WO2020105873A1 - 인간 알파코로나바이러스 전장유전체 증폭을 통한 진단키트 및 전장 유전체 서열 확인 방법 - Google Patents

인간 알파코로나바이러스 전장유전체 증폭을 통한 진단키트 및 전장 유전체 서열 확인 방법

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WO2020105873A1
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alpha
corona virus
kit
primer
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김세일
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한국표준과학연구원
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a technique for amplifying a viral genome in a trace amount of samples and analyzing the sequencing to obtain full-length genomic information by utilizing a primer set capable of amplifying the full-length dielectric of human alpha coronavirus.
  • Coronavirus has a 30kb positive-sense single-stranded RNA genome, which is the largest RNA virus.
  • Alpha coronavirus is a type of coronavirus, has spherical morphology, and has a capsid of 120-160 nm.
  • Alpha coronavirus is a human infection virus that causes respiratory infections in humans, and animal infection viruses that cause intestinal infections as well as respiratory system infections in pigs, cats, and bats are known.
  • There are 229E and NL63 species of human infections among the alpha corona and 22 and 5 complete genomes and 2 partial genomes of 229E are registered respectively, and 45 complete genomes of NL63 are registered in NCBI.
  • the vaccinia virus was used as a cloning vector to produce HCoV-229E cDNA clone (Inf-1) and recombinants of the 1973-deposited laboratory-adapted prototype strain of HCoV-229E (VR-740) to proliferate in cells and extract RNA
  • complete genome was extracted by performing RT-PCR (Genbank accession: NC_002645).
  • a complete genome sequenced with a bidirectional primer combination that generates a 500-bp PCR product that is synthesized by overlapping at least 80 bp by using a scaffold with a genome sequenced in 2001 after extracting HCov-229E total RNA from a clinical sample in 2012 was reported.
  • HCov-229E collected from plasma of children of Haiti was extracted from Vero E6 cells and sequenced with Sanger and Miseq.
  • HCoV-NL63 was isolated from Amsterdam in 2004, and after second-strand DNA synthesis, digestion with restriction enzyme, followed by anchoring and amplifying with primer, cDNA-amplified restriction fragment-length polymorphism technique (VIDISCA: Virus-Discovery-cDNA-AFLP), and a complete genome using 475 genome fragments was reported (Genbank accession: NC_005831).
  • NL63 RNA extracted from 92 respiratory specimens from paediatric patients was reverse transcribed and amplicon was generated using a modified sequence-independent single-primer amplification (SISPA) approach, followed by sequencing with Hiseq platform for assembly (Genbank accession: JQ765564 ).
  • SISPA sequence-independent single-primer amplification
  • Zika virus which emerged in Brazil in 2015, was collected from amniotic fluid (positive water) of pregnant women, synthesized double strand cDNA from RNA and sequenced with MiSeq to obtain Zika virus genome.
  • hCoV The discovery of hCoV was early, but its medical significance was low and it was not receiving attention due to difficulties in separation and identification. However, there is no sensitive and rapid detection method capable of detecting all types of human coronavirus, and it has been diagnosed using monoclonal antibodies or reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR).
  • RT-PCR reverse-transcriptase polymerase chain reaction
  • Non-Patent Document (1) Alphacoronavirus. The Springer Index of Viruses: 371-383. doi: 10.1007 / 978-0-387-95919-1_56. Retrieved, (2) Coronavirus Pathogenesis and the Emerging Pathogen Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus. Microbiol Mol Biol Rev. 2005 Dec; 69 (4): 635-664, (3) Infectious RNA transcribed in vitro from a cDNA copy of the human coronavirus genome cloned in vaccinia virus. J Gen Virol.
  • the present inventors utilize a general-purpose primer that can be amplified in human alpha coronavirus and similar alpha coronavirus, including NL63 and 229E, to amplify the amplified genome through PCR from a small amount of genome through sequencing and quickly and easily through the sequencing method.
  • the present invention was completed by developing a method for securing a genome sequence and a diagnostic method using the same.
  • An object of the present invention is to provide a method for identifying the full-length genome sequence of alpha coronavirus in a sample.
  • Another object of the present invention is to provide a diagnostic kit for alpha coronavirus in a sample.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for detecting an alpha corona virus-induced disease.
  • a method for identifying the full-length genome sequence of alpha coronavirus in an isolated sample comprising the following steps of the present invention.
  • NGS Next Generation Seqeuncing
  • the primer set preferably includes a primer set selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 20, and more preferably, the primer set comprises 10 primer sets consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 20.
  • step (e) provides a method using the primers of SEQ ID NOs: 31 to 87.
  • the sample may be isolated from blood, serum, sputum, urine, or living tissue, but is not limited thereto.
  • the alpha corona virus provides a method comprising 229E or NL63.
  • the present invention provides an alpha corona virus diagnostic kit comprising one or more forward and reverse primer sets complementary to the alpha corona virus full-length genome.
  • the present invention provides a composition for diagnosing alpha corona virus-induced disease comprising a set of one or more forward and reverse primers complementary to the alpha corona virus full-length genome.
  • the present invention relates to a method for obtaining sequences of human alpha corona virus full length genome and uses thereof.
  • the method, kit, and composition of the present invention uses a set of forward and reverse primers capable of amplifying the full-length genome of human alpha corona virus, and through genome amplification, human alpha in a small amount of viral samples and uncultured clinical samples, etc. The presence or absence of corona virus can be quickly and easily confirmed.
  • the methods, kits and compositions of the present invention enable to obtain the full-length genomic sequence of human alpha corona virus very accurately and quickly, and thus can be effectively applied to the diagnosis of diseases caused by human alpha corona virus. have.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram of viral full-length genome analysis through the present invention, and the number of primers and amplification products is not limited to those shown in the drawings.
  • nucleotide sequence secured as a phylogenetic diagram of the 229E nucleotide sequence obtained through an embodiment of the present invention belongs to the same classification as the original nucleotide sequence.
  • It provides a method for identifying the genomic sequence of the alpha corona virus comprising a.
  • the polymerase chain reaction (PCR) of step (c) may also be performed by recombinase polymerase amplification (RPA).
  • RPA recombinase polymerase amplification
  • the next-generation sequencing (NGS) of step (e) is a single DNA molecule sequencing by Long Read Sequecing method and Oxford Nanopore Technologies that reads the current base signal Using Minion, it is the same long-lead sequencing method, and single DNA molecule sequencing, but single molecule real time (SMRT) of Pacific Bioscience (Pacbio) using fluorescence pulses is also possible.
  • NGS next-generation sequencing
  • FIG. 1 The overall conceptual diagram of the method of the present invention is shown in FIG. 1.
  • HCoV-229E purchased VR-740 from ATCC, and NL63 RNA was purchased from the National Pathogen Resource Bank (NCCP 43214).
  • the virus cells were cultured in a carbon dioxide incubator in a biosafety grade 2 extraction culture facility, and MRC-5 (ATCC CCL171) and Caco-2 (ATCC HTB-37) were used.
  • the cells were cultured using MEM medium at 37 ° C before virus inoculation, and cultured at 33 ° C for 5 days in the same medium after inoculation.
  • RNA extraction QIAmp viral RNA minikit (Qiagen) was used in the infected cell culture, and RNeasy minikit (Qiagen) was extracted from the infected cells according to the manufacturer's instructions.
