WO2021182881A1 - 유방암 진단용 다중 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

유방암 진단용 다중 바이오마커 및 이의 용도 Download PDF

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WO2021182881A1
WO2021182881A1 PCT/KR2021/003004 KR2021003004W WO2021182881A1 WO 2021182881 A1 WO2021182881 A1 WO 2021182881A1 KR 2021003004 W KR2021003004 W KR 2021003004W WO 2021182881 A1 WO2021182881 A1 WO 2021182881A1
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mir
breast cancer
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exosome
combination
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PCT/KR2021/003004
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김철우
김교현
김연수
강경남
장지영
박유진
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(주) 바이오인프라생명과학
(주)다이오진
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • the present invention relates to multiple exosome microRNA biomarkers for breast cancer diagnosis and non-invasive in vitro diagnosis of breast cancer using the same.
  • breast cancer accounts for 25.2% of all female cancers worldwide, and shows the highest incidence among female cancers, and is rapidly increasing.
  • mammography is the only test method that has been clinically proven to be effective.
  • mammography has problems such as excessive additional examination, unnecessary biopsy, psychological burden, and radiation exposure due to false-negative and false positive diagnosis.
  • the sensitivity of mammography is 62.2-89.5%, and the specificity is reported to be 62.7%.
  • Korean women there are more women with dense breasts than Western women, and in the case of dense breasts, the sensitivity of mammography is significantly lower. The need for ancillary tests is emphasized.
  • breast ultrasonography is mainly used as an auxiliary examination for mammography.
  • breast ultrasonography used as an adjunct test had the following problems: (1) high dependence on test equipment and examiners, (2) scientific and objective evidence that it detects small-sized breast cancer and reduces the death rate from breast cancer has not yet been established, (3) it is impossible to avoid false positives during the diagnosis process, which may create anxiety in the patient, and the need for additional time and money for additional examination and biopsy, (4) early breast cancer due to calcified lesions difficult to diagnose.
  • an invasive method such as a biopsy has disadvantages in that the examiner suffers greatly, has side effects due to infection, and requires hospitalization and a recovery period after the examination.
  • the non-invasive method using blood is very simple and painless, and has the advantage of not requiring hospitalization and recovery period after examination.
  • such a liquid biopsy has the advantage of avoiding the side effects of biopsy, enabling early diagnosis even for potential patients who have not developed cancer, and being advantageous for periodically monitoring the treatment progress of patients who have already developed cancer.
  • the high-risk cancer screening and early diagnosis method using liquid biopsy can supplement the problems of the existing biopsy and is expected to greatly contribute to the reduction of medical costs.
  • the present inventors measure the expression level of a combination of two or more microRNAs selected from nine types of exosomal miRNAs according to the present invention, thereby diagnosing breast cancer early in a non-invasive way or screening a high-risk group of breast cancer. By confirming, the present invention was completed.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing breast cancer.
  • Another object of the present invention is to provide an information providing method for diagnosing breast cancer.
  • the present invention provides a group consisting of miR-223, miR-1246, miR-206, miR-24, miR-373, miR-21, miR-6875, miR-202 and miR-219B It provides a composition for diagnosing breast cancer comprising an agent for measuring the expression level of a combination of two or more exosomal microRNAs (exosomal miRNA) selected from.
  • the present invention provides two or more exosome microRNAs selected from the group consisting of miR-223, miR-1246, miR-206, miR-24, miR-373, miR-21, miR-6875, miR-202 and miR-219B.
  • a breast cancer diagnostic use of a composition comprising an agent for measuring the expression level of a (exosomal miRNA) combination.
  • the present invention provides two or more exosome microRNAs selected from the group consisting of miR-223, miR-1246, miR-206, miR-24, miR-373, miR-21, miR-6875, miR-202 and miR-219B.
  • an agent measuring the expression level of a combination (exosomal miRNA) for the manufacture of a diagnostic agent for breast cancer.
  • the composition may include an agent for measuring the expression level of the exosome microRNA described in (i) and (ii) below, but is not limited thereto:
  • the two or more exosome microRNA combination may be a combination of 2 to 4 exosome microRNA, but is not limited thereto.
  • the composition may include an agent for measuring the expression level of the exosome microRNA combination (combination of two microRNAs) selected from Table 9, but is not limited thereto.
  • the combination of the two microRNAs may be the following combination, but is not limited thereto:
  • the composition may include an agent for measuring the expression level of the exosome microRNA combination (a combination of three microRNAs) selected from Table 10, but is not limited thereto.
  • an agent for measuring the expression level of the exosome microRNA combination a combination of three microRNAs selected from Table 10, but is not limited thereto.
  • the combination of the three microRNAs may be the following combination, but is not limited thereto:
  • miR-223, miR-1246, and miR-206 are miR-223, miR-1246, and miR-206;
  • miR-223, miR-206, and miR-202 miR-223, miR-206, and miR-202;
  • miR-223, miR-24, and miR-21 are miR-223, miR-24, and miR-21;
  • miR-223, miR-24, and miR-6875 miR-223, miR-24, and miR-6875;
  • miR-223, miR-24, and miR-202 miR-223, miR-24, and miR-202;
  • the composition may include an agent for measuring the expression level of the exosome microRNA combination (a combination of four microRNAs) selected from Table 11, but is not limited thereto.
  • an agent for measuring the expression level of the exosome microRNA combination a combination of four microRNAs selected from Table 11, but is not limited thereto.
  • the combination of the four microRNAs may be the following combination, but is not limited thereto:
  • miR-223, miR-1246, miR-206, and miR-202 are miR-223, miR-1246, miR-206, and miR-202;
  • miR-223, miR-1246, miR-373, and miR-219B are 15 and miR-223, miR-1246, miR-373, and miR-219B;
  • miR-206 miR-21, miR-6875, and miR-202;
  • miR-206 miR-21, miR-6875, and miR-219B;
  • the agent for measuring the expression level may be a primer or probe that specifically binds to the exosome microRNA, but is not limited thereto.
  • the exosome microRNA may be isolated from blood, urine, feces or milk, but is not limited thereto.
  • the exosome microRNA may be isolated from blood, but is not limited thereto.
  • the composition may be for early diagnosis of breast cancer, but is not limited thereto.
  • the composition may be for screening for a risk group for breast cancer (eg, a high-risk group), but is not limited thereto.
  • the present invention provides a kit for diagnosing breast cancer comprising the composition for diagnosing breast cancer.
  • the kit may be a gene amplification kit, but is not limited thereto.
  • the kit may be a microarray chip, but is not limited thereto.
  • the present invention provides (a) miR-223, miR-1246, miR-206, miR-24, miR-373, miR-21, miR-6875, miR-202 and miR in a biological sample isolated from a subject. measuring the expression level of a combination of two or more exosome microRNAs selected from the group consisting of -219B; And (b) when the expression level of the measured exosome microRNA combination is increased compared to the control group, it provides an information providing method for diagnosing breast cancer, comprising the step of determining whether or not there is a risk of breast cancer.
  • the present invention provides (a) miR-223, miR-1246, miR-206, miR-24, miR-373, miR-21, miR-6875, miR-202 and miR- in a biological sample isolated from a subject. measuring the expression level of a combination of two or more exosome microRNAs selected from the group consisting of 219B; And (b) when the expression level of the measured exosome microRNA combination is increased compared to the control group, it provides a method for diagnosing breast cancer comprising the step of determining that there is a risk of breast cancer or breast cancer.
  • the present invention provides (a) miR-223, miR-1246, miR-206, miR-24, miR-373, miR-21, miR-6875, miR-202 and miR- in a biological sample isolated from a subject. measuring the expression level of a combination of two or more exosome microRNAs selected from the group consisting of 219B; And (b) when the expression level of the measured exosome microRNA combination is increased compared to the control group, or determining that there is a risk of breast cancer, or providing information for predicting the onset of breast cancer comprising the step of determining that there is a risk do.
  • the step (a) may be to measure the expression level of the exosome microRNA described in (i) and (ii) below, but is not limited thereto:
  • the exosome microRNA combination of step (a) may be a combination of 2 to 4 exosome microRNAs, but is not limited thereto.
  • step (a) can measure the expression level of the exosome microRNA combination (combination of two microRNAs) selected from Table 9, but is not limited thereto.
  • the step (a) may measure the expression level of the exosome microRNA combination (a combination of three microRNAs) selected from Table 10, but is not limited thereto.
  • step (a) may include an agent for measuring the expression level of the exosome microRNA combination (a combination of four microRNAs) selected from Table 11, but is not limited thereto.
  • a non-invasive method using a liquid biopsy such as blood Breast cancer can be diagnosed at an early stage with high accuracy without pain.
  • the present invention is expected to complement the problems of conventional mammography because it is possible to quickly and accurately screen for a high-risk group of breast cancer in a non-invasive way.
  • 1 is a bar graph showing the U-test analysis results of 9 types of miRNAs according to the present invention, and showing that the 9 types of miRNAs are meaningful in distinguishing normal people from breast cancer patients.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of correlation analysis between nine types of miRNA biomarkers according to the present invention.
  • 3 is a diagram showing sample information used to generate a classification model.
  • FIG. 4 is a diagram showing the respective performance of a single miRNA biomarker for screening breast cancer patients.
  • the present invention relates to a combination of two or more exosome microRNAs selected from the group consisting of miR-223, miR-1246, miR-206, miR-24, miR-373, miR-21, miR-6875, miR-202 and miR-219B. It provides a composition for diagnosing breast cancer comprising an agent for measuring the expression level.
  • diagnosis refers to determining a subject's susceptibility to a particular disease or disorder, determining whether a subject currently has a particular disease or disorder, or a particular disease or disorder. determining the prognosis (e.g., identification of a pre-metastatic or metastatic cancer state, staging the cancer, or determining the responsiveness of the cancer to treatment) of a subject with monitoring the condition of the subject to provide information on efficacy).
  • the composition of the present invention can be used for early diagnosis of breast cancer.
  • the present invention can be used to screen for a risk group for developing breast cancer (eg, a high risk group).
  • exosome refers to a small endoplasmic reticulum having a double lipid bilayer secreted from cells, and exosomes are secreted from various cells and are approximately 30 It is known to have a diameter of from 200 nm to 200 nm. Various types of proteins, DNA, mRNA, miRNA, etc. derived from cells are included in these exosomes.
  • composition of the present invention may include an agent for measuring the expression level of two or more exosomal microRNAs selected from the group consisting of nine types of exosomal microRNAs according to the present invention.
  • the combination of the exosome microRNA is (i) any one exosome microRNA selected from the group consisting of miR-223, miR-373 and miR-202; And (ii) miR-1246, miR-206, miR-24, miR-21, miR-6875 and miR-219B may include any one or more exosome microRNA selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the two or more exosome microRNA combination may be a combination of 2 to 4 exosome microRNAs, but is not limited thereto.
  • the exosome microRNA may be a precursor-miRNA (pre-miRNA), but is not limited thereto.
  • pre-miRNA precursor-miRNA
  • sequence of the exosome microRNA according to the present invention is described in the sequence listing.
  • the exosome microRNA may be isolated from a biological sample.
  • biological sample refers to a sample that can be obtained non-invasively, and includes all samples containing exosomes, for example, blood, cells, saliva, sputum, hair, urine, feces. , milk, and the like.
  • the exosome microRNA may be isolated from blood, urine, feces or milk, but is not limited thereto.
  • the exosomal microRNA may be isolated from blood.
  • the agent for measuring the expression level of the exosome microRNA may be a primer or probe that specifically binds to the biomarker (exosome microRNA) according to the present invention, but is not limited thereto.
  • the primer or probe has a sequence complementary to the nucleotide sequence of the biomarker (exosome microRNA) of the present invention.
  • the term “complementary” means having a degree of complementarity capable of selectively hybridizing to the above-described nucleotide sequence under certain specific hybridization or annealing conditions. Accordingly, the term “complementary” has a different meaning from the term “perfectly complementary”, and as long as the primer or probe of the present invention is capable of selectively hybridizing to the above-described nucleotide sequence, one or more It may have a mismatched nucleotide sequence.
  • primer is intended to serve as the starting point of the synthesis of a template sequence under suitable conditions (i.e., four different nucleoside triphosphates and a polymerase) in a suitable buffer at a suitable temperature.
  • suitable conditions i.e., four different nucleoside triphosphates and a polymerase
  • single-stranded oligonucleotides capable of A suitable length of a primer will vary depending on various factors such as temperature and the application of the primer, but is typically 15-30 nucleotides. Short primer molecules generally require lower temperatures to form sufficiently stable hybrid complexes with the template.
  • the design of the primer can be easily performed by those skilled in the art with reference to the above-described nucleotide sequence, for example, using a primer design program (eg, PRIMER 3 program).
  • a primer design program eg, PRIMER 3 program.
