WO2018038352A2 - 치매진단용 자가항체 바이오마커 및 이를 이용한 치매진단 방법 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to an autoantibody biomarker for diagnosis of dementia and a dementia diagnosis method using the same.
  • Alzheimer's disease is the most common degenerative brain disease that causes dementia, the most common of age-related neurodegenerative diseases, accounting for more than 70% of dementia in elderly people, and develops very slowly and gradually. Is characteristic. Patients with Alzheimer's disease show general brain atrophy due to neuronal cell loss and neurological plaques and neurofibrillary tangles, which are characteristic lesions of brain tissue. These brain pathological findings are limited to the hippocampus and the olfactory olfactory cortex, which are the major brain areas that are primarily responsible for memory, but gradually expand to the entire brain, resulting in decreased memory, and as language progresses, It develops severely with various clinical symptoms such as thinking judgment ability, daily living ability deterioration and mental disorder.
  • Alzheimer's disease The mechanism and cause of Alzheimer's disease are not known.
  • excessive beta-amyloid is produced and deposited in the brain, which is thought to have a harmful effect on brain cells, but it is also thought to be a key mechanism of the onset of the disease, but also overphosphorylation, inflammation, and oxidative damage of tau protein.
  • Seems to be related to Nervous plaques (or senile plaques) are associated with the deposition of beta amyloid proteins, and nerve fiber bundles are associated with tau protein hyperphosphorylation.
  • Mild Cognitive Impairment refers to the pre-dementia of dementia, which has a reduced cognitive function, especially memory, compared to the same age group, but maintains the ability to perform everyday life. People with mild cognitive impairment are considered to be a high risk group with a high probability of progressing to Alzheimer's disease. Therefore, mild cognitive impairment is the earliest stage of early detection of Alzheimer's disease. Recently, a new type of Alzheimer's disease drug is more effective in the early stage than Alzheimer's disease. Early detection is of great clinical significance.
  • Alzheimer's disease is 33% for men aged 65 and 45%, and 45% for women, and about 8100 patients worldwide have Alzheimer's disease around the world by 2040, with an increase in life expectancy due to population growth and advances in medicine. It is estimated that more than 10,000 people will be diagnosed with early stages of Alzheimer's disease, and the appropriate treatment system for them will be enormous in terms of social and economic and social costs as well as the personal life aspects of healthy retirement. It can lead to savings.
  • Auto-antibodies are common in all human blood and are known to increase the amount of autoantibody with age. Autoantibodies are known to be involved in adaptive debris-clearance mechanisms as self-reactive antibodies. For example, in the case of autoimmune diseases, it is known that the disease is caused or worsened by autoantibodies against their own specific cells or tissue constructs.
  • autoantibodies and Alzheimer's disease have been closely linked.
  • autoantibodies to Pentatricopeptide repeat domain 2 (PTMD2) and FERM domain 8 (FRMD8) are present in the serum of Alzheimer's patients compared to the normal group, and the antigen-binding A ⁇ autoantibodies in Alzheimer's disease patients.
  • PTMD2 Pentatricopeptide repeat domain 2
  • FRMD8 FERM domain 8
  • biomarkers are readily identifiable from blood samples. Considering that patients with such disorders or diseases are generally older, the lumen puncture to obtain cerebrospinal fluid is of great potential and is not suitable for practice in ordinary small and medium hospitals. Blood samples can usually be obtained and tested easily and safely at home or in a general hospital, and do not require any expensive equipment or surgical procedures.
  • the present inventors have attempted to find an autoantibody capable of diagnosing and predicting the onset of mild cognitive impairment or Alzheimer's disease from the blood of a patient, and using a human proteome microarray, the patient with normal mild cognitive impairment and Alzheimer's disease.
  • Autoantibodies were profiled from serum and selected for Alzheimer's disease specific autoantibodies and verified by ELISA.
  • An object of the present invention is a hardness consisting of autoantibodies against any one or more autoantigens selected from the group consisting of ATCAY (Ataxia, Cerebellar, Cayman Type), NME7 (NME / NM23 Family Member 7) and NOL3 (Nucleolar Protein 3) To provide a biomarker for diagnosing cognitive impairment.
  • ATCAY Alpha-1, Cerebellar, Cayman Type
  • NME7 NME / NM23 Family Member 7
  • NOL3 Nucleolar Protein 3
  • Another object of the present invention is to provide a dementia diagnostic biomarker composed of autoantibodies against ATCAY (Ataxia, Cerebellar, Cayman Type) autoantigens.
  • Still another object of the present invention is to provide a mild cognitive impairment diagnosis kit comprising any one or more proteins selected from the group consisting of ATCAY, NME7 and NOL3.
