗立氏立克次体感染。

9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于：所述立氏立克次体所致疾病为落基山斑点热。

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