WO2014175604A2 - 아벨리노 각막이상증 진단용 조성물 및 이의 진단방법 - Google Patents

아벨리노 각막이상증 진단용 조성물 및 이의 진단방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2014175604A2
WO2014175604A2 PCT/KR2014/003393 KR2014003393W WO2014175604A2 WO 2014175604 A2 WO2014175604 A2 WO 2014175604A2 KR 2014003393 W KR2014003393 W KR 2014003393W WO 2014175604 A2 WO2014175604 A2 WO 2014175604A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
ave
probe
corneal dystrophy
ipc
Prior art date
Application number
PCT/KR2014/003393
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2014175604A3 (ko
Inventor
이희정
이소영
박병준
김종훈
Original Assignee
주식회사 녹십자엠에스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 녹십자엠에스 filed Critical 주식회사 녹십자엠에스
Publication of WO2014175604A2 publication Critical patent/WO2014175604A2/ko
Publication of WO2014175604A3 publication Critical patent/WO2014175604A3/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/113—PCR

Definitions

  • the present invention relates to a composition for diagnosing avelino corneal dystrophy and a method for diagnosing the same, and more particularly, to a composition containing a real-time PCR primer set and probe for diagnosing avelino corneal dystrophy, wherein human TGFBI induces avelino corneal dystrophy.
  • the present invention relates to a method for diagnosing the presence or absence of an R124H (371 G> A) mutation of a gene using an allele specific primer.
  • Corneal dystrophy is one of the autosomal dominant genetic diseases in which cloudiness occurs in the center of the cornea, causing cloudiness with aging and decreased visual acuity.
  • the TGFBI gene Human transforming growth factor b-induced gene
  • TGFBI genes have been reported in recent years, but are commonly associated with five corneal dystrophy: Avelino corneal dystrophy, Rice-Buckler corneal dystrophy, lattice corneal dystrophy, granular keratose dystrophy, and Thiel-Behnke keratose dystrophy. . Since genetic testing has been performed, accurate diagnosis of corneal dysplasia has been possible. Until now, most patients reported in Korea or Japan who had been diagnosed with granular keratosis, one of corneal stromal dysplasia, have been diagnosed with avelino cornea. The diagnosis was changed to granular dystrophy type II.
  • Avellino corneal dystrophy belongs to granular corneal dystrophy type 2, a mutation in the TGFBI gene that causes an opaque layer to form on the cornea, which damages the cornea and causes vision loss or blindness.
  • the exact mechanism of cause or cause is not known, and it is known that a lot of deposition occurs in wounds such as cornea and UVB which is living ultraviolet rays.
  • In patients with Avellino Corneal Dystrophy heterozygotes show significant loss of vision as age increases, and in the case of homozygotes, blindness begins at age 6.
  • Genetic test results show that the prevalence rate (in the case of heterozygote) is 1/340 ⁇ 1 / 1,000 in Korea and there are currently 40,000 patients in Korea.
  • sequencing, conventional PCR, and DNA microarray are used to detect SNPs in codon 124 of TGFBI, the cause of avelino corneal dystrophy.
  • the snapshot (SNaPShot) method is used. Pyrosequencing method for analyzing mutations by detecting oxyluciferin released using sulfurylase, Luciferase, Apyrase) with a CCD camera.
  • these methods are not only time-consuming or expensive equipment, but also complicated procedures such as refining PCR products and performing another process again, which leads to many limitations in daily use.
  • Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2007-0076532 discloses an oligonucleotide for diagnosing corneal dystrophy, more specifically an oligonucleotide for detecting a TGFBI gene mutation for diagnosing corneal dystrophy including avelinosis to be accurately diagnosed before ophthalmic correction surgery.
  • a DNA chip for diagnosing corneal dystrophy wherein the oligonucleotide is immobilized.
  • the diagnostic method using a DNA chip has to go through various steps such as amplifying the DNA in the sample, hybridizing the amplified DNA and the DNA chip, washing the hybridized DNA chip, and detecting a positive reaction. It is cumbersome, and there is a problem that false positive results may appear depending on the probe used in the DNA chip.
  • An object of the present invention is to provide a primer set and probe for more effectively and accurately diagnosing avelino corneal dystrophy using a real-time PCR method.
  • Another object of the present invention is to provide a convenient and accurate determination method by providing a formula and the determination table useful for diagnosing avelino corneal dystrophy.
  • the present invention provides a real-time PCR primer set for diagnosing avelino corneal dystrophy represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 11, and a real-time PCR primer for diagnosing the human internal benign control group represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 21 and 24.
  • the present invention relates to a primer set comprising a mutation sequence of the TGFBI gene involved in avelino keratinosis in a composition for real-time PCR comprising a DNA polymerase, a reaction buffer solution, MgCl 2 , dATP, dTTP, dGTP, dCTP. It provides a reaction composition for real-time PCR containing a labeled probe.
  • the present invention also provides a method of using the formulas and decision tables provided for convenient and accurate diagnosis of Avelino corneal dystrophy.
  • the allele specific polymerase chain reaction (AS-PCR) method and the hydrolysis probe method (hydrolysis probe) method using the cause of avelino corneal dystrophy The mutation of the TGFBI gene can be confirmed in real time in a single tube, and the human internal positive control group can be amplified together to facilitate the determination of the mutation and the suitability of using the nucleic acid used in the diagnostic test. .
  • the primer set and probe according to the present invention it is possible to diagnose avelino keratosis more quickly and accurately than the method of diagnosing avelino corneal dystrophy using DNA microarray or PCR, which is a conventional end-point detection method.
  • the signal of the positive control group can be used to determine whether the PCR is effective and the quality of the extracted DNA so that the result can be more accurately determined.
  • Example 3 and Figure 5 (A) as a result of calculating the concentration and purity of the extracted nucleic acid by using a UV-Visible spectrophotometer both 100 ng / ⁇ l or more, A260 / 280> 1.8 appeared as the template DNA in the real-time PCR reaction There seemed to be no big problem to use. However, as a result of performing real-time PCR using these DNAs as template DNAs, it can be seen that when a small amount of ethyl alcohol and chaotropic salts are present in the template DNAs as shown in FIG. As a result, if the quality of the nucleic acid used as the template DNA is not accurately understood, false negative results may occur, which is very dangerous.
  • the human internal positive control group if the human internal positive control group is not amplified, it may be determined that there is a serious problem in the state of the nucleic acid used as the template DNA. In this case, false negatives may be generated by performing real-time PCR again after performing a new nucleic acid extraction. It has the advantage of blocking the possibility of the source.
  • the diagnosis of Avelino corneal dystrophy is to determine the presence or absence of heterozygotes of TGFBI gene. Allel-specific primers and Taqman probes are used to express the difference of expression between heterozygote and normal human. As it appears, it has the advantage of being easy to read.
  • Figure 1 shows the nucleotide sequence of the TGFBI gene associated with Avelino corneal dystrophy of the present invention.
  • Figure 2 is a real-time PCR results (sensitivity) using the primer set described in SEQ ID NO: 1, 11, 21, 24 and the probe described in SEQ ID NO: 27, 32 of the present invention.
  • Fig. 3 is a mathematical expression and judgment table for determining avelino corneal dystrophy of the present invention.
  • Figure 4 shows the diagnostic results of Avelino corneal dystrophy for Example 2.
  • Figure 5 shows the effect of the quality of the extracted nucleic acid on the test result for Example 3.
  • the present invention is a set of primers for diagnosing avelino corneal dystrophy represented by a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 20, for diagnosing avelino corneal dystrophy positive control group represented by a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 21 to 26.
  • Ave_Probe 5 'FAM-TGGTTGGGCTGGACCCCCAG-BHQ1 3' SEQ ID NO: 27
  • Ave_Probe 5 'FAM-TGTAGATGTACCGTGCTCTCTGT-BHQ1 3' SEQ ID NO: 28
  • Ave_Probe 5 'FAM-TCCGTGTACAGCTGAGTGGTGG-BHQ1 3' (SEQ ID NO: 29)
  • Ave_Probe 5 'FAM-CTGCAGCCCTACCACTCTCAAA-BHQ1 3' SEQ ID NO: 30
  • Ave_Probe 5 'FAM-CTCCTCGTCCTCTCCACCTGTAG-BHQ1 3' SEQ ID NO: 31
  • IPC_Probe 5 'HEX-CCGGGTTGCCAGCTCCCATG-BHQ1 3' (SEQ ID NO: 32)
  • IPC_Probe 5 'HEX-AGGGAGACAATAGCCCTGTCTC-BHQ1 3' (SEQ ID NO: 33).
  • the present invention is a forward primer set represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the reverse primer set represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11, the forward primer set represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 and the reverse primer set represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24, and It relates to an avelino corneal dystrophy kit composition comprising a probe represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 32:
  • Ave_Probe 5 'FAM-TGGTTGGGCTGGACCCCCAG-BHQ1 3' SEQ ID NO: 27
  • IPC_Probe 5 'HEX-CCGGGTTGCCAGCTCCCATG-BHQ1 3' (SEQ ID NO: 32).
  • the present invention comprises the steps of (a) taking a sample to separate DNA from it; (b) performing PCR using the composition of claim 1; And (c) determining a Cp value by measuring fluorescence.
