WO2010140827A2 - 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 ｈｌａ 대립유전자 자동검사 키트 - Google Patents

실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 ｈｌａ 대립유전자 자동검사 키트 Download PDF

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WO2010140827A2
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김태규
최희백
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention provides a detection set for an HLA allele comprising a primer capable of specifically amplifying the HLA allele,
  • Detection HLA alleles B27 (* 2701g), B47 (* 4701g), B13 (* 1301g), B44 (* 4402g), B49 (* 4901g), B59 (* 5901g), B38 (* 3801g), B8 ( * 0802g), B18 (* 1809g), B37 (* 3701g), B53 (* 5301g), B51 (* 5101g), B52 (* 5201g), B57 (* 5701g), B58 (* 5801g), B63 (* 1516g ), B77 (* 1513g), B62 (* 1524g)
  • Primer pairs SEQ ID NOs: 58 and 74
  • Primer pairs SEQ ID NOs: 55, 56, 51, 57 and 88
  • the detection set of the present invention can perform single or multiplex real-time PCR using at least two or more primers and fluorescent probes specific to the type of HLA allele, using one or more combinations thereof simultaneously.
  • the major histocompatibility antigen complex can be distinguished at the gene level, it can be widely used for more accurate histocompatibility determination.
  • Checking the real-time PCR results relates to a method of typing the HLA allele comprising the step of typing the HLA allele.
  • the primers may be used two or more selected from the sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 to 34 capable of selectively amplifying the HLA-A allele.
  • KoRASTM Kozen Biotech
  • the analyzed result can be represented by the O / X type or the Ct type, so that even the unskilled person can easily know the analyzed result.
  • Primer 1 GGA GTA TTG GGA CCG GAA C (SEQ ID NO: 1)
  • Primer 9 GAT AGA GCA GGA GAG GCC T (SEQ ID NO: 9)
  • Primer 19 CAC GCA GTT CGT GCG GTT T (SEQ ID NO: 19)
  • Primer 22 CAA GAG CGC AGG TCC TCG (SEQ ID NO: 22)
  • Primer 25 CCG AGT GGA CCT GGG GAC (SEQ ID NO: 25)
  • Primer 27 ACT CAC AGA CTG ACC GAG C (SEQ ID NO: 27)
  • Promoter 28 AGG ATG GAG CCG CGG GCA (SEQ ID NO: 28)
  • Primer 33 GGG TAC CAG CAG GAC GCT (SEQ ID NO: 33)
  • Precursor 34 GGA CCA CTC CAC GCA CTC (SEQ ID NO: 34)
  • Primer 36 ATT CTG TAA CTT TTC ATC AGT TGC (SEQ ID NO: 36)
  • 17 mer to 24 mer primers were constructed with the 3 'end as the site site showing the diversity of the HLA-B allele.
  • the base sequences used for each primer were as follows:
  • Primer 47 ACC GGG AGA CAC AGA TCT C (SEQ ID NO: 47)
  • Primer 74 GCC GCG GTC CAG GAG CT (SEQ ID NO: 74)
  • Prototype 85 GCC ATA CAT CCT CTG GAT GA (SEQ ID NO: 85)
  • Primer 95 GCC ATA CAT CCT CTG GAT GA (SEQ ID NO: 95)
  • Positive control standard gene fluorescent probe 2 Cyanine 3 5'-ACA GAA CTA ACC TCC AAC CAA TCA GC 3'BHQ2 (SEQ ID NO: 98) was constructed.
  • the number of tubes whose starting point was measured was D5 Target1 (25.4), E2 Target1 (25.34), and E4 Target1 (28.1), and the analysis table shows D5 Target1 (25.4) and E2 Target1 (25.34). ), E4 Target1 (28.1) was amplified to HLA-B51 (* 5101g).

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Abstract

본 발명은 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 HLA 대립유전자 자동검사 키트에 관한 것으로, 시료에서 추출한 DNA를 대상으로 HLA 대립유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 시발체와, HLA 대립유전자의 증폭 유무를 실시간으로 탐지할 수 있는 형광탐침자를 이용하여 실시간 PCR을 실시하고, 이로부터 얻은 형광값을 HLA 자동형별 분석 프로그램에서 분석하여 HLA 대립유전자의 형별을 분석하는 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 HLA 대립유전자 자동검사 키트에 관한 것이다.

Description

실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 ＨＬＡ 대립유전자 자동검사 키트
본 발명은 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 HLA 대립유전자 자동검사 키트에 관한 것으로, 시료에서 추출한 DNA를 대상으로 HLA 대립유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 시발체와, HLA 대립유전자의 증폭 유무를 실시간으로 탐지할 수 있는 형광탐침자를 이용하여 실시간 PCR을 실시하고, 이로부터 얻은 형광값을 HLA 자동형별 분석 프로그램에서 분석하여 HLA 대립유전자의 형별을 분석하는 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 HLA 대립유전자 자동검사 키트에 관한 것이다.
사람의 MHC (주조직적합성항원 복합체: Major Histocompatibility Complex)인 HLA(Human Leukocyte Antigen)는 기본적으로 이식거부반응에 관여하는 세포표면항원으로서 현대의학의 발달과 함께 난치성질환의 치료법으로서 이식술이 발달함에 따라 그 중요성과 정확한 검사에 대한 수요가 계속적으로 증가되고 있는 분야이다. HLA 유전자는 class I, II, III 부위로 구분되어 이루어져 있고, HLA class I 부위에는 HLA-A, B, C 유전자가 존재하고, HLA class II 부위에는 HLA-DR, DQ, DP 유전자들이 존재한다. HLA-A, B, C 분자는 3개의 도메인으로 구성되어 있고 분자량은 44KD를 갖는 세포막 당단백질(glycoprotein)으로 15번째 염색체의 지배를 받아 표현되는 분자량 12KD의 β-2 마이크로글로불린(microglobulin)과 결합하여 표현된다. HLA-DR, DQ, DP 분자는 α,β 체인이 헤테로다이머(heterodimer)를 형성하는 형태로 있으며 이들을 지배하는 유전자는 MHC 중심부 끝의 500kb에 위치하고 있다. HLA 대립유전자의 염기서열이 밝혀지고 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용한 HLA 대립유전자 DNA 형별(typing)이 가능해지면서 HLA 대립유전자의 다양성에 관한 연구는 더욱 급속도로 진행되어 대립유전자의 수가 현재 class I에서 HLA-A, B, C에서 각각 767, 1178, 440 종류, class II에서 HLA-DRA1, -DRB1, -DQA1, -DQB1, -DPA1, -DPB1에서 각각 3, 618, 34, 96, 27, 133 종류로 밝혀져 있다. HLA 유전자에 대해서는 최근 수년간 DNA 검사법으로 대부분 전환하고 있다. HLA 유전자에 대한 DNA 검사법이 많이 이용되고 발전되는 이유는 혈청학적인 검사에서의 부정확성 때문에 정확성이 높은 DNA 검사법으로 전환할 필요성이 대두되었고 기술적으로 DNA 검사법이 비교적 용이하며 최근에는 간편하고 정확한 상품이 키트로 많이 판매되고 있는 데에 기인한다. 현재 제품화된 HLA 유전자형 검사 키트는 나일론 멤브레인(nylon membrane)과 PCR-SSO(sequence specific oligonucleotide), 리버스 블랏(reverse blot) PCR-SSO, PCR-SSP (sequence specific primer), PCR-올리고캡쳐 샌드위치 분석(PCR-oligocapture sandwich assay), 루미넥스 비드 분석(luminex bead array) 방법 및 PCR-SBT(sequence based typing) 방법을 이용하여 개발되었다. 그러나 종래의 방법은 사용자가 중합효소연쇄반응을 기본적으로 실시하고 이후 다른 여러 반응 즉 혼성화반응(hybridization)과 전기영동을 하여야 HLA 검사를 할 수 있는 불편함과 시간적인 소모가 요구되었다. 따라서 중합효소연쇄반응만으로 HLA 검사를 할 수 있는 실시간 중합효소연쇄반응에 대한 방법이 계속적으로 요구되고 있다.
실시간 중합효소연쇄반응으로 HLA 검사를 하는 경우, 형광물질이 부착된 시발체를 이용하여 증폭 유무를 측정하는데, 한 유전자에서 단일 염기 변이의 종류가 많을 경우 이에 대한 형광시발체가 각각(여러 종류) 있어야 한다. 단일염기변이가 많은 유전자의 경우 많은 종류의 값비싼 형광탐침자가 필요하여 연구하는데 어려움이 있다.
따라서, 값비싼 형광탐침자를 최소한으로 사용하면서 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 HLA 검사 형별법에 대한 요구가 대두되었다.
