WO2009154357A2 - 인유두종 바이러스 검출 방법 및 검출 키트 - Google Patents

인유두종 바이러스 검출 방법 및 검출 키트 Download PDF

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WO2009154357A2
WO2009154357A2 PCT/KR2009/002710 KR2009002710W WO2009154357A2 WO 2009154357 A2 WO2009154357 A2 WO 2009154357A2 KR 2009002710 W KR2009002710 W KR 2009002710W WO 2009154357 A2 WO2009154357 A2 WO 2009154357A2
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hpv type
primer
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남용석
김진혁
홍성원
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주식회사 코젠바이오텍
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma

Definitions

  • the present invention relates to a human papillomavirus detection method and detection kit, and more specifically, 20 kinds of primers and probes for detecting human papilloma virus genotypes that can be used by multiplex PCR, and genotypes of human papillomavirus infection and infected human papillomavirus using the same. It is about how to check.
  • the causes of cervical cancer are various, such as the number of births, the first sexual intercourse, the number of sexual intercourse partners, and smoking.
  • HPV human papilloma virus
  • HPV infection can be transmitted only by genital skin contact, and about 50% to 80% of all sexually active women are infected with HPV at least once in their lifetime, and about half of them are carcinogenic HPV.
  • HPV is a 45-55nm double-stranded circular DNA virus with a base pair of about 8 kb.
  • the HPV genome contains the E1 to E7 genes involved in the initial process and the L1 and L2 genes involved in the late process after infecting the host cell. exist.
  • HPV is known to have more than 100 subtypes according to differences in ORF (Open Reading Frame) sequences of E6, E7, and L1 genes. Of these, 30 to 40 types of HPV cause mucosal infections. Most other viruses infect parts of the body other than the genitals, such as plantar warts.
  • HPV high-risk HPVs that cause benign low grade lesions on the surface of the cervix or genital warts that are very unlikely to progress to cancer.
  • HPV-16 and HPV-18 are found in more than 70% of cervical cancers worldwide.
  • HPV infections heal naturally within six months to two years, but persistent infection with dangerous HPV can lead to cervical cancer.
  • HPV a single infection does not form an immune system for subsequent infections and does not reduce the risk of persistent HPV infection. Therefore, women are at risk of being infected with HPV at any time during their sexual life.
  • HPV infection testing methods include antigen / antibody reactions, sequencing, PCR, and DNA chips.
  • the antigen / antibody reaction is less accurate than other methods, and the sequencing can provide the most accurate results, but it is difficult to identify multiple infections and it takes a long time to confirm the results.
  • PCR is the best method for screening a large number of samples, but it requires a large amount of labor and time to identify a large number of HPV genotypes.
  • the DNA chip is the most advanced method currently used, and many HPV genotypes can be identified at one time, but problems with sensitivity and false signals remain.
  • HPV detection methods and detection kits capable of quickly and accurately diagnosing HPV infection and genotype of infected HPV.
  • RT-PCR real-time PCR
  • the real-time PCR method is a method of observing an increase in PCR amplification products in real time every cycle of PCR, and is a technique for analyzing and detecting fluorescence reacting with PCR amplification products.
  • This method does not require additional electrophoresis, has high accuracy, high sensitivity, high reproducibility, and high degree of automation. It is possible to quantify the results, to be quick and easy, and to have excellent biological safety due to contamination by dyes such as EtBr (Ethidium Bromide) and harmful problems such as UV irradiation, and to automatically detect the presence of specific genes. In this way, accurate quantification of DNA and RNA to be detected is possible (Mackay IM, Arden KE, Nitsche A. 2002. Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res. 30 (6): 1292-1305).
  • the real-time PCR method can confirm quantitative results, not qualitative results such as PCR or antigen / antibody, and obtain high specificity comparable to sequencing.
  • probes labeled with fluorescent markers are used, the results can be confirmed with a smaller amount of sample than that used for DNA chip or antigen / antibody reaction.
  • the inventors of the present invention while performing a multi-faceted study on a method and kit that can simultaneously detect multiple HPV types using real-time PCR, primers that can specifically amplify each HPV type in one test reaction. Pairs, probes for detecting each amplified product, primer pairs and probes capable of amplifying and detecting different unique targets even when the two or more primer pairs and probes are combined, and detection conditions and detection results can be identified at once.
  • the present invention has been established and based on this, the present invention has been completed.
  • Another object of the present invention is to provide a set for detecting HPV, which consists of a probe for detecting primer pairs specific for each type of HPV and amplification products thereof.
  • Another object of the present invention is to provide an HPV detection set capable of simultaneously detecting 2 to 20 HPV types in various combinations.
  • Another object of the present invention is to provide a real-time detection method using HPV-specific primers that can accurately determine whether HPV infection and infected HPV genotype.
  • Another object of the present invention is to provide a detection kit that is easy to use and capable of detecting HPV quickly and accurately in a short time.
  • the present invention provides a primer for detecting HPV comprising one or more selected from the group consisting of the following primer pairs:
  • a primer pair specific for HPV type 16 consisting of a primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2;
  • a primer pair specific for HPV type 26 consisting of a primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 and a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8;
  • a primer pair specific for HPV type 31 consisting of a primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 and a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11;
  • a primer pair specific for HPV type 33 consisting of a primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 and a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14;
  • a primer pair specific for HPV type 35 consisting of a primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 and a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17;
  • a primer pair specific for HPV type 39 consisting of a primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19 and a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20;
  • a primer pair specific for HPV type 45 consisting of a primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22 and a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23;
  • a primer pair specific for HPV type 51 consisting of a primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25 and a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26;
  • a primer pair specific for HPV type 52 consisting of a primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28 and a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29;
  • a primer pair specific for HPV type 56 consisting of a primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31 and a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 32;
  • a primer pair specific for HPV type 59 consisting of a primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 37 and a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 38;
  • a primer pair specific for HPV type 66 consisting of a primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 40 and a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 41;
  • a primer pair specific for HPV type 68 consisting of a primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 43 and a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 44;
  • a primer pair specific for HPV type 11 consisting of a primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 49 and a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 50;
  • a primer pair specific for HPV type 42 consisting of a primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 52 and a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 53;
  • a primer pair specific for HPV type 43 consisting of a primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 55 and a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 56;
  • a primer pair specific for HPV type 44 consisting of a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 58 and a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 59.
  • the present invention also provides a probe for detecting HPV, comprising at least one member selected from the group consisting of the following probes:
  • HPV type 16 detection probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3;
  • HPV type 18 detection probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6;
  • HPV type 26 detection probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9;
  • HPV type 31 detection probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12;
  • HPV type 33 detection probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15;
  • HPV type 35 detection probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18;
  • HPV type 39 detection probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21;
  • HPV type 45 detection probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24;
  • HPV type 51 detection probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27;
  • HPV type 52 detection probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 30;
  • HPV type 56 detection probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 33;
  • HPV type 58 detection probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 36;
  • HPV type 59 detection probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 39;
  • HPV type 66 detection probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 42;
  • HPV type 68 detection probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID 45;
  • HPV type 6 detection probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 48;
  • HPV type 11 detection probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 51;
  • HPV type 42 detection probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 54;
  • HPV type 42 detection probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 57;
  • HPV type 44 detection probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 60.
  • the present invention also provides an HPV detection set for detecting HPV by real-time PCR, including the HPV detection primer and the HPV detection probe.
  • the present invention comprises the steps of performing a real-time PCR on the DNA extracted from a sample using one of the HPV detection set; And determining the HPV infection and HPV type by checking real-time PCR results, wherein the 5 'end of the probe used is FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, Labeled with one fluorescent marker selected from the group consisting of RED670 and NED, wherein the 3 'end is selected from the group consisting of 6-TAMRA, BHQ-1,2,3 and MGBNFQ (molecular grove binding non-fluorescence quencher)
  • the present invention comprises the steps of performing a real-time multiplex PCR on the DNA extracted from a sample using two or more of the HPV detection set; And determining the HPV infection and HPV type by checking the real-time multiplex PCR result, wherein the 5 'end of the probe used is FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, Labeled with one fluorescent labeling factor selected from the group consisting of TEXAS RED, RED670, and NED, the 3 'end of which consists of 6-TAMRA, BHQ-1,2,3, and molecular grove binding non-fluorescence quencher (MGNFQ) Provided is a method of detecting HPV, labeled with one fluorescent inhibitor (Quencher) selected from the group.
  • fluorescent inhibitor Quencher
  • the present invention is a primer for detecting the HPV;
  • the 5 'end is labeled with one fluorescent labeling factor selected from the group consisting of FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 and NED, and the 3' end is 6 HPV detection, comprising the HPV detection probe labeled with one fluorescence inhibitor (Quencher) selected from the group consisting of -TAMRA, BHQ-1,2,3 and molecular grove binding non-fluorescence quencher (MBGBFF) Provide the kit.
  • Quencher fluorescence inhibitor
  • MBGBFF molecular grove binding non-fluorescence quencher
  • the HPV detection set and detection method of the present invention simultaneously detect 15 types of high-risk HPV and 6 types of low-risk HPV by real-time multiplex PCR method, so that HPV infection and infected HPV genotype can be quickly and accurately determined. have.
  • Figure 1 shows the results of real-time PCR using the HPV type 16 specific primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and HPV type 16 detection probe of SEQ ID NO: 3 prepared in Experimental Example 1.
  • Figure 3 shows the results of real-time PCR using the HPV type 26 specific primer pair of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 and the probe for detecting HPV type 26 of SEQ ID NO: 9 prepared in Experimental Example 1.
  • Figure 4 shows the results of real-time PCR using the HPV type 31 specific primer pair of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 and the probe for detecting HPV type 31 of SEQ ID NO: 12 prepared in Experimental Example 1.
  • Figure 6 shows the results of real-time PCR using the HPV type 35 specific primer pair of SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 and the probe for detecting HPV type 35 of SEQ ID NO: 18 prepared in Experimental Example 1.
  • Figure 9 shows the results of real-time PCR using the HPV type 51 specific primer pair of SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 and the probe for detecting HPV type 51 of SEQ ID NO: 27 prepared in Experimental Example 1.
  • Figure 10 shows the results of real-time PCR using the HPV type 52 specific primer pair of SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29 prepared in Experimental Example 1 and the HPV type 52 detection probe of SEQ ID NO: 30, and the results.
  • FIG. 11 shows real-time PCR using HPV type 56 specific primer pairs of SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32 prepared in Experimental Example 1 and HPV type 56 detection probes of SEQ ID NO: 33, and shows the result.
  • Figure 13 shows the results of real-time PCR using the HPV type 59 specific primer pair of SEQ ID NO: 37 and SEQ ID NO: 38 prepared in Experimental Example 1 and the HPV type 59 detection probe of SEQ ID NO: 39, the results.