  • the present invention is a primer set for diagnosing avelino corneal dystrophy represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 20, a positive control diagnostic primer set represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 21 to 26, and represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 27 to 31
  • the present invention relates to an avelino corneal dystrophy composition comprising the probe for diagnosing avelino corneal dystrophy, a positive control diagnostic probe represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 32, and 33, and a method for diagnosing avelino corneal dystrophy using the same.
  • the present invention is a set of primers for diagnosing avelino corneal dystrophy represented by a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 20;
  • a real-time PCR primer set for diagnosing avelino corneal dystrophy positive control group represented by a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 21 to 26;
  • a real-time PCR probe for diagnosing avelino corneal dystrophy represented by a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 27 to 31;
  • Ave_Probe 5 'FAM-TGGTTGGGCTGGACCCCCAG-BHQ1 3' SEQ ID NO: 27
  • Ave_Probe 5 'FAM-TGTAGATGTACCGTGCTCTCTGT-BHQ1 3' SEQ ID NO: 28
  • Ave_Probe 5 'FAM-TCCGTGTACAGCTGAGTGGTGG-BHQ1 3' (SEQ ID NO: 29)
  • Ave_Probe 5 'FAM-CTGCAGCCCTACCACTCTCAAA-BHQ1 3' SEQ ID NO: 30
  • Ave_Probe 5 'FAM-CTCCTCGTCCTCTCCACCTGTAG-BHQ1 3' SEQ ID NO: 31
  • Real-time PCR probe for diagnosing avelino corneal dystrophy positive control group represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 32 or 33;
  • IPC_Probe 5 'HEX-CCGGGTTGCCAGCTCCCATG-BHQ1 3' (SEQ ID NO: 32)
  • IPC_Probe 5 'HEX-AGGGAGACAATAGCCCTGTCTC-BHQ1 3' (SEQ ID NO: 33),
  • the present invention is a forward primer represented by a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 5 and a reverse primer represented by a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6 to 20
  • a forward primer represented by a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 5 and a reverse primer represented by a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6 to 20
  • Provided a set of real-time PCR primers for diagnosing avelino corneal dystrophy comprising the set:
  • the present invention is a forward primer represented by a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 21 to 23 and a reverse primer represented by a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 24 to 26 It provides a real-time PCR primer set for diagnosing avelino corneal dystrophy positive control comprising:
  • the present invention provides a real-time PCR probe for diagnosing avelino corneal dystrophy represented by a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 27 to 31:
  • Ave_Probe 5 'FAM-TGGTTGGGCTGGACCCCCAG-BHQ1 3' SEQ ID NO: 27
  • Ave_Probe 5 'FAM-TGTAGATGTACCGTGCTCTCTGT-BHQ1 3' SEQ ID NO: 28
  • Ave_Probe 5 'FAM-TCCGTGTACAGCTGAGTGGTGG-BHQ1 3' (SEQ ID NO: 29)
  • Ave_Probe 5 'FAM-CTGCAGCCCTACCACTCTCAAA-BHQ1 3' SEQ ID NO: 30
  • Ave_Probe 5 'FAM-CTCCTCGTCCTCTCCACCTGTAG-BHQ1 3' (SEQ ID NO: 31).
  • the present invention provides a real-time PCR probe for diagnosing avelino corneal dystrophy positive control group represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 32 or 33:
  • IPC_Probe 5 'HEX-CCGGGTTGCCAGCTCCCATG-BHQ1 3' (SEQ ID NO: 32)
  • IPC_Probe 5 'HEX-AGGGAGACAATAGCCCTGTCTC-BHQ1 3' (SEQ ID NO: 33).
  • the present invention provides a primer set for diagnosing avelino corneal dystrophy, characterized in that the primer set represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 11.
  • the present invention provides a primer set for diagnosing avelino corneal dystrophy positive control, in particular characterized in that the primer set represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 24.
  • the present invention provides a real-time PCR probe for diagnosing Avelino corneal dystrophy, in particular characterized in that the probe represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27.
  • the present invention provides a real-time PCR probe for diagnosing avelino corneal dystrophy positive control, in particular characterized in that the probe represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 32.
  • the present invention is a forward primer set represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the reverse primer set represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11, the forward primer represented by SEQ ID NO: 21 and the base of SEQ ID NO: 24 Reverse primer set represented by sequence; And it provides a kit for diagnosing avelino corneal dystrophy comprising a probe represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 32.
  • the 5 'end of the probe is one fluorescent label selected from the group consisting of FAM, HEX, VIC, TET, JOE, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 and NED Labeled with a factor
  • the 3 'end of the probe may be labeled with one fluorescence inhibitor selected from the group consisting of BHQ-1, 2, 3, 6-TAMRA and MGBNFQ. More specifically, the 5 ′ end of the Avelino corneal dystrophy diagnostic probe may be labeled with FAM, the human positive internal control diagnostic probe may be labeled with HEX, and the 3 ′ end may be labeled with BHQ-1.
  • diagnosis refers to confirming a pathological condition, and for the purpose of the present invention, the diagnosis means confirming the onset and possibility of the occurrence of Avelino corneal dystrophy, and This includes judging whether the disease has occurred, development and mitigation.
  • sample refers to a biological sample, and is taken from a patient suspected of developing or progressing Avelino corneal dystrophy or suspected Avelino corneal dystrophy.
  • the sample may include, but is not limited to, tissue, cells, blood, serum, plasma, saliva, urine, and the like.
  • the nucleic acid obtained from the sample may be DNA or RNA.
  • the Cp (Crossing point) value is a cycle number value at the point where the amplification curve rises fastest, that is, the point where the rate of change of the amplification speed is greatest.
  • the Cp value is automatically calculated using the 2nd Derivative Maximum analysis method (Abs Quant / 2nd Derivative Max) built in a real-time PCR instrument. Since the maximum change rate of the amplification rate is the Cp value, the Cp value does not change due to the minimum titer that causes a reaction, and the influence of the detection error of the device can be excluded.
  • the method for diagnosing avelino corneal dystrophy is as follows:
  • step (c) When the Cp value of the positive control group derived in step (c) is 33 or less, it is determined that the Cp value of the avelino allyl is less than 40, and when ⁇ Cp is 10 or less, regardless of the Cp value of the avelino allyl, If Cp is greater than 10, a negative judgment is made.
  • step (c) If the Cp value of the positive control group derived in step (c) is over 33, it is determined as an invalid response.
  • the primer set and probe according to the present invention it is possible to diagnose avelino corneal dystrophy more quickly and accurately than the method of diagnosing avelino corneal dystrophy using DNA microarray or PCR, and at the same time, PCR using a signal of a human internal control group.
  • the validity and quality of the extracted DNA can be known for more accurate result determination.
  • the concentration and purity of the extracted nucleic acid were calculated using a UV-Visible spectrophotometer. There seemed to be no big problem to use.
  • Avelino corneal dystrophy is to determine the presence or absence of heterozygotes of TGFBI gene.
  • Allel-specific primers and Taqman probes are used to express the difference of expression between heterozygote and normal human. As it appears, it has the advantage of being easy to read.
  • the nucleotide with guanine-substituted nucleotides was 207 bp away from the reverse mutation primer located at the 3 'end and 5' upstream therefrom.
  • the forward primer was designed to be located, Tm was set to 63 °C each.
  • the probe designed to obtain a fluorescence signal from the PCR amplification product was located between the forward primer and the reverse mutation primer and attached to FAM dye at the 5 'end, BHQ1 at the 3' end, Tm was designed to be 68 °C.
  • the forward and reverse primer sets were designed to amplify the human Killer cell Ig-like receptor CD158z (KIR3DL7) gene for the detection of human positive internal control, and the Tm was 65 ° C, respectively.
  • the probe designed to obtain the fluorescence signal of the human positive internal control from the PCR amplification product is located between the forward and reverse primers, HEX dye at the 5 'end, BHQ1 at the 3' end and Tm is 68 °C. It was.
  • Ave_Probe 5 'FAM-TGGTTGGGCTGGACCCCCAG-BHQ1 3' SEQ ID NO: 27
  • IPC_Probe 5 'HEX-CCGGGTTGCCAGCTCCCATG-BHQ1 3' (SEQ ID NO: 32)
  • DNA was collected from samples of blood and oral epithelial cells of the subjects.
  • QIAGEN QIAamp DNA blood Mini Kit was used for DNA extraction.
  • the separated DNA was dissolved in 200 ⁇ l of dilution buffer, and 5 ⁇ l was used as template DNA.
  • the primers prepared in Example 1 SEQ ID NOs: 1, 11, 21, 24
  • probes SEQ ID NOs: 27, 32
  • the primers added to the reaction solution for real-time PCR were concentrations of 500 nM (SEQ ID NOs: 1 and 11) and 125 nM (SEQ ID NOs: 21 and 24), respectively, and the probes were 250 nM (SEQ ID NOs: 27) and 62.5 nM (SEQ ID NOs). 20 ⁇ l of the master mix was prepared and used at a concentration of 32).
  • the real time PCR reaction was performed using LC480II (Roche, USA), 45 cycles were performed at 95 °C 15 minutes, 95 °C 20 seconds, 68 °C 40 seconds as one cycle, and the fluorescence of FAM and HEX was measured for each cycle.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)

Abstract

본 발명은 아벨리노 각막이상증 진단용 조성물 및 이의 진단방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 프로브를 이용하는 경우, 기존의 DNA 마이크로어레이나 PCR을 이용한 아벨리노 각막이상증 진단방법보다 신속하고 정확하게 아벨리노 각막이상증을 진단할 수 있으며, 동시에 인간 내부양성대조군의 시그널을 이용하여 아벨리노 각막이상증의 정확한 판정 및 검사에 사용된 핵산의 사용 적합성을 판별할 수 있다.