본 발명의 목적은 유전자 다형성이 있는 부위를 검출함에 있어서, 형광물질이 없는 일반 시발체를 이용하여 유전자 다형성이 있는 부위를 특이적으로 증폭하고, 증폭 유무만을 검출할 수 있는 형광탐침자를 이용하여 실시간으로 HLA 대립유전자의 형별을 분석할 수 있는 선별 키트 및 이를 이용한 HLA 대립유전자의 형별 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HLA 대립유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 시발체를 포함하는 HLA 대립유전자용 검출세트에 있어서,
상기 HLA 대립유전자의 증폭 유무를 탐지할 수 있는 서열번호 37, 38, 96 및 97에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광탐침자를 포함하는, HLA 대립유전자를 실시간 PCR로 검출하기 위한 HLA 대립유전자용 검출세트를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 검출세트를 포함하는 HLA 대립유전자 형별 선별 키트를 제공한다.
본 발명은 또한
시료에서 추출한 DNA를 대상으로 본 발명의 HLA 대립유전자용 검출세트를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)을 실시하는 단계; 및
상기 실시간 PCR 결과를 확인하여 HLA 대립유전자를 형별하는 단계를 포함하는 HLA 대립유전자의 형별 방법을 제공한다.
본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 HLA 대립유전자 형별 선별 키트는 형광시발체 대신 HLA 대립유전자에 특이적인 일반 시발체로 상기 유전자를 증폭하고, 유전자의 증폭 유무만을 검출할 수 있는 형광탐침자를 사용함으로써 전기영동 없이 실시간 PCR을 통해 HLA 대립유전자를 형별 가능하며, 분석비용이 현저히 절감되며, 한 유전자에 여러 단일염기변이가 존재하는 유전자의 형별 분석 시 용이하게 사용될 수 있다.
도 1 및 2는 HLA-A 대립유전자 형별을 구분하기 위한 분석표와 그 결과를 나타낸 것이다.
도 3 내지 6은 HLA-B 대립유전자 형별을 구분하기 위한 분석표와 그 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 HLA 대립유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 시발체를 포함하는 HLA 대립유전자용 검출세트에 있어서,
상기 HLA 대립유전자의 증폭 유무를 탐지할 수 있는 서열번호 37, 38, 96 및 97에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광탐침자를 포함하는, HLA 대립유전자를 실시간 PCR로 검출하기 위한 HLA 대립유전자용 검출세트에 관한 것이다.
본 발명의 HLA 대립유전자를 실시간 PCR로 검출하기 위한 HLA 대립유전자용 검출세트는 HLA 대립유전자에 특이적으로 결합하여 실시간 PCR을 통해 상기 유전자를 증폭할 수 있는 시발체와, 동시에 증폭 산물에 혼성가능하며 형광표지된 탐침자를 이용하여 실시간 PCR을 통해 HLA 대립유전자를 검출할 수 있다.
본 발명의 검출세트를 통해 검출할 수 있는 HLA 대립유전자는 HLA-A 또는 HLA-B일 수 있다.
본 발명에서 언급한 실시간 PCR 방법은 thermal cycler와 분광 형광 광도계가 일체화된 장치를 이용하여, 실시간으로 PCR 증폭산물의 생성과정을 모니터링하여 얻고자 하는 DNA의 양을 분석하는 방법을 의미한다. 실시간 PCR 방법은 PCR 증폭산물의 확인을 위한 전기영동이 필요 없으며, 증폭이 지수 함수적으로 일어나는 영역에서 증폭 산물의 양을 비교하여 더욱 정확한 정량이 가능한, 신속성과 정량성이 뛰어난 방법이다.
상기 시발체는 HLA 대립유전자를 종류별로 특이적으로 증폭시킬 수 있는 것으로, 일 구체예에 따르면, HLA 대립유전자의 다양성을 나타내는 위치를 기점으로 하여 17 내지 24 nt의 길이로 작제할 수 있다.
상기 시발체는 통상의 PCR을 통해 HLA-A 대립유전자, 예를 들어 HLA-A*01, A*02, A*03, A*11, A*23, A*24, A*25, A*26, A*29, A*30, A*31, A*32, A*33, A*34, A*43, A*66, A*68, A*69, A*74, 또는 A*80 등; HLA-B 대립유전자, 예를 들어, HLA-B*27, B60(*4001group), B61(*4002group), B40(*4008group), B*47, B841, B*13, B*44, B*45, B*49, B*50, B*54, B*59, B*55, B*56, B*38, B*39, B*67, B*14, B*07, B*08, B*18, B*37, B*35, B*53, B*51, B*52, B*57, B*58, B62(*1501group), B75(*1502group), B72(*1503group), B76(*1512group), B63(*1516group), B77(*1513group), B*46, B*48, B71(*1509group), B*78, B*81, B*82, B*83 등을 증폭시킬 수 있다. 보다 바람직하게는, 단일 실시간 PCR 또는 멀티플렉스 실시간 PCR을 통한 HLA 대립유전자 증폭에 사용될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 비특이적 반응이 일어나지 않는 조건을 고려하여 상기 시발체를 통해 증폭될 수 있는 증폭산물의 크기는 171 내지 813bp일 수 있으며, 이때 모든 시발체의 Tm 값은 58 내지 60 ℃인 것이 좋다.
상기 각 시발체가 특이적으로 증폭할 수 있는 HLA-A 대립유전자의 종류는 다음과 같다.
1)
- 시발체 쌍: 서열번호 14 및 29
- 검출 HLA 대립유전자: A*01
2)
- 시발체 쌍: 서열번호 30 및 2
- 검출 HLA 대립유전자: A*02
3)
- 시발체 쌍: 서열번호 7 및 4
- 검출 HLA 대립유전자: A*23, A*24
4)
- 시발체 쌍: 서열번호 32 및 24
- 검출 HLA 대립유전자: A*24
5)
- 시발체 쌍: 서열번호 1 및 13
- 검출 HLA 대립유전자: A*25, A*26, A*34, A*66
6)
- 시발체 쌍: 서열번호 3 및 22
- 검출 HLA 대립유전자: A*68, A*69
7)
- 시발체 쌍: 서열번호 28 및 17
- 검출 HLA 대립유전자: A*29
8)
- 시발체 쌍: 서열번호 9 및 17
- 검출 HLA 대립유전자: A*31
9)
- 시발체 쌍: 서열번호 1 및 17
- 검출 HLA 대립유전자: A*33
10)
- 시발체 쌍: 서열번호 25 및 17
- 검출 HLA 대립유전자: A*29, A*31, A*33, A*74
11)
- 시발체 쌍: 서열번호 10, 23 및 21
- 검출 HLA 대립유전자: A*01, A*03, A*25, A*26, A*34, A*66, A*43, A*11, A*29, A*30, A*31, A*32, A*33, A*74, A*80
12)
- 시발체 쌍: 서열번호 33 및 31
- 검출 HLA 대립유전자: A*25, A*26, A*43
13)
- 시발체 쌍: 서열번호 14 및 26
- 검출 HLA 대립유전자: A*36
14)
- 시발체 쌍: 서열번호 5 및 15
- 검출 HLA 대립유전자: A*03,A*24
15)
- 시발체 쌍: 서열번호 7 및 24
- 검출 HLA 대립유전자: A*24
16)
- 시발체 쌍: 서열번호 27 및 13
- 검출 HLA 대립유전자: A*26, A*43
17)
- 시발체 쌍: 서열번호 3 및 20
- 검출 HLA 대립유전자: A*11
18)
- 시발체 쌍: 서열번호 1 및 6
- 검출 HLA 대립유전자: A*68
19)
- 시발체 쌍: 서열번호 11 및 18
- 검출 HLA 대립유전자: A*30
20)
- 시발체 쌍: 서열번호 16 및 17
- 검출 HLA 대립유전자: A*32
21)
- 시발체 쌍: 서열번호 19 및 8
- 검출 HLA 대립유전자: A*32, A*74
22)
- 시발체 쌍: 서열번호 10, 23 및 22
- 검출 HLA 대립유전자: A*02, A*24, A*26, A*68, A*69
23)
- 시발체 쌍: 서열번호 12 및 4
- 검출 HLA 대립유전자: A*02
24)
- 시발체 쌍: 서열번호 33 및 34
- 검출 HLA 대립유전자: A*66
또한, 상기 각 시발체가 특이적으로 증폭할 수 있는 HLA-B 대립유전자의 종류는 다음과 같다.