  • Still another object of the present invention is to provide a dementia diagnostic kit comprising the ATCAY protein.
  • Still another object of the present invention is to provide a mild cognitive impairment diagnostic strip comprising at least one protein antibody selected from the group consisting of ATCAY, NME7 and NOL3.
  • Still another object of the present invention is to provide a dementia diagnostic strip comprising the ATCAY protein antibody.
  • an autoantibody against at least one autoantigen selected from the group consisting of ATCAY (Ataxia, Cerebellar, Cayman Type), NME7 (NME / NM23 Family Member 7) and NOL3 (Nucleolar Protein 3)
  • ATCAY Alpha-1, Cerebellar, Cayman Type
  • NME7 NME / NM23 Family Member 7
  • NOL3 Nucleolar Protein 3
  • the present invention also provides a diagnostic dementia biomarker composed of autoantibodies against the ATCAY (Ataxia, Cerebellar, Cayman Type) autoantigen.
  • the present invention provides a diagnostic kit for mild cognitive impairment comprising any one or more proteins selected from the group consisting of ATCAY, NME7 and NOL3.
  • the present invention also provides a dementia diagnostic kit comprising the ATCAY protein.
  • sample pad is absorbed biological sample
  • reaction membrane in which a test line and a control line including each antibody of the protein are treated;
  • It provides a diagnostic strip for mild cognitive impairment comprising a support.
  • sample pad is absorbed biological sample
  • Conjugate pads that bind to ATCAY (Ataxia, Cerebellar, Cayman Type);
  • reaction membrane in which a test line and a control line including each antibody of the protein are treated;
  • It provides a diagnostic strip for dementia comprising a support.
  • the present invention is to obtain the serum of patients with mild cognitive impairment and dementia of normal people over 60 years in the urban area (Ansan, Gyeonggi-do), high levels of anti-ATCAY IgG and anti-NME7 IgG in Alzheimer's disease group, hardness It was confirmed that the anti-PAIP2 IgG level was high in the cognitive impairment group, and the higher the two autoantibody positive detection rates combined with the anti-PAIP2 IgG and the anti-ATCAY IgG, the higher the risk of Alzheimer's disease, The higher the positive detection frequency (occurrence) of the two autoantibodies that combine anti-NOL3 IgG and anti-NME7 IgG, the higher the risk of memory mild cognitive impairment (aMCI), thereby providing a biomarker for diagnosing dementia. In the future, high-risk groups that are more likely to develop Alzheimer's disease can be screened in advance, which can be used to provide a basis for early diagnosis and treatment of Alzheimer's disease.
  • Occurrence is the number of positive autoantibodies out of 10.
  • Figure 2 is a comparison of the number of autoantibodies of five normal and five Alzheimer's disease patients.
  • Figure 4 compares the differences in the levels of these autoantibodies between normal cognitive, mild cognitive impairment and Alzheimer's disease groups after normalizing autoantibody levels to total IgG levels. It is a degree. Each dot represents one subject and a bar represents the mean standard deviation error.
  • 5A is a diagram showing the correlation between anti-ATCAY IgG level and MMSE score.
  • 5B is a diagram showing the correlation between anti-ATCAY IgG level and K-MoCA score.
  • Figure 6a is a graph showing the ROC curve of the anti-ATCAY IgG autoantibody between normal and mild cognitive impaired group.
  • Figure 6b is a graph showing the ROC curve of the anti-ATCAY IgG autoantibodies between normal cognitive group and Alzheimer's disease group.
  • the present invention provides a diagnostic kit for mild cognitive impairment comprising any one or more proteins selected from the group consisting of ATCAY (Ataxia, Cerebellar, Cayman Type), NME7 (NME / NM23 Family Member 7) and NOL3 (Nucleolar Protein 3). .
  • the ATCAY (Ataxia, Cerebellar, Cayman Type) preferably comprises an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • the NME7 (NME / NM23 Family Member 7) preferably comprises an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • the NOL3 (Nucleolar Protein 3) preferably comprises an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
  • the ATCAY (Ataxia, Cerebellar, Cayman Type) preferably comprises a nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 4, the NME7 (NME / NM23 Family Member 7) preferably comprises a nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 5 In addition, the NOL3 (Nucleolar Protein 3) preferably comprises a base sequence described in SEQ ID NO: 6, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a dementia diagnostic kit comprising ATCAY (Ataxia, Cerebellar, Cayman Type) protein.
  • the diagnostic kit of the present invention is a secondary to which a label that is developed by reaction with an antigen substrate specific for an autoantibody that specifically binds to at least one protein selected from the group consisting of ATCAY, NME7 and NOL3 is conjugated.