  • 69 candidate primer groups were selected based on the sequence conserved through genome alignment. Among primer candidate groups, 50 primers ⁇ Tm ⁇ 60 °C, degeneracy of 3 or less, and inosine (N base) of primers of 2912-5342bp among 20 primers and 10 pairs of amplicon are selected and used in the experiment. Did. Table 20 shows the total of 20 primer sets selected.
  • Reverse Transcript reaction was performed using HCoV-229E and HCoV-NL63 RNA using Random hexamer and Superscrip III First-Strand Synthesis SuperMix (Cat No. 18080400).
  • RNA (conc. 50 ng / ul), 0.5ul random hexamer (5 '-NNNNNN-3' 50ng / ul), 1 ⁇ l 10mM dNTP mix, put DEPC water into 0.2 ⁇ l PCR tube and lightly mix to make final volume 8 ⁇ l
  • a tube was added to the ice, 10 ⁇ l 2X first-strand reaction mix, and 2 ⁇ l Superscript III enzyme mix were added and lightly mixed.
  • reverse transcription was performed at 50 ° C for 70 minutes, and then at 85 ° C for 5 minutes, the enzyme was inactivated.
  • RNA templates 50 ng, 1 ug
  • random hexamer 1 ul, 0.5 ul, 0.1 ul
  • RT reaction time 50, 70, 90min
  • PCR was performed using the designed primer set.
  • PCR conditions were carried out 30 times with 94 ° C 5 minutes, denaturation 94 ° C 30 seconds, annealing 55 ° C 1 minute, extension 72 ° C 4 minutes, and final extension 72 ° C for 10 minutes, QIAquick gel extraction kit (Qiagen, Germantown) , MD) and purified PCR products and pooled with the same amount of amplicon.
  • annealing temperature was performed at 55-60 °C temperature gradient PCR (55, 55.3, 56, 56.9, 58.1, 59, 59.6, 60), and extension time was performed for 3, 4, and 5 minutes, Number of PCR cycle was performed for 30 times and 40 times.
  • PCR amplicon is completed by sequencing by primer walking method using primers at the end of the sequence information obtained in 229E, NL63 additionally based on primers used for PCR according to the standard method suggested by Oxford nanopore. Did.
  • the base sequence obtained through Minion was assembled using reference to known genomic information using bowtie2.
  • the assembled genome sequence showed 99.88% identity compared to the reference sequence, and the base sequence is as follows.

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Abstract

본 발명은 코로나 바이러스 감염 여부를 판별하기 위한 전장 유전체 서열 획득 방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 방법, 키트, 조성물은 코로나 바이러스의 유전체 서열을 증폭할 수 있는 11종의 범용 프라이머 세트를 포함하고, 이에 따라 시료 내 목적 바이러스의 존재 유무 및 관련 질환을 간편하고 빠르게 확인할 수 있다. 또한 전장 유전체 분석을 통해 신종 코로나 바이러스의 변이여부를 판별하여 신규 바이러스 동정에도 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

인간 알파코로나바이러스 전장유전체 증폭을 통한 진단키트 및 전장 유전체 서열 확인 방법
본 발명은 인간 알파코로나바이러스의 전장유전체를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 활용하여 미량의 시료에서 바이러스 유전체를 증폭하고 염기서열을 분석하여 전장 유전체 정보를 얻어내는 기술에 관한 것이다.
코로나바이러스(Coronavirus)는 30kb의 positive-sense single-stranded RNA genome을 갖고 있고 있으며 이는 RNA virus 중 가장 크다. 알파코로나바이러스는 코로나바이러의 일종으로 spherical morphology를 가지며, 120-160nm의 capsid를 가지고 있다. 알파코로나바이러스는 인간에게 호흡기 감염을 일으키는 인간 감염 바이러스와 돼지, 고양이, 박쥐 등에서는 호흡 계 감염뿐 아니라 장 감염을 유발하는 동물 감염 바이러스 등이 알려져 있다. 알파코로나 중 인체 감염 종으로는 229E와 NL63 두 종이 있고, 현재 229E의 complete genome과 partial genome이 각 22건 및 5건씩 등록되어 있으며, NL63은 총 45건의 complete genome이 NCBI에 등록되어 있다.
2001년 vaccinia virus를 cloning vector로 하여 1973-deposited laboratory-adapted prototype strain of HCoV-229E (VR-740)의 HCoV-229E cDNA clone (Inf-1)과 recombinants를 제작하여 세포에서 증식시킨 뒤 RNA를 추출하고 RT-PCR을 수행하여 complete genome을 추출하였다(Genbank accession: NC_002645). 이후 빠른 분석을 위해 2012년에는 임상샘플에서 HCov-229E total RNA를 추출한 뒤 2001년 시퀀싱 된 genome을 scaffold로 하여 최소 80bp 이상 겹쳐서 합성되는 500bp의 PCR product를 생성하는 bidirectional primer 조합으로 시퀀싱한 complete genome이 보고되었다.
2017년에는 Haiti의 어린이들의 plasma에서 채취한 HCov-229E를 Vero E6 cell에서 추출하여 Sanger와 Miseq으로 시퀀싱을 수행하였다. HCoV-NL63은 2004년 암스테르담에서 분리되어 Second-strand DNA synthesis를 한 후 restriction enzyme으로 digestion 한 뒤, anchor를 붙이고 primer로 amplify를 하는 cDNA-amplified restriction fragment-length polymorphism technique (VIDISCA : Virus-Discovery-cDNA-AFLP)으로 발견되었고, 475개의 genome fragment를 이용한 complete genome이 보고되었다(Genbank accession: NC_005831).
덴마크에서는 paediatric patients의 92개의 respiratory specimens로부터 추출한 NL63 RNA를 역전사하고 modified sequence-independent single-primer amplification (SISPA) approach를 이용하여 amplicon을 생성한 후 Hiseq platform으로 시퀀싱을 하여 assembly를 하였다(Genbank accession: JQ765564).
2013년 베타코로나바이러스를 분석하기 위해 기존에 알려진 15개의 베타코로나바이러스를 바탕으로 2.5kb 정도의 15개 amplicon을 만드는 60개의 프라이머 세트를 구성하여 이를 이용하여 reverse transcription을 진행 한 후 NGS로 분석함으로써 기존 방법보다 짧은 시간에 바이러스 전장유전체를 분석하였다.
2015년 South Korea에서 Complete Genome Sequence of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus를 환자의 객담 샘플에서 바이러스를 추출하여 vero cell로 배양한 후 추출한 RNA로부터 cDNA를 합성하여 평균 300bp 길이의 overlapping PCR primer를 제작하였다. Fragments들은 Illumina MiSeq 50-bp single-end platform으로 시퀀싱되어 complete genome을 얻었다.
2015년 브라질에서 창궐한 Zika virus는 임산부의 amniotic fluid(양수)에서 채취하여 RNA로부터 double strand cDNA를 합성하고 MiSeq으로 시퀀싱하여 Zika virus genome을 얻었다.
2015년 Sierra Leone, Liberia, Guinea에서 10,000명 이상의 사상자를 낸 Ebola virus의 genome은 38개에서 11개의 primer pair를 이용하여 현장에서 수시간 내에 MinION을 이용하여 시퀀싱하였다.
hCoV의 발견은 일찍이 되었지만, 의학적 중요성이 낮고 분리 및 동정의 어려움으로 관심을 받지 못하였다가 2003년 SARS로 진단의 중요성이 커졌다. 그러나 모든 종류의 Human Coronavirus를 검출할 수 있는 sensitive하고 rapid 검출법은 존재하지 않고, monoclonal antibodies를 이용하거나 reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)을 이용하여 진단해오고 있다.