  • Figure 14 shows the results of real-time PCR using the HPV type 66 specific primer pair of SEQ ID NO: 40 and SEQ ID NO: 41 and the probe for detecting HPV type 66 of SEQ ID NO: 42 prepared in Experimental Example 1.
  • Figure 15 shows the results of real-time PCR using the HPV type 68 specific primer pair of SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 44 prepared in Experimental Example 1 and the HPV type 68 detection probe of SEQ ID 45.
  • Figure 16 shows the results of real-time PCR using the HPV type 6 specific primer pair of SEQ ID NO: 46 and SEQ ID NO: 47 prepared in Experimental Example 1 and the HPV type 6 detection probe of SEQ ID NO: 48, the results.
  • Figure 18 shows the results of real-time PCR using the HPV type 42 specific primer pair of SEQ ID NO: 52 and SEQ ID NO: 53 and the probe for detecting HPV type 42 of SEQ ID NO: 54 prepared in Experimental Example 1.
  • Figure 19 shows the results of real-time PCR using the HPV type 43 specific primer pair of SEQ ID NO: 55 and SEQ ID NO: 56 and the probe for detecting HPV type 43 of SEQ ID NO: 57 prepared in Experimental Example 1.
  • FIG. 20 illustrates real-time PCR using HPV type 44 specific primer pairs of SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 59 prepared in Experimental Example 1 and HPV type 44 detection probes of SEQ ID NO: 60, and shows the result.
  • 21 is a real time PCR was performed using a human ⁇ -actin specific primer pair of SEQ ID NO: 61 and SEQ ID NO: 62 prepared in Experimental Example 1 and a human ⁇ -actin detection probe of SEQ ID NO: 60, showing the results will be.
  • FIG. 25 shows multiplex PCR reactions simultaneously in a single vessel for HPV type 51, 31 and 59 DNA templates electropurified with primer and probe detection sets specific for the three high risk HPV types 51, 31 and 59 of Example 4. The results are shown.
  • FIG. 26 shows multiplex PCR reactions simultaneously in a single vessel against HPV type 16, 58 and 58 DNA templates electropurified with primer and probe detection sets specific for the three high risk HPV types 39, 35 and 45 of Example 5. The results are shown.
  • FIG. 27 shows multiplex PCR reactions simultaneously in a single vessel against HPV type 6, 11 and 42 DNA templates electropurified with primer and probe detection sets specific for the three low risk HPV types 6, 11 and 42 of Example 6. The results are shown.
  • FIG. 28 shows the results of multiplex PCR reactions simultaneously in a single vessel against HPV type 43 and 44 DNA templates electropurified with primer and probe detection sets specific for the three high risk HPV types 43 and 44 of Example 5. will be.
  • 29 is a schematic diagram showing an example of a screen for inputting a real-time PCR result file in KoRAS HPV version.
  • Example 30 is electropurified with primer and probe detection sets specific for the 12 high risk HPV types 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, and 59 of Example 8.
  • FIG. 31 is electropurified with primer and probe detection sets specific for the 12 high risk HPV types 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, and 59 of Example 8.
  • the results of multiplex PCR reactions on HPV types 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, and 59 DNA templates simultaneously in a single vessel were analyzed by KoRAS automated analysis program. / X Screen showing result of type.
  • FIG. 33 shows primer and probe detection specific for the 15 high risk HPV types 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 and 68 of Example 9.
  • This is a screen showing O / X type result analyzed by KoRAS automated analysis program for the result of multiplex PCR reaction in a single container at the same time.
  • the present invention provides a real-time PCR method by amplifying target genes specific for 15 high risk HPV types and 6 low risk HPV types, and simultaneously reacting labeled probes with hybridizable and detectable means to the amplification products.
  • the present invention relates to a method for detecting HPV.
  • the present invention uses a set of primer pairs and probes specific to each type of HPV, using a set of two or more sets for detecting HPV at the same time, remarkable for the process required to identify HPV infection and infected HPV genotype This is a quick and accurate way.
  • the real-time PCR method mentioned in the present invention refers to a method of analyzing the amount of DNA to be obtained by monitoring the production process of PCR amplification products in real time using a device in which a thermal cycler and a spectral fluorescent photometer are integrated.
  • the real-time PCR method does not require electrophoresis for the identification of PCR amplification products, and is an excellent method for rapid and quantitative comparison of the amount of amplification products in a region where amplification occurs exponentially.
  • the HPV type of the present invention is HPV-16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, which are 15 high-risk group HPVs closely related to cervical cancer. At least one from the group consisting of HPV-6, 11, 42, 43, and 44, low-risk group HPV associated with low-grade lesions or genital warts, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or more may be selected. Most preferably from the group consisting of 15 HPV-16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 and 68 high-risk group HPV Three selected, or three selected from the group consisting of HPV-6, 11, 42, 43, and 44, which are six low-risk group HPV.
  • primers specific to each HPV type were prepared, and the amplification products were adjusted to 60 to 80 bp to be suitable for real time PCR.
  • primers specific to each type of HPV were made, and then single and multiplex PCR optimal conditions were established that did not result in non-specific reactions.
  • Primers and probes were prepared in a length of about 18 to 30 nt at the site showing 30-70% of GC, wherein all primers had a Tm value of 58 to 60 ° C.
  • the probes were constructed to a length of about 13 to 25 nt at the site showing 30 to 70% GC in the base sequence inside the primer pair specific for the same HPV type, wherein all probes had a Tm value of 68 to 70 ° C.
  • Each primer pair and probe was confirmed by sequencing to not intersect the reaction of the probe with another primer pair used in the multiplex PCR reaction.
  • Probe 5'-FAM-CAC ACG TAG ACA TTC G-MGB-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • Probe 5'-FAM-ATT GCA TTT AGA GCC CC-MGB-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • Probe 5'-FAM-CGT TCG AGT GCT GGA G-MGB-3 '(SEQ ID NO: 9)
  • Probe 5'-NED- ACA ACT ATA CAC AAC ATT G -MGB-3 '(SEQ ID NO: 15)
  • Probe 5'-FAM-CCC AAC ATT TAC TCC AAG-MGB-3 '(SEQ ID NO: 27)
  • Probe 5'-FAM-TGT CTC GTG TTA AAA TAC CT-MGB-3 '(SEQ ID NO: 57)
  • Target gene human ⁇ -actin
  • Probe 5'-Cy5-ATC AAG ATC ATT GCT CCT CCT GAG CGC-BHQ2-3 '(SEQ ID NO: 63)
  • Real-time PCR can be performed using two or more combinations thereof, preferably three or more combinations thereof, among a total of 20 HPV detection sets of the present invention. Combinations of these total 20 HPV detection sets may include detectable means at the 3 'and 5' ends of the probe, or may be labeled, for example.
  • each probe is labeled with different detectable means.
  • the detectable means means compounds, biomolecules or biomolecule mimetics, etc., which can be linked, bound, or attached to a probe to determine the density, concentration, amount, etc. in a conventional manner. Examples thereof include fluorescent labeling factors, luminescent materials, bioluminescent materials, and isotopes that are commonly used, but are not limited thereto. In another embodiment, fluorescent labeling factors are most preferred. Fluorescent labeling factors are readily available since many species are currently commercially available.
  • TaqMan TM probe method is the method of adding the oligonucleotide (TaqManTM probe) modified with quencher substance (TAMRA etc.) the terminal "3 with a fluorescent marker (FAM, etc.) the terminal '5 in PCR reaction mixture, TaqMan TM probe TaqMan TM probe that hybridizes specifically to template DNA in the annealing step, but suppresses fluorescence by quencher on the probe and hybridizes to the template with 5 ' ⁇ 3' exonuclease activity of Taq DNA polymerase in the extension step Only after decomposition, the fluorescent dye is released from the probe, and the inhibition by the quencher is released to fluoresce.
  • the molecular beacon method is a method of adding a oligonucleotide probe (Molecular Beacon probe) to the PCR reaction system to form a hairpin secondary structure in which both ends are modified with fluorescent markers (FAM, TAMRA, etc.) and quencher material (DABCYL, etc.).
  • Molecular beacon probes have a hairpin structure in the free state and are close to the fluorescent marker and quencher material to inhibit fluorescence, but when they hybridize specifically in regions complementary to the template DNA in the annealing step, As the distance from is increased, the suppression by the quencher material is eliminated, so that the fluorescent dye on the probe fluoresces.
  • unhybridized molecular beacon probes retain their hairpin structure and thus do not fluoresce.
  • This method can be applied to the real-time multiplex PCR method for detecting HPV of the present invention. Since the above methods are known in the art, a specific method may be selected in consideration of reaction efficiency, time, fluorescent marker type, and the like. In the present invention, for example, a TaqMan TM probe method may be used. At this time, the probe is labeled with one fluorescent labeling factor selected from the group consisting of FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670, and NED. The termini is labeled with one fluorescence inhibitor (Quencher) selected from the group consisting of 6-TAMRA, BHQ-1,2,3 and molecular grove binding non-fluorescence quencher (MGBNFQ).
  • fluorescent labeling factor selected from the group consisting of FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED,
  • the HPV detection set of the present invention can be carried out using conventional real-time PCR methods and apparatuses.
  • the real-time PCR method is a method for detecting and quantitating fluorescence performed in real time every cycle of PCR based on the principle of DNA polymerase and Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). This method distinguishes specific amplification products from non-specific amplification products and can easily obtain analysis results in an automated manner.
  • FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • the real-time PCR devices that can be used in the present invention include, but are not limited to, AB Real-time PCR devices 7900, 7500, 7300, LightCycler ® 480 from Roche, Mx3000p from Stratagene, and Chromo 4 from BioRad.
  • the laser of this real-time PCR device senses a fluorescent marker labeled on the probe of the amplified PCR product, thereby implementing peaks as shown in FIGS. 22 to 28.
  • the results can be automatically analyzed by executing a program embedded in the device without the electrophoresis process.
  • KoRAS TM Kozen Biotech
  • the analyzed result can be represented by the O / X type or the Ct type, so even an unskilled person can easily know the analyzed result.
  • the HPV detection set and HPV detection method using the same of the present invention can not only significantly shorten the PCR process for identifying the existing HPV, but also quickly confirm the result in real time.
  • This method can be distinguished by laser sensitization of the presence of small DNA fragments and identification of PCR products of less than 100 bp that were difficult to distinguish by electrophoresis, and there is no concern about contamination by PCR products. All test procedures are operated as an automatic system until the end of the test period. Therefore, it is unlikely that a mistake of a tester or an error of a test will occur. It is easy to collect and analyze data, and minimizes test time and labor required. Very useful.