  • Antibody conjugates may include any one or more selected from the group consisting of a color substrate solution wash solution or an enzyme reaction stop solution to color reaction with the label.
  • any one or more proteins selected from the group consisting of ATCAY, NME7 and NOL3 is characterized in that bonded to a solid substrate, the solid substrate is nitrocellulose membrane, PVDF membrane, polyvinyl (Polyvinyl) or polystyrene (Polystyrene) It is any one selected from the group consisting of a well plate synthesized with a resin and a glass slide glass, but is not limited thereto.
  • the secondary antibody is preferably labeled with a conventional color developing agent that performs a color reaction, and includes HRP (Horseradish peroxidase), Alkaline phosphatase, Colloid gold, Poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate ), Any one label selected from the group consisting of Fluorescein and Dye such as Rhodamine-B-isothiocyanate (RITC) may be used.
  • HRP Haseradish peroxidase
  • Alkaline phosphatase Alkaline phosphatase
  • Colloid gold Poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate
  • Any one label selected from the group consisting of Fluorescein and Dye such as Rhodamine-B-isothiocyanate (RITC) may be used.
  • Substrates that induce color development were TMB (3,3 ', 5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] and OPD (o-phenylenediamine). It is any one selected from the group consisting of a) but is not limited thereto.
  • the kit may further include a washing solution for removing the remaining substances after the antigen-binding reaction and the detection reaction of the detector.
  • the wash solution preferably comprises phosphate buffer, NaCl and Tween 20, and a buffer solution (PBST) consisting of 0.02 M phosphate buffer, 0.13 M NaCl, and 0.05% Tween 20 is more preferred.
  • PBST buffer solution
  • the washing solution reacts the antibody to the antigen-antibody conjugate and then washes 3 to 6 times by adding an appropriate amount to the fixed body.
  • sulfuric acid solution H 2 SO 4
  • the present invention comprises the steps of: 1) subjecting a subject-derived sample to an antigen-antibody reaction by applying a sample derived from a test sample coated with at least one protein selected from the group consisting of ATCAY, NME7 and NOL3;
  • step 2) detecting the antigen-antibody reactant produced in step 1) using a color substrate solution;
  • a method for detecting autoantibodies to provide information for diagnosing mild cognitive impairment comprising determining a subject having an increased amount of detected autoantibody compared to a normal person as an individual having or likely to have a mild cognitive impairment To provide.
  • the present invention comprises the steps of 1) antigen-antibody reaction by adding a subject-derived sample to the ATCAY protein-coated fixture;
  • step 2) detecting the antigen-antibody reactant produced in step 1) using a color substrate solution;
  • the present invention provides a method for detecting autoantibodies to provide information for diagnosing dementia, including determining a subject having an increased amount of detected autoantibodies as a subject having or likely to have dementia.
  • the subject-derived sample is selected from the group consisting of human serum, plasma and blood, wherein the fixture is synthesized with nitrocellulose membrane, PVDF membrane, polyvinyl (Polyvinyl) or polystyrene (Polystyrene) resin And an antigen-antibody reaction, enzyme immunoassay, radioimmunoassay, sandwich assay, western blotting, immunoprecipitation, immunohistochemical staining, It is selected from the group consisting of fluorescence immunoassay, enzyme substrate coloration, antigen-antibody aggregation method, but is not limited thereto.
  • sample pad is absorbed biological sample
  • reaction membrane in which a test line and a control line including each antibody of the protein are treated;
  • It provides a diagnostic strip for mild cognitive impairment comprising a support.
  • sample pad is absorbed biological sample
  • Conjugate pads that bind to ATCAY (Ataxia, Cerebellar, Cayman Type);
  • reaction membrane in which a test line and a control line including each antibody of the protein are treated;
  • It provides a diagnostic strip for dementia comprising a support.
  • the biological sample is blood, and the reaction membrane is nitrocellulose, cellulose, poly ethylene terephthalate (PVDF), polyethersufone (PES), glass fiber or nylon, and the absorbent pad is cellulose, cotton or hydrophilic polymer. It is not limited to this.
  • the present inventors obtained the serum of patients with mild cognitive impairment and dementia over 60 years of age collected between 2009 and 2010 in urban areas (Ansan, Gyeonggi-do), education score, MMSE score , CDR scores and apoE genotyping, education scores and MMSE scores were low in patients with mild cognitive impairment and Alzheimer's disease. CDR scores were increased in patients with mild cognitive impairment and Alzheimer's disease. The proportion of genes was found to be high in patients with mild cognitive impairment and Alzheimer's disease (see Table 1).