알파코로나바이러스에서는 진단을 위해서 2000년대부터 gene 1ab나 gene N을 타켓으로 하는 universal primer를 사용하고자 하였으나, 약 30% 정도만을 정확히 검출하였다. 따라서 각 group별 specific primer를 이용한 diagnosis의 중요성이 대두되었다.
참고선행문헌은 특허문헌 대한민국 공개특허공보 제10-2010-0018993호, 비특허문헌 (1) Alphacoronavirus. The Springer Index of Viruses: 371-383. doi:10.1007/978-0-387-95919-1_56. Retrieved, (2) Coronavirus Pathogenesis and the Emerging Pathogen Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus. Microbiol Mol Biol Rev. 2005 Dec; 69(4): 635-664, (3) Infectious RNA transcribed in vitro from a cDNA copy of the human coronavirus genome cloned in vaccinia virus. J Gen Virol. 2001 Jun;82(Pt 6):1273-81, (4) The first complete genome sequences of clinical isolates of human coronavirus 229E. Virus Genes. 2012 Dec;45(3):433-9, (5) Complete Genome Sequence of Human Coronavirus Strain 229E Isolated from Plasma Collected from a Haitian Child in 2016. Genome Announc. 2017 Nov 22;5(47). pii: e01313-17, (6) Identification of a new human coronavirus. Nat Med. 2004 Apr;10(4):368-73, (7) Genomic analysis of 16 Colorado human NL63 coronaviruses identifies a new genotype, high sequence diversity in the N-terminal domain of the spike gene and evidence of recombination. J Gen Virol. 2012 Nov;93(Pt 11):2387-98, (8) Full genome deep sequencing and phylogenetic analysis of novel human betacoronavirus. Emerg Infect Dis. 2013 May;19(5):736-42B, (9) Complete Genome Sequence of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus KOR/KNIH/002_05_2015, Isolated in South Korea. Genome Announc. 2015 Aug 13;3(4). pii: e00787-15, (10) Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 2016 Feb 11;530(7589):228-232, (11) Genetic variability of human coronavirus OC43-, 229E-, and NL63-like strains and their association with lower respiratory tract infections of hospitalized infants and immunocompromised patients. J Med Virol. 2006 Jul;78(7):938-49 를 참조하였다.
본 발명자들은 NL63과 229E를 포함한 인간 알파코로나 바이러스 및 유사 알파 코로나 바이러스에서 증폭이 가능한 범용 프라이머를 활용하여 미량의 유전체로부터 PCR등을 통하여 증폭하여 증폭된 유전체를 염기서열분석법을 통하여 빠르고 간편하게 바이러스의 전장 유전체 염기서열을 확보하는 방법 및 이를 이용한 진단방법을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 시료 내 알파 코로나 바이러스의 전장 유전체 서열 확인 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 시료 내 알파 코로나 바이러스의 진단 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 알파 코로나 바이러스 유발 질환 검출용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명의 다음의 단계를 포함하는 분리된 시료 내 알파 코로나 바이러스의 전장 유전체 서열 확인 방법을 제공한다. (a) 알파 코로나 바이러스 전장 유전체에 상보적인 하나 이상의 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 제조하는 단계; (b) 시료에서 RNA를 분리하는 단계; (c) 분리된 RNA를 사용하여 역전사 반응을 수행하는 단계; (d) 역전사 반응이 수행된 시료에 하나 이상의 프라이머 세트를 첨가하여 중합효소 연쇄반응을 실시하는 단계; 및 (e) 차세대 염기서열 분석(Next Generation Seqeuncing, NGS)을 이용한 증폭된 산물의 서열을 분석하는 단계를 포함하는 알파코로나 바이러스의 유전체 서열 확인 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 서열번호 20으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머 세트를 포함하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 서열번호 20으로 이루어진 10개의 프라이머 세트를 포함하는 것이다. 더불어 상기 (e) 단계는 서열번호 31 내지 87의 프라이머를 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 시료는 혈액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
또한 본 발명에서 상기 알파 코로나 바이러스는 229E 또는 NL63을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 알파 코로나 바이러스 전장 유전체에 상보적인 하나 이상의 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 포함하는 알파 코로나 바이러스 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 알파 코로나 바이러스 전장 유전체에 상보적인 하나 이상의 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 포함하는 알파 코로나 바이러스 유발 질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 인간 알파 코로나 바이러스 전장 유전체의 서열 획득 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
(b) 본 발명의 방법, 키트 및 조성물은 인간 알파 코로나 바이러스의 전장 유전체를 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 이용하고, 유전체 증폭을 통하기 때문에 미량의 바이러스 시료 및 미배양 임상시료 등에서 인간 알파 코로나 바이러스의 존재 유무 및 변종유무를 간편하게 빠르게 확인할 수 있다.
(c) 따라서, 본 발명의 방법, 키트 및 조성물은 인간 알파 코로나 바이러스의 전장 게놈 서열을 매우 정확하고 신속하게 얻을 수 있게 해주며, 이를 통해 인간 알파 코로나 바이러스로 유발된 질환의 진단에 효과적으로 적용될 수 있다.
도 1은 본 발명을 통한 바이러스 전장 유전체 분석의 개념도로써 프라이머 및 증폭체의 숫자는 도면에 제시된 것으로 제한되는 것은 아니다.
도 2은 본 발명의 실시예를 통한 229E와 NL63을 증폭한 핵산 조각의 전기 영동 분석 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예를 통해 확보된 229E 염기 서열의 계통도로써 확보된 염기서열이 원래 염기서열과 같은 분류에 속함을 보여주는 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 알파 코로나 바이러스 전장 유전체에 상보적인 하나 이상의 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 제조하는 단계; (b) 시료에서 RNA를 분리하는 단계; (c) 분리된 RNA를 사용하여 역전사 반응을 수행하는 단계; (d) 역전사 반응이 수행된 시료에 하나 이상의 프라이머 세트를 첨가하여 중합효소 연쇄반응을 실시하는 단계; 및 (e) 차세대 염기서열 분석(Next Generation Seqeuncing, NGS)을 이용한 증폭된 산물의 서열을 분석하는 단계
를 포함하는 알파코로나 바이러스의 유전체 서열 확인 방법을 제공한다.
본 발명의 실시예에 따른 방법에 있어서, 상기 (c)단계의 중합효소 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR)은, 재조합효소 중합효소 증폭(Recombinase Polymerase amplification, RPA)도 가능하다.
또한 본 발명의 실시예에 따른 방법에 있어서, 상기 (e) 단계의 차세대 염기서열 분석(NGS)은 롱리드 시퀀싱 (Long Read Sequecing) 방법으로 단일 DNA 분자 시퀀싱이고 전류를 염기신호를 읽는 Oxford Nanopore Technologies의 Minion을 사용하였으나, 동일한 롱리드 시퀀싱 방법이며, 단일 DNA 분자 시퀀싱이지만 형광 펄스(Pulse)를 이용한 Pacific Bioscience (Pacbio)의 SMRT (Single molecule real time)도 가능하다.
본 발명의 방법의 전체 개념도는 도1에 나타난 바와 같다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
<실시예 1> 바이러스 origin
1966년에 분리보고된 이 균주의 참조유전체가 존재하지 않으므로, HCoV-229E는 ATCC에서 VR-740을 구입하였고, NL63 RNA는 국가병원체자원은행(NCCP 43214)에서 구입하여 사용하였다.