Description

아벨리노 각막이상증 진단용 조성물 및 이의 진단방법
본 발명은 아벨리노 각막이상증 진단용 조성물 및 이의 진단방법에 관한 것이며, 보다 자세하게는 아벨리노 각막이상증 진단을 위한 실시간 PCR 프라이머 세트 및 프로브를 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 아벨리노 각막이상증을 유발하는 인체 TGFBI 유전자의 R124H (371 G>A) 변이 유무를 알릴(allele) 특이 프라이머를 이용하여 진단하는 방법에 관한 것이다.
각막이상증(corneal dystrophy)은 각막 중심에 혼탁이 발생하여 노화에 따라 혼탁이 심해져 시력이 감소하는 상염색체 우성 유전질환의 하나이다. 이러한 각막이상증에서 가장 관심받고 있는 TGFBI 유전자 (Human transforming growth factor b-induced gene)는 1997년 Munier 등에 의해 사람의 5번 염색체의 장완 31번 밴드에 자리잡고 있는 것으로 확인된 바 있으며 비정상적인 단백질(keratoepithelin)을 코딩하는 17개의 엑손을 포함하고 있다. 이들 TGFBI 유전자는 최근 여러 가지 변형들이 보고되고는 있지만 일반적으로 아벨리노 각막이상증, 라이스-뷔클러 각막이상증, 격자각막이상증, 과립각막이상증, Thiel-Behnke 각막이상증의 5가지 각막이상증과 연관된 것으로 알려져 있다. 유전자 검사가 이루어진 후로는 지금까지 형태에 따라 모호하게 분리되던 각막이상증의 정확한 진단이 가능하게 되었으며, 각막기질 이상증 중 하나인 과립각막이상증으로 진단되었던 한국이나 일본에서 보고된 대부분의 환자들이 아벨리노 각막이상증(granular dystrophy typeⅡ)으로 진단이 바뀌게 되었다.
아벨리노 각막이상증(Avellino corneal dystrophy)은 과립형각막이영양증 타입2에 속하는 것으로 TGFBI 유전자의 돌연변이로 각막에 불투명한 층이 형성되어 각막을 손상시킴으로써 시력을 저하시키거나 실명하게 만드는 질환이다. 정확한 발생기전이나 원인이 밝혀진 것은 아니며 각막 등의 상처, 생활자외선인 UVB에서도 침착이 많이 발생하는 것으로 알려져 있다. 아벨리노 각막이상증 환자는 연령이 증가함에 따라 이형접합체 (heterozygote)는 시력의 상당한 손실을 보이고, 동형접합체(homozygote)의 경우에는 6세부터 실명한다. 유전자 검사결과 국내에 1/340~1/1,000 사이의 유병율(heterozygote의 경우)을 보이며 현재 국내에 4만명의 환자가 있을 것으로 추정된다.
특히, 라식(LASIK) 시술 이후 각막이상증이 악화된다는 보고가 있어 각막이상증의 정확한 진단 및 라식(LASIK) 시술 이후 각막이상증의 악화를 방지하기 위하여 TGFBI 유전자의 돌연변이 검사가 필수적이다. 따라서, 라식수술의 시술 전에 아벨리노 각막이상증 환자에 대한 정확한 진단을 수행하여, 라식수술에 의한 증상 진행을 방지할 필요가 있다. 그러나 기존의 안과에서는 안과의사가 현미경으로 안구 혼탁을 검사하는 것만으로 아벨리노 각막이상증을 진단하고 있어 증상이 진행되지 않은 환자의 경우는 발견하지 못하고, 라식수술을 시행하여 실명으로 발전하는 경우도 종종 발생하고 있다.
현재 아벨리노 각막이상증 원인 유전자 TGFBI 의 코돈 124에 존재하는 SNP 검사방법으로는 시퀀싱(Sequncing), 전통적인 PCR(Conventional PCR), DNA　마이크로어레이 등이 사용되고 있으며, 현재 널리 시행되고 있는 아벨리노 각막이상증 검사방법으로는 TGFBI 유전자의 PCR 산물에 프라이머를 부착시킨 다음 각각의 돌연변이에 대응하는 ddNTP들을 신장시켜 분석하는 스냅샷(SNaPShot) 방법, TGFBI 유전자의 PCR 산물에 프라이머를 부착시킨 다음 여러 가지 효소(DNA polymerase, Sulfurylase, Luciferase, Apyrase)들을 사용하여 방출되는 옥시루시페린(oxyluciferin)을 CCD 카메라로 검출함으로써 돌연변이를 분석하는 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 방법 등이 있다. 그러나, 이들 방법은 시간이 많이 소요되거나 고가의 장비를 사용하여야 할 뿐만 아니라, PCR 산물을 정제한 후 다시 다른 과정을 수행해야 하는 등 절차가 복잡하여 일상적으로 사용하기에는 많은 제약이 따른다.
대한민국 공개특허공보 10-2007-0076532호에는 각막이영양증 진단용 올리고뉴클레오티드, 더욱 자세하게는 안과의 시력교정 수술 전에 정확하게 진단되어야 할 아벨리노증을 포함하는 각막이영양증을 진단하기 위한 TGFBI 유전자 돌연변이 검출용 올리고뉴클레오티드 및 상기 올리고뉴클레오티드가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 각막이영양증 진단용 DNA 칩이 개시되어 있다. 그러나 DNA 칩을 이용한 진단방법은 샘플 중의 DNA를 증폭시키는 단계, 상기 증폭된 DNA와 DNA 칩을 혼성화시키는 단계, 상기 혼성화된 DNA 칩을 세척하는 단계 및 양성 반응을 검출하는 단계 등 여러 단계를 거쳐야 하는 번거로움이 있고, DNA 칩에 사용되는 프로브에 따라 위양성 결과가 나타날 수 있다는 문제를 가지고 있다.
따라서, 아벨리노 각막이상증의 진단 분야에서는 아벨리노 각막이상증을 빠르고 간편하게 진단하면서도 민감도와 특이도가 높은 검사방법을 제공하는 것이 필요하다.
본 발명의 목적은 실시간 PCR 법을 이용하여 아벨리노 각막이상증을 진단하는 데 있어서, 보다 효율적이고 정확하게 아벨리노 각막이상증을 진단하기 위한 프라이머 세트 및 프로브를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 아벨리노 각막이상증을 진단하는데 유용한 수식 및 판정표를 제공하여 편리하고 정확한 판정방법을 제공하는 것에 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1, 11의 염기서열로 표시되는 아벨리노 각막이상증 진단용 실시간 PCR 프라이머 세트 및 서열번호 21, 24의 염기서열로 표시되는 인간 내부양성대조군 진단용 실시간 PCR 프라이머 세트, 서열번호 27로 표시되는 아벨리노 각막이상증 진단용 실시간 PCR 프로브 및 서열번호 32로 표시되는 인간 내부양성대조군 진단용 실시간 PCR 프로브를 포함한다.
본 발명은 DNA 중합효소, 반응용 완충용액, MgCl2, dATP, dTTP, dGTP, dCTP를 포함하는 실시간 PCR용 조성물에 아벨리노 각막이상증에 관여된 TGFBI 유전자의 돌연변이 시퀀스를 포함하는 프라이머 세트와 형광으로 표지된 프로브가 포함된 실시간 PCR용 반응 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 아벨리노 각막이상증의 진단을 편리하고 정확하게 실시하기 위하여 제공된 수식과 판정표를 이용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 진단방법에 따르는 경우, 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(AS-PCR, Allele Specific-Polymerase Chain Reaction)방법과 가수분해탐침방법 (hydrolysis probe)방법을 이용하여 아벨리노 각막이상증의 원인이 되는 TGFBI 유전자의 돌연변이 여부를 단일튜브 내에서 실시간으로 확인할 수 있으며, 인간 내부양성대조군이 함께 증폭됨으로써 돌연변이 여부의 판정이 용이함과 동시에 진단검사에 사용된 핵산의 사용 적합성을 함께 판정할 수 있다는 장점을 가진다.
본 발명에 따른 프라이머 세트 및 프로브를 이용하면, 기존의 end-point detection 방법인 DNA 마이크로어레이나 PCR을 이용한 아벨리노 각막이상증 진단방법보다 신속하고 정확하게 아벨리노 각막이상증을 진단할 수 있으며, 동시에 인간 내부양성대조군의 시그널을 이용하여 PCR 유효성 여부 및 추출된 DNA의 quality를 알 수 있어 결과 판정을 보다 정확하게 할 수 있다.
실시예 3과 도 5 (A)에 따르면 UV-Visible spectrophotometer를 이용하여 추출된 핵산의 농도와 순도를 계산한 결과 모두 100 ng/㎕ 이상, A260/280 > 1.8로 나타나 실시간 PCR 반응에 주형 DNA로 사용하는 데에 큰 문제가 없어 보였다. 그러나 이들 DNA를 주형 DNA로 하여 실시간 PCR을 수행한 결과 도 5(B)와 같이 주형 DNA 내에 에틸알콜과 카오트로픽 염이 미량으로 존재하는 경우, 결과 판독이 매우 어렵다는 것을 알 수 있다. 결국 주형 DNA로 사용된 핵산의 quality를 정확하게 파악하지 못할 경우 위음성의 결과가 나타날 수 있어 매우 위험하다. 본 발명의 경우 인간 내부양성대조군이 증폭되지 않았을 경우 주형 DNA로 사용된 핵산의 상태에 심각한 문제가 있다고 판정할 수 있으며, 이 경우 핵산 추출을 새로 수행한 후 다시 실시간 PCR을 수행함으로써 위음성이 발생될 수 있는 가능성을 원천적으로 차단할 수 있는 장점을 가진다. 또한, 아벨리노 각막이상증의 진단은 TGFBI유전자의 이형접합(Heterozygotes) 유무를 판별하는 것으로 알릴(allele) 특이적인 프라이머와 택맨 프로브(Taqman probe)를 이용하여 이형접합자와 정상인간의 발현차이가 극명하게 나타나므로 쉽게 판독할 수 있다는 장점을 가진다.
도 1은 본 발명의 아벨리노 각막이상증과 관련된 TGFBI 유전자의 염기 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 서열번호 1, 11, 21, 24로 기재된 프라이머 세트와 서열번호 27, 32로 기재된 프로브를 이용한 실시간 PCR결과(민감도)이다.
도 3은 본 발명의 아벨리노 각막이상증 판정용 수식 및 판정표이다.
도 4는 실시예 2에 대한 아벨리노 각막이상증의 진단 결과를 보여주는 것이다.
도 5는 실시예 3에 대한 추출된 핵산의 quality가 검사결과에 미치는 영향을 보여주는 것이다.
본 발명은 서열번호 1 내지 20으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 염기서열로 표시되는 아벨리노 각막이상증 진단용 프라이머 세트, 서열번호 21 내지 26으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 염기서열로 표시되는 아벨리노 각막이상증 양성대조군 진단용 실시간 PCR 프라이머 세트, 서열번호 27 내지 31로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 염기서열로 표시되는 아벨리노 각막이상증 진단용 실시간 PCR 프로브, 및 서열번호 32 또는 33의 염기서열로 표시되는 아벨리노 각막이상증 양성대조군 진단용 실시간 PCR 프로브를 포함하는 아벨리노 각막이상증 진단용 조성물에 관한 것이다:
Ave_F 5'-CATGCCTCCTCGTCCTCTCCA-3' (서열번호 1)
Ave_F 5'-CATCCCTCCTTCTGTCTTCTGC-3' (서열번호 2)
Ave_F 5'-TGCAGCCCTACCACTCTCAAAC-3' (서열번호 3)
Ave_F 5'-TCTCTGTCAGAGAAGGGAGGGT-3' (서열번호 4)
Ave_F 5'-TGCTCTCTGTCAGAGAAGGGAG-3' (서열번호 5)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGTCT-3' (서열번호 6)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGTAT-3' (서열번호 7)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGTTT-3' (서열번호 8)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGAGT-3' (서열번호 9)