  • the primer of the present invention may include or consist of one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 18, but is not limited thereto.
  • the primer of the present invention may be one or more oligonucleotides represented by SEQ ID NOs: 1 to 18, but is not limited thereto.
  • probe refers to a linear oligomer of natural or modified monomers or linkages, including deoxyribonucleotides and ribonucleotides, capable of specifically hybridizing to a target nucleotide sequence, and naturally occurring It may be present as or artificially synthesized.
  • the present invention provides a kit for diagnosing breast cancer comprising the composition for diagnosing breast cancer of the present invention as described above.
  • kit for diagnosing breast cancer of the present invention includes the above-described composition for diagnosing breast cancer, descriptions of common parts between the two inventions will be omitted.
  • the kit of the present invention may include not only an agent for measuring the expression level of exosome microRNA according to the present invention, but also tools or reagents commonly used in the art to be suitable for use as a diagnostic kit for breast cancer.
  • the tool or reagent may include a suitable carrier, a label capable of generating a detectable signal, chromophores, solubilizers, detergents, buffers, stabilizers, and the like.
  • the kit of the present invention may further include an agent capable of measuring the expression level of a housekeeping gene that can be used as an internal control.
  • the kit of the present invention may be a gene amplification kit, but is not limited thereto.
  • amplification refers to a reaction that amplifies a nucleic acid molecule.
  • Various amplification reactions have been reported in the art, for example, polymerase chain reaction (PCR) is disclosed in US Patent Nos. 4683195, 4683202, 4800159.
  • the kit of the present invention may be a microarray chip, but is not limited thereto.
  • the probe is used as a hybridizable array element and is immobilized on a substrate.
  • Preferred gases are suitable rigid or semi-rigid supports, which may include, for example, membranes, filters, chips, slides, wafers, fibers, magnetic or non-magnetic beads, gels, tubing, plates, polymers, microparticles and capillaries. have.
  • the hybridization array elements described above are arranged and immobilized on the substrate. Such immobilization may be carried out by a chemical bonding method or a covalent bonding method such as UV.
  • a sample applied to the microarray of the present invention may be labeled and hybridized with an array element on the microarray.
  • Hybridization conditions may vary. Detection and analysis of the degree of hybridization may be variously performed depending on the labeling material.
  • the kit according to the present disclosure may further include a positive control group, a negative control group and/or instructions for use.
  • a negative control may include a sample that does not contain miRNA, and a positive control may include one or more of exosome microRNAs to be detected.
  • the present invention provides (a) miR-223, miR-1246, miR-206, miR-24, miR-373, miR-21, miR-6875, measuring the expression level of a combination of two or more exosome microRNAs selected from the group consisting of miR-202 and miR-219B; And (b) when the expression level of the measured exosome microRNA combination is increased compared to the control group, it provides an information providing method for diagnosing breast cancer, comprising the step of determining whether or not there is a risk of breast cancer.
  • the term "method for providing information” is a method of providing information on the diagnosis of breast cancer, and the level of exosome microRNA according to the present invention is increased by using microRNA in the exosome. It refers to a method of acquiring information about the onset or possibility (risk) of breast cancer when it is diagnosed.
  • the expression level of the exosome microRNA can be measured according to a method commonly used in the field of bio kits, for example, reverse transcriptase polymerase reaction (RT-PCR), competitive reverse transcriptase polymerase reaction (Competitive RT-PCR), real-time reverse transcription It may be measured using an enzyme polymerase reaction (Real-time RT-PCR), an RNase protection assay (RPA), Northern blotting, or a gene chip.
  • RT-PCR reverse transcriptase polymerase reaction
  • Competitive RT-PCR competitive reverse transcriptase polymerase reaction
  • Real-time RT-PCR enzyme polymerase reaction
  • RPA RNase protection assay
  • Northern blotting or a gene chip.
  • the step (a) comprises (i) any one exosome microRNA selected from the group consisting of miR-223, miR-373 and miR-202; and (ii) miR-1246, miR-206, miR-24, miR-21, miR-6875 and miR-219B may be carried out by measuring the expression level of any one or more exosome microRNAs selected from the group consisting of, It is not limited.
  • the exosome microRNA combination of step (a) may be a combination of 2 to 4 exosome microRNAs, but is not limited thereto.
  • the exosome microRNA combinations are described in Tables 9 to 11, and the description thereof is as described above.
  • a dumbbell-structured oligonucleotide primer was designed using a computer program for each of the obtained marker gene nucleotide sequences, and each of these PCR conditions was applied to a positive standard. was built with A screening test for these markers was performed on clinical samples using the thus constructed dumbbell-structured oligonucleotide primer.
  • N in the primer sequence of Table 1 is any one of A, T, C, and G
  • Nucleic acids were extracted using the prepared plasma from breast cancer patients and normal control plasma according to the manufacturer's manual. The materials of this study were approved by the Institutional Bioethics Committee (IRB) and were obtained from the resources collected from the Human Resources Unit Bank designated by the Ministry of Health and Welfare. We received pre-sale from Bioinfra Clinic, and breast cancer patient specimens were sold at Pusan National University Hospital, Inje University Pusan Paik Hospital, and Chonnam National University Hwasun Hospital Human Resources Bank.
  • IRB Institutional Bioethics Committee
  • the nucleic acid extraction equipment was Smart Lab Assist-32, and the equipment was warmed up 10 minutes before using the equipment. After peeling off the vinyl of the enclosed auto plate, the aluminum foil attached to the top surface of the auto plate was removed, and 300 ⁇ l of the sample was dispensed into each well of the column using a micropipette. Proteinase K stored at 4°C was taken out and 20 ⁇ l of each well was dispensed using a micropipette.
  • An 8-channel strip was mounted on the strip rack frame of the nucleic acid extraction device, and the auto plate in which the sample and Proteinase K were dispensed was inserted into the 96-well plate rack of the nucleic acid extraction device. After installing it by pushing it all the way to the back, the door was closed and the program was run according to the sample. After the program of the nucleic acid extraction device was finished, the auto plate was taken out, and the nucleic acids extracted from each well were transferred to a clean microtube.
  • the concentration of the extracted total RNA was measured, and the concentration values of all samples were corrected by analyzing the measured concentrations.
  • gDNA removal and RT procedures were performed on the total RNA extracted using PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser (product code RR047A, Takara). Specifically, first, the reagents were mixed in the ratio shown in Table 2, and the mixed reagents were reacted at 42°C for 2 minutes and then stored at 4°C.
  • the reagents were mixed in the same ratio as in Table 3, and the reagents were reacted sequentially at 37°C for 15 minutes and then at 85°C for 5 seconds, and then stored at 4°C.
  • gDNA was removed from the extracted total RNA, and then quantified with an internal control primer using the synthesized cDNA of the sample. Reaction conditions were as follows. 4 ⁇ l of the synthesized cDNA, 5 ⁇ l of Cyber Green (SYBR) master mix, and 1 ⁇ l of internal control primer were mixed to complete a final 10 ⁇ l mixture, and then the reaction was performed according to the conditions of real-time PCR (CFS 96) in Table 4.
  • SYBR Cyber Green
  • the primer concentration for each miRNA for the second real-time PCR was in the range of 4 pmol-10 pmol, and the first PCR product was diluted 1/10 and used for the second real-time PCR analysis.
  • 1 ⁇ l of primer for each gene, 4 ⁇ l of the primary PCR product, and 5 ⁇ l of 2X cybergreen master mix were mixed to make a final 10 ⁇ l mixture, and then PCR was performed according to the conditions in Table 6.
  • RNA concentration was measured so that the same concentration of RNA extracted from plasma of normal people and breast cancer patients could be used for miRNA expression analysis, and quantified once again as an internal control (house-keeping gene).
  • the samples used for the analysis were 146 normal human plasma (31 people from Ajou University Hospital Human Resources Bank, 25 from Wonkwang University Hospital Human Resources Bank, 90 from Bioinfra Clinic) and 226 plasma from breast cancer patients (147 Human Resources Bank from Pusan National University Hospital). , Inje University Pusan Paik Hospital 39 human resource banks, Chonnam National University Hwasun Hospital 40 human resource banks). In this case, plasma from a female sample was used for all normal plasma.
  • the expression level of each miRNA is the threshold cycle (Ct), which is the intersection point between the miRNA amplification curve and the threshold line, which means a relative measurement of the target miRNA concentration in a real-time PCR reaction.
  • Ct threshold cycle
  • the total sample was divided into 1 a sample for model generation (learning model) and 2 a sample for model validation, and the data for model creation and verification was distributed at a ratio of approximately 2:1 (generation: validation).
  • generation: validation the experimental period and sample distribution institution, and samples for model generation and verification samples were randomly selected for each sample distribution institution. At this time, age information was not reflected (FIG. 3).
  • the classification method was as follows:
  • the 10-fold cross validation method was used to generate the learning model (90 normal subjects, 146 breast cancer patients).
  • FIG. 4 Each performance of a single miRNA biomarker for breast cancer patient selection through classification model generation is shown in FIG. 4 .
  • miR-223 is included in the correlation matrix between biomarkers, exclude miR-373 and miR-202 (reflects the correlation analysis result between miRNAs).
  • Tables 9 to 11 The results of analysis with the RF model including the miRNA combination of Table 8 are shown in Tables 9 to 11. As shown in Tables 9-11, a combination of two or more miRNAs out of nine miRNAs has a higher performance than each of the nine miRNAs. ) and is a combination in which highly correlated miR-223, 202 and 373 do not overlap.
  • a non-invasive method using a liquid biopsy such as blood Breast cancer can be diagnosed at an early stage with high accuracy without pain.
  • a non-invasive method using a liquid biopsy such as blood Breast cancer

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Abstract

본 발명은 유방암 진단을 위한 다중 엑소좀 microRNA 바이오마커 및 이를 이용한 유방암의 비침습적 체외 진단에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바이오마커인 9종의 엑소좀 microRNA에서 선택된 둘 이상의 microRNA 조합을 이용하면, 혈액과 같은 액체 생검을 이용하여 비침습적 방법으로 비교적 간단히 검사자의 고통 없이 유방암을 높은 정확성으로 조기에 진단할 수 있다.

Description

유방암 진단용 다중 바이오마커 및 이의 용도
본 발명은 유방암 진단을 위한 다중 엑소좀 microRNA 바이오마커 및 이를 이용한 유방암의 비침습적 체외 진단에 관한 것이다.
본 출원은 2020년 03월 12일에 출원된 한국특허출원 제10-2020-0030840호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
유방암은 전세계 전체 여성 암의 25.2%를 차지하며, 여성 암 중 최다 발생률을 보이며, 급격하게 증가하는 추세이다. 유방암의 조기 진단에 사용되는 영상 의학적 진단 방법 가운데 임상적으로 효과가 증명된 검사법은 유방 촬영술(mammography)이 유일하다.
그러나, 유방 촬영술은 위음성 진단과 위양성 진단에 따른 과잉 추가 검진, 불필요한 조직검사, 심리적 부담 및 방사선 피폭 등의 문제점이 있었다. 유방 촬영술의 민감도는 62.2-89.5%이며, 특이도는 62.7%로 보고되고 있으나, 우리나라 여성의 경우 서양 여성에 비해 치밀형 유방을 가진 여성이 많고, 치밀형 유방의 경우 유방 촬영술의 민감도가 현저히 낮아서 보조 검사의 필요성이 강조되고 있다.
유방 촬영술의 보조검사로는 유방 초음파검사(breast ultrasonography)가 주로 사용되고 있다. 그러나, 보조검사로 사용되는 유방 초음파검사는 다음의 문제점이 있었다: (1) 검사 기기와 검사자에 대한 의존도 높음, (2) 작은 크기의 유방암을 발견하고 유방암으로 인한 사망률을 줄인다는 과학적이고 객관적 근거가 아직 확립되어 있지 않음, (3) 진단 과정에서 위양성을 피할 수 없어 환자에게 불안감을 조성할 수 있고, 추가 검사와 조직검사를 위한 추가적인 시간과 비용의 필요, (4) 석회화 병변으로 인한 유방암 조기 진단이 힘듦.
따라서, 유방 촬영술의 한계와 유방 촬영술 보조검사인 유방 초음파검사가 갖는 문제점을 해결하기 위한 유방암 진단법 개발이 필요하다.
한편, 조직검사와 같은 침습적인 방법(invasive method)은 검사자의 고통이 심하고, 감염으로 인한 부작용이 있으며, 입원과 검사 후 회복기간을 필요로 한다는 단점이 있다. 반면, 혈액을 이용한 비침습적인 방법(채혈)은 매우 간단하고 고통이 거의 없으며, 입원과 검사 후 회복기간이 필요 없다는 이점을 가지고 있다. 또한, 이와 같은 액체 생검은 조직검사의 부작용을 피하는 동시에 암이 발병하지 않은 잠재적 환자를 대상으로도 조기진단이 가능하며, 이미 발병한 환자의 치료 경과를 주기적으로 관찰하는데 유리하다는 장점이 있다.