1)
- 시발체 쌍: 서열번호 46 및 77
- 검출 HLA 대립유전자: B*27(*2701g)
2)
- 시발체 쌍: 서열번호 41 및 75
- 검출 HLA 대립유전자: B60(*4001g), B61(*4002g), B40(*4008g), B47(*4701g)
3)
- 시발체 쌍: 서열번호 49 및 78
- 검출 HLA 대립유전자: B57(*5701g), B58(*5801g), B63(*1516g)
4)
- 시발체 쌍: 서열번호 42 및 82
- 검출 HLA 대립유전자: B7(*0702g), B48(*4801g), B81(*8101g)
5)
- 시발체 쌍: 서열번호 52 및 83
- 검출 HLA 대립유전자: B13(*1301g))
6)
- 시발체 쌍: 서열번호 41 및 89
- 검출 HLA 대립유전자: B61(*4002g), B40(*4008g), B47(*4701g), B44(*4402g), B45(*4501g), B49(*4901g), B50(*5001g)
7)
- 시발체 쌍: 서열번호 47 및 79
- 검출 HLA 대립유전자: B44(*4402g), B45(*4501g)
8)
- 시발체 쌍: 서열번호 40 및 72
- 검출 HLA 대립유전자: B45(*4501g), B49(*4901g), B50(*5001g)
9)
- 시발체 쌍: 서열번호 48 및 72
- 검출 HLA 대립유전자: B54(*5401g), B59(*5901g), B55(*5001g), B56(5601g), B82(*8201g)
10)
- 시발체 쌍: 서열번호 53 및 76
- 검출 HLA 대립유전자: B38(*3801g), B39(*3901g), B67(*6701g)
11)
- 시발체 쌍: 서열번호 53 및 84
- 검출 HLA 대립유전자: B14(*1401g)
12)
- 시발체 쌍: 서열번호 48 및 82
- 검출 HLA 대립유전자: B40(*4025g), B7(*0702g), B81(*8101g)
13)
- 시발체 쌍: 서열번호 50 및 81
- 검출 HLA 대립유전자: B8(*0801g)
14)
- 시발체 쌍: 서열번호 39 및 74
- 검출 HLA 대립유전자: B18(*1801g)
15)
- 시발체 쌍: 서열번호 43 및 69
- 검출 HLA 대립유전자: B37(*3701g), B51(*5108g)
16)
- 시발체 쌍: 서열번호 50 및 70
- 검출 HLA 대립유전자: B35(*3501g), B53(*5301g)
17)
- 시발체 쌍: 서열번호 43 및 73
- 검출 HLA 대립유전자: B51(*5101g), B52(*5201g)
18)
- 시발체 쌍: 서열번호 54 및 86
- 검출 HLA 대립유전자: B57(*5701g)
19)
- 시발체 쌍: 서열번호 49 및 85
- 검출 HLA 대립유전자: B57(*5705g), B58(*5801g)
20)
- 시발체 쌍: 서열번호 47 및 71
- 검출 HLA 대립유전자: B13(*1304g), B61(*4003g), B62(*1501g), B72(*1503g), B76(*1512g)
21)
- 시발체 쌍: 서열번호 44 및 78
- 검출 HLA 대립유전자: B57(*5701g), B62(*1501g), B75(*1502g), B63(*1516g), B77(*1513g), B46(*4601g)
22)
- 시발체 쌍: 서열번호 51 및 81
- 검출 HLA 대립유전자: B42(*4201g)
23)
- 시발체 쌍: 서열번호 47 및 82
- 검출 HLA 대립유전자: B60(*4001g), B48(*4801g)
24)
- 시발체 쌍: 서열번호 45 및 71
- 검출 HLA 대립유전자: B39(*3907g), B75(*1521g)
25)
- 시발체 쌍: 서열번호 58 및 74
- 검출 HLA 대립유전자: B54(*5401g)
26)
- 시발체 쌍: 서열번호 55, 56, 51, 57 및 88
- 검출 HLA 대립유전자: B27(*2701g), B47(*4701g), B13(*1301g), B44(*4402g), B49(*4901g), B59(*5901g), B38(*3801g), B8(*0802g), B18(*1809g), B37(*3701g), B53(*5301g), B51(*5101g), B52(*5201g), B57(*5701g), B58(*5801g), B63(*1516g), B77(*1513g), B62(*1524g)
27)
- 시발체 쌍: 서열번호 55, 56, 51, 57 및 87
- 검출 HLA 대립유전자: B27(*2708g), B60(*4001g), B61(*4002g), B40(*4008g), B47(*4702g), B41(*4101g), B44(*4409g), B45(*4501g), B50(*5001g), B55(*5501g), B56(*5601g), B39(*3901g), B67(*6701g), B14(*1401g), B7(*0702g), B8(*0801g), B18(*1801g), B37(*3705g), B35(*3501g), B62(*1501g), B15(*1530g), B72(*1503g), B76(*1512g), B46(*4601g), B42(*4201g), B48(*4801g), B71(*1509g), B78(*7801g), B81(*8101g), B82(*8201g), B83(*8301g)
28)
- 시발체 쌍: 서열번호 48 및 73
- 검출 HLA 대립유전자: B56(*5605g), B51(*5101g), B71(*1509g), B78(*7801g)
29)
- 시발체 쌍: 서열번호 47 및 73
- 검출 HLA 대립유전자: B40(*4026g), B52(*5201g), B62(*15012)
30)
- 시발체 쌍: 서열번호 60 및 78
- 검출 HLA 대립유전자: B56(*5601g)
31)
- 시발체 쌍: 서열번호 59 및 76
- 검출 HLA 대립유전자: B39(*3910g), B67(*67011g)
32)
- 시발체 쌍: 서열번호 62 및 72
- 검출 HLA 대립유전자: B49(*4901g), B59(*5901g)
33)
- 시발체 쌍: 서열번호 61 및 76
- 검출 HLA 대립유전자: B39(*3901g), B67(*6701g), B51(*5115g)
34)
- 시발체 쌍: 서열번호 54 및 71
- 검출 HLA 대립유전자: B57(*5701g), B58(*5801g)
35)
- 시발체 쌍: 서열번호 41 및 71
- 검출 HLA 대립유전자: B61(*4003g), B13(*1304g), B72(*1546g)
36)
- 시발체 쌍: 서열번호 66 및 72
- 검출 HLA 대립유전자: B59(*5901g), B55(*5501g), B56(*5601g), B39(*3917g), B82(*8201g)
37)
- 시발체 쌍: 서열번호 61 및 90
- 검출 HLA 대립유전자: B60(*4001g), B62(*4002g), B40(*4008g), B41(*4101g), B55(*5504g), B56(*5605g), B8(*0801g), B35(*3502g), B15(*1530g), B42(*4201g), B48(*4801g), B71(*1509g), B78(*7801g)
38)
- 시발체 쌍: 서열번호 50 및 75
- 검출 HLA 대립유전자: B40(*4008g), B35(*3509g), B48(*4806g)
39)
- 시발체 쌍: 서열번호 60 및 80
- 검출 HLA 대립유전자: B54(*5401g), B55(*5501g), B67(*6701g), B7(*0719g), B42(*4201g)
40)
- 시발체 쌍: 서열번호 64 및 72
- 검출 HLA 대립유전자: B54(*5401g)
41)
- 시발체 쌍: 서열번호 45 및 76
- 검출 HLA 대립유전자: B38(*3801g), B39(*3901g)
42)
- 시발체 쌍: 서열번호 63 및 76
- 검출 HLA 대립유전자: B38(*3801g)
43)
- 시발체 쌍: 서열번호 60 및 91
- 검출 HLA 대립유전자: B7(*0702g)
44)
- 시발체 쌍: 서열번호 44 및 82
- 검출 HLA 대립유전자: B40(*4021g)
45)
- 시발체 쌍: 서열번호 41 및 92
- 검출 HLA 대립유전자: B47(*4701g)
46)
- 시발체 쌍: 서열번호 65 및 93
- 검출 HLA 대립유전자: B71(*1509g), B75(*1511g)
47)
- 시발체 쌍: 서열번호 67 및 94
- 검출 HLA 대립유전자: B46(*4601g)
48)
- 시발체 쌍: 서열번호 68 및 95
- 검출 HLA 대립유전자: B35(*3520g), B75(*1502g), B77(*1513g)
또한, 형광탐침자는 상기 시발체를 통해 증폭된 산물을 모두 검출할 수 있도록 HLA 유전자 중 다형성이 없는 부위를 선택하여 28 내지 35 nt의 길이로 작제할 수 있으며, 구체적으로, 서열번호 37, 38, 96, 또는 97에 기재된 서열을 가질 수 있다. 보다 구체적으로, HLA-A 대립유전자에 대해서는 서열번호 37 또는 38에 기재된 서열을 갖는 형광탐침자를 통해 증폭 유무를 검출할 수 있다. HLA-B 대립유전자에 대해서는 서열번호 96 또는 97에 기재된 서열을 갖는 형광탐침자를 통해 증폭 유무를 검출할 수 있다. 이때 형광탐침자의 Tm 값은 60 내지 65 ℃일 수 있다.