Ave_R 5'-GGCCTCAGCTTCTCCGGGT-3' (서열번호 10)
Ave_R 5'-GGCCTCAGCTTCTCCGCGT-3' (서열번호 11)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCCTGT-3' (서열번호 12)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCATGT-3' (서열번호 13)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCTTGT-3' (서열번호 14)
Ave_R 5'-GGCCTCAGCTTCTCCCCGT-3' (서열번호 15)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCTCGT-3' (서열번호 16)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCACGT-3' (서열번호 17)
Ave_R 5'-GGCCTCAGCTTCTCCGCCT-3' (서열번호 18)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGCAT-3' (서열번호 19)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGCTT-3' (서열번호 20)
IPC_F 5'-TCCAAATGCTGAGCGCAGATCC-3' (서열번호 21)
IPC_F 5'-GTCAGGCCTTGATGGGATCTTC-3' (서열번호 22)
IPC_F 5'-TTGTCTTCTGTCCACCAGCACC-3' (서열번호 23)
IPC_R 5'-TCGTGGTGTGAGGAAGAGCGATG-3' (서열번호 24)
IPC_R 5'-CCTTCAGATTCCAGCTGCTGGT-3' (서열번호 25)
IPC_R 5'-CCCTAAGATGCAGACTCACGC-3' (서열번호 26)
Ave_Probe 5' FAM-TGGTTGGGCTGGACCCCCAG-BHQ1 3' (서열번호 27)
Ave_Probe 5' FAM-TGTAGATGTACCGTGCTCTCTGT-BHQ1 3' (서열번호 28)
Ave_Probe 5' FAM-TCCGTGTACAGCTGAGTGGTGG-BHQ1 3' (서열번호 29)
Ave_Probe 5' FAM-CTGCAGCCCTACCACTCTCAAA-BHQ1 3' (서열번호 30)
Ave_Probe 5' FAM-CTCCTCGTCCTCTCCACCTGTAG-BHQ1 3' (서열번호 31)
IPC_Probe 5' HEX-CCGGGTTGCCAGCTCCCATG-BHQ1 3' (서열번호 32)
IPC_Probe 5' HEX-AGGGAGACAATAGCCCTGTCTC-BHQ1 3' (서열번호 33).
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머와 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머 세트, 서열번호 21로 표시되는 정방향 프라이머와 서열번호 24의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머 세트 및 서열번호 27 및 서열번호 32의 염기서열로 표시되는 프로브를 포함하는 아벨리노 각막이상증 진단용 키트 조성물에 관한 것이다:
Ave_F 5'-CATGCCTCCTCGTCCTCTCCA-3' (서열번호 1)
Ave_R 5'-GGCCTCAGCTTCTCCGCGT-3' (서열번호 11)
IPC_F 5'-TCCAAATGCTGAGCGCAGATCC-3' (서열번호 21)
IPC_R 5'-TCGTGGTGTGAGGAAGAGCGATG-3' (서열번호 24)
Ave_Probe 5' FAM-TGGTTGGGCTGGACCCCCAG-BHQ1 3' (서열번호 27)
IPC_Probe 5' HEX-CCGGGTTGCCAGCTCCCATG-BHQ1 3' (서열번호 32).
또한, 본 발명은 (a) 샘플을 채취하여 이로부터 DNA를 분리하는 단계; (b) 제1항에 기재된 조성물을 사용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (c) 형광도를 측정하여 Cp값을 도출하는 단계를 포함하는 아벨리노 각막이상증의 진단방법에 관한 것이다.
본 발명은 서열번호 1 내지 20의 염기서열로 표시되는 아벨리노 각막이상증 진단용 프라이머 세트, 서열번호 21 내지 26의 염기서열로 표시되는 양성대조군 진단용 프라이머 세트, 서열번호 27 내지 31의 염기서열로 표시되는 아벨리노 각막이상증 진단용 프로브, 서열번호 32 및 33의 염기서열로 표시되는 양성대조군 진단용 프로브를 포함하는 아벨리노 각막이상증 진단용 조성물 및 이를 이용한 아벨리노 각막이상증의 진단방법에 관한 것이다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 서열번호 1 내지 20으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 염기서열로 표시되는 아벨리노 각막이상증 진단용 프라이머 세트;
Ave_F 5'-CATGCCTCCTCGTCCTCTCCA-3' (서열번호 1)
Ave_F 5'-CATCCCTCCTTCTGTCTTCTGC-3'(서열번호 2)
Ave_F 5'-TGCAGCCCTACCACTCTCAAAC-3' (서열번호 3)
Ave_F 5'-TCTCTGTCAGAGAAGGGAGGGT-3' (서열번호 4)
Ave_F 5'-TGCTCTCTGTCAGAGAAGGGAG-3' (서열번호 5)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGTCT-3' (서열번호 6)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGTAT-3'(서열번호 7)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGTTT-3'(서열번호 8)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGAGT-3'(서열번호 9)
Ave_R 5'-GGCCTCAGCTTCTCCGGGT-3'(서열번호 10)
Ave_R 5'-GGCCTCAGCTTCTCCGCGT-3' (서열번호 11)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCCTGT-3' (서열번호 12)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCATGT-3' (서열번호 13)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCTTGT-3' (서열번호 14)
Ave_R 5'-GGCCTCAGCTTCTCCCCGT-3' (서열번호 15)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCTCGT-3' (서열번호 16)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCACGT-3' (서열번호 17)
Ave_R 5'-GGCCTCAGCTTCTCCGCCT-3' (서열번호 18)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGCAT-3' (서열번호 19)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGCTT-3' (서열번호 20)
하기 서열번호 21 내지 26으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 염기서열로 표시되는 아벨리노 각막이상증 양성대조군 진단용 실시간 PCR 프라이머 세트;
IPC_F 5'-TCCAAATGCTGAGCGCAGATCC-3' (서열번호 21)
IPC_F 5'-GTCAGGCCTTGATGGGATCTTC-3' (서열번호 22)
IPC_F 5'-TTGTCTTCTGTCCACCAGCACC-3' (서열번호 23)
IPC_R 5'-TCGTGGTGTGAGGAAGAGCGATG-3' (서열번호 24)
IPC_R 5'-CCTTCAGATTCCAGCTGCTGGT-3' (서열번호 25)
IPC_R 5'-CCCTAAGATGCAGACTCACGC-3' (서열번호 26)
하기 서열번호 27 내지 31로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 염기서열로 표시되는 아벨리노 각막이상증 진단용 실시간 PCR 프로브; 및
Ave_Probe 5' FAM-TGGTTGGGCTGGACCCCCAG-BHQ1 3' (서열번호 27)
Ave_Probe 5' FAM-TGTAGATGTACCGTGCTCTCTGT-BHQ1 3' (서열번호 28)
Ave_Probe 5' FAM-TCCGTGTACAGCTGAGTGGTGG-BHQ1 3' (서열번호 29)
Ave_Probe 5' FAM-CTGCAGCCCTACCACTCTCAAA-BHQ1 3' (서열번호 30)
Ave_Probe 5' FAM-CTCCTCGTCCTCTCCACCTGTAG-BHQ1 3' (서열번호 31)
하기 서열번호 32 또는 33의 염기서열로 표시되는 아벨리노 각막이상증 양성대조군 진단용 실시간 PCR 프로브;
IPC_Probe 5' HEX-CCGGGTTGCCAGCTCCCATG-BHQ1 3' (서열번호 32)
IPC_Probe 5' HEX-AGGGAGACAATAGCCCTGTCTC-BHQ1 3' (서열번호 33),
를 포함하는, 아벨리노 각막이상증 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 본 발명은 하기 서열번호 1 내지 5로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머와 하기 서열번호 6 내지 20으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머 세트를 포함하는 아벨리노 각막이상증 진단용 실시간 PCR 프라이머 세트를 제공한다:
Ave_F 5'-CATGCCTCCTCGTCCTCTCCA-3' (서열번호 1)
Ave_F 5'-CATCCCTCCTTCTGTCTTCTGC-3'(서열번호 2)
Ave_F 5'-TGCAGCCCTACCACTCTCAAAC-3' (서열번호 3)
Ave_F 5'-TCTCTGTCAGAGAAGGGAGGGT-3' (서열번호 4)
Ave_F 5'-TGCTCTCTGTCAGAGAAGGGAG-3' (서열번호 5)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGTCT-3' (서열번호 6)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGTAT-3'(서열번호 7)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGTTT-3'(서열번호 8)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGAGT-3'(서열번호 9)
Ave_R 5'-GGCCTCAGCTTCTCCGGGT-3'(서열번호 10)
Ave_R 5'-GGCCTCAGCTTCTCCGCGT-3' (서열번호 11)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCCTGT-3' (서열번호 12)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCATGT-3' (서열번호 13)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCTTGT-3' (서열번호 14)
Ave_R 5'-GGCCTCAGCTTCTCCCCGT-3' (서열번호 15)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCTCGT-3' (서열번호 16)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCACGT-3' (서열번호 17)