  • the present invention is a primer for detecting HPV; And 5 'end is labeled with one fluorescent labeling factor selected from the group consisting of FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 and NED of different colors, 3 'An HPV detection probe labeled with one fluorescence inhibitor (Quencher) selected from the group consisting of 6-TAMRA, BHQ-1,2,3 and molecular grove binding non-fluorescence quencher (MGBNFQ), Provided are kits for HPV detection.
  • the primer pairs and probes can be packaged in one reaction vessel, strip or microplate, and packaged by methods known in the art.
  • kit of the present invention may further include one or more selected from the group consisting of Taq polymerase, a reaction buffer including MgCl 2 , dNTP, and a stabilizer, in addition to those known in the art.
  • Other reagents such as a master mix for real-time PCR.
  • the size of the PCR product generated to maximize the efficiency of RT-PCR was within 60 ⁇ 80bp.
  • Each primer was similarly analyzed for a large number of homologous DNAs obtained through the NCBI (National Center for Biotechnology Information), and the primers were prepared from genes with identical homologous sequences. The prepared primer sequences were reconfirmed for specificity with the target HPV type using BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).
  • the size of the PCR product generated to maximize the efficiency of RT-PCR was within 60 ⁇ 80bp.
  • Each primer was similarly analyzed for a large number of homologous DNAs obtained through the NCBI (National Center for Biotechnology Information), and the primers were prepared from genes with identical homologous sequences. The prepared primer sequences were reconfirmed for specificity match with the target human ⁇ -actin gene using BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).
  • TaqMan-probe which is bound inside the PCR product generated by the primer pair, was prepared to detect the amount of the PCR product increasing in real time on the RT-PCR.
  • the probe thus produced has a higher sensitivity than the conventional gel electrophoresis method because the amount of PCR product is confirmed by fluorescence generated from the probe.
  • TaqMan-MGB (Minor Groove binder) type RT-PCR probe was used and four types of fluorescent markers (FAM, VIC, NED and Cy5) were used for multiple analysis.
  • a dual labeled probe was prepared that binds to the PCR product generated by the primer pair.
  • the sample used for the reaction was used after analyzing the sequencing using the MY09 / MY11 primer set (5'-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3 '/ 5'-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3') before use.
  • Primer pairs and probes prepared in Experimental Example 1 were simultaneously performed in a single container by real-time PCR. At this time, primer pairs and probe sets were configured to identify three types of HPV types in one tube, and all sets included IPC. Details of the manufactured multiple detection set are shown in Table 9 below. Real time PCR reaction composition and reaction conditions were used in the same manner as Tables 7 and 8.
  • Example 22 shows multiplex PCR reactions simultaneously in a single vessel against HPV type 16, 58 and 58 DNA templates electropurified with primer and probe detection sets specific for the three high risk HPV types 16, 56 and 58 of Example 1 This is the result.
  • FIG. 23 shows multiplex PCR reactions simultaneously in a single vessel for HPV type 18, 52 and 33 DNA templates electropurified with primer and probe detection sets specific for the three high risk HPV types 18, 52 and 33 of Example 2. This is the result.
  • FIG. 25 shows multiplex PCR reactions simultaneously in a single vessel for HPV type 51, 31 and 59 DNA templates electropurified with primer and probe detection sets specific for the three high risk HPV types 51, 31 and 59 of Example 4. This is the result.
  • FIG. 26 shows multiplex PCR reactions simultaneously in a single vessel against HPV type 16, 58 and 58 DNA templates electropurified with primer and probe detection sets specific for the three high risk HPV types 39, 35 and 45 of Example 5. This is the result.
  • FIG. 27 shows multiplex PCR reactions simultaneously in a single vessel against HPV type 6, 11 and 42 DNA templates electropurified with primer and probe detection sets specific for the three low risk HPV types 6, 11 and 42 of Example 6. This is the result.
  • FIG. 28 shows the results of multiplex PCR reactions simultaneously in a single vessel against HPV type 43 and 44 DNA templates electropurified with primer and probe detection sets specific for the three high risk HPV types 43 and 44 of Example 5.
  • the HPV type can be detected by real-time multiplex PCR using the HPV type specific primers and probes of the present invention.
  • Primer pairs and probes prepared in Experimental Example 1 were simultaneously performed in a single container by real-time PCR. At this time, a primer pair and a probe set were configured to identify 12, 15, and 5 types of HPV in one tube, and all sets included IPC. Details of the manufactured multiple detection set are shown in Table 10 below. Real time PCR reaction composition and reaction conditions were used in the same manner as Tables 7 and 8.
  • KoRAS Kermute Real-time Analysis System
  • HPV version is an automated program for analyzing the results of the experiment through real-time PCR.
  • 29 is a schematic diagram showing an example of a screen for inputting a real-time PCR result file in the KoRAS HPV version.
  • the program extracts the real-time PCR result as a CSV extension file, and the extracted Ct values of all samples used in the experiment are recorded. It is also possible to display the result in Ct or O / X type.
  • Example 30 is electropurified with primer and probe detection sets specific for the 12 high risk HPV types 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, and 59 of Example 8.
  • FIG. 31 is electropurified with primer and probe detection sets specific for the 12 high risk HPV types 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, and 59 of Example 8.
  • the results of multiplex PCR reactions on HPV types 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, and 59 DNA templates simultaneously in a single vessel were analyzed by KoRAS automated analysis program. / X Screen showing result of type.
  • FIG. 33 shows primer and probe detection specific for the 15 high risk HPV types 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 and 68 of Example 9.
  • This screen shows the result of O / X type analysis of the multiplex PCR reaction on the template at the same time in a single container by KoRAS automated analysis program.
  • the HPV type can be detected simply and quickly by real-time multiplex PCR using the HPV type specific primers and probes of the present invention.

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Abstract

본 발명은 인유두종 바이러스 검출 방법 및 검출 키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 멀티플렉스 실시간 PCR 방법에 의한 인유두종 바이러스의 감염 여부 및 20종의 인유두종 바이러스 유전형을 동시에 신속 정확하게 검출하는 방법 및 상기 방법을 실시하기 용이한 검출 키트에 관한 것이다.

Description

인유두종 바이러스 검출 방법 및 검출 키트
본 발명은 인유두종 바이러스 검출 방법 및 검출 키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 멀티플렉스 PCR로 사용가능한 20종의 인유두종 바이러스 유전형 검출용 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용하여 인유두종 바이러스 감염 여부 및 감염된 인유두종 바이러스의 유전형을 확인하는 방법에 관한 것이다.
자궁경부암은 전세계 여성의 암 사망 원인 중 유방암과 폐암에 이어 세 번째를 차지하고 있고, 해마다 약 500,000명에게서 발병하고, 발생 빈도는 유방암에 이어 두 번째로 빈번히 발생한다.
자궁경부암의 발생원인은 다양하여 출산횟수, 첫 성교 연령, 성교 상대자수, 흡연 등이 있으며, 특히 성 접촉으로 감염되는 인유두종 바이러스(Human Papilloma Virus, 이하 'HPV')가 자궁경부 종양의 발생에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. HPV 감염은 생식기 피부접촉만으로도 전염이 가능하고, 모든 성생활을 하는 여성의 약 50~80%가 평생에 한번은 HPV에 감염되며, 그 중 절반 정도가 발암성 HPV인 것으로 추정된다.
HPV는 45~55nm 크기의 이중쇄 환상 DNA 바이러스로 약 8kb의 염기쌍으로 갖으며, HPV 게놈에는 숙주 세포를 감염시킨 후 초기 과정에 관여하는 E1 내지 E7 유전자와 후기 과정에 관여하는 L1, L2 유전자가 존재한다. 현재까지 HPV는 E6, E7, L1 유전자의 ORF(Open Reading Frame) 서열 차이에 따라 100 여종이 넘은 아종(subtype)이 존재하는 것으로 알려져 있다. 이중 30 내지 40종의 HPV는 점막조직 감염을 유발한다. 이외의 대부분의 바이러스는 발바닥 사마귀와 같은 생식기 외의 신체부위에 감염된다.
점막조직 감염을 유발하는 HPV 유형 중에는 자궁경부 표면에 양성의 저등급병변이나 암으로의 진행 가능성이 매우 낮은 생식기 사마귀 등을 유발하는 저위험성(low-risk)의 HPV가 있다. 하지만 이보다 중요한 것은 자궁경부암과 직접 관련이 있는 15종 이상의 고위험성(high-risk)인 발암성 HPV이다. 이러한 발암성 HPV 중 특히 HPV-16, HPV-18 유형이 가장 중요한데 이는 전세계적으로 70% 이상의 자궁경부암에서 발견된다.
일반적으로 대부분의 HPV 감염은 6개월에서 2년 이내에 자연 치유되지만 위험성 HPV에 지속적으로 감염되면 자궁경부암으로 진행될 수 있다. HPV의 경우 한번 감염되었다고 해서 이후 감염에 대한 면역체계가 형성되는 것이 아니며, 또한 HPV 지속적 감염의 위험을 감소시키지도 못한다. 따라서 여성들은 성생활을 지속하는 동안 언제든지 HPV에 감염될 위험이 있다.
현재 HPV 감염 여부 검사는 항원/항체 반응, 염기서열 분석, PCR 그리고 DNA chip 등의 방법을 이용하고 있다. 하지만 항원/항체 반응의 경우 다른 방법들에 비해 정확성이 부족하고, 염기서열 분석의 경우 가장 정확한 결과를 얻을 수 있지만 복수 감염을 확인하기 힘들고 결과 확인에 많은 시간이 소요된다. 또한 PCR의 경우 다수의 시료를 스크리닝 하기에 최적의 방법이지만 다수의 HPV 유전형을 확인하기 위해서는 많은 양의 노동력과 시간을 필요로 한다. DNA chip은 현재 사용하는 방법 중 가장 발전된 방법으로 다수의 HPV 유전형을 한번에 확인할 수 있지만 민감도 및 허위신호(false signal)에 대한 문제가 아직 남아있다.
따라서, HPV의 감염여부와 감염된 HPV의 유전형을 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 HPV 검출 방법 및 검출 키트 개발 필요성이 요구되고 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위해서는 복수의 시료를 적은 노동력으로 빠른 시간 내에 정확하게 분석할 수 있는 실험 방법이 필요한데, 현재 개발된 기술 중 이러한 조건에 가장 부합되는 것은 실시간 PCR(RT-PCR)이라고 할 수 있다.