  • the present inventors analyzed the autoantibody profile from the HuProt proteome microarray data in order to determine the type and distribution of autoantibodies in the serum of 10 Korean elderly aged 60 years or older, showing a positive autoantibody signal.
  • Protein probes detected autoantibodies against a total of 434 proteins, except for immunoglobulin molecules, and 269 (62%) of autoantibodies against a total of 434 proteins were individual specific. individual-specific) and five (1.2%) autoantibodies were detected in all sera (see FIG. 1 and Table 2).
  • the present inventors compared and analyzed the autoantibody profiles of five normal and five Alzheimer's disease patients from the HuProt proteome microarray data to search for the autoantibodies that are present in many patients with Alzheimer's disease.
  • the average number of autoantibodies in patients was 1.5 times higher than in normal subjects (see FIG. 2), and the high levels of AD-abundant autoantigens in patients with Alzheimer's disease were PAIP2, SURF5, HIST1H3F and C4orf40 (see Table 3).
  • DAVID Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery
  • many antigens present in Alzheimer's disease patients are characterized by non-membrane bounded organelles and protein localization. Antigenic protein associated with ErbB signaling pathway was confirmed (see Table 4 and Table 5).
  • the present inventors performed a HuProt proteome microarray to select 12 protein probes from the protein probes (probe) showing an autoantibody positive signal, and sex and age ( ⁇ ) for the 12 antigenic proteins selected as described above ATCAY, HIST1H3F, NME7, NOL3, and PAIP2 of these 12 antigenic proteins were analyzed using an indirect ELISA assay in a discovery set consisting of five normal and dementia patients each matching 2). Significantly high correlation between autoantibody ELISA AU value and chip data was confirmed (see Table 7).
  • the present inventors also found that the autoantibodies of five antigens of ATCAY, HIST1H3F, NME7, NOL3 and PAIP2, which showed a significantly high correlation between autoantibody ELISA AU values and chip data, were used as biomarkers for Alzheimer's and mild cognitive impairment.
  • Indirect enzyme immunoassay was performed on a validation sample set consisting of 44 patients, each of whom were matched with gender and age, amnestic mild cognitive impairment (aMCI), and Alzheimer's disease.
  • aMCI amnestic mild cognitive impairment
  • the levels of anti-ATCAY autoantibody IgG and anti-NME7 autoantibody IgG were statistically significant between normal, mild cognitive impairment (MCI) and Alzheimer's disease groups. There was a difference (see Table 8).
  • the anti-ATCAY IgG level was higher in the Alzheimer's disease group than the normal cognitive group, and the anti-NME7 IgG level was higher in the mild cognitive impairment group. Compared with the Alzheimer's disease group, the anti-PAIP2 IgG level was significantly higher in the mild cognitive impairment group than in the normal cognitive group.
  • the inventors of the present invention to determine whether the total IgG level of the normal group, mild cognitive impairment group, Alzheimer's disease group affects the level of autoantibodies (total IgG level) in serum samples was measured by indirect ELISA assay, the total IgG level in serum was not different between the three groups, normal group, mild cognitive impairment group, Alzheimer's disease group (see Figure 3), ATCAY , HIST1H3F, NME7, NOL3, and PAIP2 showed significant positive correlation with all five levels of autoantibodies.
  • the present inventors normalized the level of autoantibodies to the total IgG level, and then the difference of these autoantibody levels between normal cognitive group, mild cognitive impairment group and Alzheimer's disease group. In comparison, the significance of the anti-ATCAY IgG level difference between the normal cognitive group and the Alzheimer's disease group was confirmed to increase (see FIG. 4).
  • the present inventors confirmed the positive detection frequency (occurrence) of autoantibodies between normal cognitive group, mild cognitive impairment group and Alzheimer's disease group, and performed risk assessment using the anti-PAIP2 IgG and anti-ATCAY.
  • aMCI increased risk of cognitive impairment
  • the inventors confirmed that the ATCAY autoantibodies have a discrimination ability against the mild cognitive impairment group and the Alzheimer's disease group compared to the normal group (see Table 11, FIGS. 6A and 6B).
  • the levels of anti-ATCAY IgG and anti-NME7 IgG are high in the Alzheimer's disease group, and the levels of anti-PAIP2 IgG are high in the mild cognitive impairment group.
  • aMCI memory mild cognitive impairment
  • Example 1 normal person, Mild cognitive impairment Statistical data and apoE genotype analysis of Alzheimer's disease patients
  • the discovery set consisted of five normal and dementia patients each matched for sex and age ( ⁇ 2) for autoantibody profiling using human proteome microarrays.