따라서, 액체 생검을 이용한 암 고위험군 선별 및 조기 진단법 개발은 기존의 조직검사의 문제점을 보완할 수 있으며, 의료비 절감에 크게 기여할 것이라 기대되고 있다.
이에 본 발명자들은 본 발명에 따른 9종의 엑소좀 microRNA(exosomal miRNA)에서 선택된 둘 이상의 microRNA 조합의 발현 수준을 측정함으로써, 비침습적 방법으로 유방암을 조기에 진단하거나, 유방암 고위험군을 선별 검사할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 유방암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 유방암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 유방암 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 miR-223, miR-1246, miR-206, miR-24, miR-373, miR-21, miR-6875, miR-202 및 miR-219B로 이루어진 군으로부터 선택된 둘 이상의 엑소좀 microRNA(exosomal miRNA) 조합의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 miR-223, miR-1246, miR-206, miR-24, miR-373, miR-21, miR-6875, miR-202 및 miR-219B로 이루어진 군으로부터 선택된 둘 이상의 엑소좀 microRNA(exosomal miRNA) 조합의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물의 유방암 진단 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 miR-223, miR-1246, miR-206, miR-24, miR-373, miR-21, miR-6875, miR-202 및 miR-219B로 이루어진 군으로부터 선택된 둘 이상의 엑소좀 microRNA(exosomal miRNA) 조합의 발현 수준을 측정하는 제제의 유방암 진단제의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 하기 (i) 및 (ii)에 기재된 엑소좀 microRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
(i) miR-223, miR-373 및 miR-202로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 엑소좀 microRNA; 및
(ii) miR-1246, miR-206, miR-24, miR-21, miR-6875 및 miR-219B로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 엑소좀 microRNA.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 둘 이상의 엑소좀 microRNA 조합은 2 내지 4개의 엑소좀 microRNA의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 표 9로부터 선택된 엑소좀 microRNA 조합(2개 microRNA의 조합)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 2개의 microRNA의 조합은 하기 조합인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
(1) miR-223 및 miR-1246;
(2) miR-223 및 miR-206;
(3) miR-223 및 miR-24;
(4) miR-223 및 miR-373;
(5) miR-223 및 miR-21;
(6) miR-223 및 miR-6875;
(7) miR-223 및 miR-202;
(8) miR-223 및 miR-219B;
(9) miR-1246 및 miR-206;
(10) miR-1246 및 miR-24;
(11) miR-1246 및 miR-373;
(12) miR-1246 및 miR-21;
(13) miR-1246 및 miR-6875;
(14) miR-1246 및 miR-202;
(15) miR-1246 및 miR-219B;
(16) miR-206 및 miR-24;
(17) miR-206 및 miR-373;
(18) miR-206 및 miR-21;
(19) miR-206 및 miR-6875;
(20) miR-206 및 miR-202;
(21) miR-206 및 miR-219B;
(22) miR-24 및 miR-373;
(23) miR-24 및 miR-21;
(24) miR-24 및 miR-6875;
(25) miR-24 및 miR-202;
(26) miR-24 및 miR-219B;
(27) miR-373 및 miR-21;
(28) miR-373 및 miR-6875;
(29) miR-373 및 miR-202;
(30) miR-373 및 miR-219B;
(31) miR-21 및 miR-6875;
(32) miR-21 및 miR-202;
(33) miR-21 및 miR-219B;
(34) miR-6875 및 miR-202;
(35) miR-6875 및 miR-219B; 및
(36) miR-202 및 miR-219B.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 표 10으로부터 선택된 엑소좀 microRNA 조합(3개 microRNA의 조합)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 3개의 microRNA의 조합은 하기 조합인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
(1) miR-223, miR-1246, 및 miR-206;
(2) miR-223, miR-1246, 및 miR-24;
(3) miR-223, miR-1246, 및 miR-373;
(4) miR-223, miR-1246, 및 miR-21;
(5) miR-223, miR-1246, 및 miR-6875;
(6) miR-223, miR-1246, 및 miR-202;
(7) miR-223, miR-1246, 및 miR-219B;
(8) miR-223, miR-206, 및 miR-24;
(9) miR-223, miR-206, 및 miR-373;
(10) miR-223, miR-206, 및 miR-21;
(11) miR-223, miR-206, 및 miR-6875;
(12) miR-223, miR-206, 및 miR-202;
(13) miR-223, miR-206, 및 miR-219B;
(14) miR-223, miR-24, 및 miR-373;
(15) miR-223, miR-24, 및 miR-21;
(16) miR-223, miR-24, 및 miR-6875;
(17) miR-223, miR-24, 및 miR-202;
(18) miR-223, miR-24, 및 miR-219B;
(19) miR-223, miR-373, 및 miR-21;
(20) miR-223, miR-373, 및 miR-6875;
(21) miR-223, miR-373, 및 miR-202;
(22) miR-223, miR-373, 및 miR-219B;
(23) miR-223, miR-21, 및 miR-6875;
(24) miR-223, miR-21, 및 miR-202;
(25) miR-223, miR-21, 및 miR-219B;
(26) miR-223, miR-6875, 및 miR-202;
(27) miR-223, miR-6875, 및 miR-219B;
(28) miR-223, miR-202, 및 miR-219B;
(29) miR-1246, miR-206, 및 miR-24;
(30) miR-1246, miR-206, 및 miR-373;
(31) miR-1246, miR-206, 및 miR-21;
(32) miR-1246, miR-206, 및 miR-6875;
(33) miR-1246, miR-206, 및 miR-202;
(34) miR-1246, miR-206, 및 miR-219B;
(35) miR-1246, miR-24, 및 miR-373;
(36) miR-1246, miR-24, 및 miR-21;
(37) miR-1246, miR-24, 및 miR-6875;
(38) miR-1246, miR-24, 및 miR-202;
(39) miR-1246, miR-24, 및 miR-219B;
(40) miR-1246, miR-373, 및 miR-21;
(41) miR-1246, miR-373, 및 miR-6875;
(42) miR-1246, miR-373, 및 miR-202;
(43) miR-1246, miR-373, 및 miR-219B;
(44) miR-1246, miR-21, 및 miR-6875;
(45) miR-1246, miR-21, 및 miR-202;
(46) miR-1246, miR-21, 및 miR-219B;
(47) miR-1246, miR-6875, 및 miR-202;
(48) miR-1246, miR-6875, 및 miR-219B;
(49) miR-1246, miR-202, 및 miR-219B;
(50) miR-206, miR-24, 및 miR-373;
(51) miR-206, miR-24, 및 miR-21;
(52) miR-206, miR-24, 및 miR-6875;
(53) miR-206, miR-24, 및 miR-202;
(54) miR-206, miR-24, 및 miR-219B;
(55) miR-206, miR-373, 및 miR-21;
(56) miR-206, miR-373, 및 miR-6875;
(57) miR-206, miR-373, 및 miR-202;
(58) miR-206, miR-373, 및 miR-219B;
(59) miR-206, miR-21, 및 miR-6875;
(60) miR-206, miR-21, 및 miR-202;
(61) miR-206, miR-21, 및 miR-219B;
(62) miR-206, miR-6875, 및 miR-202;
(63) miR-206, miR-6875, 및 miR-219B;
(64) miR-206, miR-202, 및 miR-219B;
(65) miR-24, miR-373, 및 miR-21;
(66) miR-24, miR-373, 및 miR-6875;
(67) miR-24, miR-373, 및 miR-202;
(68) miR-24, miR-373, 및 miR-219B;
(69) miR-24, miR-21, 및 miR-6875;
(70) miR-24, miR-21, 및 miR-202;
(71) miR-24, miR-21, 및 miR-219B;
(72) miR-24, miR-6875, 및 miR-202;
(73) miR-24, miR-6875, 및 miR-219B;
(74) miR-24, miR-202, 및 miR-219B;
(75) miR-373, miR-21, 및 miR-6875;
(76) miR-373, miR-21, 및 miR-202;
(77) miR-373, miR-21, 및 miR-219B;
(78) miR-373, miR-6875, 및 miR-202;
(79) miR-373, miR-6875, 및 miR-219B;
(80) miR-373, miR-202, 및 miR-219B;
(81) miR-21, miR-6875, 및 miR-202;
(82) miR-21, miR-6875, 및 miR-219B;
(83) miR-21, miR-202, 및 miR-219B; 및
(84) miR-6875, miR-202, 및 miR-219B.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 표 11로부터 선택된 엑소좀 microRNA 조합(4개 microRNA의 조합)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 4개의 microRNA의 조합은 하기 조합인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
(1) miR-223, miR-1246, miR-206, 및 miR-24;
(2) miR-223, miR-1246, miR-206, 및 miR-373;
(3) miR-223, miR-1246, miR-206, 및 miR-21;
(4) miR-223, miR-1246, miR-206, 및 miR-6875;
(5) miR-223, miR-1246, miR-206, 및 miR-202;
(6) miR-223, miR-1246, miR-206, 및 miR-219B;
(7) miR-223, miR-1246, miR-24, 및 miR-373;
(8) miR-223, miR-1246, miR-24, 및 miR-21;
(9) miR-223, miR-1246, miR-24, 및 miR-6875;
(10) miR-223, miR-1246, miR-24, 및 miR-202;
(11) miR-223, miR-1246, miR-24, 및 miR-219B;
(12) miR-223, miR-1246, miR-373, 및 miR-21;
(13) miR-223, miR-1246, miR-373, 및 miR-6875;
(14) miR-223, miR-1246, miR-373, 및 miR-202;
(15) miR-223, miR-1246, miR-373, 및 miR-219B;
(16) miR-223, miR-1246, miR-21, 및 miR-6875;
(17) miR-223, miR-1246, miR-21, 및 miR-202;
(18) miR-223, miR-1246, miR-21, 및 miR-219B;
(19) miR-223, miR-1246, miR-6875, 및 miR-202;
(20) miR-223, miR-1246, miR-6875, 및 miR-219B;
(21) miR-223, miR-1246, miR-202, 및 miR-219B;
(22) miR-223, miR-206, miR-24, 및 miR-373;
(23) miR-223, miR-206, miR-24, 및 miR-21;
(24) miR-223, miR-206, miR-24, 및 miR-6875;
(25) miR-223, miR-206, miR-24, 및 miR-202;
(26) miR-223, miR-206, miR-24, 및 miR-219B;
(27) miR-223, miR-206, miR-373, 및 miR-21;
(28) miR-223, miR-206, miR-373, 및 miR-6875;
(29) miR-223, miR-206, miR-373, 및 miR-202;
(30) miR-223, miR-206, miR-373, 및 miR-219B;
(31) miR-223, miR-206, miR-21, 및 miR-6875;
(32) miR-223, miR-206, miR-21, 및 miR-202;
(33) miR-223, miR-206, miR-21, 및 miR-219B;
(34) miR-223, miR-206, miR-6875, 및 miR-202;
(35) miR-223, miR-206, miR-6875, 및 miR-219B;
(36) miR-223, miR-206, miR-202, 및 miR-219B;
(37) miR-223, miR-24, miR-373, 및 miR-21;
(38) miR-223, miR-24, miR-373, 및 miR-6875;
(39) miR-223, miR-24, miR-373, 및 miR-202;
(40) miR-223, miR-24, miR-373, 및 miR-219B;
(41) miR-223, miR-24, miR-21, 및 miR-6875;
(42) miR-223, miR-24, miR-21, 및 miR-202;
(43) miR-223, miR-24, miR-21, 및 miR-219B;
(44) miR-223, miR-24, miR-6875, 및 miR-202;
(45) miR-223, miR-24, miR-6875, 및 miR-219B;
(46) miR-223, miR-24, miR-202, 및 miR-219B;
(47) miR-223, miR-373, miR-21, 및 miR-6875;
(48) miR-223, miR-373, miR-21, 및 miR-202;
(49) miR-223, miR-373, miR-21, 및 miR-219B;
(50) miR-223, miR-373, miR-6875, 및 miR-202;
(51) miR-223, miR-373, miR-6875, 및 miR-219B;
(52) miR-223, miR-373, miR-202, 및 miR-219B;
(53) miR-223, miR-21, miR-6875, 및 miR-202;
(54) miR-223, miR-21, miR-6875, 및 miR-219B;
(55) miR-223, miR-21, miR-202, 및 miR-219B;
(56) miR-223, miR-6875, miR-202, 및 miR-219B;
(57) miR-1246, miR-206, miR-24, 및 miR-373;
(58) miR-1246, miR-206, miR-24, 및 miR-21;
(59) miR-1246, miR-206, miR-24, 및 miR-6875;
(60) miR-1246, miR-206, miR-24, 및 miR-202;
(61) miR-1246, miR-206, miR-24, 및 miR-219B;
(62) miR-1246, miR-206, miR-373, 및 miR-21;
(63) miR-1246, miR-206, miR-373, 및 miR-6875;
(64) miR-1246, miR-206, miR-373, 및 miR-202;
(65) miR-1246, miR-206, miR-373, 및 miR-219B;
(66) miR-1246, miR-206, miR-21, 및 miR-6875;
(67) miR-1246, miR-206, miR-21, 및 miR-202;
(68) miR-1246, miR-206, miR-21, 및 miR-219B;
(69) miR-1246, miR-206, miR-6875, 및 miR-202;
(70) miR-1246, miR-206, miR-6875, 및 miR-219B;
(71) miR-1246, miR-206, miR-202, 및 miR-219B;
(72) miR-1246, miR-24, miR-373, 및 miR-21;
(73) miR-1246, miR-24, miR-373, 및 miR-6875;
(74) miR-1246, miR-24, miR-373, 및 miR-202;
(75) miR-1246, miR-24, miR-373, 및 miR-219B;
(76) miR-1246, miR-24, miR-21, 및 miR-6875;
(77) miR-1246, miR-24, miR-21, 및 miR-202;