실시간 PCR 방법은 PCR 증폭산물의 증가를 PCR의 매 주기마다 실시간으로 관찰하는 방법으로, PCR 증폭산물과 반응하는 형광물질의 검출과 정량으로 해석하는 기술이다. 이 방법은 기존의 PCR법이 최종 단계를 마치고 겔 상에서 염색하여 전기영동 후 PCR 증폭산물을 확인하는 것에 비해, 전기영동의 추가 작업이 필요 없고 정확도 및 민감도가 뛰어나며, 재현율이 높고, 자동화가 가능하고, 결과를 수치화할 수 있으며, 신속하고 간편하며, EtBr(Ethidium Bromide)과 같은 염색제에 의한 오염 및 자외선 조사 등의 유해문제에 따른 생물학적 안전성이 뛰어나고, 자동으로 특이 유전자의 증폭 유무를 확인할 수 있는 진단방법으로, 검출하고자 하는 DNA와 RNA의 정확한 정량이 가능하다(Mackay IM, Arden KE, Nitsche A. 2002. Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res. 30(6):1292-1305).
따라서, 실시간 PCR 방법을 통해 PCR이나 항원/항체와 같은 정성적인 결과가 아닌 정량적인 결과를 확인할 수 있고, 염기서열 분석에 버금가는 높은 특이도를 얻을 수 있다. 또한 형광 표지인자로 표지된 프로브를 이용하기 때문에 DNA chip이나 항원/항체 반응에 사용되는 시료양 보다 적은양의 시료로도 결과를 확인할 수 있다.
이에 본 발명자들은 실시간 PCR을 이용하여 다수 종의 HPV 유형을 동시에 검출할 수 있는 방법 및 키트에 대하여 다각적 연구를 수행하던 중, 하나의 검사 반응물에서 각각의 HPV 유형을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍, 각 증폭된 산물을 탐지하는 프로브, 상기 2종 이상의 프라이머 쌍 및 프로브가 조합된 상태에서도 서로 다른 고유 타겟을 증폭 및 탐지할 수 있는 프라이머 쌍 및 프로브, 검출 조건, 및 검출 결과를 한번에 파악할 수 있는 방법을 확립하게 되었으며, 이를 토대로 본 발명을 완성하였다.
상기 문제점을 해결하기 위해, 본 발명의 목적은 고위험성 HPV 유형 15종과 저위험성 HPV 유형 6종의 HPV를 정확하고 신속하게 동시에 검출할 수 있는 HPV에 특이적인 프라이머를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 각각의 HPV 유형에 특이적인 프라이머 쌍과 이의 증폭 산물을 탐지하기 위한 프로브로 이루어진 HPV 검출용 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 2 내지 20종의 HPV 유형을 다양한 조합으로 동시에 검출할 수 있는 HPV 검출용 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 HPV 감염 여부 및 감염된 HPV 유전형을 정확하게 판단할 수 있는 HPV 특이적인 프라이머를 이용한 실시간 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 사용이 용이하며, 단시간에 신속 정확하게 HPV를 검출할 수 있는 검출 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 HPV 검출용 프라이머를 제공한다:
서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 16에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 18에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 7의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 26에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 10의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 31에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 13의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 33에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 16의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 17의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 35에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 19의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 39에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 22의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 23의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 45에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 25의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 26의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 51에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 28의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 52에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 31의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 32의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 56에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 34의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 35의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 58에 특이적인 프라이머 쌍; 및
서열번호 37의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 38의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 59에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 40의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 41의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 66에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 43의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 44의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 68에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 46의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 47의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 6에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 49의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 50의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 11에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 52의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 53의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 42에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 55의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 56의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 43에 특이적인 프라이머 쌍; 및
서열번호 58의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 59의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 44에 특이적인 프라이머 쌍.
또한, 본 발명은 하기 프로브로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 HPV 탐지용 프로브를 제공한다:
서열번호 3의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 16 탐지용 프로브;
서열번호 6의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 18 탐지용 프로브;
서열번호 9의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 26 탐지용 프로브;
서열번호 12의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 31 탐지용 프로브;
서열번호 15의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 33 탐지용 프로브;
서열번호 18의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 35 탐지용 프로브;
서열번호 21의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 39 탐지용 프로브;
서열번호 24의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 45 탐지용 프로브;
서열번호 27의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 51 탐지용 프로브;
서열번호 30의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 52 탐지용 프로브;
서열번호 33의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 56 탐지용 프로브;
서열번호 36의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 58 탐지용 프로브;
서열번호 39의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 59 탐지용 프로브;
서열번호 42의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 66 탐지용 프로브;
서열번호 45의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 68 탐지용 프로브;
서열번호 48의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 6 탐지용 프로브;
서열번호 51의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 11 탐지용 프로브;
서열번호 54의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 42 탐지용 프로브;
서열번호 57의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 42 탐지용 프로브; 및
서열번호 60의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 44 탐지용 프로브.
또한, 본 발명은 상기 HPV 검출용 프라이머 및 상기 HPV 탐지용 프로브를 포함하는, HPV를 실시간 PCR로 검출하기 위한 HPV 검출 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 시료로부터 추출한 DNA를 대상으로 상기 HPV 검출 세트 1종을 이용하여 실시간 PCR을 실시하는 단계; 및 실시간 PCR 결과를 확인하여 HPV 감염 여부 및 HPV 유형을 판단하는 단계를 포함하며, 사용되는 프로브의 5' 말단이 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광 표지 인자로 표지되며, 3' 말단이 6-TAMRA, BHQ-1,2,3 및 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 형광 억제 물질(Quencher)로 표지된, HPV의 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 시료로부터 추출한 DNA를 대상으로 상기 HPV 검출 세트 2종 이상을 이용하여 실시간 멀티플렉스 PCR을 실시하는 단계; 및 상기 실시간 멀티플렉스 PCR 결과를 확인하여 HPV 감염 여부 및 HPV 유형을 판단하는 단계를 포함하며, 사용되는 프로브의 5' 말단이 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광 표지 인자로 표지되며, 3' 말단이 6-TAMRA, BHQ-1,2,3 및 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 형광 억제 물질(Quencher)로 표지된, HPV의 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 HPV 검출용 프라이머; 및 5' 말단이 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광 표지 인자로 표지되며, 3' 말단이 6-TAMRA, BHQ-1,2,3 및 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 형광 억제 물질(Quencher)로 표지된 상기 HPV 탐지용 프로브를 포함하는, HPV 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 HPV 검출 세트 및 검출 방법은 실시간 멀티플렉스 PCR 방법에 의해 15종의 고위험성 HPV 유형, 6종의 저위험성 HPV 유형을 동시에 검출함으로써, HPV 감염 여부와 감염된 HPV 유전형을 신속 정확하게 판단할 수 있다.
도 1은 실험예 1에서 제작한 서열번호 1 및 서열번호 2의 HPV 유형 16 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 HPV 유형 16 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 실험예 1에서 제작한 서열번호 4 및 서열번호 5의 HPV 유형 18 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 HPV 유형 18 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실험예 1에서 제작한 서열번호 7 및 서열번호 8의 HPV 유형 26 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 9의 HPV 유형 26 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실험예 1에서 제작한 서열번호 10 및 서열번호 11의 HPV 유형 31 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 12의 HPV 유형 31 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 1에서 제작한 서열번호 13 및 서열번호 14의 HPV 유형 33 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 15의 HPV 유형 33 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 실험예 1에서 제작한 서열번호 16 및 서열번호 17의 HPV 유형 35 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 18의 HPV 유형 35 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실험예 1에서 제작한 서열번호 19 및 서열번호 20의 HPV 유형 39 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 21의 HPV 유형 39 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 실험예 1에서 제작한 서열번호 22 및 서열번호 23의 HPV 유형 45 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 24의 HPV 유형 45 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 실험예 1에서 제작한 서열번호 25 및 서열번호 26의 HPV 유형 51 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 27의 HPV 유형 51 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 실험예 1에서 제작한 서열번호 28 및 서열번호 29의 HPV 유형 52 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 30의 HPV 유형 52 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 실험예 1에서 제작한 서열번호 31 및 서열번호 32의 HPV 유형 56 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 33의 HPV 유형 56 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 실험예 1에서 제작한 서열번호 34 및 서열번호 35의 HPV 유형 58 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 36의 HPV 유형 58 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 실험예 1에서 제작한 서열번호 37 및 서열번호 38의 HPV 유형 59 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 39의 HPV 유형 59 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 실험예 1에서 제작한 서열번호 40 및 서열번호 41의 HPV 유형 66 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 42의 HPV 유형 66 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 실험예 1에서 제작한 서열번호 43 및 서열번호 44의 HPV 유형 68 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 45의 HPV 유형 68 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 실험예 1에서 제작한 서열번호 46 및 서열번호 47의 HPV 유형 6 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 48의 HPV 유형 6 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 실험예 1에서 제작한 서열번호 49 및 서열번호 50의 HPV 유형 11 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 51의 HPV 유형 11 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 실험예 1에서 제작한 서열번호 52 및 서열번호 53의 HPV 유형 42 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 54의 HPV 유형 42 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 실험예 1에서 제작한 서열번호 55 및 서열번호 56의 HPV 유형 43 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 57의 HPV 유형 43 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 실험예 1에서 제작한 서열번호 58 및 서열번호 59의 HPV 유형 44 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 60의 HPV 유형 44 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 실험예 1에서 제작한 서열번호 61 및 서열번호 62의 인간 β-액틴 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 60의 인간 β-액틴 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 실시예 1의 3종의 고위험성 HPV 유형 16, 56 및 58에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 58 및 58 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 실시예 2의 3종의 고위험성 HPV 유형 18, 52 및 33에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 18, 52 및 33 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 실시예 3의 3종의 고위험성 HPV 유형 39, 35 및 45에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 39, 35 및 45 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 실시예 4의 3종의 고위험성 HPV 유형 51, 31 및 59에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 51, 31 및 59 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 실시예 5의 3종의 고위험성 HPV 유형 39, 35 및 45에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 58 및 58 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 27은 실시예 6의 3종의 저위험성 HPV 유형 6, 11 및 42에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 6, 11 및 42 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 28은 실시예 5의 3종의 고위험성 HPV 유형 43 및 44에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 43 및 44 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 29는 KoRAS HPV version에서 실시간 PCR 결과 파일을 입력하는 화면의 일예를 보여주는 모식도이다.
도 30은 실시예 8의 12종의 고위험성 HPV 유형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 및 59에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 및 59 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 Ct 타입 결과를 나타낸 화면이다.
도 31은 실시예 8의 12종의 고위험성 HPV 유형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 및 59에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 및 59 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 O/X 타입 결과를 나타낸 화면이다.
도 32는 실시예 9의 15종의 고위험성 HPV 유형 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 Ct 타입 결과를 나타낸 화면이다.
도 33은 실시예 9의 15종의 고위험성 HPV 유형 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 O/X 타입 결과를 나타낸 화면이다.
도 34는 실시예 10의 5종의 저위험성 HPV 유형 6, 11, 42, 43, 및 44에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 11, 42, 43, 및 44 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 Ct 타입 결과를 나타낸 화면이다.