  • the validation set consisted of 44 patients in each of the three groups: normal and matched gender and age, amnestic mild cognitive impairment (aMCI), and Alzheimer's patient for validation of AD-abundant autoantibodies. Included. Genotypes of sex, age, education score, Mini-Mental State Examination (MMSE), Clinical Dementia Rating (CDR) and apo E (Apolipoprotein E) for the patient group was analyzed in the following manner.
  • the education scores of patients were collected through questionnaires, and the questionnaire items were divided into elementary (6 years), middle (3 years), high (3 years), universities (4 years), and graduate (2 years). In addition, the total number of years of training was included and quantified.
  • the diagnosis of dementia was based on criteria set forth in the Diagnosis and Statistical Manual of Mental Disorders, fourth edition (DSM-IV), and mild cognitive impairment followed the Petersen / Winblad criteria.
  • MMSE scores range from 0 to 19 for moderate cognitive impairment, 20 to 23 for mild cognitive impairment, and 24 to 30 for normal. Digitized.
  • the Clinical Dementia Rating Scale used the Korean version of the expanded Clinical Dementia Rating scale, which was revised by Choi, Seong-Hye et al. (2001) .
  • the CDR score was 0 for normal cases and 0.5 for suspected dementia.
  • the score was 1 point for mild dementia and 2 points for severe dementia.
  • ApoE genotyping was performed according to the manufacturer's protocol using a SNaPshot system (Applied Biosystems, Forster City, Calif., USA).
  • ApoE is a representative risk gene that increases the risk of developing Alzheimer's disease
  • the E4 (ApoE4) genotype is about 2.7 times more likely to have one allele and 17.4 times more than two alleles in Korea. It is reported that the risk of Alzheimer's disease increases.
  • the analysis process was performed by using a first primer reaction using an extension primer, and primers and dNTPs not used for synthesis were removed, and the PCR products were purified. The product is again The second PCR reaction was performed by mixing with SNaPshot ready Reaction Mix and SNaPshot primer, and the PCR product was sequenced to determine the genotype.
  • Example 2 protein bodies Microarray ( proteome microarray With) Autoantibodies (autoantibody) analysis
  • HuProt microarray (CDI Laboratories, Baltimore, MD, USA), in which 19,000 protein antigens were spotted, was used to examine the autoantibody profile of human serum. Proteins deposited on protein microarray chips were expressed as GST-fusion proteins in yeast (Saccharomyces cerevisiae), each of which was duplicated. Microarray experiment was performed according to the manual provided by the manufacturer, the method is as follows. After blocking 3 hours at room temperature by adding 3 ml blocking buffer [5% BSA in TBST (TBS, 0.1% tween 20)] to the microarray chip, the serum sample was 1: 500 with blocking buffer. Dilution with 3 ml was added to the chip and reacted at room temperature for 1 hour.
  • 3 ml blocking buffer [5% BSA in TBST (TBS, 0.1% tween 20)
  • Spot intensity signal was defined as F635 median (the median of all the feature pixel intensities)-B635 (the median of all the background pixel intensities), and the intensity of specific protein probes (intensity) When the signal value is greater than 3 standard deviations of the intensity signal of all probes, the protein probe was considered as an autoantibody positive signal.
  • the average number of autoantibodies in patients with Alzheimer's disease was 98.0 ⁇ 39.9, which was 1.5 times higher than that in normal patients (66.0 ⁇ 39.6) (FIG. 2). It was confirmed that SURF5, HIST1H3F and C4orf40 (Table 3).
  • DAVID Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery
  • the autoantibodies were verified in a discovery set consisting of five normal and dementia patients each matching the sex and age ( ⁇ 2) of ⁇ Example 1>. It was performed by the method.
  • the dementia patients group consisted of five or more autoantibodies, and the differences between the normal group and the two or more cases. The presence of autoantibodies is highly likely to differ between the control group and the patient group.
  • CHAC2, HIST1H3F, NOL3, PAIP2, RAB11FIP1, and SURF5 probes were selected to distinguish between patient and control group.
  • Twelve antigen proteins selected as described above were measured for their autoantibody levels in the discovery sample set of ⁇ Example 1> by using an indirect enzyme immunoassay (indirect ELISA assay). Correlation of was compared. Twelve recombinant proteins (see Table 6) selected as described above in a 96-well plate (Thermo Scientific, Roskilde, Denmark) are suitable for coating buffer (0.05M Carbonate / bicarbonate buffer, pH9.6: SIGMA). After diluting to a concentration (1ug / ml), 100 ⁇ l of the diluted recombinant protein (recombinant protein) was added to each well and reacted overnight at 4 ° C.