상기 형광탐침자는 탐침자의 5' 및 3' 말단에 형광 표지 인자로 표지되어 있는 것으로, HLA 대립유전자의 검출세트의 종류에 따라 각각의 탐침자는 서로 상이한 형광 표지 인자로 표지된다. 형광 표지 인자는 종류에 따라 여기 및 방사 파장이 다르며, 사용방법 또한 상이하므로, 이를 고려하여 하나의 PCR 반응물에 함께 사용하는 형광 표지 인자는 별개로 검출가능한지 여부를 판단하여 선택 사용하여야 하며, 서로 다른 색상을 사용할 수 있다. 상기 형광 표지 인자에 대한 구체적인 사항 및 선택은 본원 발명에 속하는 기술분야의 당업자들에게 자명한 것이다.
일 구체예에 따르면, 형광 표지 인자는 통상의 방법으로 본 발명에 따른 HLA 대립유전자 검사세트에 포함된 탐침자에 표지되며, 표지 방법은 인터킬레이팅(interchelating) 방법, TaqMan™ 프로브법 및 분자 비콘(Molecualr beacon) 방법들이 있다. 본 발명에서 사용하고 있는 TaqMan™ 프로브법은 5'말단을 형광 표지인자(FAM 등)로 3'말단을 quencher 물질(TAMRA 등)로 수식한 올리고뉴클레오티드(TaqManTM probe)를 PCR 반응액에 첨가하는 방법으로, TaqManTM 프로브가 어닐링 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브상의 형광억제물질(quencher)에 의해 형광 발생이 억제되고, 연장 단계에서 Taq DNA 중합효소가 갖는 5'→ 3'엑소뉴클레아제 활성으로 주형에 혼성화한 TaqManTM 프로브만 분해되어 형광색소가 프로브에서 유리됨으로써 형광억제물질(quencher)에 의한 억제가 해제되어 형광을 발하게 된다. 이때 상기 프로브는 5'말단이 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광 표지 인자로 표지되며, 3' 말단이 6-TAMRA, BHQ-1,2,3 및 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 형광억제물질(Quencher)로 표지될 수 있다.
또한, 본 발명의 검출세트는 검사의 신뢰도를 높이고, 실험 과정에서 사용되는 전체 PCR 튜브에 포함되어 주형 및 PCR 조건의 상태 확인을 위해 내부 양성대조군 유전자를 증폭하기 위한 시발체를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, β-글로빈, 인간 β-액틴, GAPDH(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase), 또는 Homo sapiens adenomatous polyposis coli (APC) 유전자 등을 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는, Homo sapiens adenomatous polyposis coli (APC) 유전자를 증폭할 수 있는 서열번호 35 및 36에 기재된 서열로 이루어진 시발체 쌍을 사용하는 것이 좋다.
따라서, 본 발명의 검출세트는 양성대조군 유전자의 증폭 유무를 탐지하기 위한 형광탐침자를 추가로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 98에 기재된 서열을 갖는 것을 사용할 수 있다.
일 구체예에 따르면, HLA-A 대립유전자를 위한 시발체 및 형광탐침자를 포함하는 검출세트의 상세한 사항은 다음과 같다. 또한, 모든 검출세트에서 양성대조군 시발체 쌍(서열번호 35 및 36)과 형광탐침자(서열번호 37, 38, 98)의 종류는 동일하다:
1)
- 시발체 쌍: 서열번호 14 및 29
- 증폭산물의 크기: 574 bp
2)
- 시발체 쌍: 서열번호 30 및 2
- 증폭산물의 크기: 813 bp
3)
- 시발체 쌍: 서열번호 7 및 4
- 증폭산물의 크기: 555 bp
4)
- 시발체 쌍: 서열번호 32 및 24
- 증폭산물의 크기: 462 bp
5)
- 시발체 쌍: 서열번호 1 및 13
- 증폭산물의 크기: 438 bp
6)
- 시발체 쌍: 서열번호 3 및 22
- 증폭산물의 크기: 445 bp
7)
- 시발체 쌍: 서열번호 28 및 17
- 증폭산물의 크기: 515 bp
8)
- 시발체 쌍: 서열번호 9 및 17
- 증폭산물의 크기: 481 bp
9)
- 시발체 쌍: 서열번호 1 및 17
- 증폭산물의 크기: 461 bp
10)
- 시발체 쌍: 서열번호 25 및 17
- 증폭산물의 크기: 414 bp
11)
- 시발체 쌍: 서열번호 10, 23 및 21
- 증폭산물의 크기: 446 bp
12)
- 시발체 쌍: 서열번호 33 및 31
- 증폭산물의 크기: 171 bp
13)
- 시발체 쌍: 서열번호 14 및 26
- 증폭산물의 크기: 563 bp
14)
- 시발체 쌍: 서열번호 5 및 15
- 증폭산물의 크기: 626 bp
15)
- 시발체 쌍: 서열번호 7 및 24
- 증폭산물의 크기: 398 bp
16)
- 시발체 쌍: 서열번호 27 및 13
- 증폭산물의 크기: 400 bp
17)
- 시발체 쌍: 서열번호 3 및 20
- 증폭산물의 크기: 518 bp
18)
- 시발체 쌍: 서열번호 1 및 6
- 증폭산물의 크기: 426 bp
19)
- 시발체 쌍: 서열번호 11 및 18
- 증폭산물의 크기: 560 bp
20)
- 시발체 쌍: 서열번호 16 및 17
- 증폭산물의 크기: 421 bp
21)
- 시발체 쌍: 서열번호 19 및 8
- 증폭산물의 크기: 494 bp
22)
- 시발체 쌍: 서열번호 10, 23 및 22
- 증폭산물의 크기: 446 bp
23)
- 시발체 쌍: 서열번호 12 및 4
- 증폭산물의 크기: 574 bp
24)
- 시발체 쌍: 서열번호 33 및 34
- 증폭산물의 크기: 175 bp
다른 구체예에 따르면, HLA-B 대립유전자를 위한 시발체 및 형광탐침자를 포함하는 검출세트의 상세한 사항은 다음과 같다. 또한, 각 검출세트의 양성대조군 시발체 쌍(서열번호 35 및 36)과 형광탐침자(서열번호 96, 97, 98)의 종류는 동일하다:
1)
- 시발체 쌍: 서열번호 46 및 77
- 증폭산물의 크기: 562bp
2)
- 시발체 쌍: 서열번호 41 및 75
- 증폭산물의 크기: 544bp
3)
- 시발체 쌍: 서열번호 49 및 78
- 증폭산물의 크기: 551bp
4)
- 시발체 쌍: 서열번호 42 및 82
- 증폭산물의 크기: 548bp
5)
- 시발체 쌍: 서열번호 52 및 83
- 증폭산물의 크기: 471bp
6)
- 시발체 쌍: 서열번호 41 및 89
- 증폭산물의 크기: 669bp
7)
- 시발체 쌍: 서열번호 47 및 79
- 증폭산물의 크기: 575bp
8)
- 시발체 쌍: 서열번호 40 및 72
- 증폭산물의 크기: 600bp
9)
- 시발체 쌍: 서열번호 48 및 72
- 증폭산물의 크기: 436bp
10)
- 시발체 쌍: 서열번호 53 및 76
- 증폭산물의 크기: 572bp
11)
- 시발체 쌍: 서열번호 53 및 84
- 증폭산물의 크기: 390bp
12)
- 시발체 쌍: 서열번호 48 및 82
- 증폭산물의 크기: 619bp
13)
- 시발체 쌍: 서열번호 50 및 81
- 증폭산물의 크기: 606bp
14)
- 시발체 쌍: 서열번호 39 및 74
- 증폭산물의 크기: 503bp
15)
- 시발체 쌍: 서열번호 43 및 69
- 증폭산물의 크기: 606bp
16)
- 시발체 쌍: 서열번호 50 및 70
- 증폭산물의 크기: 390bp
17)
- 시발체 쌍: 서열번호 43 및 73
- 증폭산물의 크기: 504bp
18)
- 시발체 쌍: 서열번호 54 및 86
- 증폭산물의 크기: 380bp
19)
- 시발체 쌍: 서열번호 49 및 85
- 증폭산물의 크기: 345bp
20)
- 시발체 쌍: 서열번호 47 및 71
- 증폭산물의 크기: 422bp
21)
- 시발체 쌍: 서열번호 44 및 78
- 증폭산물의 크기: 623bp
22)
- 시발체 쌍: 서열번호 51 및 81
- 증폭산물의 크기: 702bp
23)
- 시발체 쌍: 서열번호 47 및 82