도 35는 실시예 10의 5종의 저위험성 HPV 유형 6, 11, 42, 43, 및 44에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 11, 42, 43, 및 44 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 O/X 타입 결과를 나타낸 화면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 고위험성 HPV 유형 15종, 저위험성 HPV 유형 6종에 특이적인 표적 유전자를 PCR을 통해 증폭시키고, 동시에 증폭 산물에 혼성가능하며 검출가능한 수단으로 표지된 프로브를 반응시킴으로써, 실시간 PCR 방법을 통해 HPV를 검출하는 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 각 HPV 유형에 특이적인 프라이머 쌍과 프로브를 한 세트로 하여, 1 세트 또는 2세트 이상의 HPV 검출용 세트를 동시에 이용하는 방법으로, HPV 감염 여부 및 감염된 HPV 유전형 확인에 필요한 과정을 현저하게 단축시킨 신속 정확한 방법이다.
본 발명에서 언급한 실시간 PCR 방법은 thermal cycler와 분광 형광 광도계가 일체화된 장치를 이용하여, 실시간으로 PCR 증폭산물의 생성과정을 모니터링하여 얻고자하는 DNA의 양을 분석하는 방법을 의미한다. 실시간 PCR 방법은 PCR 증폭산물의 확인을 위한 전기영동이 필요 없으며, 증폭이 지수 함수적으로 일어나는 영역에서 증폭 산물량을 비교하여 더욱 정확한 정량이 가능한, 신속성과 정량성이 뛰어난 방법이다.
본 발명의 HPV 유형은, 자궁경부암과 밀접한 관련이 있는 고위험성(high-risk group) HPV 15종인 HPV-16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68과 저등급 병변이나 생식기 사마귀 등과 관련이 있는 저위험성(low-risk group) HPV 6종인 HPV-6, 11, 42, 43, 및 44로 이루어진 군으로부터 1종 이상, 바람직하기로는 2종, 3종, 4종, 5종, 6종, 7종, 8종, 9종 이상 선택될 수 있다. 가장 바람직하기로는 고위험성(high-risk group) HPV 15종인 HPV-16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68로 이루어진 군으로부터 선택된 3종, 또는 저위험성(low-risk group) HPV 6종인 HPV-6, 11, 42, 43, 및 44로 이루어진 군으로부터 선택된 3종이다.
본 발명의 바람직한 실험예 1을 참조하면, 각각의 HPV 유형에 특이적인 프라이머를 제작하였고, 이때 실시간 PCR시 적합하도록 60 내지 80 bp 로 증폭산물 크기를 조정하여 제작하였다.
아울러, 각 HPV 유형에 특이적인 20종의 프라이머를 여러 세트로 제작한 다음, 비특이적 반응이 일어나지 않는 단일 및 멀티플렉스 PCR 최적조건을 확립하였다. 프라이머와 프로브는 30 - 70% 의 GC를 나타내는 부위에서 약 18 내지 30 nt의 길이로 제작하였고, 이때 모든 프라이머의 Tm 값은 58 내지 60 ℃로 하였다. 프로브는 동일한 HPV 유형에 특이적인 프라이머쌍 내부의 염기서열 중 30 내지 70%의 GC를 나타내는 부위에서 약 13 내지 25 nt의 길이로 제작하였고, 이때 모든 프로브의 Tm 값은 68 내지 70 ℃로 하였다. 각각의 프라이머 쌍과 프로브는 염기서열 분석을 통해 멀티플렉스 PCR 반응시 함께 사용되는 다른 프라이머쌍과 프로브의 반응에 간성을 주지 않는 것을 확인하였다.
이러한 과정으로 제작한, 본 발명의 HPV 검출 세트의 상세한 사항은 하기와 같다.
1) HPV 유형 16
- 표적 유전자: E7
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-TTC GGT TGT GCG TAC AAA GC-3' (서열번호 1)
역방향: 5'-GCC CAT TAA CAG GTC TTC CAA A-3' (서열번호 2)
- 프로브: 5'-FAM-CAC ACG TAG ACA TTC G-MGB-3' (서열번호 3)
- 증폭산물의 크기 : 62bp
2) HPV 유형 18
- 표적 유전자: E7
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-AAG GCA ACA TTG CAA GAC ATT G-3' (서열번호 4)
역방향: 5'-AGA AGG TCA ACC GGA ATT TCA TT-3' (서열번호 5)
- 프로브: 5'-FAM-ATT GCA TTT AGA GCC CC-MGB-3' (서열번호 6)
- 증폭산물의 크기 : 65bp
3) HPV 유형 26
- 표적 유전자: E7
- 프라이머쌍
정방향: 5'-CTG TGC AGA GCA GTC GAC AGA-3' (서열번호 7)
역방향: 5'-AAG GAC ACG TCT TCC ATT AAC ATC T-3' (서열번호 8)
- 프로브 : 5'-FAM-CGT TCG AGT GCT GGA G-MGB-3' (서열번호 9)
- 증폭산물의 크기 : 64bp
4) HPV 유형 31
- 표적 유전자: E1
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-ATG GCT GAT CCA GCA GGT ACA-3' (서열번호 10)
역방향 : 5'-CTT CTA CAT AAA ACC AAC CAT TGC AT-3' (서열번호 11)
- 프로브: 5'-VIC- ATG GGG AGG GGA CGG -MGB-3' (서열번호 12)
- 증폭산물의 크기: 64bp
5) HPV 유형 33
- 표적 유전자: E6
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-TGA TTT GTG CCA AGC ATT GG-3' (서열번호 13)
역방향 : 5'-TTT GCA TTC CAC GCA CTG TAG-3' (서열번호 14)
- 프로브: 5'-NED- ACA ACT ATA CAC AAC ATT G -MGB-3' (서열번호 15)
- 증폭산물의 크기: 64bp
6) HPV 유형 35
- 표적 유전자: E6
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-CAA GAA TTA CAG CGG AGT GAG GTA-3' (서열번호 16)
역방향 : 5'-ATA TGG CTG GCC TTC TCT ATA TAC TAT ACA-3' (서열번호 17)
- 프로브: 5'-VIC-ATG ACT TTG CAT GCT ATG-MGB-3' (서열번호 18)
- 증폭산물의 크기 : 78bp
7) HPV 유형 39
- 표적 유전자: L1
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-AGT CTG CAG CCA TTA CAT GTC AA-3' (서열번호 19)
역방향 : 5'-GAC CGT CAT ATG GAT CTT TCT TTT C-3' (서열번호 20)
- 프로브: 5'-FAM- AGG ATG CTC CAG CAC C -MGB-3' (서열번호 21)
- 증폭산물의 크기 : 66bp
8) HPV 유형 45
- 표적 유전자: L1
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-ATG GCA CAC AAT ATT ATT TAT GGC C-3' (서열번호 22)
역방향 : 5'-CCA TCT GCA AAA AAA TAG GGA ATA C-3' (서열번호 23)
- 프로브: 5'-NED-TGG TAT TAT TAT TTT CCT AAA AAA CGT AAA-MGB-3' (서열번호 24)
- 증폭산물의 크기 : 82bp
9) HPV 유형 51
- 표적 유전자: L1
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-TGC CAC TGC TGC GGT TT-3' (서열번호 25)
역방향 : 5'-CCC CAT GCC TAA TAT ATT GCT TAA A-3' (서열번호 26)
- 프로브: 5'-FAM-CCC AAC ATT TAC TCC AAG-MGB-3' (서열번호 27)
- 증폭산물의 크기 : 65bp
10) HPV 유형 52
- 표적 유전자: L1
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-GGA TTT GGT TGC ATG GAT TTT AA-3' (서열번호 28)
역방향 : 5'-GCT ACA TAT ATC AAT GGG CAC ATC A-3' (서열번호 29)
- 프로브: 5'-VIC-ACC TTG CAA GCT AGT AAA-MGB-3' (서열번호 30)
- 증폭산물의 크기 : 69bp
11) HPV 유형 56
- 표적 유전자: E7
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-ATG CAT GGT AAA GTA CCA ACG CT-3' (서열번호 31)
역방향 : 5'-TGT AGG TCA ATT TCT GTT TGA GGT G-3' (서열번호 32)
- 프로브: 5'-VIC- CAA GAC GTT GTA TTA GAA CTA -MGB-3' (서열번호 33)
- 증폭산물의 크기 : 71bp
12) HPV 유형 58
- 표적 유전자 : E6
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-TCC AGG ACG CAG AGG AGA A-3' (서열번호 34)
역방향 : 5'-TCC AAC GCC TGA CAC AAA TC-3' (서열번호 35)
- 프로브 : 5'-NED-CCA CGG ACA TTG CA-MGB-3'(서열번호 36)
- 증폭산물의 크기 : 55bp
13) HPV 유형 59
- 표적 유전자: E7
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-AGC GAC CAA GAC AGT GTG GAT-3' (서열번호 37)
역방향 : 5'-GTC CAC TGA CAC GCT GGT AGA C-3' (서열번호 38)
- 프로브: 5'-NED-CAC ACA GCA CCC TC-MGB-3'(서열번호 39)
- 증폭산물의 크기 : 59bp
14) HPV 유형 66
- 표적 유전자: E1
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-GAC AGG GAG ACA GCT CAA CAA TTA-3' (서열번호 40)
역방향 : 5'-TTG CAA CGT CTG TGC ATC TG-3' (서열번호 41)
- 프로브: 5'-VIC-TGC AAG TAC AAA CAG C-MGB-3'(서열번호 42)
- 증폭산물의 크기 : 66bp
15) HPV 유형 68
- 표적 유전자: E1
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-GGC CAA TTG TGA AGG TAC CG-3' (서열번호 43)
역방향 : 5'-CTT CTA CAA AAA ACC ATC CGT TAC AC-3' (서열번호 44)
- 프로브 : 5'-NED- TGG GGA CGG GAC GG -MGB-3'(서열번호 45)
- 증폭산물의 크기: 62bp
16) HPV 유형 6
- 표적 유전자: E7
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-GAC AGC AAC GTT CGA CTG GTT-3' (서열번호 46)
역방향 : 5'-GAA GCT GTT GCA CTT CTC TGA TGT-3' (서열번호 47)
- 프로브 : 5'-FAM-TGC AGT GTA CAG AAA CA-MGB-3' (서열번호 48)
- 증폭산물의 크기 : 64bp
17) HPV 유형 11
- 표적 유전자: E6
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-GCG AGA CAA CTT TCC CTT TGC-3' (서열번호 49)
역방향 : 5'-TGG TTA ATT TTC CCT TGC AGT TC-3' (서열번호 50)
- 프로브 : 5'-VIC-CGT GTG CCT GTT GCT-MGB-3' (서열번호 51)
- 증폭산물의 크기 : 63bp
18) HPV 유형 42
- 표적 유전자: E6
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-GGC AGA ATG TCA GGT ACA TCT GC-3' (서열번호 52)
역방향 : 5'-CCC AAA TTC CTT ACA CAA TTG GTA TAA-3' (서열번호 53)
- 프로브 : 5'-NED-TCA TCA CAG CCA CGC AC-MGB-3' (서열번호 54)
- 증폭산물의 크기 : 69bp
19) HPV 유형 43
- 표적 유전자: E2
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-GTG AAC AAC AGA GGG CTG ACT TT-3' (서열번호 55)
역방향 : 5'-GCT CCC AGG CAC TGT TTA ATA GTT A-3' (서열번호 56)
- 프로브 : 5'-FAM-TGT CTC GTG TTA AAA TAC CT-MGB-3' (서열번호 57)
- 증폭산물의 크기 : 70bp
20) HPV 유형 44
- 표적 유전자: E2
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-ATG GAG ACA ATA GCC AAG CAT TTA G-3' (서열번호 58)
역방향 : 5'-TTG TAA GTT TAT TAC TAT TTT CTT CAT ACA GTT CTA
AC-3' (서열번호 59)
- 프로브 : 5'-VIC-TGT GTG CCA GGA ACA-MGB-3' (서열번호 60)
- 증폭산물의 크기 : 82bp
상기 HPV 검출 세트는 검사의 신뢰도를 높이고, 실험 과정에 사용되는 전체 PCR 튜브에 포함되어 template 및 PCR 조건의 상태 확인을 위해 내부 양성 대조(Internal Positive Control, 이하'IPC')를 추가로 포함할 수 있다. 상기 IPC로β-글로빈, 인간 β-액틴, GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자 등을 포함할 수 있다. 바람직하게는 인간 β-액틴 유전자를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서 제작된 IPC의 상세한 사항은 하기와 같다.