Ave_R 5'-GGCCTCAGCTTCTCCGCCT-3' (서열번호 18)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGCAT-3' (서열번호 19)
Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGCTT-3' (서열번호 20).
본 발명에 따른 일 양태에서, 본 발명은 하기 서열번호 21 내지 23으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머와 하기 서열번호 24 내지 26으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 아벨리노 각막이상증 양성대조군 진단용 실시간 PCR 프라이머 세트를 제공한다:
IPC_F 5'-TCCAAATGCTGAGCGCAGATCC-3' (서열번호 21)
IPC_F 5'-GTCAGGCCTTGATGGGATCTTC-3' (서열번호 22)
IPC_F 5'-TTGTCTTCTGTCCACCAGCACC-3' (서열번호 23)
IPC_R 5'-TCGTGGTGTGAGGAAGAGCGATG-3' (서열번호 24)
IPC_R 5'-CCTTCAGATTCCAGCTGCTGGT-3' (서열번호 25)
IPC_R 5'-CCCTAAGATGCAGACTCACGC-3' (서열번호 26).
본 발명에 다른 일 양태에서, 본 발명은 하기 서열번호 27 내지 31로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 염기서열로 표시되는 아벨리노 각막이상증 진단용 실시간 PCR 프로브를 제공한다:
Ave_Probe 5' FAM-TGGTTGGGCTGGACCCCCAG-BHQ1 3' (서열번호 27)
Ave_Probe 5' FAM-TGTAGATGTACCGTGCTCTCTGT-BHQ1 3' (서열번호 28)
Ave_Probe 5' FAM-TCCGTGTACAGCTGAGTGGTGG-BHQ1 3' (서열번호 29)
Ave_Probe 5' FAM-CTGCAGCCCTACCACTCTCAAA-BHQ1 3' (서열번호 30)
Ave_Probe 5' FAM-CTCCTCGTCCTCTCCACCTGTAG-BHQ1 3' (서열번호 31).
본 발명에 따른 일 양태에서, 본 발명은 서열번호 32 또는 33의 염기서열로 표시되는 아벨리노 각막이상증 양성대조군 진단용 실시간 PCR 프로브를 제공한다:
IPC_Probe 5' HEX-CCGGGTTGCCAGCTCCCATG-BHQ1 3' (서열번호 32)
IPC_Probe 5' HEX-AGGGAGACAATAGCCCTGTCTC-BHQ1 3' (서열번호 33).
본 발명에 따른 일 양태에서, 본 발명은 특히 서열번호 1 및 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 아벨리노 각막이상증 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 본 발명은 특히 서열번호 21 및 서열번호 24의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 아벨리노 각막이상증 양성대조군 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 본 발명은 특히 서열번호 27의 염기서열로 표시되는 프로브인 것을 특징으로 하는 아벨리노 각막이상증 진단용 실시간 PCR 프로브를 제공한다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 본 발명은 특히 서열번호 32의 염기서열로 표시되는 프로브인 것을 특징으로 하는 아벨리노 각막이상증 양성대조군 진단용 실시간 PCR 프로브를 제공한다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머와 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머 세트, 서열번호 21로 표시되는 정방향 프라이머와 서열번호 24의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머 세트; 및 서열번호 27 및 서열번호 32의 염기서열로 표시되는 프로브를 포함하는 아벨리노 각막이상증 진단용 키트 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 프로브의 5’ 말단은 FAM, HEX, VIC, TET, JOE, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종의 형광표지인자로 표지되며, 상기 프로브의 3’ 말단은 BHQ-1, 2, 3, 6-TAMRA 및 MGBNFQ로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종의 형광억제인자로 표지될 수 있다. 보다 구체적으로, 아벨리노 각막이상증 진단용 프로브의 5’ 말단은 FAM으로, 인간 양성내부대조군 진단용 프로브는 HEX로 표지하고, 3’ 말단은 BHQ-1으로 표지할 수 있다.
본 발명에 따른 또 다른 양태에서, (a) 샘플을 채취하여 이로부터 DNA를 분리하는 단계; (b) 제1항에 기재된 조성물을 사용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (c) 형광도를 측정하여 Cp값을 도출하는 단계를 포함하는, 아벨리노 각막이상증의 진단방법이 제공된다.
본 발명에서 상기 "진단"이라는 용어는 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 진단은 아벨리노 각막이상증의 발병 가능성, 발병 여부를 확인하는 것을 의미하며, 아벨리노 각막이상증의 발병여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다.
상기에서 "샘플"이란 생물학적 샘플을 말하며, 아벨리노 각막이상증이 발생 또는 진행 정도에 따른 환자 또는 아벨리노 각막이상증으로 의심되는 환자로부터 채취된 것이다. 상기 샘플로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다. 또한, 상기 샘플로부터 수득한 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다.
이때, 상기 Cp (Crossing point) 값은 증폭 곡선이 가장 빠르게 상승하는 지점 즉 증폭 속도의 변화율이 가장 큰 지점의 사이클 수 (cycle number) 값이다. Cp값은 실시간(Real-time) PCR 장비에 내장되어 있는 2차 도함수 방정식 프로그램 2nd Derivative Maximum analysis method (Abs Quant/2nd Derivative Max)을 이용하여 자동으로 산출한다. 증폭 속도의 변화율이 가장 큰 시점을 Cp값으로 하므로 반응을 일으키는 최소의 역가에 의해 Cp값이 변하지 않으며 또한 기기의 검출 오차에 의한 영향을 배제할 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 아벨리노 각막이상증 진단방법은 다음과 같다:
상기 단계(c)에서 도출된 양성대조군의 Cp값이 33이하인 경우, 아벨리노 알릴의 Cp값이 40 미만이며, △Cp가 10 이하이면 양성으로 판정하고, 아벨리노 알릴의 Cp값에 상관없이 △Cp가 10 초과이면 음성으로 판정하게 된다.
만약, 상기 단계(c)에서 도출된 양성대조군의 Cp값이 33초과인 경우, 유효하지 않은 반응으로 판정하게 된다.
본 발명에 따른 프라이머 세트 및 프로브를 이용하면, DNA 마이크로어레이나 PCR을 이용한 아벨리노 각막이상증 진단방법보다 신속하고 정확하게 아벨리노 각막이상증을 진단할 수 있으며, 동시에 인간 내부양성대조군의 시그널을 이용하여 PCR 유효성 여부 및 추출된 DNA의 quality를 알 수 있어 결과 판정을 보다 정확하게 할 수 있다. 실시예 3과 도 5(A)에 따르면 UV-Visible spectrophotometer를 이용하여 추출된 핵산의 농도와 순도를 계산한 결과 모두 100 ng/㎕ 이상, A260/280 > 1.8로 나타나 실시간 PCR 반응에 주형 DNA로 사용하는 데에 큰 문제가 없어 보였다. 그러나 이들 DNA를 주형 DNA로 하여 실시간 PCR을 수행한 결과 도 5(B)와 같이 주형 DNA내에 에틸알콜과 카오트로픽 염이 미량으로 존재하는 경우, 결과 판독이 매우 어렵다는 것을 알 수 있었다. 결국 주형 DNA로 사용된 핵산의 quality를 정확하게 파악하지 못할 경우 위음성의 결과가 나타날 수 있어 매우 위험한데, 본 발명에 따르면 인간 내부양성대조군이 증폭되지 않았을 경우 주형 DNA로 사용된 핵산의 상태에 심각한 문제가 있다고 판정할 수 있으며, 이 경우 핵산 추출을 새로 수행한 후 다시 실시간 PCR을 수행함으로써 위음성이 발생될 수 있는 가능성을 원천적으로 차단할 수 있는 장점을 가진다. 또한, 아벨리노 각막이상증의 진단은 TGFBI유전자의 이형접합(Heterozygotes) 유무를 판별하는 것으로 알릴(allele) 특이적인 프라이머와 택맨 프로브(Taqman probe)를 이용하여 이형접합자와 정상인간의 발현차이가 극명하게 나타나므로 쉽게 판독할 수 있다는 장점을 가진다.
이하, 본 발명을 본 발명의 실시예에 기초하여 보다 상세하게 기술한다. 다만 본 발명의 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위를 이로 한정하는 것을 의미하는 것이 아니다.
실시예 1 : 실시간 PCR 용 프라이머 및 프로브의 제작
TGFBI 유전자의 엑손 4의 돌연변이 R124H(371 G>A)만을 특이적으로 검출할 수 있도록 구아닌이 아데닌으로 치환된 뉴클레오타이드가 3’ 말단부분에 위치한 역방향 변이 프라이머와 이로부터 5’ upstream 방향으로 207 bp 떨어진 곳에 위치하는 정방향 프라이머를 디자인 하였으며, Tm은 각각 63 ℃가 되도록 하였다.
또한, PCR 증폭산물로부터 형광 시그널을 획득하기 위해 디자인한 프로브는 정방향 프라이머와 역방향 변이 프라이머 사이에 위치하고 5’말단에 FAM dye, 3’말단에 BHQ1을 부착하였으며, Tm이 68 ℃가 되도록 디자인 하였다.
더불어, 인간 양성내부대조군의 검출을 위해 인간 Killer cell Ig-like receptor CD158z(KIR3DL7) 유전자가 증폭되도록 정방향, 역방향 프라이머세트를 디자인 하였으며, Tm은 각각 65 ℃가 되도록 하였다.
또한, PCR 증폭산물로부터 인간 양성내부대조군의 형광 시그널을 획득하기 위해 디자인한 프로브는 정방향과 역방향 프라이머 사이에 위치하고 5’말단에 HEX dye, 3’말단에 BHQ1을 부착하였으며 Tm이 68 ℃가 되도록 디자인 하였다.
Ave_F 5'-CATGCCTCCTCGTCCTCTCCA-3' (서열번호 1)
Ave_R 5'-GGCCTCAGCTTCTCCGCGT-3' (서열번호 11)
IPC_F 5'-TCCAAATGCTGAGCGCAGATCC-3' (서열번호 21)
IPC_R 5'-TCGTGGTGTGAGGAAGAGCGATG-3' (서열번호 24)
Ave_Probe 5' FAM-TGGTTGGGCTGGACCCCCAG-BHQ1 3' (서열번호 27)
IPC_Probe 5' HEX-CCGGGTTGCCAGCTCCCATG-BHQ1 3' (서열번호 32)
실시예 2 : 실시간 PCR을 이용한 아벨리노 각막이상증의 진단
검사 대상자의 혈액, 구강 상피세포에서 샘플을 채취하여 DNA를 분리하였다. DNA 추출 시 QIAGEN QIAamp DNA blood Mini Kit을 사용하였다. 분리된 DNA는 희석완충액(elution buffer) 200 ㎕로 용해시켜 주형 DNA로 5 ㎕을 사용하였다. 실시간 PCR반응에는 실시예 1 에서 제조한 프라이머 (서열번호 1, 11, 21, 24)와 프로브(서열번호 27, 32)을 이용하였다.