- 증폭산물의 크기: 608bp
24)
- 시발체 쌍: 서열번호 45 및 71
- 증폭산물의 크기: 426bp
25)
- 시발체 쌍: 서열번호 58 및 74
- 증폭산물의 크기: 508bp
26)
- 시발체 쌍: 서열번호 55, 56, 51, 57 및 88
- 증폭산물의 크기: 180bp
27)
- 시발체 쌍: 서열번호 55, 56, 51, 57 및 87
- 증폭산물의 크기: 180bp
28)
- 시발체 쌍: 서열번호 48 및 73
- 증폭산물의 크기: 451bp
29)
- 시발체 쌍: 서열번호 47 및 73
- 증폭산물의 크기: 440bp
30)
- 시발체 쌍: 서열번호 60 및 78
- 증폭산물의 크기: 551bp
31)
- 시발체 쌍: 서열번호 59 및 76
- 증폭산물의 크기: 548bp
32)
- 시발체 쌍: 서열번호 62 및 72
- 증폭산물의 크기: 385bp
33)
- 시발체 쌍: 서열번호 61 및 76
- 증폭산물의 크기: 567bp
34)
- 시발체 쌍: 서열번호 54 및 71
- 증폭산물의 크기: 416bp
35)
- 시발체 쌍: 서열번호 41 및 71
- 증폭산물의 크기: 487bp
36)
- 시발체 쌍: 서열번호 66 및 72
- 증폭산물의 크기: 489bp
37)
- 시발체 쌍: 서열번호 61 및 90
- 증폭산물의 크기: 382bp
38)
- 시발체 쌍: 서열번호 50 및 75
- 증폭산물의 크기: 477bp
39)
- 시발체 쌍: 서열번호 60 및 80
- 증폭산물의 크기: 558bp
40)
- 시발체 쌍: 서열번호 64 및 72
- 증폭산물의 크기: 495bp
41)
- 시발체 쌍: 서열번호 45 및 76
- 증폭산물의 크기: 552bp
42)
- 시발체 쌍: 서열번호 63 및 76
- 증폭산물의 크기: 492bp
43)
- 시발체 쌍: 서열번호 60 및 91
- 증폭산물의 크기: 400bp
44)
- 시발체 쌍: 서열번호 44 및 82
- 증폭산물의 크기: 672bp
45)
- 시발체 쌍: 서열번호 41 및 92
- 증폭산물의 크기: 435bp
46)
- 시발체 쌍: 서열번호 65 및 93
- 증폭산물의 크기: 392bp
47)
- 시발체 쌍: 서열번호 67 및 94
- 증폭산물의 크기: 460bp
48)
- 시발체 쌍: 서열번호 68 및 95
- 증폭산물의 크기: 358bp
본 발명의 검출세트는 HLA 대립유전자의 종류에 특이적인 적어도 둘 이상의 시발체와 형광탐침자를 한 세트로 하여, 이들의 1종 이상의 조합을 동시에 사용하여 단일 또는 멀티플렉스 실시간 PCR을 수행할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 검출세트를 포함하는 HLA 대립유전자 형별 선별 키트에 관한 것이다.
본 발명의 HLA 대립유전자 형별 선별 키트를 통해 형별할 수 있는 HLA 대립유전자는 HLA-A 또는 HLA-B 대립유전자일 수 있다.
상기 시발체 쌍 및 형광탐침자는 하나의 반응 용기, 스트립 또는 마이크로플레이트에 패키징될 수 있으며, 당업계에 공지된 방법으로 패키징된다. 또한, 본 발명의 키트는 태그 폴리머라제(Taq polymerase), MgCl2를 포함한 반응 완충액, dNTP 및 안정화제(stabilizer)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있으며, 그 외에도 당업계에 공지된 다른 시약, 예컨대 실시간 PCR용 마스터 믹스를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 HLA 대립유전자 형별 선별 키트를 사용할 경우, 주조직적합성항원 복합체를 유전자 수준에서 구별할 수 있으므로, 보다 정확한 조직적합성 판단에 널리 활용될 수 있다.
본 발명은 또한
시료에서 추출한 DNA를 대상으로 본 발명의 HLA 대립유전자용 검출세트를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)을 실시하는 단계; 및
상기 실시간 PCR 결과를 확인하여 HLA 대립유전자를 형별하는 단계를 포함하는 HLA 대립유전자의 형별 방법에 관한 것이다.
본 발명의 HLA 대립유전자의 형별 방법을 단계별로 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
제1단계는 HLA 대립유전자 증폭을 위한 시발체를 제작하는 단계로, HLA 대립유전자의 다양성을 나타내는 위치를 기점으로 하여 17 내지 24 nt 길이의 시발체를 작제한다.
바람직하게는, 상기 시발체는 HLA-A 대립유전자를 선택적으로 증폭할 수 있는 서열번호 1 내지 34에 기재된 서열로부터 선택된 2종 이상을 사용하는 것이 좋다.
상기 시발체는 검사의 신뢰도를 높이고, 실험 과정에서 사용되는 전체 PCR 튜브에 포함되어 주형 및 PCR 조건의 상태 확인을 위해 내부 양성대조군 유전자를 증폭하기 위한 서열번호 35 및 36에 기재된 서열로 이루어진 시발체 쌍을 더 포함할 수 있다.
제2단계는 형광탐침자의 제작단계로 상기에서 작제된 시발체를 증폭하고, 이 증폭 산물을 검출할 수 있는 형광탐침자를 HLA 각 유전자별로 1 내지 2 종류 작제한다. 작제된 형광탐침자는 HLA 유전자 중 다형성이 없는 부위를 선택하여 28 내지 35 nt 길이로 작제한다.
구체적으로, HLA-A 대립유전자의 증폭 유무를 검출할 수 있는 서열번호 37 또는 38에 기재된 서열일 수 있다. 또한, HLA-B 대립유전자의 증폭 유무를 검출할 수 있는 서열번호 96 또는 97에 기재된 서열일 수 있다.
또한, 양성대조군 유전자의 증폭 유무를 탐지하기 위한 서열번호 98에 기재된 서열을 갖는 형광탐침자를 더 포함할 수 있다.
제3단계는 실시간 PCR을 통해 상기 시발체를 증폭하는 단계와 형광탐침자로 증폭 시 증폭 유무를 실시간 측정하는 단계가 동시에 이루어지는 단계이다.
본 발명의 HLA 대립유전자를 형별하는 방법에 있어, 단일 또는 멀티플렉스 실시간 PCR 반응 조건은 통상적인 조건을 취할 수 있다. 또한, 단일 실시간 PCR과 멀티플렉스 실시간 PCR 반응은 동일한 조건으로 수행될 수 있으며, 일 예로 초기 변성(initial denaturation)을 95℃에서 1분간 수행한 후, 변성(denaturation, 95℃에서 25초), 어닐링(annealing, 65℃에서 45초) 및 연장(extension, 72℃에서 30초) 을 총 40회 실시하는 조건을 취할 수 있다. 실시간 PCR 중 결합 및 연장단계에서 형광탐침자에 의해 생성된 형광을 측정한다.
또한, 본 발명의 HLA 대립유전자 형별 방법은 통상적인 실시간 PCR 방법 및 장치를 사용하여 실시할 수 있다. 상기 실시간 PCR 방법은 DNA 중합효소와 형광 공명 에너지 이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)의 원리에 의해 PCR의 매 주기마다 실시간으로 시행되는 형광을 검출하고 정량하는 방법이다. 이러한 방법은 특이적인 증폭 산물을 비 특이적인 증폭산물로부터 구별하여 확인할 수 있으며, 자동화된 양상으로 분석 결과를 쉽게 입수할 수 있다.
본 발명에 사용 가능한 실시간 PCR 기기로는 AB 사의 Real-time PCR 기기 7900, 7500, 7300, Roche 사의 LightCycler®80, Stratagene 사의 Mx3000p, 및 BioRad 사의 Chromo 4 기기 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. PCR 종료 시 이러한 실시간 PCR 기기의 레이저는 증폭된 PCR 산물의 형광탐침자에 표지된 형광 표지 인자를 감지하여 도 2 및 6과 같은 피크를 구현한다. 이에, 전기영동 과정 없이 기기에 내장된 프로그램을 실행시켜 자동으로 결과를 분석할 수 있다.
본 발명에서는 일 예로, 자동화 프로그램으로 KoRASTM (코젠바이오텍)을 사용할 수 있다. 상기 자동화 프로그램을 사용하는 경우 분석된 결과를 O/X 타입 또는 Ct 타입으로 나타낼 수 있어 비숙련자라도 분석된 결과를 쉽게 알 수 있다.