1) IPC
- 표적 유전자 : 인간 β-액틴
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-CTG GCA CCC AGC ACA ATG-3' (서열번호 61)
역방향 : 5'-GCC GAT CCA CAC GGA GTA CG-3' (서열번호 62)
- 프로브 : 5'-Cy5-ATC AAG ATC ATT GCT CCT CCT GAG CGC-BHQ2-3'(서열번호 63)
- 증폭산물의 크기 : 69bp
본 발명의 HPV 검출용 세트 총 20종 중 이들의 2종 이상의 조합, 바람직하기로는 3종 이상의 조합을 동시에 사용하여 실시간 PCR을 수행할 수 있다. 이들 총 20종의 HPV 검출용 세트의 조합은 프로브의 3' 및 5' 말단에 검출가능한 수단을 포함하거나, 예컨대 표지되어 있을 수 있다.
이때, 하나의 PCR 반응물에 동시에 사용하는 HPV 검출용 세트의 종류에 따라, 각각의 프로브는 서로 상이한 검출가능한 수단으로 표지된다. 상기 검출가능한 수단은 프로브에 연결, 결합, 또는 부착시켜 통상적인 방식으로 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물, 생체 분자 또는 생체 분자 모방체 등을 의미한다. 그 예로, 통상적으로 사용되는 형광 표지인자, 발광물질, 생발광물질, 동위원소 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 다른 예로, 형광 표지 인자가 가장 바람직하다. 형광 표지 인자는 현재 시중에 다수 종이 시판되고 있으므로, 용이하게 입수가능하다. 형광 표지 인자의 예로는, FAM, VIC, TAMRA, JOE, ROX, NED, HEX, TET, SYBR Green, Cy3, Texas Red, RED610, RED670, Cy5™ 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 형광 표지 인자는 종류에 따라 여기 및 방사 파장이 다르면 사용방법 또한 상이하므로, 이를 고려하여 하나의 PCR 반응물에 함께 사용하는 형광 표지 인자는 별개로 검출가능한지 여부를 판단하여 선택 사용하여야 하며, 서로 다른 색상을 사용할 수 있다. 상기 형광 표지 인자에 대한 구체적인 사항 및 선택은 본원 발명에 속하는 기술분야의 당업자들에게 자명한 것이다.
일 예로, 형광 표지 인자는 통상의 방법으로 본 발명에 따른 HPV 검출용 세트에 포함된 프라이머, 또는 프로브에 표지된다. 표지 방법은 인터컬레이팅(interchelating) 방법, TaqMan™ 프로브법 및 분자 비콘(Molecualr beacon) 방법들이 있다. 인터컬레이팅 방법은 이중가닥 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 시약(inter-chelator: SYBR Green I, EtBr 등)을 PCR 반응에 첨가하여 증폭과 함께 발색하는 형광을 검출하는 방법으로, 인터컬레이터가 PCR 반응으로 합성된 이중가닥 DNA에 결합하여 형광을 발하며 이 형광강도를 검출하여 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있다. TaqMan™ 프로브법은 5'말단을 형광 표지인자(FAM 등)로 3'말단을 quencher 물질(TAMRA 등)로 수식한 올리고뉴클레오티드(TaqManTM probe)를 PCR 반응액에 첨가하는 방법으로, TaqManTM 프로브가 어닐링 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브상의 quencher에 의해 형광 발생이 억제되고, 연장 단계에서 Taq DNA 중합효소가 갖는 5'→ 3'엑소뉴클레아제 활성으로 주형에 혼성화한 TaqMan™ 프로브만 분해되어 형광색소가 프로브에서 유리되므로서 quencher에 의한 억제가 해제되어 형광을 발하게 된다. 분자 비콘 방법은 양 말단을 형광 표지인자(FAM, TAMRA 등)과 quencher 물질(DABCYL 등)로 수식한 헤어핀형 이차구조를 만드는 올리고뉴클레오티드 프로브(Molecular Beacon probe)를 PCR 반응계에 첨가하는 방법이다. 분자 비콘 프로브는 유리 상태에서 헤어핀 구조를 취하며 형광 표지인자와 quencher 물질에 근접해 있어 형광발생이 억제되지만, 어닐링 단계에서 주형 DNA와 상보적인 영역에서 특이적으로 혼성화할때 형광 표지인자와 quencher 물질과의 거리가 멀어져 quencher 물질에 의한 억제가 해소됨으로써 프로브상의 형광색소가 형광을 나타내게 된다. 그러나, 혼성화되지 않은 분자 비콘 프로브는 헤어핀 구조를 유지하고 있어 형광을 나타내지 않게 된다.
이러한 방법을 본 발명의 HPV를 검출하기 위한 실시간 멀티플렉스 PCR 방법에 적용할 수 있다. 상기한 방법들은 당업계에 공지된 것이므로, 반응 효율, 시간, 형광 표지인자 타입 등을 적절히 고려하여, 특정 방법을 선택할 수 있을 것이다. 본 발명에서는 일 예로, TaqMan™ 프로브 방법을 사용할 수 있다. 이때 상기 프로브는 5' 말단이 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광 표지 인자로 표지되며, 3' 말단이 6-TAMRA, BHQ-1,2,3 및 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 형광 억제 물질(Quencher)로 표지된다.
본 발명의 HPV를 검출하는 방법에 있어, 멀티플렉스 실시간 PCR 반응 조건은 통상적인 조건을 취할 수 있다. 단일 실시간 PCR과 멀티플렉스 실시간 PCR 반응은 동일한 조건으로 수행될 수 있으며, 일예로 UDG 활성을 위하여 50℃에서 2분간 처리하고, 초기 변성(initial denaturation)을 95℃에서 10분간 수행한 후, 변성(denaturation, 95℃에서 15초), 결합 및 연장(annealing & extension, 60℃에서 1분)을 총 40회 실시하는 조건을 취할 수 있다. 실시간 PCR 중 결합 및 연장단계에서 프로브에 의해 생성된 형광을 측정한다.
또한, 본 발명의 HPV 검출용 세트는 통상적인 실시간 PCR 방법 및 장치를 사용하여, 실시할 수 있다. 상기 실시간 PCR 방법은 DNA 중합효소와 형광공명 에너지이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)의 원리에 의해 PCR의 매 주기마다 실시간으로 시행되는 형광을 검출하고 정량하는 방법이다. 이러한 방법은 특이적인 증폭산물을 비 특이적인 증폭산물로부터 구별하여 확인할 수 있으며, 자동화된 양상으로 분석 결과를 쉽게 입수할 수 있다.
본 발명에 사용가능한 실시간 PCR 기기로는 AB 사의 Real-time PCR 기기 7900, 7500, 7300, Roche 사의 LightCycler®480, Stratagene 사의 Mx3000p, 및 BioRad 사의 Chromo 4 기기 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. PCR 종료시 이러한 실시간 PCR 기기의 레이저는 증폭된 PCR 산물의 프로브에 표지된 형광 표지인자를 감지하여 도 22 내지 28과 같은 피크를 구현한다. 이에, 전기영동과정없이 기기에 내장된 프로그램을 실행시켜 자동으로 결과를 분석할 수 있다.
본 발명에서는 일 예로, 자동화 프로그램으로 KoRAS TM(코젠바이오텍)을 사용할 수 있다. 상기 자동화 프로그램을 사용하는 경우 분석된 결과를 O/X 타입 또는 Ct 타입으로 나타낼 수 있어 비숙련자라도 분석된 결과를 쉽게 알 수 있다.
본 발명의 HPV 검출용 세트 및 이를 이용한 HPV 검출 방법에 의해, 기존의 HPV를 식별하기 위한 PCR 과정을 현저하게 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라, 그 결과를 실시간으로 신속하게 확인할 수 있다. 이러한 방법은 전기영동법으로는 분별하기 어려웠던 적은 농도의 DNA 절편의 유무나 100 bp 미만의 PCR 산물의 확인을 레이저 감광으로 구분할 수 있고, PCR 산물에 의한 오염에 대한 우려가 없으며, 결과가 분석되어 검사가 종료되기까지 모든 시험과정이 자동 시스템으로 운영되기 때문에 시험자의 실수, 검사의 오류 등이 발생할 확률이 낮으며, 데이터의 수집, 분석이 용이하고 소요되는 검사시간과 노동력을 최소화시킬 수 있다는 점에서 매우 유용하다.
또한, 본 발명은 HPV 검출용 프라이머; 및 5' 말단이 서로 다른 색상의 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광 표지 인자로 표지되며, 3' 말단이 6-TAMRA, BHQ-1,2,3 및 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 형광 억제 물질(Quencher)로 표지된 HPV 탐지용 프로브를 포함하는, HPV 검출용 키트를 제공한다. 상기 프라이머 쌍 및 프로브는 하나의 반응 용기, 스트립 또는 마이크로플레이트에 패키징될 수 있으며, 당업계에 공지된 방법으로 패키징된다. 또한, 본 발명의 키트는 텍 중합효소(Taq polymerase), MgCl2를 포함한 반응 완충액, dNTP 및 안정화제(stabilizer)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있으며, 그 외에도 당업계에 공지된 다른 시약, 예컨대 실시간 PCR용 마스터 믹스를 추가적으로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실험예 1: 인유두종 바이러스 특이적 프라이머 제조
1-1. 고위험성 HPV 유형 특이적 프라이머 제작
자궁경부암의 원인으로 알려진 15종의 고위험성 인유두종 바이러스, HPV-16, HPV-18, HPV-26, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66 및 HPV-68 각각에 특이적인 프라이머를 개발하였다.