실시간 PCR을 위한 반응액에 첨가된 프라이머는 각각 500 nM (서열번호 1, 11), 125 nM (서열번호 21, 24)의 농도로 하였으며, 프로브는 250 nM (서열번호 27), 62.5 nM (서열번호 32)의 농도가 되도록 하여 20 ㎕의 마스터 믹스를 제조하여 사용하였다.
실시간 PCR 반응은 LC480II (로슈, 미국)을 사용하였고, 95 ℃ 15분, 95 ℃ 20초, 68 ℃ 40초를 1 사이클로 하여 45 사이클 수행하였으며, 각 사이클마다 FAM과 HEX의 형광을 측정하였다.
결과의 판정은 인간 양성내부대조군의 Cp값이 유효범위일 때, △Cp값으로 판정한다.
1) 인간 양성내부대조군의 Cp 값이 33이하면 유효한 결과이며 33초과 시에는 유효하지 않은 반응으로 판정한다.
2) 인간 양성내부대조군의 Cp 값이 33이하일 때, 검체의 아벨리노 알릴(avellino allele) Cp값이 40 미만이고, Cp값 차이(△Cp)가 10 이하이면 양성으로 판정한다.
3) 인간 양성내부대조군의 Cp 값이 33이하일 때, 검체의 아벨리노 알릴(avellino allele) Cp값에 관계없이 Cp값 차이(△Cp)가 10 초과이면 음성으로 판정한다.
4) 인간 양성내부대조군의 Cp 값이 33초과 시에는 유효하지 않은 반응으로 판정하여, 재시험하도록 한다.
실시예 3 : 추출된 핵산의 상태에 따른 결과 판정의 부정확성 예측
클론 DNA에 각각 1.25%, 2.5%, 5.0%의 에틸알콜(Ethyl alcohol), 그리고 핵산 추출에 주로 사용되는 카오트로픽염 (Chaotropic salt, Gu-HCl)을 각각 0.125 M, 0.25 M, 0.5 M 되게 처리한 후 각각을 UV-Visible spectrophotometer를 사용하여 흡광도(absorbance)를 측정하고 농도와 순도를 계산하였다 (도 5(A)). 각각의 실험 세트는 모두 100 ng/㎕ 이상의 농도를 나타내었고, 순도(A260/280)는 각각 1.8 이상을 나타내고 있었다. 정량을 위해 고농도의 클론 DNA를 사용하였고, 클론 DNA를 1/1000 연속희석 한 것을 주형으로 상기 실시예 2의 실험방법에 따라 실시간 PCR을 수행하고 그 결과를 정리하였다 (도 5(B)).
라식(LASIK) 시술 이후 각막이상증의 악화를 방지하기 위하여 시술 전 TGFBI 유전자의 돌연변이 검사가 필수적으로 요구되고 있다. 하지만 스냅샷(SNaPShot), 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 또는 DNA 칩을 이용한 기존의 아벨리노 각막이상증 진단방법들은 그 절차가 복잡하고 시간이 많이 소요되며 위양성 결과가 나타날 수 있는 위험성이 있다. 따라서 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 프로브를 이용하면 보다 신속하고 정확하게 아벨리노 각막이상증을 진단할 수 있으며, 동시에 인간 내부양성대조군의 시그널을 이용하여 PCR 유효성 여부 및 추출된 DNA의 quality를 알 수 있어 결과 판정을 보다 정확하게 할 수 있기 때문에 그 수요는 클 것으로 전망된다.
<110> greencrossms
<120> Composition for diagnosing avellino corneal dystrophy and
diagnostic method thereof
<130> P2013-0147
<160> 34
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_F-1
<400> 1
catgcctcct cgtcctctcc a 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_F-2
<400> 2
catccctcct tctgtcttct gc 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_F-3
<400> 3
tgcagcccta ccactctcaa ac 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_F-4
<400> 4
tctctgtcag agaagggagg gt 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_F-5
<400> 5
tgctctctgt cagagaaggg ag 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_F-6
<400> 6
aggcctcagc ttctccgtct 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_F-7
<400> 7
aggcctcagc ttctccgtat 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_F-8
<400> 8
aggcctcagc ttctccgttt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_F-9
<400> 9
aggcctcagc ttctccgagt 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_F-10
<400> 10
ggcctcagct tctccgggt 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_F-11
<400> 11
ggcctcagct tctccgcgt 19
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_F-12
<400> 12
aggcctcagc ttctccctgt 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_F-13
<400> 13
aggcctcagc ttctccatgt 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_F-14
<400> 14
aggcctcagc ttctccttgt 20
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_F-15
<400> 15
ggcctcagct tctccccgt 19
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_F-16
<400> 16
aggcctcagc ttctcctcgt 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_F-17
<400> 17
aggcctcagc ttctccacgt 20
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_F-18
<400> 18
ggcctcagct tctccgcct 19
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_F-19
<400> 19
aggcctcagc ttctccgcat 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_F-20
<400> 20
aggcctcagc ttctccgctt 20
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_F-21
<400> 21
tccaaatgct gagcgcagat cc 22
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_F-22
<400> 22
gtcaggcctt gatgggatct tc 22
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_F-23
<400> 23
ttgtcttctg tccaccagca cc 22
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_F-24
<400> 24
tcgtggtgtg aggaagagcg atg 23
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_F-25
<400> 25
ccttcagatt ccagctgctg gt 22
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_F-26
<400> 26
ccctaagatg cagactcacg c 21
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_Probe-27
<400> 27
tggttgggct ggacccccag 20
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_Probe-28
<400> 28
tgtagatgta ccgtgctctc tgt 23
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_Probe-29
<400> 29
tccgtgtaca gctgagtggt gg 22
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_Probe-30
<400> 30
ctgcagccct accactctca aa 22
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ave_Probe-31
<400> 31
ctcctcgtcc tctccacctg tag 23
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IPC_Probe -32
<400> 32
ccgggttgcc agctcccatg 20
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IPC_Probe -33
<400> 33
agggagacaa tagccctgtc tc 22
<210> 34
<211> 800
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> avellino
<400> 34
ctgtaagact agtttgtaat taggatatct gtttccagtg tccattcctg cctctgttat 60
ctaaatgtct gggaacaaga gctgtgctct gctgtgttta aaatgattaa aaatcaccaa 120
ttagttgagt tcacgtagac aggcatttga cttattgagt tgttttaaga agactataac 180
aagccttaag ccccccagaa acagcctgtc tttgggcttt cccacatgcc tcctcgtcct 240
ctccacctgt agatgtaccg tgctctctgt cagagaaggg agggtgtggt tgggctggac 300
ccccagaggc catccctcct tctgtcttct gctcctgcag ccctaccact ctcaaacctt 360
tacgagaccc tgggagtcgt tggatccacc accactcagc tgtacacgga ccgcacggag 420
aagctgaggc ctgagatgga ggggcccggc agcttcacca tcttcgcccc tagcaacgag 480
gcctgggcct ccttgccagc tgtgagatga cctccgtctg cccgggggac tcttatgggg 540
aactgcctta cttccccgag gggtgggcat gatgaatggg agtctgcagt catttcctac 600
tgtttcagga agctttctcc ttaacccctt agaaaaggct gtggaacttg agctaaaata 660
tgtcttacca ggttgcgtct aatgcccccc gttccctact gggcagaaag acttgggtgc 720
ttcctgagga gggatccttg gcagaagaga ggcctgggct cacgagggct gagaacatgt 780
ttcccagagt tgcaaggacc 800