(78) miR-1246, miR-24, miR-21, 및 miR-219B;
(79) miR-1246, miR-24, miR-6875, 및 miR-202;
(80) miR-1246, miR-24, miR-6875, 및 miR-219B;
(81) miR-1246, miR-24, miR-202, 및 miR-219B;
(82) miR-1246, miR-373, miR-21, 및 miR-6875;
(83) miR-1246, miR-373, miR-21, 및 miR-202;
(84) miR-1246, miR-373, miR-21, 및 miR-219B;
(85) miR-1246, miR-373, miR-6875, 및 miR-202;
(86) miR-1246, miR-373, miR-6875, 및 miR-219B;
(87) miR-1246, miR-373, miR-202, 및 miR-219B;
(88) miR-1246, miR-21, miR-6875, 및 miR-202;
(89) miR-1246, miR-21, miR-6875, 및 miR-219B;
(90) miR-1246, miR-21, miR-202, 및 miR-219B;
(91) miR-1246, miR-6875, miR-202, 및 miR-219B;
(92) miR-206, miR-24, miR-373, 및 miR-21;
(93) miR-206, miR-24, miR-373, 및 miR-6875;
(94) miR-206, miR-24, miR-373, 및 miR-202;
(95) miR-206, miR-24, miR-373, 및 miR-219B;
(96) miR-206, miR-24, miR-21, 및 miR-6875;
(97) miR-206, miR-24, miR-21, 및 miR-202;
(98) miR-206, miR-24, miR-21, 및 miR-219B;
(99) miR-206, miR-24, miR-6875, 및 miR-202;
(100) miR-206, miR-24, miR-6875, 및 miR-219B;
(101) miR-206, miR-24, miR-202, 및 miR-219B;
(102) miR-206, miR-373, miR-21, 및 miR-6875;
(103) miR-206, miR-373, miR-21, 및 miR-202;
(104) miR-206, miR-373, miR-21, 및 miR-219B;
(105) miR-206, miR-373, miR-6875, 및 miR-202;
(106) miR-206, miR-373, miR-6875, 및 miR-219B;
(107) miR-206, miR-373, miR-202, 및 miR-219B;
(108) miR-206, miR-21, miR-6875, 및 miR-202;
(109) miR-206, miR-21, miR-6875, 및 miR-219B;
(110) miR-206, miR-21, miR-202, 및 miR-219B;
(111) miR-206, miR-6875, miR-202, 및 miR-219B;
(112) miR-24, miR-373, miR-21, 및 miR-6875;
(113) miR-24, miR-373, miR-21, 및 miR-202;
(114) miR-24, miR-373, miR-21, 및 miR-219B;
(115) miR-24, miR-373, miR-6875, 및 miR-202;
(116) miR-24, miR-373, miR-6875, 및 miR-219B;
(117) miR-24, miR-373, miR-202, 및 miR-219B;
(118) miR-24, miR-21, miR-6875, 및 miR-202;
(119) miR-24, miR-21, miR-6875, 및 miR-219B;
(120) miR-24, miR-21, miR-202, 및 miR-219B;
(121) miR-24, miR-6875, miR-202, 및 miR-219B;
(122) miR-373, miR-21, miR-6875, 및 miR-202;
(123) miR-373, miR-21, miR-6875, 및 miR-219B;
(124) miR-373, miR-21, miR-202, 및 miR-219B;
(125) miR-373, miR-6875, miR-202, 및 miR-219B; 및
(126) miR-21, miR-6875, miR-202, 및 miR-219B.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 발현 수준을 측정하는 제제는 엑소좀 microRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 엑소좀 microRNA는 혈액, 소변, 대변 또는 유즙으로부터 분리될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 엑소좀 microRNA는 혈액으로부터 분리될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 유방암의 조기 진단을 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 유방암 발병 위험군(예컨대, 고위험군)을 선별 검사하기 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 유방암 진단용 조성물을 포함하는 유방암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 키트는 유전자 증폭 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 키트는 마이크로어레이 칩일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
뿐만 아니라, 본 발명은 (a) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-223, miR-1246, miR-206, miR-24, miR-373, miR-21, miR-6875, miR-202 및 miR-219B로 이루어진 군으로부터 선택된 둘 이상의 엑소좀 microRNA 조합의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 측정된 엑소좀 microRNA 조합의 발현 수준이 대조군에 비하여 증가된 경우 유방암으로 판정하거나, 또는 유방암에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는 유방암 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-223, miR-1246, miR-206, miR-24, miR-373, miR-21, miR-6875, miR-202 및 miR-219B로 이루어진 군으로부터 선택된 둘 이상의 엑소좀 microRNA 조합의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 측정된 엑소좀 microRNA 조합의 발현 수준이 대조군에 비하여 증가된 경우 유방암으로 판정하거나, 또는 유방암에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는 유방암 진단 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-223, miR-1246, miR-206, miR-24, miR-373, miR-21, miR-6875, miR-202 및 miR-219B로 이루어진 군으로부터 선택된 둘 이상의 엑소좀 microRNA 조합의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 측정된 엑소좀 microRNA 조합의 발현 수준이 대조군에 비하여 증가된 경우 유방암으로 판정하거나, 또는 유방암에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는 유방암 발병을 예측하기 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)는 하기 (i) 및 (ii)에 기재된 엑소좀 microRNA의 발현 수준을 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
(i) miR-223, miR-373 및 miR-202로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 엑소좀 microRNA; 및
(ii) miR-1246, miR-206, miR-24, miR-21, miR-6875 및 miR-219B로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 엑소좀 microRNA.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)의 엑소좀 microRNA 조합은 2 내지 4개의 엑소좀 microRNA의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)는 표 9로부터 선택된 엑소좀 microRNA 조합(2개 microRNA의 조합)의 발현 수준을 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)는 표 10으로부터 선택된 엑소좀 microRNA 조합(3개 microRNA의 조합)의 발현 수준을 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)는 표 11로부터 선택된 엑소좀 microRNA 조합(4개 microRNA의 조합)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 바이오마커인 9종의 엑소좀 microRNA에서 선택된 둘 이상의(예컨대, 2개, 3개 또는 4개) microRNA 조합을 이용하면, 혈액과 같은 액체 생검을 이용하여 비침습적 방법으로 비교적 간단히 검사자의 고통 없이 유방암을 높은 정확성으로 조기에 진단할 수 있다. 또한, 본 발명을 이용하면 비침습적 방법으로 유방암 고위험군을 빠르고 정확하게 선별 검사할 수 있어 기존 유방 촬영술의 문제점을 보완할 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에 따른 9종의 miRNA의 U-test 분석결과, 상기 9종의 miRNA가 정상인과 유방암 환자를 구분하는데 유의미함을 보여주는 bar 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 9종의 miRNA 바이오마커 간의 상관성 분석 결과를 보여주는 도이다.
도 3은 분류 모형 생성에 사용된 검체 정보를 보여주는 도이다.
도 4는 유방암 환자 선별을 위한 단일 miRNA 바이오마커의 각각의 성능을 보여주는 도이다.
본 발명은 miR-223, miR-1246, miR-206, miR-24, miR-373, miR-21, miR-6875, miR-202 및 miR-219B로 이루어진 군으로부터 선택된 둘 이상의 엑소좀 microRNA 조합의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 진단용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 조성물은 유방암의 조기 진단에 사용될 수 있다. 다른 한편으로, 본 발명은 유방암 발병 위험군(예컨대, 고위험군)을 선별 검사하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "엑소좀(exosome)"이란, 세포로부터 분비되는 이중 지질막(lipid bilayer)을 가지고 있는 작은 형태의 소포체를 포괄적으로 의미하며, 엑소좀은 다양한 세포들로부터 분비되며 대략 30 내지 200 nm의 직경을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 엑소좀 내에는 세포로부터 유래된 다양한 종류의 단백질, DNA, mRNA, miRNA 등이 포함되어 있다.
본 발명의 조성물은 본 발명에 따른 9종의 엑소좀 microRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 둘 이상의 엑소좀 microRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 엑소좀 microRNA의 조합은 (i) miR-223, miR-373 및 miR-202로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 엑소좀 microRNA; 및 (ii) miR-1246, miR-206, miR-24, miR-21, miR-6875 및 miR-219B로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 엑소좀 microRNA를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 둘 이상의 엑소좀 microRNA 조합은 2 내지 4개의 엑소좀 microRNA들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 엑소좀 microRNA 조합의 예는 표 9 내지 11에 기재되어 있다. 구체적으로, 표 9(2개 miRNA의 조합), 10(3개 miRNA의 조합) 및 11(4개 miRNA의 조합)에 기재된 엑소좀 microRNA 조합은, 9종의 miRNA 각각의 단일 유전자 성능보다 높은 다중 miRNA 조합으로(단일 miRNA 성능 최대 값: 모형 AUC=0.963, 검증 AUC=0.962), 상관성이 높은 것으로 확인된 miR-223, miR-202, miR-373가 중복 포함되지 않는 조합이다.
본 발명에 있어서, 상기 엑소좀 microRNA는 precursor-miRNA(pre-miRNA)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 엑소좀 microRNA의 서열은 서열목록에 기재되어 있다.
상기 엑소좀 microRNA는 생물학적 시료(biological sample)로부터 분리될 수 있다. 본 명세서에 있어서, "생물학적 시료"란, 비침습적으로 획득될 수 있는 시료로서, 엑소좀을 포함하고 있는 모든 시료를 포함하며, 예를 들어, 혈액, 세포, 타액, 객담, 머리카락, 소변, 대변, 유즙 등일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 엑소좀 microRNA는 혈액, 소변, 대변 또는 유즙으로부터 분리될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 하나의 특정예에서, 상기 엑소좀 microRNA는 혈액으로부터 분리될 수 있다. 혈액과 같은 액체 생검(liquid biopsy)을 이용하면, 조직검사와 같은 침습적인 방법과 달리 검사자에게 고통을 주지 않으면서 질병의 진단이 가능하다. 또한, 액체 생검을 이용하는 경우 암이 발병하지 않은 잠재적 환자를 대상으로 조기 진단을 실시하거나, 이미 발병한 환자의 치료 경과를 주기적으로 관찰하는데 있어 조직검사에 비하여 큰 이점을 가진다.
본 발명에 있어서, 상기 엑소좀 microRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 본 발명에 따른 바이오마커(엑소좀 microRNA)에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 프라이머 또는 프로브는 본 발명의 바이오마커(엑소좀 microRNA) 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적(complementary)인 서열을 갖는다. 본 명세서에서 사용된 용어, "상보적"은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서, 용어 "상보적"은 용어 "완전 상보적(perfectly complementary)"과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "프라이머"는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형(template) 서열의 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.
프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시될 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 실시할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 서열번호 1 내지 18로 이루어진 군으로부터 선택된 하나를 포함하거나, 그로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 프라이머는 서열번호 1 내지 18로 표시되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어, "프로브"는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하고 타깃 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상술한 본 발명의 유방암 진단용 조성물을 포함하는 유방암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 유방암 진단용 키트는 상술한 유방암 진단용 조성물을 포함하므로, 이 두 발명 사이의 공통된 부분은 그 기재를 생략한다.
본 발명의 키트는 본 발명에 따른 엑소좀 microRNA의 발현 수준을 측정하는 제제뿐만 아니라, 유방암의 진단 키트로 사용되기에 적합하도록 당분야에서 일반적으로 사용되는 도구나 시약 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 도구 또는 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 내부 대조군(internal control)으로 사용할 수 있는 하우스키핑(housekeeping) 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 키트는 유전자 증폭 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 용어 "증폭"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 예를 들어, 중합효소 연쇄반응(PCR)은 미국 특허 제4683195호, 제4683202호, 제4800159호에 개시되어 있다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 키트는 마이크로어레이 칩일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체상에 배열되고 고정화된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시될 수 있다.