  • buffer 0.05M Carbonate / bicarbonate buffer, pH9.6: SIGMA
  • the plate was washed with 300 ⁇ l PBST (prepared by adding 0.05% Tween 20 to PBS), followed by the addition of 200 ⁇ l blocking buffer (prepared by adding 5% skim milk powder to PBST) and reaction at room temperature for 2 hours. I was. After 2 hours, 50 ⁇ l of a serum sample dilution, washed with PBST and diluted 1:50 in blocking buffer, was added to the wells and allowed to react at room temperature for 2 hours. After 2 hours, the plate was washed with PBST and 100 ⁇ l of HRP conjugated secondary antibody (HRP-conjugated goat anti-human IgG H & L: Abcam, Cambridge, UK) diluted 1: 5000 was added to the blocking buffer.
  • HRP conjugated secondary antibody HRP-conjugated goat anti-human IgG H & L: Abcam, Cambridge, UK
  • the reaction was carried out for 1 hour at. After 1 hour, rinse with PBST and add 100 ⁇ l TMB (Invitrogen, Frederick, MD, USA) to the wells for 15 minutes at room temperature, then add 100 ⁇ l Stop solution (Invitrogen, Frederick, MD, USA) After stopping, the optical density (OD) value was measured at 450 nm using an ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, Calif., USA).
  • Human internal IgG (Genuine, Piscataway, NJ, USA) was used for internal variability test and normalization of autoantibody OD values.
  • the level of autoantibodies was human human IgG (Human whole IgG).
  • the normalized arbitrary unit (AU) was calculated and compared by dividing by the OD value of IgG) as follows.
  • ⁇ background OD OD value of well coated protein except serum sample
  • each group was matched with gender and age, amnestic mild cognitive impairment (aMCI), and Alzheimer's patient group. It was verified by an indirect ELISA assay as in Example 3-2.
  • a is a numerical representation of the difference between groups by the Kruskal-Wallis test.
  • the total IgG level in the serum sample was determined as follows. It was measured by an indirect ELISA assay.
  • the serum sample was diluted 1: 500,000 in the coating buffer, and then 100 ⁇ l each was added twice to a 96-well plate (duplicate) and reacted at room temperature for 2 hours. After 2 hours, washed three times with 300 ⁇ l PBST and 200 ⁇ l blocking buffer (1% BSA in PBS) was added to react for 2 hours at room temperature. After 2 hours, 100 ⁇ l of HRP conjugated secondary antibody (HRP-conjugated goat anti-human IgG H & L: Abcam, Cambridge, UK) washed with PBST and diluted 1: 10,000 in blocking buffer was added for 1 hour at room temperature. Reacted. After 1 hour, the reaction was washed and the reaction was performed at room temperature for 15 minutes by adding 100 ⁇ l TMB, and the OD value was measured at 450 nm within 30 minutes by adding 100 ⁇ l stop solution.
  • HRP conjugated secondary antibody HRP-conjugated goat anti-human IgG H & L: Abcam, Cambridge, UK
  • the total IgG level in serum was not different between the three groups of normal group, mild cognitive impairment group and Alzheimer's disease group (FIG. 3), but ATCAY, which was verified in ⁇ Example 3-3>, HIST1H3F, NME7, NOL3, and PAIP2 showed significant positive correlation with all five levels of autoantibodies.
  • MMSE score which is the simple mental state test obtained in Example 1, and K-MoCA score and CDR score for mild cognitive impairment examination, MMSE score Correlation between and the K-MoCA and CDR scores was confirmed by a Spearman rank correlation test.
  • autoantibodies The occurrence of autoantibodies was defined as positive values when the mean + 2 standard deviations of autoantibody AU / total IgG concentrations of 44 normal cognitive groups were above.
  • a represents the significant probability of difference in occurrence of autoantibodies between two groups by chi-square test or Fisher exact test. p value ⁇ 0.05 was regarded as a significant value. .
  • Receive operator characteristic (ROC) analysis was performed to assess whether ATCAY, NOL3 and NME7 autoantibodies can be distinguished from normal cognitive group (NC), mild cognitive impairment group (MCI) and Alzheimer's disease group (AD). .

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Abstract

본 발명은 치매 진단용 자가항체 바이오마커 및 이를 포함하는 치매 진단용 키트에 관한 것으로, 구체적으로 정상인에 비하여 치매 환자의 혈액 내에서 그 양이 특이적으로 증가하여 치매를 진단할 수 있는 ATCAY(Ataxia, Cerebellar, Cayman Type), NME7(NME/NM23 Family Member 7) 및 NOL3(Nucleolar Protein 3)를 각각 선택적으로 인식하는 자가항체 바이오마커, 이를 인식하는 항원을 포함한 치매 진단용 진단 키트에 관한 것이다. 본 발명의 치매 진단용 마커로 사용할 수 있는 ATCAY, NME7 및 NOL3의 자가항체를 포함하는 치매 진단 키트는 환자의 혈액을 이용하여 매우 간편하게 치매를 진단할 수 있어 치매의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

치매진단용 자가항체 바이오마커 및 이를 이용한 치매진단 방법
본 발명은 치매진단용 자가항체 바이오마커 및 이를 이용한 치매진단 방법에 관한 것이다.