Claims (14)

  1. 하기 서열번호 1 내지 20으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 염기서열로 표시되는 아벨리노 각막이상증 진단용 프라이머 세트;
    Ave_F 5'-CATGCCTCCTCGTCCTCTCCA-3' (서열번호 1)
    Ave_F 5'-CATCCCTCCTTCTGTCTTCTGC-3' (서열번호 2)
    Ave_F 5'-TGCAGCCCTACCACTCTCAAAC-3' (서열번호 3)
    Ave_F 5'-TCTCTGTCAGAGAAGGGAGGGT-3' (서열번호 4)
    Ave_F 5'-TGCTCTCTGTCAGAGAAGGGAG-3' (서열번호 5)
    Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGTCT-3' (서열번호 6)
    Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGTAT-3' (서열번호 7)
    Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGTTT-3' (서열번호 8)
    Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGAGT-3' (서열번호 9)
    Ave_R 5'-GGCCTCAGCTTCTCCGGGT-3' (서열번호 10)
    Ave_R 5'-GGCCTCAGCTTCTCCGCGT-3' (서열번호 11)
    Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCCTGT-3' (서열번호 12)
    Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCATGT-3' (서열번호 13)
    Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCTTGT-3' (서열번호 14)
    Ave_R 5'-GGCCTCAGCTTCTCCCCGT-3' (서열번호 15)
    Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCTCGT-3' (서열번호 16)
    Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCACGT-3' (서열번호 17)
    Ave_R 5'-GGCCTCAGCTTCTCCGCCT-3' (서열번호 18)
    Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGCAT-3' (서열번호 19)
    Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGCTT-3' (서열번호 20)
    하기 서열번호 21 내지 26으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 염기서열로 표시되는 아벨리노 각막이상증 양성대조군 진단용 실시간 PCR 프라이머 세트;
    IPC_F 5'-TCCAAATGCTGAGCGCAGATCC-3' (서열번호 21)
    IPC_F 5'-GTCAGGCCTTGATGGGATCTTC-3' (서열번호 22)
    IPC_F 5'-TTGTCTTCTGTCCACCAGCACC-3' (서열번호 23)
    IPC_R 5'-TCGTGGTGTGAGGAAGAGCGATG-3' (서열번호 24)
    IPC_R 5'-CCTTCAGATTCCAGCTGCTGGT-3' (서열번호 25)
    IPC_R 5'-CCCTAAGATGCAGACTCACGC-3' (서열번호 26)
    하기 서열번호 27 내지 31로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 염기서열로 표시되는 아벨리노 각막이상증 진단용 실시간 PCR 프로브; 및
    Ave_Probe 5' FAM-TGGTTGGGCTGGACCCCCAG-BHQ1 3' (서열번호 27)
    Ave_Probe 5' FAM-TGTAGATGTACCGTGCTCTCTGT-BHQ1 3' (서열번호 28)
    Ave_Probe 5' FAM-TCCGTGTACAGCTGAGTGGTGG-BHQ1 3' (서열번호 29)
    Ave_Probe 5' FAM-CTGCAGCCCTACCACTCTCAAA-BHQ1 3' (서열번호 30)
    Ave_Probe 5' FAM-CTCCTCGTCCTCTCCACCTGTAG-BHQ1 3' (서열번호 31)
    하기 서열번호 32 또는 33의 염기서열로 표시되는 아벨리노 각막이상증 양성대조군 진단용 실시간 PCR 프로브
    IPC_Probe 5' HEX-CCGGGTTGCCAGCTCCCATG-BHQ1 3' (서열번호 32)
    IPC_Probe 5' HEX-AGGGAGACAATAGCCCTGTCTC-BHQ1 3' (서열번호 33)
    를 포함하는, 아벨리노 각막이상증 진단용 조성물.
  2. 하기 서열번호 1 내지 5로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머와 하기 서열번호 6 내지 20으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머 세트를 포함하는 아벨리노 각막이상증 진단용 실시간 PCR 프라이머 세트:
    Ave_F 5'-CATGCCTCCTCGTCCTCTCCA-3' (서열번호 1)
    Ave_F 5'-CATCCCTCCTTCTGTCTTCTGC-3' (서열번호 2)
    Ave_F 5'-TGCAGCCCTACCACTCTCAAAC-3' (서열번호 3)
    Ave_F 5'-TCTCTGTCAGAGAAGGGAGGGT-3' (서열번호 4)
    Ave_F 5'-TGCTCTCTGTCAGAGAAGGGAG-3' (서열번호 5)
    Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGTCT-3' (서열번호 6)
    Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGTAT-3' (서열번호 7)
    Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGTTT-3' (서열번호 8)
    Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGAGT-3' (서열번호 9)
    Ave_R 5'-GGCCTCAGCTTCTCCGGGT-3' (서열번호 10)
    Ave_R 5'-GGCCTCAGCTTCTCCGCGT-3' (서열번호 11)
    Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCCTGT-3' (서열번호 12)
    Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCATGT-3' (서열번호 13)
    Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCTTGT-3' (서열번호 14)
    Ave_R 5'-GGCCTCAGCTTCTCCCCGT-3' (서열번호 15)
    Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCTCGT-3' (서열번호 16)
    Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCACGT-3' (서열번호 17)
    Ave_R 5'-GGCCTCAGCTTCTCCGCCT-3' (서열번호 18)
    Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGCAT-3' (서열번호 19)
    Ave_R 5'-AGGCCTCAGCTTCTCCGCTT-3' (서열번호 20).
  3. 하기 서열번호 21 내지 23으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머와 하기 서열번호 24 내지 26으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 아벨리노 각막이상증 양성대조군 진단용 실시간 PCR 프라이머 세트:
    IPC_F 5'-TCCAAATGCTGAGCGCAGATCC-3' (서열번호 21)
    IPC_F 5'-GTCAGGCCTTGATGGGATCTTC-3' (서열번호 22)
    IPC_F 5'-TTGTCTTCTGTCCACCAGCACC-3' (서열번호 23)
    IPC_R 5'-TCGTGGTGTGAGGAAGAGCGATG-3' (서열번호 24)
    IPC_R 5'-CCTTCAGATTCCAGCTGCTGGT-3' (서열번호 25)
    IPC_R 5'-CCCTAAGATGCAGACTCACGC-3' (서열번호 26).
  4. 하기 서열번호 27 내지 31로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 염기서열로 표시되는 아벨리노 각막이상증 진단용 실시간 PCR 프로브:
    Ave_Probe 5' FAM-TGGTTGGGCTGGACCCCCAG-BHQ1 3' (서열번호 27)
    Ave_Probe 5 'FAM-TGTAGATGTACCGTGCTCTCTGT-BHQ1 3' (서열번호 28)
    Ave_Probe 5' FAM-TCCGTGTACAGCTGAGTGGTGG-BHQ1 3' (서열번호 29)
    Ave_Probe 5' FAM-CTGCAGCCCTACCACTCTCAAA-BHQ1 3' (서열번호 30)
    Ave_Probe 5' FAM-CTCCTCGTCCTCTCCACCTGTAG-BHQ1 3' (서열번호 31).
  5. 서열번호 32 또는 33의 염기서열로 표시되는 아벨리노 각막이상증 양성대조군 진단용 실시간 PCR 프로브:
    IPC_Probe 5' HEX-CCGGGTTGCCAGCTCCCATG-BHQ1 3' (서열번호 32)
    IPC_Probe 5' HEX-AGGGAGACAATAGCCCTGTCTC-BHQ1 3' (서열번호 33).
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 아벨리노 각막이상증 진단용 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 아벨리노 각막이상증 진단용 프라이머 세트.
  7. 제1항 또는 제3항에 있어서,
    상기 아벨리노 각막이상증 양성대조군 진단용 프라이머 세트는 서열번호 21 및 서열번호 24의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 아벨리노 각막이상증 양성대조군 진단용 프라이머 세트.
  8. 제1항 또는 제4항에 있어서,
    상기 실시간 PCR 프로브는 서열번호 27의 염기서열로 표시되는 프로브인 것을 특징으로 하는 아벨리노 각막이상증 진단용 실시간 PCR 프로브.
  9. 제1항 또는 제5항에 있어서,
    상기 아벨리노 각막이상증 양성대조군 진단용 실시간 PCR 프로브는 서열번호 32의 염기서열로 표시되는 프로브인 것을 특징으로 하는 아벨리노 각막이상증 양성대조군 진단용 실시간 PCR 프로브.
  10. 하기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머와 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머 세트, 하기 서열번호 21로 표시되는 정방향 프라이머와 서열번호 24의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머 세트; 및
    하기 서열번호 27 및 서열번호 32의 염기서열로 표시되는 프로브를 포함하는 아벨리노 각막이상증 진단용 키트 조성물:
    Ave_F 5'-CATGCCTCCTCGTCCTCTCCA-3' (서열번호 1)
    Ave_R 5'-GGCCTCAGCTTCTCCGCGT-3' (서열번호 11)
    IPC_F 5'-TCCAAATGCTGAGCGCAGATCC-3' (서열번호 21)
    IPC_R 5'-TCGTGGTGTGAGGAAGAGCGATG-3' (서열번호 24)
    Ave_Probe 5' FAM-TGGTTGGGCTGGACCCCCAG-BHQ1 3' (서열번호 27)
    IPC_Probe 5' HEX-CCGGGTTGCCAGCTCCCATG-BHQ1 3' (서열번호 32).
  11. 제1항에 있어서,
    상기 프로브의 5’ 말단이 FAM, HEX, VIC, TET, JOE, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종의 형광표지인자로 표지되며,
    상기 프로브의 3’ 말단이 BHQ-1, 2, 3, 6-TAMRA 및 MGBNFQ로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종의 형광억제인자로 표지되는 것을 특징으로 하는 아벨리노 각막이상증 진단용 조성물.
  12. (a) 샘플을 채취하여 이로부터 DNA를 분리하는 단계;
    (b) 제1항에 기재된 조성물을 사용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    (c) 형광도를 측정하여 Cp값을 도출하는 단계를 포함하는,
    아벨리노 각막이상증의 진단방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 단계(c)에서 도출된 양성대조군의 Cp값이 33이하인 경우,
    아벨리노 알릴의 Cp값이 40 미만이며, △Cp가 10 이하이면 양성으로 판정하고,
    아벨리노 알릴의 Cp값에 상관없이 △Cp가 10 초과이면 음성으로 판정하는 것을 특징으로 하는 아벨리노 각막이상증의 진단방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 단계(c)에서 도출된 양성대조군의 Cp값이 33초과인 경우, 유효하지 않은 반응으로 판정하는 것을 특징으로 하는 아벨리노 각막이상증의 진단방법.
PCT/KR2014/003393 2013-04-23 2014-04-18 아벨리노 각막이상증 진단용 조성물 및 이의 진단방법 WO2014175604A2 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130044730A KR101577109B1 (ko) 2013-04-23 2013-04-23 아벨리노 각막이상증 진단용 조성물 및 이의 진단방법
KR10-2013-0044730 2013-04-23