본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료는 표지(labeling) 될 수 있고, 마이크로어레이 상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
본원에 따른 키트는 양성대조군, 음성대조군 및/또는 사용설명서를 추가로 포함할 수 있다. 음성대조군으로는 miRNA를 포함하지 않는 시료, 양성대조군은 검출대상 엑소좀 microRNA 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-223, miR-1246, miR-206, miR-24, miR-373, miR-21, miR-6875, miR-202 및 miR-219B로 이루어진 군으로부터 선택된 둘 이상의 엑소좀 microRNA 조합의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 측정된 엑소좀 microRNA 조합의 발현 수준이 대조군에 비하여 증가된 경우 유방암으로 판정하거나, 또는 유방암에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는 유방암 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "정보제공방법(method for providing information)"이란, 유방암의 진단에 관한 정보를 제공하는 방법으로서, 엑소좀 내의 microRNA를 이용하여 본 발명에 따른 엑소좀 microRNA의 수준이 증가되었을 때 유방암의 발병이나 발병 가능성(위험성)에 대한 정보를 획득하는 방법을 의미한다.
상기 엑소좀 microRNA의 발현 수준은 바이오 키트 분야에서 통상 사용되는 방법에 따라 측정될 수 있는데, 예컨대 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 유전자 칩 등을 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (a)는 (i) miR-223, miR-373 및 miR-202로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 엑소좀 microRNA; 및 (ii) miR-1246, miR-206, miR-24, miR-21, miR-6875 및 miR-219B로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 엑소좀 microRNA의 발현 수준을 측정하여 실시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (a)의 엑소좀 microRNA 조합은 2 내지 4개의 엑소좀 microRNA들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 엑소좀 microRNA 조합은 표 9 내지 11에 기재되어 있으며, 이에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실험방법
실시예 1. 유방암 miRNA 표지 발굴
다중 유전자 분석에 용이한 30여 종의 유방암 miRNA 표지를 확보하고, 이에 대한 표준 물질에 적용하여 표 1에 기재된 바와 같이 최종 9종을 확보하였다(표 1). 확보한 miRNA 표지를 이용한 동시 다중 실시간 유전자 증폭 기술을 구축하기 위하여, 확보한 각 표지 유전자 염기서열을 컴퓨터 프로그램을 활용하여 덤벨 구조 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하고, 이들 각각의 PCR 조건을 양성 표준물질을 대상으로 구축하였다. 이렇게 구축한 덤벨 구조 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 임상 시료를 대상으로 이들 표지에 대한 선별 시험을 실시하였다.
(표 1의 프라이머 서열 중 N은 A, T, C, G 중 어느 하나의 염기임)
miRNA 위치 정방향 프라이머(5'→3') 역방향 프라이머(5'→3')
miR-223 NR_029637.1 GACCANNNNNAGTTGGACACTCCATGTGGTC
(서열번호 1)		 AGTGCNNNNNTGGTAAGCATGTGCCGCACT
(서열번호 2)
miR-21 NR_029493.1 CAGTCNNNNNGTCGGGTAGCTTATCAGACTG
(서열번호 3)		 CAGTCNNNNNCAGACAGCCCATCGACTG
(서열번호 4)
miR-24 NR_029497.1 CTGTGNNNNNGTGCCTACTGAGCTGAAACACAG(서열번호 5) CACTGNNNNNGTTCCTGCTGAACTGAGCCAGTG
(서열번호 6)
miR-1246 NR_031648.1 CAGGTNNNNNTGGAGCAGGAGTGGACACCTG(서열번호 7) CAATCNNNNNATTGCTAGCCTATGGATTG(서열번호 8)
miR-6875 NR_106935.1 CTTCTNNNNNGACCCAGGACAGGAGAAG(서열번호 9) GTGATNNNNNGCAGGAAGAATGCAAATCAC
(서열번호 10)
miR-206 NR_029713.1 AGCATNNNNNTGCTTCCCGAGGCCACATGCT(서열번호 11) AAGTGNNNNNACTTGCCGAAACCACACACTT(서열번호 12)
miR-219B NR_039815.1 ACATCNNNNNGGAGCTCAGCCACAGATGT(서열번호 13) GTTTGNNNNNGCGCCACTGATTGTCCAAAC
(서열번호 14)
miR-373 NR_029866.1 CAGACNNNNNCGCTTTCCTTTTTGTCTG(서열번호 15) GTGCTNNNNNGACACCCCAAAATCGAAGCAC
(서열번호 16)
miR-202 NR_030170.1 GGCCANNNNNGCATATACTTCTTTGAGGATCTGGCC(서열번호 17) CATGGNNNNNGACCGCCCCGTTTTCCCATG
(서열번호 18)
실시예 2. 총 RNA 추출
준비된 유방암 환자의 혈장 및 정상 대조군 혈장을 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 핵산을 추출하였다. 이 연구의 재료는 기관생명윤리위원(IRB) 승인을 받았고, 보건복지부 지정 인체자원단위은행에서 수집된 자원을 분양 받아 이루어졌으며, 구체적으로 정상 대조군 검체는 아주대학교 병원, 원광대학교 병원 인체자원은행과 바이오인프라의원에서 분양 받았고, 유방암 환자 검체는 부산대학교 병원, 인제대학교 부산백병원, 전남대학교 화순병원 인체자원은행에서 분양 받았다.
핵산 추출 장비는 Smart Lab Assist-32를 사용하였으며, 장비 사용 10분 전부터 장비를 준비(warming up) 시켰다. 동봉된 오토 플레이트(auto plate)의 비닐을 벗긴 뒤, 오토 플레이트의 윗면에 붙어있는 알루미늄 호일을 제거한 다음, 마이크로 파이펫을 이용하여 컬럼의 각 웰(well)에 300 ㎕의 검체를 분주하였다. 4℃에서 보관 중인 Proteinase K를 꺼내 검체가 분주된 각 웰에 20 ㎕씩 마이크로 파이펫을 이용하여 분주하였다.
8채널 스트립(channel strip)을 핵산 추출기구의 스트립 받침대 프레임(strip rack frame)에 장착시키고, 검체와 Proteinase K를 분주한 오토 플레이트를 핵산 추출기구의 96 웰 플레이트 받침대(deep well plate rack)에 끼운 뒤 끝까지 밀어서 장착시킨 다음 문을 닫고 시료에 맞게 프로그램을 실행시켰다. 핵산 추출기구의 프로그램이 끝난 후 오토 플레이트를 밖으로 빼낸 다음 각 웰에 추출되어 있는 핵산을 깨끗한 마이크로 튜브에 옮겨 담았다.
추출한 총 RNA의 농도를 측정하고, 측정한 농도를 분석하여 모든 검체의 농도 값을 보정하였다.
실시예 3. gDNA(genomic DNA) 제거
PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(제품 코드 RR047A, Takara)를 이용하여 추출한 총 RNA에서 gDNA 제거 및 RT 과정을 수행하였다. 구체적으로, 먼저 표 2와 같은 비율로 시약을 혼합하고, 혼합된 시약을 42℃에서 2분 동안 반응시킨 후 4℃에서 보관하였다.
2 ㎕ 5X gDNA Eraser Buffer
1 ㎕ gDNA Eraser
7 ㎕ 총 RNA
10 ㎕ 총 부피
2차 단계를 위해 표 3과 같은 비율로 시약을 혼합하고, 시약을 37℃에서 15분 후 85℃에서 5초 동안 차례대로 반응시킨 후 4℃에서 보관하였다.
10 ㎕ Reaction solution from Step 1
4 ㎕ 5X PrimeScript Buffer 2
1 ㎕ PrimeScript RT Enzyme Mix 1
1 ㎕ RT Primer Mix
4 ㎕ RNase Free dH 2O
20 ㎕ 총 부피
실시예 4. microRNA 유전자 증폭
확보한 유방암 miRNA 분석을 수행하기 전에 추출한 총 RNA에서 gDNA를 제거한 후 합성된 검체의 cDNA를 이용하여 내부 대조군 프라이머(internal control primer)로 정량화하였다. 반응 조건은 다음과 같았다. 합성된 cDNA 4 ㎕, 사이버 그린(SYBR) master mix 5 ㎕, 내부 대조군 프라이머 1 ㎕를 혼합하여 최종 10 ㎕의 혼합액을 완성한 다음 표 4의 실시간 PCR(CFS 96) 조건에 따라 반응을 수행하였다.
Segment 사이클 수 온도 시간
1 1 95℃ 600초
2 35 95℃ 10초
65℃ 60초
상기 과정 완료 후 normalization한 후 miRNA 분석을 수행하였으며, 1차 multiplex PCR은 총 9종의 miRNA 프라이머를 혼합(2.5 pmol-30 pmol)하여 하나의 튜브에 1 ㎕, 주형(template) cDNA 4 ㎕, 2X multiplex PCR master mix 5 ㎕를 혼합하여 최종 10 ㎕의 혼합액을 만든 다음 표 5의 조건에 따라 PCR을 수행하였다.
Segment 사이클 수 온도 수행시간
1 1 94℃ 600초
2 20 94℃ 30 초
65℃ 30 초
72℃ 60 초
3 1 72℃ 300 초
2차 실시간(real-time) PCR을 위한 각 miRNA별 프라이머 농도는 4 pmol-10 pmol 범위였으며, 1차 PCR 산물을 1/10로 희석하여 2차 실시간 PCR 분석에 이용하였다. 각 유전자별 프라이머 1 ㎕, 1차 PCR 산물 4 ㎕, 2X 사이버그린 master mix 5 ㎕를 혼합하여 최종 10 ㎕의 혼합액을 만든 다음 표 6의 조건에 따라 PCR을 수행하였다.
Segment 사이클 수 온도 시간
1 1 95℃ 600초
2 25 95℃ 10초
65℃ 60초
실험결과
정상인과 유방암 환자를 선별(screening)하는데 유의미할 것이라 예상되는 9종의 miRNA(miR-223, 21, 24, 1246, 6875, 206, 219B, 373, 202)의 발현도를 분석하였다. 이때 정상인과 유방암 환자의 혈장(plasma)에서 추출한 RNA가 miRNA 발현도 분석에 동일한 농도가 사용될 수 있도록 추출한 총 RNA 농도를 측정하고, 내부 대조군(internal control; house-keeping gene)으로 한번 더 정량화하였다.
분석에 사용된 검체는 정상인 혈장 146개(아주대학교 병원 인체자원은행 31명, 원광대학교 병원 인체자원은행 25개, 바이오인프라의원 90개)와 유방암 환자 혈장 226개(부산대학교 병원 인체자원은행 147개, 인제대학교 부산백병원 인체자원은행 39개, 전남대학교 화순병원 인체자원은행 40개)였다. 이때 정상인 혈장은 모두 여성 검체의 혈장을 사용하였다.
각 miRNA의 발현도는 Ct(threshold cycle; 역치 사이클)로 miRNA 증폭 곡선과 역치선 사이의 교차점으로 실시간 PCR 반응에서 타겟 miRNA 농도의 상대적 측정값을 의미하는 것이다.
결과 1. 정상인과 유방암 환자를 구분하는데 9종의 miRNA 모두 유의미한 결과를 나타냄
U-test 분석 결과, 9개의 miRNA 모두 정상인과 유방암 환자를 구분하는데 유의미함을 확인하였으며(표 7), bar 그래프에서도 유의미함을 확인하였다(도 1).
[규칙 제91조에 의한 정정 14.04.2021]　
Figure WO-DOC-TABLE-7
결과 2. 9종의 miRNA 바이오마커 간의 상관성 분석 결과
9종의 miRNA 바이오마커 간의 상관성 분석 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, miR-223의 경우 miR-373, miR-202와의 상관성이 높다는 것을 확인하였으며, 이러한 결과를 통하여 추후 분석모형 생성시 3개의 miRNA 가운데 하나의 miRNA 바이오마커만을 사용하는 것이 효율적일 것으로 판단하였다(도 2).
결과 3. 분류 모형 생성을 통한 유방 암 환자 선별을 위한 최적의 다중 miRNA 바이오마커 세트 선정
분류 모형을 만들기 위하여 총 검체를 ① 모형 생성을 위한 검체와(학습모형) ② 모형 검증을 위한 검체로 구분하였으며, 모형 생성 및 검증용 데이터는 대략 2:1(생성: 검증)의 비율로 분배하였고, 실험 시기 및 검체 분양기관에 따라 결정하였으며, 검체 분양기관마다 모형 생성용 검체와 검증용 검체는 무작위 추출하였다. 이때 나이 정보는 반영하지 않았다(도 3).