<실시예 2> 바이러스 세포배양 및 RNA 추출
바이러스 세포는 생물안전성 2등급 추출 배양 시설 내 이산화탄소 배양기에서 배양하였고, MRC-5(ATCC CCL171) 및 Caco-2(ATCC HTB-37)을 사용하였다. 바이러스 접종 전 37℃ 에서 MEM 배지를 이용하여 배양하였으며 접종후에는 같은 배지에서 33℃에서 5일간 배양하였다.
RNA 추출을 위하여 감염된 세포 배양액에서는 QIAmp viral RNA minikit (Qiagen)를 사용하였고, 감염된 세포에서는 RNeasy minikit (Qiagen)를 제조자의 사용설명서에 따라 추출하였다.
<실시예 3> 프라이머 설계 및 선정 기준
유전체 정렬을 통해 보존된 서열 중심으로 primer 후보군을 표2와 같이 69개 선정하였다. Primer 후보군 가운데 50 ℃ < Tm < 60 ℃이며 degeneracy 가 3개 이하이고 Inosine(N base)가 1개 이하인 primer 가운데 2912-5342bp 사이로 amplicon이 생성되는 총 20개의 primer, 10개 pair를 선정하여 실험에 사용하였다. 선정된 총 20개의 프라이머 세트 (Primer sets)는 표1과 같다.
프라이머 세트
Primer Forward(5＇-> 3＇) Reverse(5＇-> 3＇) length(bp)
Set 1 43 (서열번호 1)(TAGACTTTGTGTCTACTYYTCTC) 5385 (서열번호 2)(GCATTACCCAACAATTATTT) 5342
Set 2 4358 (서열번호 3)(TTTAATGTTGTWGGKCCICG) 9077 (서열번호 4)(GCATAACAAGCCACGTA) 4719
Set 3 8201 (서열번호 5)(GGTGGTRAYAATGTTTATTGYTA) 11113 (서열번호 6)(AGCCAAAATCACTTGTTA) 2912
Set 4 9077 (서열번호 7)(TAYCGYTGYGCTTGTTATGC) 13477 (서열번호 8)(GGACACCATCATAAAAC) 4400
Set 5 12255 (서열번호 9)(CTGGTARYGGTCARGCTAT) 15343 (서열번호 10)(CATTAGTCACAACATGG) 3088
Set 6 13477 (서열번호 11)(GTKTTTATWGATGGTGTWCC) 17266 (서열번호 12)(AACAAACTTGACTCCAGG) 3789
Set 7 15343 (서열번호 13)(CCKATGTTGTGYACTAARTG) 20047 (서열번호 14)(CTCCATCTACATATCGA) 4704
Set 8 17266 (서열번호 15)(CCTGGYAGTCAYAGTTTGTT) 22457 (서열번호 16)(TAAGGCTCTTCATGTTTTACA) 5191
Set 9 19333 (서열번호 17)(TATGGTGATGTKTCWAAAACTAC) 24066 (서열번호 18)(TCTAATAAGGAAGTTTAGTTGA) 4733
Set 10 22457 (서열번호 19)(TGTAAAACYATWGAAGAYGCCTTA) polyT (서열번호 20)(TTTTTTTTTTTTT-GTGTATCCATATC) 5000
<실시예 4> Reverse Transcription
HCoV-229E와 HCoV-NL63 RNA를 Random hexamer와 Superscrip III First-Strand Synthesis SuperMix (Cat No. 18080400) 를 이용하여 Reverse Transcript 반응을 수행하였다.
1μl RNA (conc. 50 ng/ul), 0.5ul random hexamer (5＇ -NNNNNN-3 ＇50ng/ul), 1μl 10mM dNTP mix, 최종 볼륨이 8μl가 되도록 DEPC water를 0.2μl PCR tube에 넣고 가볍게 혼합하였고, 65℃에서 5분간 incubation 한 후 ice에서 최소 1분 이상 식히고 가볍게 centrifugation한 후, 얼음에 tube를 꽂고 10μl 2X first-strand reaction mix, 2μl Superscript III enzyme mix를 넣은 후 가볍게 혼합하였다. Thermal cycler를 이용하여 25℃에서 10분간 incubation 한 후 50℃에서 70분 역전사를 진행한 뒤, 85℃에서 5분간 두어 효소의 불활성화를 진행하였다.
1μl RNase H를 첨가한 후 37℃에서 20분간 incubation하였고, RT 반응을 최적화하기 위하여 다양한 RNA template(50ng, 1ug), random hexamer(1ul, 0.5ul, 0.1ul) 및 RT reaction time(50, 70, 90min) 조건에서 최적화하였다.
<실시예 5> Polymerase Chain Reaction
설계한 primer set를 이용하여 PCR을 수행하였다.
1μl First strand cDNA, 1μl Forward primer (conc. 10 pmol/ul), 1μl Reverse primer (conc. 10 pmol/ul), 25μl KAPA hotstart ready mix (catalog number KR0370), 22μl 멸균증류수를 0.2μl PCR tube에 넣고 혼합하였다.
PCR 조건은 94℃ 5분 후, denaturation 94℃ 30초, annealing 55℃ 1분, extension 72℃ 4분으로 30회를 진행하고 final extension 72℃ 10분 동안 수행하였고, QIAquick gel extraction kit (Qiagen, Germantown, MD) 을 이용하여 PCR products를 purified하였으며 동일한 양의 amplicon으로 pooling하였다.
PCR 최적화를 위하여 Annealing temperature는 55-60℃ temperature gradient PCR (55, 55.3, 56, 56.9, 58.1, 59, 59.6, 60)을 수행하였고, Extension time은 3, 4, 5분동안 수행하였으며, Number of PCR cycle은 30회, 40회 동안 수행하였다.
<실시예 6> Sequencing
PCR amplicon은 Oxford nanopore사가 제시한 표준적인 방법에 따라 PCR에 사용된 프라이머를 기반으로 추가로 229E, NL63 확보된 염기서열정보의 끝부분의 서열의 프라이머를 이용하여 primer walking법으로 sequencing을 진행하여 완료하였다.