본 발명의 HLA 대립유전자용 검출세트 및 이를 이용한 HLA 대립유전자 형별 방법에 의해, 기존의 HLA 대립유전자를 식별하기 위한 PCR 과정을 현저하게 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라, 그 결과를 실시간으로 신속하게 확인할 수 있다. 이러한 방법은 전기영동법으로는 분별하기 어려웠던 적은 농도의 DNA 절편의 유무나 100 bp 미만의 PCR 산물의 확인을 레이저 감광으로 구분할 수 있고, PCR 산물에 의한 오염에 대한 우려가 없으며, 결과가 분석되어 검사가 종료되기까지 모든 시험과정이 자동 시스템으로 운영되기 때문에 시험자의 실수, 검사의 오류 등이 발생할 확률이 낮으며, 데이터의 수집, 분석이 용이하고 소요되는 검사시간과 노동력을 최소화시킬 수 있다는 점에서 매우 유용하다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 및 본 발명에 따르지 않는 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 특이 HLA-A 대립 유전자 증폭을 위한 시발체 제조
HLA-A 대립유전자의 다양성을 나타내는 위치 부위를 3' 말단으로 하여 17 mer에서 24 mer의 시발체를 작제하였다. 각 시발체에 사용한 염기서열은 다음과 같다:
시발체1: GGA GTA TTG GGA CCG GAA C(서열번호 1)
시발체2: GTG GCC CCT GGT ACC CGT (서열번호 2)
시발체3: ACG GAA TGT GAA GGC CCA G(서열번호 3)
시발체4: CCT CCA GGT AGG CTC TCA A (서열번호 4)
시발체5: AGC GAC GCC GCG AGC CA(서열번호 5)
시발체6: CGT CGT AGG CGT CCT GCC(서열번호 6)
시발체7: GGC CGG AGT ATT GGG ACG A(서열번호 7)
시발체8: CTG GTA CCG GCG GAG GAG(서열번호 8)
시발체9: GAT AGA GCA GGA GAG GCC T(서열번호 9)
시발체10: CGG AAT GTG AAG GCC CAC T (서열번호 10)
시발체11: CCC GGC CCG GCA GTG GA(서열번호 11)
시발체12: GTG GAT AGA GCA GGA GGG T(서열번호 12)
시발체13: ATG TAA TCC TTG CCG TCG TAA(서열번호 13)
시발체14: GGA CCA GGA GAC ACG GAA TA(서열번호 14)
시발체15: CAC TCC ACG CAC GTG CCA(서열번호 15)
시발체16: TCA CAG ACT GAC CGA GAG AG(서열번호 16)
시발체17: AGC GCA GGT CCT CGT TCA A(서열번호 17)
시발체18: CCG TCG TAG GCG TGC TGT(서열번호 18)
시발체19: CAC GCA GTT CGT GCG GTT T(서열번호 19)
시발체20: CTC TCT GCT GCT CCG CCG(서열번호 20)
시발체21: CAA GAG CGC AGG TCC TCG(서열번호 21)
시발체22: CAA GAG CGC AGG TCC TCG(서열번호 22)
시발체23: CGG AAT GTG AAG GCC CAG T(서열번호 23)
시발체24: CCT CCA GGT AGG CTC TCT G(서열번호 24)
시발체25: CCG AGT GGA CCT GGG GAC(서열번호 25)
시발체26: GAG CCA CTC CAC GCA CGT(서열번호 26)
시발체27: ACT CAC AGA CTG ACC GAG C(서열번호 27)
시발체28: AGG ATG GAG CCG CGG GCA(서열번호 28)
시발체29: AGG TAT CTG CGG AGC CCG(서열번호 29)
시발체30: TCC TCG TCC CCA GGC TCT(서열번호 30)
시발체31: GAG CCA CTC CAC GCA CCG(서열번호 31)
시발체32: ACC TGC GGA TCG CGC TCC G(서열번호 32)
시발체33: GGG TAC CAG CAG GAC GCT(서열번호 33)
시발체34: GGA CCA CTC CAC GCA CTC(서열번호 34)
또한, 양성대조군 표준유전자(Homo sapiens adenomatous polyposis coli (APC)) 증폭 유무를 위한 시발체35 및 36을 작제하였다.
시발체35: ATG ATG TTG ACC TTT CCA GGG(서열번호 35)
시발체36: ATT CTG TAA CTT TTC ATC AGT TGC(서열번호 36)
<실시예 2> 특이 HLA-B 대립 유전자 증폭을 위한 시발체 제조
HLA-B 대립유전자의 다양성을 나타내는 위치 부위를 3' 말단으로 하여 17 mer에서 24 mer의 시발체를 작제하였다. 각 시발체에 사용한 염기서열은 다음과 같다:
시발체39: GGC GCC GTG GAT AGA GCA A (서열번호 39)
시발체40: CCA CTC CAT GAG GTA TTT CC(서열번호 40)
시발체41: CGC CAC GAG TCC GAG GAA(서열번호 41)
시발체42: CGC GAG TCC GAG AGA GGA(서열번호 42)
시발체43: GCC GCG AGT CCG AGG AC(서열번호 43)
시발체44: CGC GAG TCC GAG GAT GGC(서열번호 44)
시발체45: GAC CGG AAC ACA CAG ATC TG(서열번호 45)
시발체46: ACC GGG AGA CAC AGA TCT G(서열번호 46)
시발체47: ACC GGG AGA CAC AGA TCT C (서열번호 47)
시발체48: GGA GTA TTG GGA CCG GAA C(서열번호 48)
시발체49: GAA CAT GAA GGC CTC CGC G(서열번호 49)
시발체50: GAC CGG AAC ACA CAG ATC TT(서열번호 50)
시발체51: GAC GAC ACC CAG TTC GTG A(서열번호 51)
시발체52: TAC CGA GAG AAC CTG CGC(서열번호 52)
시발체53: GAG CAG GAG GGG CCG GAA (서열번호 53)
시발체54: GGC CGG AGT ATT GGG ACG (서열번호 54)
시발체55: GAC GAC ACG CAG TTC GTG A(서열번호 55)
시발체56: GAC GAC ACG CTG TTC GTG A(서열번호 56)
시발체57: GAC GGC ACC CAG TTC GTG A(서열번호 57)
시발체58: GCG GGC GCC GTG GGT G(서열번호 58)
시발체59: GAC CGG AAC ACA CAG ATC TA(서열번호 59)
시발체60: CAG ATC TAC AAG GCC CAG G(서열번호 60)
시발체61: CCG AGA GAG CCT GCG GAA(서열번호 61)
시발체62: ACC GAG AGA ACC TGC GGA T(서열번호 62)
시발체63: GCG CTC CGC TAC TAC AAC(서열번호 63)
시발체64: ACG CCG CGA GTC CGA CAG G(서열번호 64)
시발체65: CTC CTG CTG CTC TCG GGA(서열번호 65)
시발체66: CGC CGC GAG TCC GAG AGA(서열번호 66)
시발체67: GAG ACA CAG AAG TAC AAG CG (서열번호 67)
시발체68: ACC GGA ACA CAC AGA TCT C(서열번호 68)
시발체69: CCT CCA GGT AGG CTC TGT C(서열번호 69)
시발체70: GGA GGA GGC GCC CGT CG (서열번호 70)
시발체71: CCT TGC CGT CGT AGG CGG(서열번호 71)
시발체72: ATC CTT GCC GTC GTA GGC T(서열번호 72)
시발체73: CGT TCA GGG CGA TGT AAT CT(서열번호 73)
시발체74: GCC GCG GTC CAG GAG CT(서열번호 74)
시발체75: GAG CCG CCG TGT CCG CG(서열번호 75)
시발체76: CGT GCC CTC CAG GTA GGT(서열번호 76)
시발체77: GAG CCA CTC CAC GCA CTC(서열번호 77)
시발체78: GAG CCA CTC CAC GCA CAG(서열번호 78)
시발체79: CCA GGT ATC TGC GGA GCG(서열번호 79)
시발체80: GAG CCA CTC CAC GCA CGT(서열번호 80)
시발체81: CCG CGC GCT CCA GCG TG(서열번호 81)
시발체82: TAC CAG CGC GCT CCA GCT(서열번호 82)
시발체83: GGG CCG CCT CCC ACT TGA(서열번호 83)
시발체84: CGT CGC AGC CAT ACA TCC A(서열번호 84)
시발체85: GCC ATA CAT CCT CTG GAT GA(서열번호 85)
시발체86: CGT CGC AGC CAT ACA TCA C(서열번호 86)
시발체87: CGC TCT GGT TGT AGT AGC C(서열번호 87)
시발체88: CGC TCT GGT TGT AGT AGC G(서열번호 88)
시발체89: CGC GCG CTG CAG CGT CTC(서열번호 89)
시발체90: GTC GTA GGC GTA CTG GTT(서열번호 90)
시발체91: GTC GTA GGC GTA CTG GTC(서열번호 91)
시발체92: CAA ACA TCC TCT GGA GGG T(서열번호 92)
시발체93: AGT CTG TGT GTT GGT CTT GT(서열번호 93)
시발체94: GCC GCG GTC CAG GAG CT(서열번호 94)
시발체95: GCC ATA CAT CCT CTG GAT GA(서열번호 95)
<실시예 3> 증폭 유무를 측정하기 위한 형광 탐침자의 제조
HLA-A 유전자의 증폭유무를 측정하기 위하여 보편적인 형광탐침자를 1종류 작제하고 양성대조군 표준유전자 증폭 유무를 측정할 수 있는 보편적인 형광탐침자 1종류를 작제하였다. 각 형광탐침자에 사용한 염기 서열과 형광물질은 다음과 같다:
HLA-A 형광탐침자 1: FAM 5'-CCC GGT TTC ATT TTC AGT TTA GGC CAA AAA T 3' BHQ1(서열번호 37)
HLA-A 형광탐침자 2: FAM 5'- GTT CTC ACA CCV(G/A/C) TCC AGA K(G/T)R(A/G)A TGTD(G/A/T)TG GCT 3' BHQ1(서열번호 38)
HLA-B 형광탐침자 3: FAM 5'-ACC CTC GAC CGG CGA GAG CCC CAG GCG CG 3' BHQ1 (서열번호 96)
HLA-B 형광탐침자 4: FAM 5'-AGA GCA R(A/G)GA GGG GCC GGA R(A/G)TA TTG GGA C 3'BHQ1 (서열번호 97)
양성대조군 표준유전자 형광탐침자 2: Cyanine 3 5'-ACA GAA CTA ACC TCC AAC CAA CAA TCA GC 3'BHQ2(서열번호 98)를 작제하였다.