알츠하이머질환(Alzheimer's disease)은 나이와 관련된 신경퇴행성 질환 중에 가장 대표적인 치매를 일으키는 가장 흔한 퇴행성 뇌질환으로, 노인들에게서 나타나는 치매의 약 70% 이상을 차지하는 질병이며, 매우 서서히 발병하여 점진적으로 진행되는 경과가 특징적이다. 알츠하이머질환 환자는 신경세포 소실로 인해 전반적인 뇌 위축 소견을 나타내며, 뇌 조직에서 특징적인 병변인 신경반(neuritic plaque)과 신경섬유다발(neurofibrillary tangle) 등이 관찰된다. 이러한 뇌 병리 소견은 질병 초기에는 주로 기억력을 담당하는 주요 뇌 부위인 해마와 내후각뇌피질 부위에 국한되어 나타나지만 점차 뇌 전체로 확장되어 초기에는 기억력 저하가 주로 나타나다가 병이 진행됨에 따라 언어능력, 사고판단력, 일상생활수행능력 등이 저하되고 정신이상행동 등 다양한 임상 증상이 나타나면서 중증으로 발전한다.
알츠하이머병의 발병 기전과 원인에 대해서는 정확히 알려져 있지않다. 현재 베타 아밀로이드(beta-amyloid)가 과량 만들어져 뇌에 침착되면서 뇌 세포에 유해한 영향을 주는 것이 발병의 핵심 기전으로 생각되나, 그 외에도 타우 단백질(tau protein)의 과인산화, 염증, 산화적 손상 등도 발병과 관련이 있는 것으로 보인다. 신경반(혹은 노인반)은 베타 아밀로이드 단백질의 침착과 관련되며, 신경섬유다발은 타우 단백질 과인산화와 연관이 있다.
경도인지장애(Mild Cognitive Impairment: MCI)는 동일 연령대에 비해 인지기능, 특히 기억력이 저하되어 있지만, 일상생활을 수행하는 능력은 유지하고 있는 치매의 전단계를 지칭한다. 경도인지장애가 나타나는 사람의 경우 알츠하이머병으로의 진행가능성이 매우 높은 고위험군으로 지목되고 있다. 따라서 경도인지장애는 알츠하이머병을 가장 조기에 발견할 수 있는 단계로써 최근 새로운 유형의 알츠하이머병 치료약물이 알츠하이머병의 말기보다 초기에 더욱 더 효과적이라는 점에서 치료효과의 극대화와 관련하여 경도인지장애의 조기 발견은 임상적으로 매우 중요한 의미를 가진다. 더구나 65세 이상의 남자의 경우 알츠하이머병의 유병률이 33%, 여자의 경우 45%에 이르며, 인구증가 및 의학의 발전으로 인한 평균수명의 증가와 함께 2040년 정도에는 전세계적으로 알츠하이머병 환자가 약 8100만여명에 이를 것으로 추산되는 바 조기에 알츠하이머병으로 진행가능성이 높은 군을 선별하고, 이에 대한 적절한 치료 체계를 확립하는 것은 건강한 노후생활이라는 개인의 삶적인 측면 뿐만 아니라 사회적으로도 경제적, 사회적 비용의 막대한 절감을 이끌어 낼 수 있는 것이다.
자가항체(auto-antibody)는 모든 인간의 혈액에서 보편적으로 존재하며, 나이가 들어감에 따라 자가항체의 양이 증가하는 것으로 알려져 있다. 자가항체는 자기 자신에 대항하는 (self-reactive) 항체로서 adaptive debris-clearance mechanism에 관여한다고 알려져 있다. 예를 들어, 자가면역질환의 경우에는, 자기 자신의 특정 세포나 조직 구성물에 대항하는 자가항체에 의해서 질환이 발생하거나 악화된다고 알려져 있다.
최근 자가항체와 알츠하이머가 밀접하게 연관되어 있음이 알려졌다. 예를 들어, PTCD2(Pentatricopeptide repeat domain 2), FRMD8(FERM domain containing 8)에 대한 자가항체들이 정상군에 비해 알츠하이머 환자 혈청에서 더 많이 존재하고, 항원에 결합되어 있는 Aβ자가항체가 알츠하이머 질환 환자의 혈청과 뇌척수액에서 증가한다는 보고들이 있다. 그래서 최근에는 자가항체가 알츠하이머 질환의 진단과 발병예측을 위한 바이오마커로 주목을 받고 있다.