Supplement table primer list(229E, NL63)
서열번호 Name Sequence(5＇-> 3＇)
21 Alpha13F TTWTCTATCTAYAGATAGARAA
22 Alpha41F TTTAGACTTTGTGTCTACTYYTCTC
23 Alpha43F TAGACTTTGTGTCTACTYYTCTC
24 Alpha62F TCTCAACTAAACGAAATTTTT
25 Alpha252F AAGCAAMGTTYTGTCKTTGTGG
26 Alpha950F GGTTCICCIKTTATKACIAATGGT
27 Alpha1421F GGTGTYATWGAYATTAGT
28 Alpha2981F GGTGGYAARRTWTCWTTYTCTGA
29 Alpha3940F TRTIGATGGTTTYGGTGT
30 Alpha4358F TTTAATGTTGTWGGKCCICG
31 Alpha4904F TAYATGTGYGTTKTRCCATC
32 Alpha5385F AYAATAATTGTTGGGTKAATGC
33 Alpha5546F AAGGGTGATGCTGARGA
34 Alpha6842F TATGTTAATGCWAATGGTGGT
35 Alpha7517F GCKTGYTGTATGCGYGC
36 Alpha8201F GGTGGTRAYAATGTTTATTGYTA
37 Alpha8432F TGGTWTGTTAAYGATGGAMGTGT
38 Alpha8933F GARAGTGCTGCWGCWGG
39 Alpha8961F TWGAYATKCGTTCTTATGA
40 Alpha9077F TAYCGYTGYGCTTGTTATGC
41 Alpha9203F ATGGCRCARCCRTCTGG
42 Alpha10476F TGGCGYTTTKCTARAGA
43 Alpha10814F AARTAYATGRTWGCTAATGG
44 Alpha11113F TAARCAYAGTGATTTTGGWCT
45 Alpha11189F TCITCWTTTGTTRGTATGCC
46 Alpha11360F AGRATGGCTGAACAAGCTGC
47 Alpha11507F GCACGTRATGGTGTTGT
48 Alpha11624F TAYGCKGGIGTTGTTTGGAC
49 Alpha12179F GCTGTTARACAWGGYGCAAAACC
50 Alpha12255F CTGGTARYGGTCARGCTAT
51 Alpha12532F TCTAGTGCMGCTCGACTAGA
52 Alpha12717F GGAMCACGAGCARTCCATGTA
53 Alpha13477F GTKTTTATWGATGGTGTWCC
54 Alpha13816F GGTGATGCTGCWRTTAAAGATTTTGA
55 Alpha13868F CTTAATAARAGYGCTGGKTGGCC
56 Alpha14036F CARAAIGGTGATGCTGC
57 Alpha14220F CTTAATAARAGYGCTGKTTGGCC
58 Alpha14742F GGTACRACTTCWGGTGAYGC
59 Alpha15343F CCKATGTTGTGYACTAARTG
60 Alpha15532F GCTGGWAATRTITTTGGTTT
61 Alpha16114F ACAATACAGGGTCCICCTGGTAGTGG
62 Alpha16561F CGWATGTGTGCWATAGGMCC
63 Alpha17266F CCTGGYAGTCAYAGTTTGTT
64 Alpha17320F GGTTGGTTRGGWATGGATGT
65 Alpha17989F TTTAAACAYGCWTTGGGITGTGA
66 Alpha18574F TTTGAWKKTTATAATTTGTGGCA
67 Alpha18874F TTRTGGGATTATGAAGCWGA
68 Alpha19333F TATGGTGATGTKTCWAAAACTAC
69 Alpha19735F TGTAATTTRTATAATTAYGGTGC
70 Alpha20047F TCWGATATGTAYGATGGYAG
71 Alpha20829F01 TGYTTATGGTCTGTTTCTGG
72 Alpha20829F02 TGYTTATGGCCTGTACCTGG
73 Alpha20829F03 TGYYTCIGGCCTGTWCCTGG
74 Alpha20846F01 GGTTTTGTYTATTTTAAYGGTACTGG
75 Alpha20846F02 GGTTTTGTYTATTTTAAYGCCACTGG
76 Alpha22436F CTYAAGCAGTAYACTTCTGCTTG
77 Alpha22457F TGTAAAACYATWGAAGAYGCCTTA
78 Alpha22789F TGATGCWGARCGWATGGC
79 Alpha23909F TGGCCITGGTGGGTKTGG
80 Alpha24066F TCAACTAAACTTCCTTATTAYGA
81 Alpha25053F GTTGGAATITWATYCTAAC
82 Alpha25287F01 GTTTCAGACTTTTCCGWCGTG
83 Alpha25287F02 GTTTCAGACTTTGGCGCCGTG
84 Alpha25679F TTGCTTCATTTIWTCTAAACTRAAC
85 Alpha25980F GGTGTYGTYTGGGTTGCT
86 Alpha27065F TAGTCTTAYACACAATGGTARGCC
87 Alpha27168F TGGAGTAMTYAAAGATCGC
<실시예 7> Assembly
Minion을 통해서 얻어진 염기서열은 bowtie2를 이용하여 알려진 유전체 정보를 참조로 하여 assembly하였다. Assembly된 유전체 염기서열은 참조서열 대비 99.88%의 일치도를 나타내었으며 염기서열은 다음과 같다.
>1 229E|NC_002645:1
ACTTAAGTACCTTATCTATCTACAGATAGAAAAGTTGCTTTTTAGACTTTGTGTCTACTT
TTCTCAACTAAACGAAATTTTTGCTATGGCCGGCATCTTTGATGCTGGAGTCGTAGTGTA
ATTGAAATTTCATTTGGGTTGCAACAGTTTGGAAGCAAGTGCTGTGTGTCCTAGTCTAAG
GGTTTCGTGTTCCGTCACGAGATTCCATTCTACAAACGCCTTACTCGAGGTTCCGTCTCG
TGTTTGTGTGGAAGCAAAGTTCTGTCTTTGTGGAAACCAGTAACTGTTCCTAATGGCCTG
CAACTGTGTGACACTTGCCGTAGCAAGTGATTCTGAAATTTCTGCAAATGGCTGTTCTAC
TATTGCGCAAGCCGTCCGCCGTTATAGCGAGGCCGCTAGCAATGGTTTTAGGGCATGCCG
ATTTGTTTCATTAGATTTGCAGGATTGCATCGTTGGCATTGCAGACGATACATATGTTAT
GGGTCTGCATGGCAATCAGACGTTGTTTTGCAACATAATGAAATTTTCTGACCGTCCTTT
TATGCTTCATGGGTGGTTGGTTTTTTCCAATTCAAATTACCTTTTGGAGGAATTTGATGT
TGTCTTCGGTAAGAGAGGTGGTGGTAATGTGACATACACTGACCAGTATCTCTGTGGCGC
CGATGGCAAACCTGTTATGAGTGAAGATTTATGGCAGTTTGTTGACCATTTCGGTGAGAA
CGAAGAAATTATCATCAATGGTCATACTTACGTTTGTGCTTGGCTTACTAAGCGTAAGCC
CTTAGATTACAAACGTCAGAACAACCTTGCCATTGAAGAGATTGAATATGTGCATGGTGA
TGCTTTGCATACACTACGCAATGGTTCTGTTCTTGAAATGGCTAAGGAAGTGAAGACATC
TAGTAAAGTTGTGTTAAGCGATGCTCTTGACAAACTTTACAAAGTCTTTGGTTCTCCTGT
TATGACAAATGGTTCCAACATCCTAGAGGCCTTTACTAAACCTGTGTTTATTAGTGCATT
AGTTCAATGTACTTGTGGTACCAAGTCTTGGTCTGTTGGTGATTGGACCGGTTTTAAATC
CTCTTGTTGCAACGTGATCAGTAATAAACTGTGTGTTGTTCCCGGTAATGTTAAACCTGG