분류 방법은 아래와 같았다:
① Linear 2종(GLM, RIDGE), Non-linear 2종(RF, SVM), 총 4종의 분류 알고리즘을 이용한 9개의 miRNA로 조합 가능한 모든 경우의 모델 생성(512개) 후 결과를 검토.
② 학습 모형 생성(정상인 90개, 유방암 환자 146개)은 10-fold cross validation 방법을 사용.
③ 모형의 전체 성능은 AUC(Area Under the Curve) 값으로 평가하였으며, 특이도(specificity) 85-95%로 변화를 주었을 때 해당 특이도에 해당하는 민감도(sensitivity)를 계산.
④ 모형 검증용 검체(정상인 56개, 유방암 환자 80개)로 학습 모형에 적용하여 결과를 검증.
분류 모형 생성을 통한 유방암 환자 선별을 위한 단일 miRNA 바이오마커의 각각의 성능을 도 4에 나타내었다.
또한, 유방암 환자 선별을 위한 최적의 다중 miRNA 바이오마커 세트를 선정하기 위해 아래와 같은 규칙을 적용하였다:
① 학습 모형의 AUC, 검증 검체들의 AUC의 내림차순 순위가 가장 높은 세트를 정렬(AUC 값이 1에 가까울수록 성능이 우수함).
② 바이오마커 간의 상관관계 행렬(CORRELATION Matrix)에 서 miR-223번이 포함될 경우, miR-373와 miR-202를 배제(miRNA 간의 상관성 분석결과 반영).
③ linear 보다는 non-linear 방법(RF)에서 최적 바이오마커 세트를 선정하기 위한 후보 바이오마커 리스트를 선정하고 평가.
④ 선정된 최적의 바이오마커 세트가 공통적으로 4가지 방법에서 성능이 우수함을 재확인.
모든 규칙을 충족시키는 여러 개의 다중 miRNA 바이오마커 세트 가운데 하나의 예를 표 8에 나타내었다.
Figure PCTKR2021003004-appb-img-000002
표 8의 miRNA 조합을 포함하는 RF 모델로 분석한 결과를 표 9 내지 11에 나타내었다. 표 9 내지 11에 기재된, 9종의 miRNA 가운데 2개 이상이 조합된 miRNA 조합은, 9종의 miRNA 각각의 성능보다 높은 다중 miRNA 조합(단일 miRNA 성능 최대값: 모형 AUC=0.963, 검증 AUC=0.962)이며, 상관성이 높은 miR-223, 202 및 373가 중복 포함되지 않는 조합이다.
또한, 표 12 내지 표 14에는 9종의 miRNA 가운데 2개 이상이 조합된 miRNA 조합의 모든 예시의 모형 AUC 및 검증 AUC를 확인하고 기재하였다.
[규칙 제91조에 의한 정정 14.04.2021]　
Figure WO-DOC-TABLE-9
Figure PCTKR2021003004-appb-img-000004
Figure PCTKR2021003004-appb-img-000005
Figure PCTKR2021003004-appb-img-000006
Figure PCTKR2021003004-appb-img-000007
Biomarker 1 2 모형
AUC		 검증
AUC
1 miR.223 miR.1246 0.983 0.984
2 miR.223 miR.206 0.991 0.979
3 miR.223 miR.24 0.994 0.985
4 miR.223 miR.373 0.975 0.967
5 miR.223 miR.21 0.986 0.962
6 miR.223 miR.6875 0.989 0.971
7 miR.223 miR.202 0.968 0.959
8 miR.223 miR.219B 0.976 0.959
9 miR.1246 miR.206 0.979 0.988
10 miR.1246 miR.24 0.984 0.987
11 miR.1246 miR.373 0.968 0.983
12 miR.1246 miR.21 0.973 0.976
13 miR.1246 miR.6875 0.991 0.984
14 miR.1246 miR.202 0.959 0.966
15 miR.1246 miR.219B 0.963 0.964
16 miR.206 miR.24 0.976 0.973
17 miR.206 miR.373 0.964 0.981
18 miR.206 miR.21 0.979 0.973
19 miR.206 miR.6875 0.966 0.969
20 miR.206 miR.202 0.956 0.971
21 miR.206 miR.219B 0.942 0.933
22 miR.24 miR.373 0.982 0.977
23 miR.24 miR.21 0.985 0.988
24 miR.24 miR.6875 0.989 0.987
25 miR.24 miR.202 0.973 0.969
26 miR.24 miR.219B 0.963 0.96
27 miR.373 miR.21 0.96 0.973
28 miR.373 miR.6875 0.957 0.964
29 miR.373 miR.202 0.934 0.956
30 miR.373 miR.219B 0.94 0.95
31 miR.21 miR.6875 0.97 0.969
32 miR.21 miR.202 0.956 0.944
33 miR.21 miR.219B 0.927 0.933
34 miR.6875 miR.202 0.972 0.938
35 miR.6875 miR.219B 0.915 0.94
36 miR.202 miR.219B 0.938 0.914
Biomarker 1 2 3 모형
AUC		 검증
AUC
1 miR.223 miR.1246 miR.206 0.991 0.992
2 miR.223 miR.1246 miR.24 0.997 0.99
3 miR.223 miR.1246 miR.373 0.986 0.986
4 miR.223 miR.1246 miR.21 0.987 0.985
5 miR.223 miR.1246 miR.6875 0.994 0.986
6 miR.223 miR.1246 miR.202 0.981 0.983
7 miR.223 miR.1246 miR.219B 0.99 0.982
8 miR.223 miR.206 miR.24 0.998 0.992
9 miR.223 miR.206 miR.373 0.99 0.985
10 miR.223 miR.206 miR.21 0.993 0.979
11 miR.223 miR.206 miR.6875 0.993 0.983
12 miR.223 miR.206 miR.202 0.988 0.982
13 miR.223 miR.206 miR.219B 0.988 0.974
14 miR.223 miR.24 miR.373 0.995 0.986
15 miR.223 miR.24 miR.21 0.998 0.989
16 miR.223 miR.24 miR.6875 0.998 0.99
17 miR.223 miR.24 miR.202 0.991 0.981
18 miR.223 miR.24 miR.219B 0.997 0.982
19 miR.223 miR.373 miR.21 0.99 0.974
20 miR.223 miR.373 miR.6875 0.988 0.977
21 miR.223 miR.373 miR.202 0.976 0.966
22 miR.223 miR.373 miR.219B 0.981 0.971
23 miR.223 miR.21 miR.6875 0.99 0.977
24 miR.223 miR.21 miR.202 0.98 0.968
25 miR.223 miR.21 miR.219B 0.986 0.958
26 miR.223 miR.6875 miR.202 0.989 0.97
27 miR.223 miR.6875 miR.219B 0.984 0.965
28 miR.223 miR.202 miR.219B 0.976 0.957
29 miR.1246 miR.206 miR.24 0.991 0.994
30 miR.1246 miR.206 miR.373 0.985 0.991
31 miR.1246 miR.206 miR.21 0.988 0.988
32 miR.1246 miR.206 miR.6875 0.992 0.993
33 miR.1246 miR.206 miR.202 0.978 0.987
34 miR.1246 miR.206 miR.219B 0.987 0.984
35 miR.1246 miR.24 miR.373 0.99 0.989
36 miR.1246 miR.24 miR.21 0.989 0.993
37 miR.1246 miR.24 miR.6875 0.997 0.992
38 miR.1246 miR.24 miR.202 0.987 0.987
39 miR.1246 miR.24 miR.219B 0.989 0.988
40 miR.1246 miR.373 miR.21 0.977 0.984
41 miR.1246 miR.373 miR.6875 0.988 0.989
42 miR.1246 miR.373 miR.202 0.973 0.983
43 miR.1246 miR.373 miR.219B 0.976 0.981
44 miR.1246 miR.21 miR.6875 0.989 0.989
45 miR.1246 miR.21 miR.202 0.974 0.979
46 miR.1246 miR.21 miR.219B 0.97 0.978
47 miR.1246 miR.6875 miR.202 0.988 0.984
48 miR.1246 miR.6875 miR.219B 0.989 0.987
49 miR.1246 miR.202 miR.219B 0.975 0.971
50 miR.206 miR.24 miR.373 0.989 0.987
51 miR.206 miR.24 miR.21 0.994 0.992
52 miR.206 miR.24 miR.6875 0.991 0.987
53 miR.206 miR.24 miR.202 0.987 0.987
54 miR.206 miR.24 miR.219B 0.976 0.977
55 miR.206 miR.373 miR.21 0.983 0.984
56 miR.206 miR.373 miR.6875 0.976 0.984
57 miR.206 miR.373 miR.202 0.969 0.984
58 miR.206 miR.373 miR.219B 0.972 0.975
59 miR.206 miR.21 miR.6875 0.982 0.986
60 miR.206 miR.21 miR.202 0.979 0.975
61 miR.206 miR.21 miR.219B 0.973 0.966
62 miR.206 miR.6875 miR.202 0.983 0.979
63 miR.206 miR.6875 miR.219B 0.968 0.967
64 miR.206 miR.202 miR.219B 0.966 0.959
65 miR.24 miR.373 miR.21 0.988 0.992
66 miR.24 miR.373 miR.6875 0.991 0.983
67 miR.24 miR.373 miR.202 0.981 0.979
68 miR.24 miR.373 miR.219B 0.985 0.977
69 miR.24 miR.21 miR.6875 0.992 0.991
70 miR.24 miR.21 miR.202 0.987 0.985
71 miR.24 miR.21 miR.219B 0.986 0.982
72 miR.24 miR.6875 miR.202 0.992 0.984
73 miR.24 miR.6875 miR.219B 0.986 0.983
74 miR.24 miR.202 miR.219B 0.985 0.969
75 miR.373 miR.21 miR.6875 0.975 0.983
76 miR.373 miR.21 miR.202 0.967 0.966
77 miR.373 miR.21 miR.219B 0.965 0.972
78 miR.373 miR.6875 miR.202 0.966 0.967
79 miR.373 miR.6875 miR.219B 0.962 0.972
80 miR.373 miR.202 miR.219B 0.951 0.954
81 miR.21 miR.6875 miR.202 0.98 0.969
82 miR.21 miR.6875 miR.219B 0.964 0.965
83 miR.21 miR.202 miR.219B 0.965 0.952
84 miR.6875 miR.202 miR.219B 0.973 0.952
Biomarker 1 2 3 4 모형 AUC 검증 AUC
1 miR.223 miR.1246 miR.206 miR.24 0.997 0.994
2 miR.223 miR.1246 miR.206 miR.373 0.991 0.993
3 miR.223 miR.1246 miR.206 miR.21 0.993 0.992
4 miR.223 miR.1246 miR.206 miR.6875 0.995 0.991
5 miR.223 miR.1246 miR.206 miR.202 0.989 0.99
6 miR.223 miR.1246 miR.206 miR.219B 0.991 0.989
7 miR.223 miR.1246 miR.24 miR.373 0.997 0.99
8 miR.223 miR.1246 miR.24 miR.21 0.997 0.989
9 miR.223 miR.1246 miR.24 miR.6875 0.999 0.991
10 miR.223 miR.1246 miR.24 miR.202 0.996 0.989
11 miR.223 miR.1246 miR.24 miR.219B 0.998 0.988
12 miR.223 miR.1246 miR.373 miR.21 0.986 0.985
13 miR.223 miR.1246 miR.373 miR.6875 0.993 0.988
14 miR.223 miR.1246 miR.373 miR.202 0.984 0.986
15 miR.223 miR.1246 miR.373 miR.219B 0.991 0.986
16 miR.223 miR.1246 miR.21 miR.6875 0.993 0.986
17 miR.223 miR.1246 miR.21 miR.202 0.986 0.986
18 miR.223 miR.1246 miR.21 miR.219B 0.991 0.984
19 miR.223 miR.1246 miR.6875 miR.202 0.991 0.985
20 miR.223 miR.1246 miR.6875 miR.219B 0.994 0.986
21 miR.223 miR.1246 miR.202 miR.219B 0.987 0.983
22 miR.223 miR.206 miR.24 miR.373 0.998 0.99
23 miR.223 miR.206 miR.24 miR.21 0.999 0.993
24 miR.223 miR.206 miR.24 miR.6875 0.998 0.993
25 miR.223 miR.206 miR.24 miR.202 0.997 0.992
26 miR.223 miR.206 miR.24 miR.219B 0.998 0.989
27 miR.223 miR.206 miR.373 miR.21 0.993 0.981
28 miR.223 miR.206 miR.373 miR.6875 0.991 0.984
29 miR.223 miR.206 miR.373 miR.202 0.99 0.984
30 miR.223 miR.206 miR.373 miR.219B 0.99 0.984
31 miR.223 miR.206 miR.21 miR.6875 0.993 0.987
32 miR.223 miR.206 miR.21 miR.202 0.991 0.981
33 miR.223 miR.206 miR.21 miR.219B 0.992 0.976
34 miR.223 miR.206 miR.6875 miR.202 0.994 0.983
35 miR.223 miR.206 miR.6875 miR.219B 0.991 0.979
36 miR.223 miR.206 miR.202 miR.219B 0.988 0.98
37 miR.223 miR.24 miR.373 miR.21 0.997 0.988
38 miR.223 miR.24 miR.373 miR.6875 0.996 0.99
39 miR.223 miR.24 miR.373 miR.202 0.993 0.983
40 miR.223 miR.24 miR.373 miR.219B 0.996 0.982
41 miR.223 miR.24 miR.21 miR.6875 0.998 0.989
42 miR.223 miR.24 miR.21 miR.202 0.996 0.985
43 miR.223 miR.24 miR.21 miR.219B 0.997 0.985
44 miR.223 miR.24 miR.6875 miR.202 0.996 0.987
45 miR.223 miR.24 miR.6875 miR.219B 0.997 0.988
46 miR.223 miR.24 miR.202 miR.219B 0.995 0.979
47 miR.223 miR.373 miR.21 miR.6875 0.989 0.978
48 miR.223 miR.373 miR.21 miR.202 0.983 0.972
49 miR.223 miR.373 miR.21 miR.219B 0.988 0.975
50 miR.223 miR.373 miR.6875 miR.202 0.987 0.974
51 miR.223 miR.373 miR.6875 miR.219B 0.988 0.974
52 miR.223 miR.373 miR.202 miR.219B 0.978 0.967
53 miR.223 miR.21 miR.6875 miR.202 0.988 0.975
54 miR.223 miR.21 miR.6875 miR.219B 0.991 0.972
55 miR.223 miR.21 miR.202 miR.219B 0.983 0.967
56 miR.223 miR.6875 miR.202 miR.219B 0.989 0.966
57 miR.1246 miR.206 miR.24 miR.373 0.993 0.992
58 miR.1246 miR.206 miR.24 miR.21 0.995 0.996
59 miR.1246 miR.206 miR.24 miR.6875 0.997 0.996
60 miR.1246 miR.206 miR.24 miR.202 0.991 0.995
61 miR.1246 miR.206 miR.24 miR.219B 0.993 0.992
62 miR.1246 miR.206 miR.373 miR.21 0.987 0.99
63 miR.1246 miR.206 miR.373 miR.6875 0.99 0.995
64 miR.1246 miR.206 miR.373 miR.202 0.982 0.99
65 miR.1246 miR.206 miR.373 miR.219B 0.987 0.988
66 miR.1246 miR.206 miR.21 miR.6875 0.992 0.996
67 miR.1246 miR.206 miR.21 miR.202 0.988 0.988