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2014175604A2 true WO2014175604A2 (ko) 2014-10-30
WO2014175604A3 WO2014175604A3 (ko) 2014-12-18

Family

ID=51792470

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2014/003393 WO2014175604A2 (ko) 2013-04-23 2014-04-18 아벨리노 각막이상증 진단용 조성물 및 이의 진단방법

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101577109B1 (ko)
WO (1) WO2014175604A2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021117009A3 (en) * 2019-12-11 2021-08-26 Moore Tara Allele-specific silencing of transforming growth factor beta induced gene with r124h mutation using short interfering rna

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101692545B1 (ko) * 2015-01-16 2017-01-05 연세대학교 산학협력단 중증 아벨리노 각막이상증과 관련된 돌연변이 및 그 용도

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090305394A1 (en) * 2006-01-18 2009-12-10 Medigenes Co., Ltd. Dna chip for diagnosis of corneal dystrophy
KR20100115030A (ko) * 2009-04-17 2010-10-27 (주)아벨리노 아벨리노 각막이상증 진단용 프라이머
KR20110037379A (ko) * 2009-10-06 2011-04-13 주식회사 크라운진 실시간 중합효소 연쇄반응과 고해상도 융해 분석을 이용한 아벨리노 각막이상증 검사 방법 및 이를 위한 검사 키트
KR101125212B1 (ko) * 2010-10-01 2012-03-21 (주)아벨리노 아벨리노 각막이상증 진단용 시스템
KR20130005208A (ko) * 2011-07-05 2013-01-15 (주)지노첵 리얼타임 ｐｃｒ을 이용한 카바페넴 내성 장내균 검사 방법 및 키트

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090305394A1 (en) * 2006-01-18 2009-12-10 Medigenes Co., Ltd. Dna chip for diagnosis of corneal dystrophy
KR20100115030A (ko) * 2009-04-17 2010-10-27 (주)아벨리노 아벨리노 각막이상증 진단용 프라이머
KR20110037379A (ko) * 2009-10-06 2011-04-13 주식회사 크라운진 실시간 중합효소 연쇄반응과 고해상도 융해 분석을 이용한 아벨리노 각막이상증 검사 방법 및 이를 위한 검사 키트
KR101125212B1 (ko) * 2010-10-01 2012-03-21 (주)아벨리노 아벨리노 각막이상증 진단용 시스템
KR20130005208A (ko) * 2011-07-05 2013-01-15 (주)지노첵 리얼타임 ｐｃｒ을 이용한 카바페넴 내성 장내균 검사 방법 및 키트

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHENSHENG GU ET AL.: 'An Arg124His mutation in TGFBI associated to Avellino corneal dystrophy in a Chinese pedigree' MOLECULAR VISION vol. 17, 2011, pages 3200 - 3207 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021117009A3 (en) * 2019-12-11 2021-08-26 Moore Tara Allele-specific silencing of transforming growth factor beta induced gene with r124h mutation using short interfering rna

Also Published As

Publication number Publication date
KR101577109B1 (ko) 2015-12-11
KR20140126496A (ko) 2014-10-31
WO2014175604A3 (ko) 2014-12-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2015068957A1 (en) Method for the detection of multiple target nucleic acids using clamping probes and detection probes
WO2017188669A2 (ko) 절단된 상보적인 태그 절편을 이용한 표적 핵산 서열 검출 방법 및 그 조성물
WO2018001258A1 (zh) 一种用于核酸富集捕获的探针及设计方法
WO2020105873A1 (ko) 인간 알파코로나바이러스 전장유전체 증폭을 통한 진단키트 및 전장 유전체 서열 확인 방법
WO2010120013A1 (ko) 신규한 로다민 유도체 및 이를 포함한 차아염소산 검출 센서
WO2018139826A1 (ko) Dna 메틸화를 이용한 연령 예측 방법
WO2011157222A1 (zh) 淋巴瘤融合基因的联合检测方法及其诊断试剂盒
WO2012048607A1 (zh) 检测pca3基因、psa基因的方法及其诊断试剂盒
WO2018038352A2 (ko) 치매진단용 자가항체 바이오마커 및 이를 이용한 치매진단 방법
WO2014175604A2 (ko) 아벨리노 각막이상증 진단용 조성물 및 이의 진단방법
WO2021182881A1 (ko) 유방암 진단용 다중 바이오마커 및 이의 용도
WO2013043002A1 (en) Imide-containing benzothiazole derivative or its salt and pharmaceutical composition comprising the same
WO2015167087A1 (ko) Dna 복제수 변이를 이용한 강직성 척추염 발병 위험도 예측 방법
WO2011120398A1 (zh) 白血病融合基因的联合检测方法及其诊断试剂盒
WO2019135477A2 (ko) 다복제유전자를 이용한 쯔쯔가무시병의 진단방법
WO2017146400A1 (en) Compound and composition for detecting phosgene and diethyl chlorophosphate
WO2014157825A1 (ko) 스피드 멀티플렉스 pcr법을 이용한 hla 대립유전자 검사방법 및 검사키트
WO2010140827A2 (ko) 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 ｈｌａ 대립유전자 자동검사 키트
WO2023191206A1 (ko) 변수 속성에 기반한 탐색적 데이터 분석 자동화 시스템과 방법
WO2019103475A2 (ko) 실시간 중합 효소 연쇄 반응을 이용한 ｈｌａ 대립유전자 검사 키트
WO2016122058A1 (ko) 세포성점균을 이용한 인간 페닐알라닌 수산화효소의 활성분석 방법
WO2020122679A1 (en) Method for detecting a target analyte in a sample using an s-shaped function for a slope data set
WO2022055276A1 (ko) 여성형 탈모증 관련 유전자 다형성 마커 및 이의 용도
WO2009154357A2 (ko) 인유두종 바이러스 검출 방법 및 검출 키트
WO2020050470A1 (ko) 메로시아닌 화합물, 이의 이성질체를 포함하는 dsrna 검출용 조성물 및 dsrna 발현 분석을 이용한 암 진단을 위한 정보 제공 방법

Legal Events

Date Code Title Description
122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 14788555

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2