TGATGCTGTGATTACCACTCAGCAAGCTGGTGCTGGTATTAAGTATTTTTGTGGCATGAC
TCTTAAGTTTGTTGCAAATATTGAAGGTGTCTCTGTTTGGAGAGTGATTGCTCTTCAGAG
TGTGGATTGCTTTGTTGCTTCTTCCACTTTTGTAGAAGAGGAACATGTTAATAGAATGGA
TACATTCTGCTTCAATGTACGCAATAGTGTTACTGATGAGTGTCGTCTGGCCATGTTGGG
TGCTGAAATGACTAGTAATGTCAGAAGACAAGTTGCTTCAGGTGTCATAGACATTAGTAC
CGGTTGGTTTGATGTTTATGATGACATCTTTGCTGAAAGCAAACCATGGTTTGTTCGCAA
GGCTGAAGACATTTTTGGCCCTTGTTGGTCCGCTCTTGTTTCTGCACTTAAACAACTTAA
AGTCACTACAGGTGAACTTGTGAGATTTGTTAAGTCTATTTGCAATTCAGCTGTTGCTGT
CGTGGGTGGTACTATACAAATTCTCGCTAGTGTGCCTGAGAAGTTTTTGAATGCGTTTGA
CGTGTTTGTCACAGCTATTCAAACTGTCTTTGACTGTGCTGTTGAAACTTGTACTATTGC
CGGTAAAGCATTTGACAAGGTTTTTGACTATGTCTTGCTTGATAATGCGCTTGTAAAACT
TGTCACCACAAAGCTTAAGGGTGTTCGTGAACGTGGCCTTAATAAAGTTAAGTATGCAAC
AGTTGTTGTTGGTTCCACTGAAGAAGTTAAATCTTCACGTGTTGAACGTAGCACTGCTGT
ACTTACAATCGCCAACAATTATTCCAAACTTTTTGATGAAGGGTATACTGTTGTAATTGG
CGATGTGGCGTACTTTGTTAGTGACGGCTACTTCCGTCTTATGGCCAGTCCAAATAGTGT
GTTGACTACTGCAGTCTATAAACCATTGTTTGCTTTTAATGTGAATGTTATGGGTACTAG
ACCTGAAAAATTTCCAACCACTGTGACTTGTGAAAATTTAGAGTCTGTTGTTTTGTTTGT
TAATGACAAAATTACTGAATTCCAATTGGATTACAGTATTGATGTCATTGATAATGAAAT
AATTGTCAAACCTAATATCAGCCTATGTGTTCCACTTTATGTGAGAGACTATGTTGACAA
ATGGGATGATTTTTGCAGACAATATAGTAACGAGTCTTGGTTTGAGGATGATTACAGGGC
TTTTATCAGTGTTTTGGACATCACTGATGCTGCTGTGAAAGCTGCAGAGTCTAAAGCTTT
CGTTGATACTATTGTTCCACCTTGCCCATCTATTTTGAAAGTTATAGATGGAGGCAAAAT
ATGGAATGGTGTTATTAAAAATGTTAACTCTGTTAGAGACTGGCTTAAGTCTTTGAAGTT
AAATCTCACACAACAGGGTTTGCTTGGAACATGTGCAAAGCGTTTTAAACGTTGGCTTGG
CATTTTGCTAGAGGCCTATAATGCGTTTTTAGACACTGTGGTTTCTACTGTTAAAATTGG
TGGCTTGACCTTTAAAACATATGCTTTTGATAAACCTTACATTGTGATACGTGATATCGT
GTGTAAGGTTGAAAATAAAACAGAAGCAGAATGGATTGAGCTTTTTCCACATAATGACAG
GATTAAGTCTTTTAGTACTTTCGAGAGTGCTTACATGCCAATTGCAGACCCTACACATTT
TGACATTGAAGAAGTTGAACTTTTAGATGCAGAGTTTGTAGAACCAGGCTGTGGTGGTAT
TTTGGCAGTAATAGATGAGCACGTCTTTTATAAGAAGGATGGTGTTTATTATCCATCAAA
TGGTACTAACATTCTACCTGTTGCATTTACAAAAGCCGCTGGTGGTAAAGTTTCATTTTC
TGATGACGTTGAAGTAAAAGACATTGAACCTGTTTACAGAGTCAAGCTTTGCTTTGAGTT
TGAAGATGAAAAACTTGTAGATGTTTGTGAAAAGGCAATTGGCAAGAAAATTAAACATGA
AGGTGACTGGGATAGCTTTTGTAAGACTATTCAATCAGCACTTTCTGTTGTTTCTTGCTA
TGTAAATCTACCTACTTATTACATTTATGATGAAGAAGGCGGTAATGACTTGAGTTTGCC
CGTTATGATTTCTGAATGGCCTCTTTCTGTTCAACAAGCTCAACAAGAAGCTACTTTACC
TGATATTGCTGAGGATGTTGTTGACCAAGTTGAAGAAGTCAATAGCATTTTTGACATTGA
GACAGTGGATGTTAAACATGATGTGAGTCCTTTTGAAATGCCATTTGAAGAGTTAAATGG
TTTAAAGATACTCAAACAATTGGATAACAACTGCTGGGTTAACTCAGTTATGTTACAAAT
ACAATTAACTGGTATACTTGATGGTGACTATGCTATGCAGTTTTTTAAAATGGGCCGAGT
TGCCAAGATGATTGAACGCTGCTACACTGCTGAGCAATGTATACGTGGTGCTATGGGTGA
TGTTGGTTTGTGTATGTATAGACTGCTTAAAGACTTACACACTGGTTTTATGGTTATGGA
TTATAAATGTAGTTGTACCAGTGGTAGGCTTGAAGAATCGGGAGCTGTTTTGTTTTGTAC
GCCCACTAAGAAGGCGTTTCCTTATGGTACTTGTCTAAATTGTAACGCACCTCGCATGTG
TACAATTAGGCAGTTACAAGGTACCATAATATTTGTGCAACAAAAACCAGAACCTGTTAA
TCCTGTTTCTTTTGTTGTTAAACCAGTCTGCTCATCAATTTTTCGTGGTGCTGTGTCTTG
TGGTCATTACCAGACTAACATCTATTCACAAAATTTGTGTGTGGATGGTTTTGGTGTTAA
CAAGATTCAGCCCTGGACAAATGATGCACTTAATACTATTTGTATTAAGGATGCAGATTA
TAATGCAAAAGTTGAAATATCTGTTACACCAATTAAAAATACAGTTGATACAACACCTAA
GGAAGAATTTGTTGTTAAAGAGAAGTTGAACGCCTTCCTCGTTCATGACAATGTAGCTTT
CTACCAAGGTGATGTTGATACTGTTGTTAATGGTGTTGACTTTGACTTTATTGTAAATGC
TGCTAATGAGAACCTTGCTCATGGTGGAGGACTTGCCAAAGCTTTAGATGTGTACACTAA
AGGTAAACTTCAACGTTTATCTAAAGAACACATTGGATTAGCGGGTAAAGTAAAAGTTGG
TACAGGAGTTATGGTTGAGTGTGATAGCCTTAGAATTTTTAATGTTGTTGGTCCACGCAA
GGGTAAACATGAACGTGATTTACTCATAAAAGCTTACAACACTATTAATAATGAACAAGG
CACACCTTTAACACCAATTTTGAGCTGTGGTATTTTTGGTATCAAACTCGAAACTTCATT
AGAAGTTTTGCTTGATGTTTGTAATACAAAAGAAGTTAAAGTTTTTGTTTATACAGACAC
AGAGGTTTGTAAGGTTAAGGATTTTGTGTCTGGTTTAGTGAATGTTCAAAAAGTTGAGCA
ACCTAAAATAGAACCAAAACCAGTGTCCGTAATTAAAGTTGCACCCAAGCCTTACAGGGT
AGATGGTAAATTTAGTTACTTTACAGAAGACTTGTTGTGTGTCGCTGATGACAAACCCAT
TGTTTTGTTTACTGACTCTATGCTTACTTTGGATGACCGTGGTTTAGCTCTAGACAATGC
ACTTAGTGGTGTGCTTAGTGCTGCTATTAAGGATTGTGTTGACATAAATAAAGCTATACC