68 miR.1246 miR.206 miR.21 miR.219B 0.987 0.985
69 miR.1246 miR.206 miR.6875 miR.202 0.99 0.994
70 miR.1246 miR.206 miR.6875 miR.219B 0.992 0.994
71 miR.1246 miR.206 miR.202 miR.219B 0.983 0.986
72 miR.1246 miR.24 miR.373 miR.21 0.992 0.991
73 miR.1246 miR.24 miR.373 miR.6875 0.996 0.992
74 miR.1246 miR.24 miR.373 miR.202 0.991 0.988
75 miR.1246 miR.24 miR.373 miR.219B 0.992 0.987
76 miR.1246 miR.24 miR.21 miR.6875 0.997 0.995
77 miR.1246 miR.24 miR.21 miR.202 0.991 0.99
78 miR.1246 miR.24 miR.21 miR.219B 0.99 0.99
79 miR.1246 miR.24 miR.6875 miR.202 0.996 0.991
80 miR.1246 miR.24 miR.6875 miR.219B 0.997 0.99
81 miR.1246 miR.24 miR.202 miR.219B 0.991 0.985
82 miR.1246 miR.373 miR.21 miR.6875 0.987 0.991
83 miR.1246 miR.373 miR.21 miR.202 0.979 0.982
84 miR.1246 miR.373 miR.21 miR.219B 0.979 0.984
85 miR.1246 miR.373 miR.6875 miR.202 0.987 0.99
86 miR.1246 miR.373 miR.6875 miR.219B 0.988 0.99
87 miR.1246 miR.373 miR.202 miR.219B 0.977 0.983
88 miR.1246 miR.21 miR.6875 miR.202 0.988 0.989
89 miR.1246 miR.21 miR.6875 miR.219B 0.987 0.988
90 miR.1246 miR.21 miR.202 miR.219B 0.978 0.979
91 miR.1246 miR.6875 miR.202 miR.219B 0.989 0.985
92 miR.206 miR.24 miR.373 miR.21 0.992 0.994
93 miR.206 miR.24 miR.373 miR.6875 0.994 0.99
94 miR.206 miR.24 miR.373 miR.202 0.988 0.99
95 miR.206 miR.24 miR.373 miR.219B 0.99 0.985
96 miR.206 miR.24 miR.21 miR.6875 0.993 0.993
97 miR.206 miR.24 miR.21 miR.202 0.992 0.993
98 miR.206 miR.24 miR.21 miR.219B 0.993 0.988
99 miR.206 miR.24 miR.6875 miR.202 0.994 0.991
100 miR.206 miR.24 miR.6875 miR.219B 0.989 0.987
101 miR.206 miR.24 miR.202 miR.219B 0.987 0.981
102 miR.206 miR.373 miR.21 miR.6875 0.983 0.99
103 miR.206 miR.373 miR.21 miR.202 0.98 0.981
104 miR.206 miR.373 miR.21 miR.219B 0.982 0.979
105 miR.206 miR.373 miR.6875 miR.202 0.977 0.985
106 miR.206 miR.373 miR.6875 miR.219B 0.977 0.979
107 miR.206 miR.373 miR.202 miR.219B 0.972 0.978
108 miR.206 miR.21 miR.6875 miR.202 0.983 0.986
109 miR.206 miR.21 miR.6875 miR.219B 0.981 0.981
110 miR.206 miR.21 miR.202 miR.219B 0.979 0.973
111 miR.206 miR.6875 miR.202 miR.219B 0.982 0.972
112 miR.24 miR.373 miR.21 miR.6875 0.991 0.992
113 miR.24 miR.373 miR.21 miR.202 0.988 0.988
114 miR.24 miR.373 miR.21 miR.219B 0.989 0.988
115 miR.24 miR.373 miR.6875 miR.202 0.991 0.985
116 miR.24 miR.373 miR.6875 miR.219B 0.991 0.983
117 miR.24 miR.373 miR.202 miR.219B 0.986 0.974
118 miR.24 miR.21 miR.6875 miR.202 0.993 0.989
119 miR.24 miR.21 miR.6875 miR.219B 0.993 0.989
120 miR.24 miR.21 miR.202 miR.219B 0.99 0.981
121 miR.24 miR.6875 miR.202 miR.219B 0.991 0.981
122 miR.373 miR.21 miR.6875 miR.202 0.974 0.977
123 miR.373 miR.21 miR.6875 miR.219B 0.977 0.98
124 miR.373 miR.21 miR.202 miR.219B 0.971 0.968
125 miR.373 miR.6875 miR.202 miR.219B 0.968 0.964
126 miR.21 miR.6875 miR.202 miR.219B 0.978 0.966
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에 따른 바이오마커인 9종의 엑소좀 microRNA에서 선택된 둘 이상의(예컨대, 2개, 3개 또는 4개) microRNA 조합을 이용하면, 혈액과 같은 액체 생검을 이용하여 비침습적 방법으로 비교적 간단히 검사자의 고통 없이 유방암을 높은 정확성으로 조기에 진단할 수 있다. 또한, 본 발명을 이용하면 비침습적 방법으로 유방암 고위험군을 빠르고 정확하게 선별 검사할 수 있어 기존 유방 촬영술의 문제점을 보완할 것으로 기대되는 바, 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (22)

  1. miR-223, miR-1246, miR-206, miR-24, miR-373, miR-21, miR-6875, miR-202 및 miR-219B로 이루어진 군으로부터 선택된 둘 이상의 엑소좀 microRNA(exosomal miRNA) 조합의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 하기 (i) 및 (ii)에 기재된 엑소좀 microRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물:
    (i) miR-223, miR-373 및 miR-202로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 엑소좀 microRNA; 및
    (ii) miR-1246, miR-206, miR-24, miR-21, miR-6875 및 miR-219B로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 엑소좀 microRNA.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 둘 이상의 엑소좀 microRNA 조합은 2 내지 4개의 엑소좀 microRNA의 조합인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 하기의 엑소좀 microRNA 조합의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물:
    (1) miR-223 및 miR-24;
    (2) miR-223 및 miR-1246;
    (3) miR-223 및 miR-6875;
    (4) miR-223 및 miR-206;
    (5) miR-24 및 miR-373;
    (6) miR-24 및 miR-202; 또는
    (7) miR-1246 및 miR-373.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 하기의 엑소좀 microRNA 조합의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물:
    (1) miR-223, miR-21 및 miR-24;
    (2) miR-223, miR-21 및 miR-1246;
    (3) miR-223, miR-21 및 miR-6875;
    (4) miR-223, miR-21 및 miR-206;
    (5) miR-223, miR-24 및 miR-1246;
    (6) miR-223, miR-24 및 miR-6875;
    (7) miR-223, miR-24 및 miR-206;
    (8) miR-223, miR-24 및 miR-219B;
    (9) miR-223, miR-1246 및 miR-6875;
    (10) miR-223, miR-1246 및 miR-206;
    (11) miR-223, miR-1246 및 miR-219B;
    (12) miR-223, miR-6875 및 miR-206;
    (13) miR-223, miR-6875 및 miR-219B;
    (14) miR-223, miR-206 및 miR-219B;
    (15) miR-21, miR-24 및 miR-373;
    (16) miR-21, miR-24 및 miR-202;
    (17) miR-21, miR-1246 및 miR-373;
    (18) miR-21, miR-1246 및 miR-202;
    (19) miR-21, miR-6875 및 miR-373;
    (20) miR-21, miR-6875 및 miR-202;
    (21) miR-21, miR-206 및 miR-373;
    (22) miR-21, miR-206 및 miR-202;
    (23) miR-21, miR-219B 및 miR-373;
    (24) miR-24, miR-1246 및 miR-373;
    (25) miR-24, miR-1246 및 miR-202;
    (26) miR-24, miR-6875 및 miR-206;
    (27) miR-24, miR-6875 및 miR-373;
    (28) miR-24, miR-6875 및 miR-202;
    (29) miR-24, miR-206 및 miR-373;
    (30) miR-24, miR-206 및 miR-202;
    (31) miR-24, miR-219B 및 miR-373;
    (32) miR-24, miR-219B 및 miR-202;
    (33) miR-1246, miR-6875 및 miR-373;
    (34) miR-1246, miR-6875 및 miR-202;
    (35) miR-1246, miR-206 및 miR-373;
    (36) miR-1246, miR-206 및 miR-202;
    (37) miR-1246, miR-219B 및 miR-373;
    (38) miR-1246, miR-219B 및 miR-202;
    (39) miR-6875, miR-206 및 miR-373;
    (40) miR-6875, miR-206 및 miR-202;
    (41) miR-6875, miR-219B 및 miR-373; 또는
    (42) miR-206, miR-219B 및 miR-373.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 하기의 엑소좀 microRNA 조합의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물:
    (1) miR-223, miR-21, miR-24 및 miR-1246;
    (2) miR-223, miR-21, miR-24 및 miR-6875;
    (3) miR-223, miR-21, miR-24 및 miR-206;
    (4) miR-223, miR-21, miR-24 및 miR-219B;
    (5) miR-223, miR-21, miR-1246 및 miR-6875;
    (6) miR-223, miR-21, miR-1246 및 miR-206;
    (7) miR-223, miR-21, miR-1246 및 miR-219B;
    (8) miR-223, miR-21, miR-6875 및 miR-206;
    (9) miR-223, miR-21, miR-6875 및 miR-219B;
    (10) miR-223, miR-21, miR-206 및 miR-219B;
    (11) miR-223, miR-24, miR-1246 및 miR-6875;
    (12) miR-223, miR-24, miR-1246 및 miR-206;
    (13) miR-223, miR-24, miR-1246 및 miR-219B;
    (14) miR-223, miR-24, miR-6875 및 miR-206;
    (15) miR-223, miR-24, miR-6875 및 miR-219B;
    (16) miR-223, miR-24, miR-206 및 miR-219B;
    (17) miR-223, miR-1246, miR-6875 및 miR-206;
    (18) miR-223, miR-1246, miR-6875 및 miR-219B;
    (19) miR-223, miR-1246, miR-206 및 miR-219B;
    (20) miR-223, miR-6875, miR-206 및 miR-219B;
    (21) miR-21, miR-24, miR-1246 및 miR-373;
    (22) miR-21, miR-24, miR-1246 및 miR-202;
    (23) miR-21, miR-24, miR-6875 및 miR-373;
    (24) miR-21, miR-24, miR-6875 및 miR-202;
    (25) miR-21, miR-24, miR-206 및 miR-373;
    (26) miR-21, miR-24, miR-206 및 miR-202;
    (27) miR-21, miR-24, miR-219B 및 miR-373;
    (28) miR-21, miR-24, miR-219B 및 miR-202;
    (29) miR-21, miR-1246, miR-6875 및 miR-373;
    (30) miR-21, miR-1246, miR-6875 및 miR-202;
    (31) miR-21, miR-1246, miR-206 및 miR-373;
    (32) miR-21, miR-1246, miR-206 및 miR-202;
    (33) miR-21, miR-1246, miR-219B 및 miR-373;
    (34) miR-21, miR-1246, miR-219B 및 miR-202;
    (35) miR-21, miR-6875, miR-206 및 miR-373;
    (36) miR-21, miR-6875, miR-206 및 miR-202;
    (37) miR-21, miR-6875, miR-219B 및 miR-373;
    (38) miR-21, miR-6875, miR-219B 및 miR-202;
    (39) miR-21, miR-206, miR-219B 및 miR-373;
    (40) miR-21, miR-206, miR-219B 및 miR-202;
    (41) miR-24, miR-1246, miR-6875 및 miR-206;
    (42) miR-24, miR-1246, miR-6875 및 miR-373;
    (43) miR-24, miR-1246, miR-6875 및 miR-202;
    (44) miR-24, miR-1246, miR-206 및 miR-373;
    (45) miR-24, miR-1246, miR-206 및 miR-202;
    (46) miR-24, miR-1246, miR-219B 및 miR-373;
    (47) miR-24, miR-1246, miR-219B 및 miR-202;
    (48) miR-24, miR-6875, miR-206 및 miR-373;
    (49) miR-24, miR-6875, miR-206 및 miR-202;
    (50) miR-24, miR-6875, miR-219B 및 miR-373;
    (51) miR-24, miR-6875, miR-219B 및 miR-202;
    (52) miR-24, miR-206, miR-219B 및 miR-373;
    (53) miR-24, miR-206, miR-219B 및 miR-202;
    (54) miR-1246, miR-6875, miR-206 및 miR-373;
    (55) miR-1246, miR-6875, miR-206 및 miR-202;
    (56) miR-1246, miR-6875, miR-219B 및 miR-373;
    (57) miR-1246, miR-6875, miR-219B 및 miR-202;
    (58) miR-1246, miR-206, miR-219B 및 miR-373;
    (59) miR-1246, miR-206, miR-219B 및 miR-202;
    (60) miR-6875, miR-206, miR-219B 및 miR-373; 또는
    (61) miR-6875, miR-206, miR-219B 및 miR-202.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 발현 수준을 측정하는 제제는 엑소좀 microRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 엑소좀 microRNA는 혈액, 소변, 대변 또는 유즙으로부터 분리된 것을 특징으로 하는, 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 유방암의 조기 진단을 위한 것을 특징으로 하는, 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 유방암 발병 위험군을 선별 검사하기 위한 것을 특징으로 하는, 조성물.