이때 RT-PCR 효율의 극대화를 위해 생성되는 PCR 산물의 크기는 60~80bp 이내로 하였다.
각각의 프라이머는 최초 NCBI(National Center for Biotechnology Information)를 통해 얻은 다수의 동종 DNA를 유사성 분석하여 동종간 염기서열이 모두 일치하는 유전자에서 제작하였다. 제작된 프라이머 염기서열은 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)을 이용하여 목표가 되는 HPV 유형과의 특이성 부합 여부를 재확인하였다.
제작된 고위험성 HPV 유형별 프라이머의 상세한 사항은 아래 표 1에 나타내었다.
표 1
Figure PCTKR2009002710-appb-T000001
1-2. 저위험성 HPV 유형 특이적 프라이머 제작
암 발생의 원인은 아니지만 저등급 병변이나 생식기 사마귀 등을 생성하는 인유두종바이러스 중 대표적인 5종 인유두종 바이러스, HPV-6, HPV-11, HPV-42, HPV-43 및 HPV-44 각각에 특이적인 프라이머를 개발하였다.
이때 RT-PCR 효율의 극대화를 위해 생성되는 PCR 산물의 크기는 60~80bp 이내로 하였다.
각각의 프라이머는 최초 NCBI(National Center for Biotechnology Information)를 통해 얻은 다수의 동종 DNA를 유사성 분석하여 동종간 염기서열이 모두 일치하는 유전자에서 제작하였다. 제작된 프라이머 염기서열은 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)을 이용하여 목표가 되는 HPV 유형과의 특이성 부합 여부를 재확인하였다.
제작된 저위험성 HPV 유형별 프라이머의 상세한 사항은 아래 표 2에 나타내었다.
표 2
Figure PCTKR2009002710-appb-T000002
1-3. HPV 검출 확인을 위한 Internal Positive Control 프라이머 제작
검사의 신뢰도를 높이고, 실험 과정에 사용되는 전체 PCR tube에 포함되어 template 및 PCR condition의 상태 확인을 위해 사용하기 위해 내부 양성 대조(Internal Positive Control, 이하'IPC')로 인간 β-액틴 특이적인 프라이머를 개발하였다.
이때 RT-PCR 효율의 극대화를 위해 생성되는 PCR 산물의 크기는 60~80bp 이내로 하였다.
각각의 프라이머는 최초 NCBI(National Center for Biotechnology Information)를 통해 얻은 다수의 동종 DNA를 유사성 분석하여 동종간 염기서열이 모두 일치하는 유전자에서 제작하였다. 제작된 프라이머 염기서열은 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)을 이용하여 목표가 되는 인간 β-액틴 유전자와의 특이성 부합 여부를 재확인하였다.
제작된 HPV 검출용 IPC 프라이머의 상세한 사항은 아래 표 3에 나타내었다.
표 3
Figure PCTKR2009002710-appb-T000003
1-4. 고위험성 HPV 유형 특이적 프로브 제작
프라이머 쌍으로 생성된 PCR 산물 내부에 결합되는 택맨-프로브(TaqMan-probe)를 제작하여 RT-PCR에서 실시간으로 증가하는 PCR 산물의 양을 감지할 수 있도록 하였다.
이렇게 제작된 프로브는 프로브에서 발생되는 형광에 의해 PCR 산물의 양이 확인되므로 기존의 젤 전기 영동 방식에 비해 높은 민감도를 나타낸다.
TaqMan-MGB (Minor Groove binder) 방식의 RT-PCR 용 프로브를 사용하였고, 다중분석을 위해 4가지 종류의 형광 표지인자(FAM, VIC, NED 및 Cy5)를 조합하여 사용하였다.
제작된 고위험성 HPV 유형별 프로브의 상세한 사항은 아래 표 4에 나타내었다.
표 4
Figure PCTKR2009002710-appb-T000004
1-5. 저위험성 HPV 유형 특이적 프로브 제작
상기 1-4와 동일한 방법으로 저위험성 HPV 유형 특이적 프로브를 제작하였다.
제작된 저위험성 HPV 유형별 프로브의 상세한 사항은 아래 표 5에 나타내었다.
표 5
Figure PCTKR2009002710-appb-T000005
1-6. HPV 검출 확인을 위한 IPC 프로브 제작
프라이머쌍으로 생성된 PCR 산물 내부에 결합되는 이중 표지 프로브(Dual labeled probe)를 제작하였다.
전체 반응에서 IPC를 확인해야 하므로 다른 프로브에서 사용되지 않는 Cy5 형광 표지 인자를 이용하여 프로브를 제작하였다.
제작된 HPV 검출용 IPC 프로브의 상세한 사항은 아래 표 6에 나타내었다.
표 6
Figure PCTKR2009002710-appb-T000006
실험예 2: HPV 유형 특이 프라이머 및 프로브의 특이도 검증
2-1. 프라이머 및 프로브의 특이도
실시예 1에서 제작한 각각의 프라이머 쌍 및 프로브의 특이도 확인을 위해, 실험적인 방법으로 실시간 PCR을 실시하였다. 실시간 PCR 기종은 AB-7500-Real time PCR system을 사용하였다. 실시간 PCR 반응 조성 및 온도 조건은 표 7 및 8과 같다.
반응에 사용된 시료는 사용하기 전에 MY09/MY11 프라이머 세트(5'-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3'/5'-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3')를 이용하여 염기서열을 분석한 후 사용하였다.
PCR 증폭 유무는 KoRAS TM(코젠바이오텍) 프로그램을 이용하여 실시간 관찰하였다.
실시간 PCR의 반응 조성
표 7
Figure PCTKR2009002710-appb-T000007
실시간 PCR의 온도 조건
표 8
Figure PCTKR2009002710-appb-T000008
2-1-1. HPV 유형 16 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 16의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1을 참조하면, HPV 유형 16 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-2. HPV 유형 18 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 18의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2를 참조하면, HPV 유형 18 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-3. HPV 유형 26 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 26의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍 및 서열번호 9의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3을 참조하면, HPV 유형 26 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-4. HPV 유형 31 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 31의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머 쌍 및 서열번호 12의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4를 참조하면, HPV 유형 31 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-5. HPV 유형 33 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 33의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 쌍 및 서열번호 15의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5를 참조하면, HPV 유형 33 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-6. HPV 유형 35 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 35의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 16 및 서열번호 17의 프라이머 쌍 및 서열번호 18의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6을 참조하면, HPV 유형 35 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-7. HPV 유형 39 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 39의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 19 및 서열번호 20의 프라이머 쌍 및 서열번호 21의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7을 참조하면, HPV 유형 39 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-8. HPV 유형 45 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 45의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 22 및 서열번호 23의 프라이머 쌍 및 서열번호 24의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8을 참조하면, HPV 유형 45 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-9. HPV 유형 51 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 51의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 25 및 서열번호 26의 프라이머 쌍 및 서열번호 27의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9를 참조하면, HPV 유형 51 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-10. HPV 유형 52 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 52의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 28 및 서열번호 29의 프라이머 쌍 및 서열번호 30의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10을 참조하면, HPV 유형 52 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-11. HPV 유형 56 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 56의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 31 및 서열번호 32의 프라이머 쌍 및 서열번호 33의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11을 참조하면, HPV 유형 56 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-12. HPV 유형 58 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 58의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 34 및 서열번호 35의 프라이머 쌍 및 서열번호 36의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12를 참조하면, HPV 유형 58 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-13. HPV 유형 59 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 59의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 37 및 서열번호 38의 프라이머 쌍 및 서열번호 39의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13을 참조하면, HPV 유형 59 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-14. HPV 유형 66 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 66의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 40 및 서열번호 41의 프라이머 쌍 및 서열번호 42의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14를 참조하면, HPV 유형 66 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-15. HPV 유형 68 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 68의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 43 및 서열번호 44의 프라이머 쌍 및 서열번호 45의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15를 참조하면, HPV 유형 68 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-16. HPV 유형 6 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 6의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 46 및 서열번호 47의 프라이머 쌍 및 서열번호 48의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16을 참조하면, HPV 유형 6 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-17. HPV 유형 11 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 11의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 49 및 서열번호 50의 프라이머 쌍 및 서열번호 51의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17을 참조하면, HPV 유형 11 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-18. HPV 유형 42 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 42의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 52 및 서열번호 53의 프라이머 쌍 및 서열번호 54의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18을 참조하면, HPV 유형 42 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-19. HPV 유형 43 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 43의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 55 및 서열번호 56의 프라이머 쌍 및 서열번호 57의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 19에 나타내었다.
도 19를 참조하면, HPV 유형 43 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-20. HPV 유형 44 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 44의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 58 및 서열번호 59의 프라이머 쌍 및 서열번호 60의 프로브를 사용하여 상기와 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 20에 나타내었다.
도 20을 참조하면, HPV 유형 44 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-21. HPV 검출용 IPC의 특이도
인유두종 바이러스 검출 확인을 위해 제작된 IPC에 대해 전기 정제된 HPV-16, HPV-18, HPV-26, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66, HPV-68 HPV-6, HPV-11, HPV-42, HPV-43 및 HPV-44 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 61 및 서열번호 62의 프라이머 쌍 및 서열번호 63의 프로브를 사용하여 상기와 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 21에 나타내었다.
도 21을 참조하면, 실험에 사용된 모든 HPV 유형 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
실험예 3: 프라이머 쌍 및 프로브를 이용한 실시간 멀티플렉스 PCR 방법
3-1. HPV 검출을 위한 다중 검출용 세트
실험예 1에서 제작한 프라이머 쌍 및 프로브를 실시간 PCR 방법으로 단일 용기에서 동시에 수행하였다. 이때 한 튜브에 3종류의 HPV 유형을 확인할 수 있도록 프라이머 쌍 및 프로브 세트를 구성하고, 모든 세트에는 IPC가 포함되었다. 제작된 다중 검출용 세트의 상세한 사항은 아래 표 9에 나타내었다. 실시간 PCR 반응 조성 및 반응 조건은 표 7 및 8과 동일하게 사용하였다.
표 9
Figure PCTKR2009002710-appb-T000009
상기 표 9에 기재된 실시예 1 내지 7의 HPV 검출 세트로 전기 정제된 HPV DNA 시료로 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응을 실시하고, 그 결과를 도 22 내지 28에 나타낸다.