TTCTGGTAATCTTATTAAGTTTGATATAGGTTCTGTTGTTGTCTACATGTGTGTTGTGCC
ATCCGAAAAGGACAAACATTTAGATAATAATGTTCAACGATGCACACGTAAGTTGAATAG
ACTTATGTGTGATATAGTTTGTACTATACCAGCTGACTACATCTTGCCATTGGTGTTGTC
TAGTTTGACTTGTAATGTTTCTTTTGTAGGTGAACTTAAAGCTGCTGAAGCTAAAGTTAT
AACTATAAAGGTGACAGAGGATGGTGTTAATGTTCATGATGTGACCGTGACAACAGACAA
GTCATTTGAACAACAAGTTGGTGTTATTGCTGATAAGGACAAAGATCTTTCTGGTGCAGT
ACCAAGTGATCTTAACACATCTGAATTGCTTACTAAAGCAATAGATGTTGATTGGGTCGA
ATTTTATGGCTTTAAAGATGCTGTTACTTTTGCAACAGTTGATCATAGTGCTTTTGCCTA
TGAAAGTGCTGTTGTTAATGGTATTAGAGTGTTAAAAACTAGTGATAATAATTGTTGGGT
GAATGCTGTTTGTATTGCACTACAGTATTCGAAACCCCATTTTATTTCACAAGGTCTTGA
TGCTGCGTGGAATAAATTTGTTTTAGGCGATGTTGAAATTTTTGTTGCATTTGTTTACTA
TGTTGCAAGACTAATGAAAGGTGACAAGGGTGATGCTGAAGACACTTTGACTAAGTTGTC
TAAGTATCTTGCTAATGAAGCTCAAGTTCAATTAGAACATTATAGTTCTTGTGTTGAATG
TGATGCTAAATTTAAAAACTCTGTTGCATCTATCAATTCTGCTATAGTTTGTGCTAGTGT
CAAACGTGATGGTGTGCAAGTTGGTTATTGTGTCCATGGTATTAAGTACTATTCACGTGT
TAGAAGTGTTAGAGGTAGAGCTATTATAGTCAGTGTCGAACAGCTTGAACCGTGTGCTCA
GTCTAGACTTTTGAGTGGTGTTGCTTATACTGCTTTTTCTGGACCTGTTGACAAAGGTCA
TTATACTGTTTATGATACTGCAAAGAAATCAATGTATGATGGTGATCGTTTTGTTAAACA
TGATCTTTCTCTGCTGTCTGTCACATCAGTTGTTATGGTTGGTGGTTATGTTGCACCTGT
TAATACAGTGAAACCTAAACCAGTCATTAATCAACTTGATGAAAAGGCACAGAAGTTCTT
TGATTTTGGTGATTTTTTGATTCATAATTTTGTTATTTTTTTCACATGGTTATTGAGTAT
GTTTACTTTGTGTAAAACTGCAGTAACTACAGGTGATGTTAAAATAATGGCCAAAGCACC
ACAAAGGACGGGTGTTGTTTTAAAACGTAGTCTTAAATATAACTTAAAAGCGTCAGCAGC
TGTTCTTAAATCTAAGTGGTGGCTGCTTGCTAAGTTTACGAAACTACTGTTACTCATATA
TACATTGTACTCAGTAGTTTTGCTTTGTGTACGTTTTGGACCGTTTAATTTTTGTAGTGA
GACTGTTAATGGTTATGCTAAGTCAAACTTTGTCAAGGATGATTACTGTGATGGTTCATT
GGGCTGCAAGATGTGTCTTTTTGGTTACCAAGAGTTAAGTCAATTTAGCCATTTGGATGT
TGTGTGGAAGCATATAACAGACCCTTTGTTTAGTAATATGCAACCTTTCATTGTCATGGT
TTTGCTGCTTATATTTGGTGACAATTATTTGAGATGCTTCTTGCTGTATTTTGTTGCTCA
GATGATAAGCACAGTTGGTGTTTTTCTAGGTTACAAGGAAACAAATTGGTTCTTGCACTT
TATTCCATTTGATGTTATTTGTGATGAACTGCTTGTCACTGTTATTGTTATTAAGGTTAT
TTCTTTTGTCAGACATGTGCTTTTTGGTTGTGAAAACCCAGATTGCATTGCGTGTTCTAA
GAGTGCTAGACTTAAGAGATTCCCTGTTAACACAATTGTCAATGGTGTGCAACGTTCATT
TTATGTTAATGCAAATGGTGGTAGTAAGTTTTGTAAGAAACATAGATTTTTCTGTGTTGA
TTGTGACTCTTATGGTTATGGCAGCACGTTTATAACACCCGAAGTTTCTAGAGAACTTGG
TAACATTACCAAAACAAATGTGCAACCAACAGGCCCAGCGTATGTCATGATTGACAAAGT
GGAGTTTGAAAATGGTTTTTACAGATTGTATTCCTGTGAAACATTTTGGCGTTACAACTT
TGATATAACTGAAAGCAAGTATTCTTGCAAAGAGGTTTTTAAAAATTGTAATGTTTTGGA
TGATTTCATCGTGTTTAACAATAATGGGACCAATGTAACGCAGGTTAAAAATGCTAGTGT
TTACTTTTCACAGTTGTTGTGTAGGCCCATTAAATTAGTTGACAGTGAACTTTTGTCCAC
TTTGTCAGTTGATTTTAATGGTGTCTTACACAAGGCATACATTGATGTACTACGTAATAG
CTTTGGTAAAGATCTTAATGCTAATATGTCTTTAGCCGAGTGCAAGAGTGCTTTAGGCCT
GTCTATTAGTGATCATGAATTTACTAGTGCTATTTCTAATGCACATCGTTGTGACGTGTT
GTTATCTGATTTGTCATTTAACAACTTTGTCAGTTCGTATGCTAAACCTGAGGAAAAATT
ATCAGCTTATGACTTGGCGTGTTGTATGCGTGCAGGTGCTAAGGTTGTTAATGCCAATGT
TCTGACAAAGGACCAAACTCCTATTGTTTGGCATGCAAAGGATTTTAACAGTCTTTCTGC
TGAAGGTCGCAAGTATATTGTAAAAACTAGCAAAGCTAAGGGTTTGACTTTCTTGTTGAC
AATTAATGAAAACCAAGCTGTCACGCAAATACCTGCAACTAGCATTGTTGCTAAGCAAGG
TGCTGGTGATGCTGGCCATTCATTAACATGGCTGTGGCTACTGTGTGGTCTTGTGTGTTT
GATTCAATTCTACTTGTGCTTTTTCATGCCCTATTTTATGTACGATATCGTGAGTAGTTT
TGAGGGTTATGATTTTAAGTATATAGAAAATGGTCAGTTGAAGAATTTTGAAGCGCCACT
TAAATGCGTCAGAAACGTTTTTGAAAACTTTGAGGACTGGCATTATGCTAAGTTTGGCTT
CACACCTTTAAACAAGCAAAGCTGTCCTATTGTAGTTGGAGTTTCTGAAATTGTTAATAC
TGTCGCTGGCATTCCATCTAATGTGTATCTTGTTGGTAAAACTTTAATTTTTACACTACA
AGCTGCTTTTGGTAATGCTGGTGTTTGTTATGACATTTTTGGAGTCACAACACCTGAAAA
GTGCATTTTTACTTCTGCTTGTACTAGATTAGAAGGTTTGGGTGGTGACAATGTTTATTG
TTATAACACAGCGCTTATGGAAGGTTCTTTGCCTTACAGTTCAATACAAGCTAATGCATA
TTATAAATATGACAATGGCAATTTTATTAAGTTGCCAGAAGTTATTGCACAAGGCTTTGG
TTTTAGAACAGTGCGTACTATTGCCACCAAATACTGCCGCGTAGGTGAATGTGTTGAATC
CAATGCAGGTGTGTGTTTTGGCTTTGACAAGTGGTTTGTTAACGATGGACGTGTTGCCAA
TGGTTACGTTTGTGGTACTGGTTTGTGGAACCTTGTATTTAACATACTTTCCATGTTTTC
ATCTTCATTCTCTGTTGCTGCAATGTCAGGTCAAATTTTACTTAATTGTGCATTAGGTGC
TTTTGCTATTTTTTGTTGTTTTCTTGTGACAAAGTTTAGACGCATGTTTGGTGACCTTTC