  11. 제1항의 조성물을 포함하는 유방암 진단용 키트.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 키트는 유전자 증폭 키트인 것을 특징으로 하는, 키트.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 키트는 마이크로어레이 칩인 것을 특징으로 하는, 키트.
  14. 다음의 단계를 포함하는 유방암 진단을 위한 정보제공방법:
    (a) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-223, miR-1246, miR-206, miR-24, miR-373, miR-21, miR-6875, miR-202 및 miR-219B로 이루어진 군으로부터 선택된 둘 이상의 엑소좀 microRNA 조합의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 측정된 엑소좀 microRNA 조합의 발현 수준이 대조군에 비하여 증가된 경우 유방암으로 판정하거나, 또는 유방암에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정하는 단계.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 단계 (a)는 하기 (i) 및 (ii)에 기재된 엑소좀 microRNA의 발현 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법:
    (i) miR-223, miR-373 및 miR-202로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 엑소좀 microRNA; 및
    (ii) miR-1246, miR-206, miR-24, miR-21, miR-6875 및 miR-219B로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 엑소좀 microRNA.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    상기 단계 (a)의 엑소좀 microRNA 조합은 2 내지 4개의 엑소좀 microRNA의 조합인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  17. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    상기 단계 (a)는 하기의 엑소좀 microRNA 조합의 발현 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법:
    (1) miR-223 및 miR-24;
    (2) miR-223 및 miR-1246;
    (3) miR-223 및 miR-6875;
    (4) miR-223 및 miR-206;
    (5) miR-24 및 miR-373;
    (6) miR-24 및 miR-202; 또는
    (7) miR-1246 및 miR-373.
  18. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    상기 단계 (a)는 하기의 엑소좀 microRNA 조합의 발현 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법:
    (1) miR-223, miR-21 및 miR-24;
    (2) miR-223, miR-21 및 miR-1246;
    (3) miR-223, miR-21 및 miR-6875;
    (4) miR-223, miR-21 및 miR-206;
    (5) miR-223, miR-24 및 miR-1246;
    (6) miR-223, miR-24 및 miR-6875;
    (7) miR-223, miR-24 및 miR-206;
    (8) miR-223, miR-24 및 miR-219B;
    (9) miR-223, miR-1246 및 miR-6875;
    (10) miR-223, miR-1246 및 miR-206;
    (11) miR-223, miR-1246 및 miR-219B;
    (12) miR-223, miR-6875 및 miR-206;
    (13) miR-223, miR-6875 및 miR-219B;
    (14) miR-223, miR-206 및 miR-219B;
    (15) miR-21, miR-24 및 miR-373;
    (16) miR-21, miR-24 및 miR-202;
    (17) miR-21, miR-1246 및 miR-373;
    (18) miR-21, miR-1246 및 miR-202;
    (19) miR-21, miR-6875 및 miR-373;
    (20) miR-21, miR-6875 및 miR-202;
    (21) miR-21, miR-206 및 miR-373;
    (22) miR-21, miR-206 및 miR-202;
    (23) miR-21, miR-219B 및 miR-373;
    (24) miR-24, miR-1246 및 miR-373;
    (25) miR-24, miR-1246 및 miR-202;
    (26) miR-24, miR-6875 및 miR-206;
    (27) miR-24, miR-6875 및 miR-373;
    (28) miR-24, miR-6875 및 miR-202;
    (29) miR-24, miR-206 및 miR-373;
    (30) miR-24, miR-206 및 miR-202;
    (31) miR-24, miR-219B 및 miR-373;
    (32) miR-24, miR-219B 및 miR-202;
    (33) miR-1246, miR-6875 및 miR-373;
    (34) miR-1246, miR-6875 및 miR-202;
    (35) miR-1246, miR-206 및 miR-373;
    (36) miR-1246, miR-206 및 miR-202;
    (37) miR-1246, miR-219B 및 miR-373;
    (38) miR-1246, miR-219B 및 miR-202;
    (39) miR-6875, miR-206 및 miR-373;
    (40) miR-6875, miR-206 및 miR-202;
    (41) miR-6875, miR-219B 및 miR-373; 또는
    (42) miR-206, miR-219B 및 miR-373.
  19. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    상기 단계 (a)는 하기의 엑소좀 microRNA 조합의 발현 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법:
    (1) miR-223, miR-21, miR-24 및 miR-1246;
    (2) miR-223, miR-21, miR-24 및 miR-6875;
    (3) miR-223, miR-21, miR-24 및 miR-206;
    (4) miR-223, miR-21, miR-24 및 miR-219B;
    (5) miR-223, miR-21, miR-1246 및 miR-6875;
    (6) miR-223, miR-21, miR-1246 및 miR-206;
    (7) miR-223, miR-21, miR-1246 및 miR-219B;
    (8) miR-223, miR-21, miR-6875 및 miR-206;
    (9) miR-223, miR-21, miR-6875 및 miR-219B;
    (10) miR-223, miR-21, miR-206 및 miR-219B;
    (11) miR-223, miR-24, miR-1246 및 miR-6875;
    (12) miR-223, miR-24, miR-1246 및 miR-206;
    (13) miR-223, miR-24, miR-1246 및 miR-219B;
    (14) miR-223, miR-24, miR-6875 및 miR-206;
    (15) miR-223, miR-24, miR-6875 및 miR-219B;
    (16) miR-223, miR-24, miR-206 및 miR-219B;
    (17) miR-223, miR-1246, miR-6875 및 miR-206;
    (18) miR-223, miR-1246, miR-6875 및 miR-219B;
    (19) miR-223, miR-1246, miR-206 및 miR-219B;
    (20) miR-223, miR-6875, miR-206 및 miR-219B;
    (21) miR-21, miR-24, miR-1246 및 miR-373;
    (22) miR-21, miR-24, miR-1246 및 miR-202;
    (23) miR-21, miR-24, miR-6875 및 miR-373;
    (24) miR-21, miR-24, miR-6875 및 miR-202;
    (25) miR-21, miR-24, miR-206 및 miR-373;
    (26) miR-21, miR-24, miR-206 및 miR-202;
    (27) miR-21, miR-24, miR-219B 및 miR-373;
    (28) miR-21, miR-24, miR-219B 및 miR-202;
    (29) miR-21, miR-1246, miR-6875 및 miR-373;
    (30) miR-21, miR-1246, miR-6875 및 miR-202;
    (31) miR-21, miR-1246, miR-206 및 miR-373;
    (32) miR-21, miR-1246, miR-206 및 miR-202;
    (33) miR-21, miR-1246, miR-219B 및 miR-373;
    (34) miR-21, miR-1246, miR-219B 및 miR-202;
    (35) miR-21, miR-6875, miR-206 및 miR-373;
    (36) miR-21, miR-6875, miR-206 및 miR-202;
    (37) miR-21, miR-6875, miR-219B 및 miR-373;
    (38) miR-21, miR-6875, miR-219B 및 miR-202;
    (39) miR-21, miR-206, miR-219B 및 miR-373;
    (40) miR-21, miR-206, miR-219B 및 miR-202;
    (41) miR-24, miR-1246, miR-6875 및 miR-206;
    (42) miR-24, miR-1246, miR-6875 및 miR-373;
    (43) miR-24, miR-1246, miR-6875 및 miR-202;
    (44) miR-24, miR-1246, miR-206 및 miR-373;
    (45) miR-24, miR-1246, miR-206 및 miR-202;
    (46) miR-24, miR-1246, miR-219B 및 miR-373;
    (47) miR-24, miR-1246, miR-219B 및 miR-202;
    (48) miR-24, miR-6875, miR-206 및 miR-373;
    (49) miR-24, miR-6875, miR-206 및 miR-202;
    (50) miR-24, miR-6875, miR-219B 및 miR-373;
    (51) miR-24, miR-6875, miR-219B 및 miR-202;
    (52) miR-24, miR-206, miR-219B 및 miR-373;
    (53) miR-24, miR-206, miR-219B 및 miR-202;
    (54) miR-1246, miR-6875, miR-206 및 miR-373;
    (55) miR-1246, miR-6875, miR-206 및 miR-202;
    (56) miR-1246, miR-6875, miR-219B 및 miR-373;
    (57) miR-1246, miR-6875, miR-219B 및 miR-202;
    (58) miR-1246, miR-206, miR-219B 및 miR-373;
    (59) miR-1246, miR-206, miR-219B 및 miR-202;
    (60) miR-6875, miR-206, miR-219B 및 miR-373; 또는
    (61) miR-6875, miR-206, miR-219B 및 miR-202.
  20. 다음의 단계를 포함하는 유방암 진단 방법:
    (a) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-223, miR-1246, miR-206, miR-24, miR-373, miR-21, miR-6875, miR-202 및 miR-219B로 이루어진 군으로부터 선택된 둘 이상의 엑소좀 microRNA 조합의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 측정된 엑소좀 microRNA 조합의 발현 수준이 대조군에 비하여 증가된 경우 유방암으로 판정하거나, 또는 유방암에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정하는 단계.
  21. miR-223, miR-1246, miR-206, miR-24, miR-373, miR-21, miR-6875, miR-202 및 miR-219B로 이루어진 군으로부터 선택된 둘 이상의 엑소좀 microRNA(exosomal miRNA) 조합의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물의 유방암 진단 용도.
  22. miR-223, miR-1246, miR-206, miR-24, miR-373, miR-21, miR-6875, miR-202 및 miR-219B로 이루어진 군으로부터 선택된 둘 이상의 엑소좀 microRNA(exosomal miRNA) 조합의 발현 수준을 측정하는 제제의 유방암 진단제의 제조를 위한 용도.
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