도 22는 실시예 1의 3종의 고위험성 HPV 유형 16, 56 및 58에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 58 및 58 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과이다.
도 23은 실시예 2의 3종의 고위험성 HPV 유형 18, 52 및 33에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 18, 52 및 33 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과이다.
도 24는 실시예 3의 3종의 고위험성 HPV 유형 39, 35 및 45에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 39, 35 및 45 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과이다.
도 25는 실시예 4의 3종의 고위험성 HPV 유형 51, 31 및 59에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 51, 31 및 59 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과이다.
도 26은 실시예 5의 3종의 고위험성 HPV 유형 39, 35 및 45에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 58 및 58 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과이다.
도 27은 실시예 6의 3종의 저위험성 HPV 유형 6, 11 및 42에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 6, 11 및 42 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과이다.
도 28은 실시예 5의 3종의 고위험성 HPV 유형 43 및 44에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 43 및 44 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과이다.
도 22 내지 38을 참조하면, 모든 HPV 시료에 대하여 각각에 해당하는 정확한 PCR 산물이 생성되었음을 알 수 있다.
상기 결과로, 본 발명의 HPV 유형 특이적인 프라이머 및 프로브를 이용하여 실시간 멀티플렉스 PCR을 실시하여 HPV 유형을 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.
3-2. 자동화 프로그램을 이용한 HPV 검출을 위한 다중 검출용 세트
실험예 1에서 제작한 프라이머 쌍 및 프로브를 실시간 PCR 방법으로 단일 용기에서 동시에 수행하였다. 이때 한 튜브에 12종, 15종, 5종의 HPV 유형을 확인할 수 있도록 프라이머 쌍 및 프로브 세트를 구성하고, 모든 세트에는 IPC가 포함되었다. 제작된 다중 검출용 세트의 상세한 사항은 아래 표 10에 나타내었다. 실시간 PCR 반응 조성 및 반응 조건은 표 7 및 8과 동일하게 사용하였다.
이때 실시간 PCR 을 통해 실험된 결과를 분석하기 위한 자동화 프로그램인 KoRAS(Kogene Real-time Analysis System) HPV version을 이용하였다. 도 29는 상기 KoRAS HPV version에 실시간 PCR 결과 파일을 입력하는 화면의 일예를 보여주는 모식도이다. 상기 프로그램을 통해 실시간 PCR 결과를 CSV 확장자 파일로 추출하고, 이렇게 추출된 파일에는 실험에 사용된 모든 시료의 Ct 밸류가 기록된다. 또한 결과를 Ct 타입 또는 O/X 타입으로 표시하는 것이 가능하다.
표 10
Figure PCTKR2009002710-appb-T000010
도 30은 실시예 8의 12종의 고위험성 HPV 유형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 및 59에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 및 59 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 Ct 타입 결과를 나타낸 화면이다.
도 31은 실시예 8의 12종의 고위험성 HPV 유형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 및 59에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 및 59 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 O/X 타입 결과를 나타낸 화면이다.
도 32는 실시예 9의 15종의 고위험성 HPV 유형 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 Ct 타입 결과를 나타낸 화면이다.
도 33은 실시예 9의 15종의 고위험성 HPV 유형 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 O/X 타입 결과를 나타낸 화면이다.
도 34는 실시예 10의 5종의 저위험성 HPV 유형 6, 11, 42, 43, 및 44에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 11, 42, 43, 및 44 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 Ct 타입 결과를 나타낸 화면이다.
도 35는 실시예 10의 5종의 저위험성 HPV 유형 6, 11, 42, 43, 및 44/에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 11, 42, 43, 및 44 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 O/X 타입 결과를 나타낸 화면이다.
상기 결과로, 본 발명의 HPV 유형 특이적인 프라이머 및 프로브를 이용하여 실시간 멀티플렉스 PCR을 실시하여 HPV 유형을 간단하고 신속하게 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.

Claims (11)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 16에 특이적인 프라이머 쌍;
    서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 18에 특이적인 프라이머 쌍;
    서열번호 7의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 26에 특이적인 프라이머 쌍;
    서열번호 10의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 31에 특이적인 프라이머 쌍;
    서열번호 13의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 33에 특이적인 프라이머 쌍;
    서열번호 16의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 17의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 35에 특이적인 프라이머 쌍;
    서열번호 19의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 39에 특이적인 프라이머 쌍;
    서열번호 22의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 23의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 45에 특이적인 프라이머 쌍;
    서열번호 25의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 26의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 51에 특이적인 프라이머 쌍;
    서열번호 28의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 52에 특이적인 프라이머 쌍;
    서열번호 31의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 32의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 56에 특이적인 프라이머 쌍;
    서열번호 34의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 35의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 58에 특이적인 프라이머 쌍; 및
    서열번호 37의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 38의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 59에 특이적인 프라이머 쌍;
    서열번호 40의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 41의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 66에 특이적인 프라이머 쌍;
    서열번호 43의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 44의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 68에 특이적인 프라이머 쌍;
    서열번호 46의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 47의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 6에 특이적인 프라이머 쌍;
    서열번호 49의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 50의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 11에 특이적인 프라이머 쌍;
    서열번호 52의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 53의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 42에 특이적인 프라이머 쌍;
    서열번호 55의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 56의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 43에 특이적인 프라이머 쌍; 및
    서열번호 58의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 59의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 44에 특이적인 프라이머 쌍;
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 3종 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 HPV 검출용 프라이머.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 HPV 검출용 프라이머는 내부 양성 대조로 서열번호 61의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 62의 염기서열로 이루어진 인간 β-액틴 특이적인 프라이머 쌍을 더욱 포함하는 HPV 검출용 프라이머.
  3. 제1항에 따른 HPV 검출용 프라이머; 및
    서열번호 3의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 16 탐지용 프로브;
    서열번호 6의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 18 탐지용 프로브;
    서열번호 9의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 26 탐지용 프로브;
    서열번호 12의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 31 탐지용 프로브;
    서열번호 15의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 33 탐지용 프로브;
    서열번호 18의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 35 탐지용 프로브;
    서열번호 21의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 39 탐지용 프로브;
    서열번호 24의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 45 탐지용 프로브;
    서열번호 27의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 51 탐지용 프로브;
    서열번호 30의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 52 탐지용 프로브;
    서열번호 33의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 56 탐지용 프로브;
    서열번호 36의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 58 탐지용 프로브;
    서열번호 39의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 59 탐지용 프로브;
    서열번호 42의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 66 탐지용 프로브;
    서열번호 45의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 68 탐지용 프로브;
    서열번호 48의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 6 탐지용 프로브;
    서열번호 51의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 11 탐지용 프로브;
    서열번호 54의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 42 탐지용 프로브;
    서열번호 57의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 42 탐지용 프로브; 및
    서열번호 60의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 44 탐지용 프로브로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 HPV 탐지용 프로브
    를 포함하는, HPV를 실시간 PCR로 검출하기 위한 HPV용 검출 세트.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 검출 세트에 포함되는 프라이머 및 프로브는 동일한 HPV 유형을 표적으로 하며, 1종 이상의 HPV 유형을 검출하기 위한 것임을 특징으로 하는 검출 세트.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 PCR은 2종 이상의 프라이머 쌍 및 상기 프라이머 쌍과 동일한 HPV 유형 탐지용 프로브 2종 이상을 이용하여 멀티플렉스(mutiplex) PCR로 실시되는 것을 특징으로 하는 검출 세트.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 HPV 탐지용 프로브는 내부 양성 대조로 서열번호 62의 염기서열로 이루어진 인간 β-액틴 탐지용 프로브를 더욱 포함하는 검출 세트.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 프로브의 5' 말단이 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광 표지 인자로 표지되며, 3' 말단이 6-TAMRA, BHQ-1,2,3 및 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 형광 억제 물질(Quencher)로 표지된, 검출 세트.
  8. 시료로부터 추출한 DNA를 대상으로 제6항의 HPV용 검출 세트 1종 이용하여 실시간 PCR을 실시하는 단계; 및
    상기 실시간 PCR 결과를 확인하여 HPV 감염 여부 및 HPV 유형을 판단하는 단계를 포함하며,
    사용되는 프로브의 5' 말단이 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광 표지 인자로 표지되며, 3' 말단이 6-TAMRA, BHQ-1,2,3 및 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 형광 억제 물질(Quencher)로 표지된 것을 특징으로 하는, HPV의 검출 방법.
  9. 시료로부터 추출한 DNA를 대상으로 제3항의 HPV용 검출 세트 2종 이상을 이용하여 실시간 멀티플렉스 PCR을 실시하는 단계; 및
    상기 실시간 멀티플렉스 PCR 결과를 확인하여 HPV 감염 여부 및 HPV 유형을 판단하는 단계를 포함하며,
    상기 프로브의 5' 말단이 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광 표지 인자로 표지되며, 3' 말단이 6-TAMRA, BHQ-1,2,3 및 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 형광 억제 물질(Quencher)로 표지된 것을 특징으로 하는, HPV의 검출 방법.
  10. 제1항에 따른 HPV 검출용 프라이머; 및
    서열번호 3의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 16 탐지용 프로브;
    서열번호 6의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 18 탐지용 프로브;
    서열번호 9의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 26 탐지용 프로브;
    서열번호 12의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 31 탐지용 프로브;
    서열번호 15의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 33 탐지용 프로브;
    서열번호 18의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 35 탐지용 프로브;
    서열번호 21의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 39 탐지용 프로브;
    서열번호 24의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 45 탐지용 프로브;
    서열번호 27의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 51 탐지용 프로브;
    서열번호 30의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 52 탐지용 프로브;
    서열번호 33의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 56 탐지용 프로브;
    서열번호 36의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 58 탐지용 프로브;
    서열번호 39의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 59 탐지용 프로브;
    서열번호 42의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 66 탐지용 프로브;
    서열번호 45의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 68 탐지용 프로브;
    서열번호 48의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 6 탐지용 프로브;
    서열번호 51의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 11 탐지용 프로브;
    서열번호 54의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 42 탐지용 프로브;
    서열번호 57의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 42 탐지용 프로브; 및
    서열번호 60의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 44 탐지용 프로브로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 HPV 탐지용 프로브를 포함하고,
    상기 프로브의 5' 말단이 서로 다른 색상의 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광 표지 인자로 표지되며, 3' 말단이 6-TAMRA, BHQ-1,2,3 및 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 형광 억제 물질(Quencher)로 표지된 제3항에 따른 HPV 탐지용 프로브를 포함하는, HPV 검출용 키트.
  11. 제10항에 있어서, 상기 프라이머 쌍 및 프로브는 하나의 반응 용기, 스트립(strip) 또는 마이크로플레이트에 패키징 되는 것을 특징으로 하는 HPV 검출용 키트.
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