TGTAGGTGTTTGCACTGTTGTTGTGGCTGTTTTGCTTAACAATGTCTCTTACATTGTAAC
TCAGAATTTAGTAACAATGATTGCTTATGCCATATTGTATTTCTTTGCTACTAGAAGCTT
ACGCTATGCATGGATTTGGTGTGCTGCATATTTAATTGCGTATATTTCTTTTGCTCCATG
GTGGTTGTGTGCTTGGTACTTTCTTGCTATGTTGACAGGTTTGTTACCTAGTTTGCTGAA
GCTTAAAGTTTCGACAAATCTTTTCGAAGGTGACAAATTTGTAGGTACATTTGAAAGTGC
TGCTGCAGGAACATTTGTCATTGACATGCGTTCTTATGAGAAACTTGCTAATAGCATCTC
TCCAGAAAAGTTGAAAAGTTATGCTGCTAGCTATAATAGATATAAGTACTATAGTGGTAA
TGCAAATGAAGCTGATTACTGTTGCGCTTGTTATGCCTATTTAGCAAAAGCAATGTTGGA
CTTTTCGCGTGATCATAATGACATCTTGTACACACCTCCGACTGTCAGTTATGGTTCTAC
ATTACAGGCTGGTTTGCGCAAAATGGCACAACCATCTGGCTTTGTGGAGAAATGTGTTGT
CCGTGTCTGCTATGGAAACACTGTGTTGAATGGGTTGTGGCTTGGTGATATTGTTTATTG
CCCACGTCATGTTATCGCATCTAACACAACTTCTGCTATAGATTATGATCACGAATATAG
TATTATGCGGTTGCATAATTTTTCTATAATATCTGGTACAGCATTTCTTGGTGTTGTAGG
TGCTACTATGCATGGAGTAACTCTTAAAATTAAGGTTTCACAGACTAACATGCACACACC
TAGACATTCTTTTAGAACACTAAAATCTGGTGAAGGTTTTAACATCTTAGCATGCTATGA
TGGTTGTGCTCAAGGTGTTTTTGGTGTGAACATGAGAACTAATTGGACTATCCGTGGTTC
ATTTATTAATGGTGCGTGTGGTTCCCCTGGCTACAATCTTAAAAATGGCGAGGTGGAATT
TGTTTATATGCATCAAATTGAACTCGGAAGTGGTAGCCATGTAGGTTCTAGCTTTGATGG
TGTTATGTATGGTGGTTTTGAAGACCAACCTAATCTTCAAGTTGAATCTGCAAACCAGAT
GTTAACAGTTAATGTGGTTGCATTTCTTTATGCTGCTATATTGAATGGTTGCACATGGTG
GCTTAAAGGTGAAAAATTGTTTGTGGAGCATTATAATGAGTGGGCACAGGCTAATGGTTT
CACAGCTATGAATGGTGAAGACGCTTTTTCCATTCTTGCTGCTAAAACTGGTGTCTGTGT
GGAAAGATTACTTCATGCTATTCAAGTTTTGAATAATGGCTTTGGTGGTAAACAAATTTT
GGGTTATTCTAGTCTCAATGATGAGTTCAGTATTAATGAAGTTGTCAAACAAATGTTTGG
TGTTAACCTGCAAAGTGGTAAAACCACTAGTATGTTTAAATCCATAAGCTTATTTGCTGG
CTTCTTTGTCATGTTCTGGGCTGAATTATTTGTTTATACCACCACTATTTGGGTTAACCC
TGGTTTTCTTACTCCGTTTATGATTTTGCTTGTTGCTTTGTCACTCTGTCTTACATTTGT
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AGTAACTGCTAATGGAACGGTTTCGATATGGATACACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAA

Claims (19)

  1. 하기의 단계를 포함하는 분리된 시료 내 알파 코로나 바이러스의 전장 유전체 서열 확인 방법
    (a) 알파 코로나 바이러스 전장 유전체에 상보적인 하나 이상의 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 제조하는 단계;
    (b) 시료에서 RNA를 분리하는 단계;
    (c) 분리된 RNA를 사용하여 역전사 반응을 수행하는 단계;
    (d) 역전사 반응이 수행된 시료에 하나 이상의 프라이머 세트를 첨가하여 중합효소 연쇄반응을 실시하는 단계; 및
    (e) 증폭된 산물의 서열을 분석하는 단계
  2. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 서열번호 20으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머 세트를 포함하는 것인, 방법
  3. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 서열번호 20으로 이루어진 10개의 프라이머 세트를 포함하는 것인, 방법
  4. 제1항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것인, 방법
  5. 제1항에 있어서, 상기 알파 코로나 바이러스는 229E 또는 NL63을 포함하는 것인, 방법
  6. 제1항에 있어서, 상기 (e) 단계는 서열번호 31 내지 87의 프라이머를 사용하는 것인, 방법
  7. 알파 코로나 바이러스 전장 유전체에 상보적인 하나 이상의 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 포함하는 알파 코로나 바이러스 진단 키트
  8. 제7항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 서열번호 20으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머 세트를 포함하는 것인, 키트
  9. 제7항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 서열번호 20으로 이루어진 10개의 프라이머 세트를 포함하는 것인, 키트
  10. 제7항에 있어서, 진단 시료는 혈액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것인, 키트
  11. 제7항에 있어서, 상기 알파 코로나 바이러스는 229E 또는 NL63을 포함하는 것인, 키트
  12. 제7항에 있어서, 알파 코로나 바이러스의 서열 분석은 서열번호 31 내지 87의 프라이머를 사용하는 것인, 키트
  13. 알파 코로나 바이러스 전장 유전체에 상보적인 하나 이상의 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 포함하는 알파 코로나 바이러스 유발 질환 진단용 조성물
  14. 제13항에 있어서, 상기 코로나 바이러스 유발 질환은 호흡기 질환인 것인, 조성물
  15. 제13항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 서열번호 20으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머 세트를 포함하는 것인, 조성물
  16. 제13항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 서열번호 20으로 이루어진 10개의 프라이머 세트를 포함하는 것인, 조성물
  17. 제13항에 있어서, 진단 시료는 혈액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것인, 조성물
  18. 제13항에 있어서, 상기 알파 코로나 바이러스는 229E 또는 NL63을 포함하는 것인, 조성물
  19. 제13항에 있어서, 알파 코로나 바이러스의 서열 분석은 서열번호 31 내지 87의 프라이머를 사용하는 것인, 조성물
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