<실시예 4> 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 HLA-A 및 HLA-B 대립 유전자 형별 분석
혈액에서 분리한 DNA를 2mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP와 HLA-A 및 HLA-B 대립유전자를 증폭할 수 있는 특이 시발체 쌍과 양성대조군 표준유전자를 증폭하기 위한 시발체 쌍, 증폭 유무를 측정하기 위한 HLA-A, B 형광탐침자, 양성대조군 표준유전자 형광탐침자, 중합반응 완충용액, 중합반응효소, DNA를 넣고 실시간 중합효소연쇄반응 기기를 이용하여 96?에서 1분간 1회, 96℃에서 25초 65℃에서 45초 72℃에서 30초로 40회 실시하고 실시간 증폭 유무 측정은 72℃에서 30초 되는 단계에서 측정하였다. 실시간 중합효소연쇄반응 기기에서의 증폭 유무 측정은 FAM은 490nm에서, Cyanine 3은 532nm 로 측정하였다. 이때 사용된 특이 시발체의 농도는 각각 1.0μM로 실시하였고 양성대조군은 0.5μM로 사용하였다. 또한 사용한 중합효소 연쇄반응 완충용액은 트리스 베이스(Tris base) 67mM, 암모늄 설페이트(ammonium sulphate) 16.6mM 트윈(Tween) 0.1%, MgCl2 0.2mM 이다. 사용된 dNTP 농도는 0.2mM로 사용하였고 Taq 폴리머라제(Biotools)를 사용하였다. 사용된 real time PCR 기기는 Bio-Rad의 제품을 사용하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 시작점이 측정된 튜브의 번호는 unkn-4(23.87), unkn-9(23.18), unkn-10(20.67), unkn-11(21.17), unkn-15(22), unkn-22(24.43)이 측정되었고, 이를 분석표를 보면 unkn-4, unkn-15, unkn-22이 증폭되어서 HLA-A24(*2402g)로 판명되었고 unkn-9, unkn-10, unkn-11이 증폭되어서 HLA-A33(*3301g)으로 판명되었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 시작점이 측정된 튜브의 번호는 D5 Target1(25.4), E2 Target1(25.34), E4 Target1(28.1)이 측정되었고, 이를 분석표를 보면 D5 Target1(25.4), E2 Target1(25.34), E4 Target1(28.1)이 증폭되어서 HLA-B51(*5101g)로 판명되었다.

Claims (11)

  1. HLA 대립유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 시발체를 포함하는 HLA 대립유전자용 검출세트에 있어서,
    상기 HLA 대립유전자의 증폭 유무를 탐지할 수 있는 서열번호 37, 38, 96 및 97에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광탐침자를 포함하는, HLA 대립유전자를 실시간 PCR로 검출하기 위한 HLA 대립유전자용 검출세트.
  2. 제1항에 있어서,
    HLA 대립유전자는 HLA-A 또는 HLA-B인 검출세트.
  3. 제1항에 있어서, 시발체는
    서열번호 14 및 29에 기재된 서열로 이루어진 HLA-A*01에 특이적인 시발체;
    서열번호 30 및 2에 기재된 서열로 이루어진 HLA-A*02에 특이적인 시발체;
    서열번호 7 및 4에 기재된 서열로 이루어진 HLA-A*23, 또는 HLA-A*24 에 특이적인 시발체;
    서열번호 32 및 24에 기재된 서열로 이루어진 HLA-A*24에 특이적인 시발체;
    서열번호 1 및 13에 기재된 서열로 이루어진 HLA-A*25, HLA-A*26, HLA-A*34, 또는 HLA-A*66에 특이적인 시발체;
    서열번호 3 및 22에 기재된 서열로 이루어진 HLA-A*68, 또는 HLA-A*69에 특이적인 시발체;
    서열번호 28 및 17에 기재된 서열로 이루어진 HLA-A*29에 특이적인 시발체;
    서열번호 9 및 17에 기재된 서열로 이루어진 HLA-A*31에 특이적인 시발체;
    서열번호 1 및 17에 기재된 서열로 이루어진 HLA-A*33에 특이적인 시발체;
    서열번호 25 및 17에 기재된 서열로 이루어진 HLA-A*29, HLA-A*31, HLA-A*33, 또는 HLA-A*74에 특이적인 시발체;
    서열번호 10, 23 및 21에 기재된 서열로 이루어진 HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*26, HLA-A*34, HLA-A*66, HLA-A*43, HLA-A*11, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*32, HLA-A*33, HLA-A*74, 또는 HLA-A*80에 특이적인 시발체;
    서열번호 33 및 31에 기재된 서열로 이루어진 HLA-A*25, HLA-A*26, 또는 HLA-A*43에 특이적인 시발체;
    서열번호 14 및 26에 기재된 서열로 이루어진 HLA-A*36에 특이적인 시발체;
    서열번호 5 및 15에 기재된 서열로 이루어진 HLA-A*03, 또는 HLA-A*24에 특이적인 시발체;
    서열번호 7 및 24에 기재된 서열로 이루어진 HLA-A*24에 특이적인 시발체;
    서열번호 27 및 13에 기재된 서열로 이루어진 HLA-A*26, 또는 HLA-A*43에 특이적인 시발체;
    서열번호 3 및 20에 기재된 서열로 이루어진 HLA-A*11에 특이적인 시발체;
    서열번호 1 및 6에 기재된 서열로 이루어진 HLA-A*68에 특이적인 시발체;
    서열번호 11 및 18에 기재된 서열로 이루어진 HLA-A*30에 특이적인 시발체;
    서열번호 16 및 17에 기재된 서열로 이루어진 HLA-A*32에 특이적인 시발체;
    서열번호 19 및 8에 기재된 서열로 이루어진 HLA-A*32, 또는 HLA-A*74에 특이적인 시발체;
    서열번호 10, 23 및 22에 기재된 서열로 이루어진 HLA-A*02, HLA-A*24, HLA-A*26, HLA-A*68, 또는 HLA-A*69에 특이적인 시발체;
    서열번호 12 및 4에 기재된 서열로 이루어진 HLA-A*02에 특이적인 시발체; 또는
    서열번호 33 및 34에 기재된 서열로 이루어진 HLA-A*66에 특이적인 시발체인 검출세트.
    서열번호 46 및 77 에 기재된 서열로 이루어진 B*27(*2701g)에 특이적인 시발체;
    서열번호 41 및 75 에 기재된 서열로 이루어진 B60(*4001g), B61(*4002g), B40(*4008g), B47(*4701g) 에 특이적인 시발체;
    서열번호 49 및 78 에 기재된 서열로 이루어진 B57(*5701g), B58(*5801g), B63(*1516g)에 특이적인 시발체;
    서열번호 42 및 82 에 기재된 서열로 이루어진 B7(*0702g), B48(*4801g), B81(*8101g) 에 특이적인 시발체;
    서열번호 52 및 83 에 기재된 서열로 이루어진 B13(*1301g)) 에 특이적인 시발체;
    서열번호 41 및 89 에 기재된 서열로 이루어진 B61(*4002g), B40(*4008g), B47(*4701g), B44(*4402g), B45(*4501g), B49(*4901g), B50(*5001g)에 특이적인 시발체;
    서열번호 47 및 79 에 기재된 서열로 이루어진 B44(*4402g), B45(*4501g) 에 특이적인 시발체;
    서열번호 40 및 72 에 기재된 서열로 이루어진 B45(*4501g), B49(*4901g), B50(*5001g)에 특이적인 시발체;
    서열번호 48 및 72 에 기재된 서열로 이루어진 B54(*5401g), B59(*5901g), B55(*5001g), B56(5601g), B82(*8201g)에 특이적인 시발체;
    서열번호 53 및 76 에 기재된 서열로 이루어진 B38(*3801g), B39(*3901g), B67(*6701g) 에 특이적인 시발체;
    서열번호 53 및 84 에 기재된 서열로 이루어진 B14(*1401g)에 특이적인 시발체;
    서열번호 48 및 82 에 기재된 서열로 이루어진 B40(*4025g), B7(*0702g), B81(*8101g) 에 특이적인 시발체;
    서열번호 50 및 81 에 기재된 서열로 이루어진 B8(*0801g)에 특이적인 시발체;
    서열번호 39 및 74 에 기재된 서열로 이루어진 B18(*1801g)에 특이적인 시발체;
    서열번호 43 및 69 에 기재된 서열로 이루어진 B37(*3701g), B51(*5108g)에 특이적인 시발체;
    서열번호 50 및 70 에 기재된 서열로 이루어진 B35(*3501g), B53(*5301g) 에 특이적인 시발체;
    서열번호 43 및 73 에 기재된 서열로 이루어진 B51(*5101g), B52(*5201g) 에 특이적인 시발체;
    서열번호 54 및 86 에 기재된 서열로 이루어진 B57(*5701g)에 특이적인 시발체;
    서열번호 49 및 85 에 기재된 서열로 이루어진 B57(*5705g), B58(*5801g) 에 특이적인 시발체;
    서열번호 47 및 71 에 기재된 서열로 이루어진 B13(*1304g), B61(*4003g), B62(*1501g), B72(*1503g), B76(*1512g)에 특이적인 시발체;
    서열번호 44 및 78 에 기재된 서열로 이루어진 B57(*5701g), B62(*1501g), B75(*1502g), B63(*1516g), B77(*1513g), B46(*4601g)에 특이적인 시발체;
    서열번호 51 및 81 에 기재된 서열로 이루어진 B42(*4201g)에 특이적인 시발체;
    서열번호 47 및 82 에 기재된 서열로 이루어진 B60(*4001g), B48(*4801g)에 특이적인 시발체;
    서열번호 45 및 71 에 기재된 서열로 이루어진 B39(*3907g), B75(*1521g)에 특이적인 시발체;
    서열번호 58 및 74 에 기재된 서열로 이루어진 B54(*5401g)에 특이적인 시발체;
    서열번호 55, 56, 51, 57 및 88 에 기재된 서열로 이루어진 B27(*2701g), B47(*4701g), B13(*1301g), B44(*4402g), B49(*4901g), B59(*5901g), B38(*3801g), B8(*0802g), B18(*1809g), B37(*3701g), B53(*5301g), B51(*5101g), B52(*5201g), B57(*5701g), B58(*5801g), B63(*1516g), B77(*1513g), B62(*1524g) 에 특이적인 시발체;
    서열번호 55, 56, 51, 57 및 87 에 기재된 서열로 이루어진 B27(*2708g), B60(*4001g), B61(*4002g), B40(*4008g), B47(*4702g), B41(*4101g), B44(*4409g), B45(*4501g), B50(*5001g), B55(*5501g), B56(*5601g), B39(*3901g), B67(*6701g), B14(*1401g), B7(*0702g), B8(*0801g), B18(*1801g), B37(*3705g), B35(*3501g), B62(*1501g), B15(*1530g), B72(*1503g), B76(*1512g), B46(*4601g), B42(*4201g), B48(*4801g), B71(*1509g), B78(*7801g), B81(*8101g), B82(*8201g), B83(*8301g) 에 특이적인 시발체;
    서열번호 48 및 73 에 기재된 서열로 이루어진 B56(*5605g), B51(*5101g), B71(*1509g), B78(*7801g)에 특이적인 시발체;
    서열번호 47 및 73 에 기재된 서열로 이루어진 B40(*4026g), B52(*5201g), B62(*15012)에 특이적인 시발체;
    서열번호 60 및 78 에 기재된 서열로 이루어진 B56(*5601g) 에 특이적인 시발체;
    서열번호 59 및 76 에 기재된 서열로 이루어진 B39(*3910g), B67(*67011g)에 특이적인 시발체;
    서열번호 62 및 72 에 기재된 서열로 이루어진 B49(*4901g), B59(*5901g)에 특이적인 시발체;
    서열번호 61 및 76 에 기재된 서열로 이루어진 B39(*3901g), B67(*6701g), B51(*5115g) 에 특이적인 시발체;
    서열번호 54 및 71 에 기재된 서열로 이루어진 B57(*5701g), B58(*5801g) 에 특이적인 시발체;
    서열번호 41 및 71 에 기재된 서열로 이루어진 B61(*4003g), B13(*1304g), B72(*1546g)에 특이적인 시발체;
    서열번호 66 및 72 에 기재된 서열로 이루어진 B59(*5901g), B55(*5501g), B56(*5601g), B39(*3917g), B82(*8201g) 에 특이적인 시발체;
    서열번호 61 및 90 에 기재된 서열로 이루어진 B60(*4001g), B62(*4002g), B40(*4008g), B41(*4101g), B55(*5504g), B56(*5605g), B8(*0801g), B35(*3502g), B15(*1530g), B42(*4201g), B48(*4801g), B71(*1509g), B78(*7801g)에 특이적인 시발체;
    서열번호 50 및 75 에 기재된 서열로 이루어진 B40(*4008g), B35(*3509g), B48(*4806g)에 특이적인 시발체;
    서열번호 60 및 80 에 기재된 서열로 이루어진 B54(*5401g), B55(*5501g), B67(*6701g), B7(*0719g), B42(*4201g)에 특이적인 시발체;
    서열번호 64 및 72 에 기재된 서열로 이루어진 B54(*5401g)에 특이적인 시발체;
    서열번호 45 및 76 에 기재된 서열로 이루어진 B38(*3801g), B39(*3901g) 에 특이적인 시발체;
    서열번호 63 및 76 에 기재된 서열로 이루어진 B38(*3801g) 에 특이적인 시발체;
    서열번호 60 및 91 에 기재된 서열로 이루어진 B7(*0702g)에 특이적인 시발체;
    서열번호 44 및 82 에 기재된 서열로 이루어진 B40(*4021g)에 특이적인 시발체;
    서열번호 41 및 92 에 기재된 서열로 이루어진 B47(*4701g)에 특이적인 시발체;
    서열번호 65 및 93 에 기재된 서열로 이루어진 B71(*1509g), B75(*1511g)에 특이적인 시발체;
    서열번호 67 및 94 에 기재된 서열로 이루어진 B46(*4601g)에 특이적인 시발체; 또는
    서열번호 68 및 95 에 기재된 서열로 이루어진 B35(*3520g), B75(*1502g), B77(*1513g)에 특이적인 시발체인 검출세트.
  4. 제1항에 있어서,
    형광탐침자는 5' 말단이 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광 표지 인자로 표지되며, 3' 말단이 6-TAMRA, BHQ-1,2,3 및 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 형광 억제물질(Quencher)로 표지된 것인 검출세트.
  5. 제1항에 있어서,
    양성대조군 유전자를 증폭하기 위한 서열번호 35 및 36에 기재된 서열로 이루어진 시발체를 더 포함하는 검출세트.
  6. 제1항에 있어서,
    양성대조군 유전자의 증폭 유무를 탐지하기 위한 서열번호 98에 기재된 서열로 이루어진 형광탐침자를 더 포함하는 HLA 대립유전자 검출세트.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 PCR은 1종 이상의 시발체 쌍 및 상기 형광탐침자를 이용하여 단일 또는 멀티플렉스 PCR로 실시하는 것인 검출세트.
  8. 제1항 기재의 검출세트를 포함하는 HLA 대립유전자 형별 선별 키트.
  9. 제8항에 있어서,
    HLA 대립유전자는 HLA-A 또는 HLA-B인 HLA 대립유전자 형별 선별 키트.
  10. 시료에서 추출한 DNA를 대상으로 제1항 기재의 HLA 대립유전자용 검출세트를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)을 실시하는 단계; 및
    상기 실시간 PCR 결과를 확인하여 HLA 대립유전자를 형별하는 단계를 포함하는 HLA 대립유전자의 형별 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    실시간 중합효소연쇄반응은 단일 또는 멀티플렉스 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)인 HLA 대립유전자의 형별 방법.
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