현재까지 경도인지장애 또는 알츠하이머병의 진단은 주로 보호자를 통한 병력 청취 및 신경심리학적 평가, 인지테스트, 뇌영상검사등에 의존하고 있으나, 이들의 발병 유무 및 진행 정도를 파악할 수 있으며 비교적 간편하고 신뢰할 수 있는 바이오마커의 개발이 절실한 실정이다. 바이오마커는 혈액샘플로부터 쉽게 확인가능한 것이 가장 이상적이다. 상기 장애 또는 질환을 가진 환자가 일반적으로 고령임을 고려하면, 뇌척수액을 얻기 위한 요부천공(lumber puncture)은 그 잠재적 위험성이 크며 또한 보통의 중소형병원에서 실시하기가 적당하지 않다. 혈액샘플은 보통 가정이나 일반 병원에서 쉽고 안전하게 수득하여 검사가 가능하며, 여타 고가의 장비나 수술적 처치등을 요구하지 않는다.
이에, 본 발명자들은 환자의 혈액으로부터 경도인지장애 또는 알츠하이머 질환의 진단 및 발병 예측이 가능한 자가항체를 발굴하고자 하였으며, 인간 단백질체 마이크로어레이(human proteome microarray)를 이용하여 정상인 경도인지장애환자 및 알츠하이머 환자의 혈청으로부터 자가항체를 프로파일링(profiling)하고 알츠하이머 질환 특이적인 자가항체를 선별하여 ELISA를 통하여 검증하였다.
본 발명의 목적은 ATCAY(Ataxia, Cerebellar, Cayman Type), NME7(NME/NM23 Family Member 7) 및 NOL3(Nucleolar Protein 3)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 자가항원에 대항하는 자가항체로 구성된 경도인지장애 진단 바이오마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 ATCAY(Ataxia, Cerebellar, Cayman Type) 자가항원에 대항하는 자가항체로 구성된 치매 진단 바이오마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 ATCAY, NME7 및 NOL3로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 포함하는 경도인지장애 진단 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 ATCAY 단백질을 포함하는 치매 진단 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 ATCAY, NME7 및 NOL3로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 항체를 포함하는 경도인지장애 진단 스트립을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 ATCAY 단백질 항체를 포함하는 치매 진단 스트립을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, ATCAY(Ataxia, Cerebellar, Cayman Type), NME7(NME/NM23 Family Member 7) 및 NOL3(Nucleolar Protein 3)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 자가항원에 대항하는 자가항체로 구성된 경도인지장애 진단 바이오마커를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 ATCAY(Ataxia, Cerebellar, Cayman Type) 자가항원에 대항하는 자가항체로 구성된 치매 진단 바이오마커를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 ATCAY, NME7 및 NOL3로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 포함하는 경도인지장애 진단 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 ATCAY 단백질을 포함하는 치매 진단 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 생물학적 시료가 흡수되는 샘플패드(sample pad);
ATCAY(Ataxia, Cerebellar, Cayman Type), NME7(NME/NM23 Family Member 7) 및 NOL3(Nucleolar Protein 3)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상과 결합하는 결합 패드(conjugate pad);
상기 단백질의 각 항체를 포함하는 반응선(test line) 및 대조선(control line)이 처리되어 있는 반응막(membrane);
잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드(absorption pad); 및
지지체를 포함하는 경도인지장애 진단용 스트립을 제공한다.
또한 본 발명은 생물학적 시료가 흡수되는 샘플패드(sample pad);
ATCAY(Ataxia, Cerebellar, Cayman Type)와 결합하는 결합 패드(conjugate pad);
상기 단백질의 각 항체를 포함하는 반응선(test line) 및 대조선(control line)이 처리되어 있는 반응막(membrane);
잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드(absorption pad); 및
지지체를 포함하는 치매 진단용 스트립을 제공한다.
본 발명은 도시지역(경기도 안산)을 대상으로 60세 이상의 정상인, 경도인지장애 및 치매 환자의 혈청을 얻어, 알츠하이머질환군에서 항-ATCAY IgG와 항-NME7 IgG 양(level)이 높게 나타나며, 경도인지장애군에서 항-PAIP2 IgG 양(level)이 높게 나타남을 확인하고, 항-PAIP2 IgG와 항-ATCAY IgG를 결합한 두 개 자가항체 양성탐지빈도(occurrence)가 높을수록 알츠하이머 질환의 위험이 높아지고, 항-NOL3 IgG와 항-NME7 IgG를 결합한 두개 자가항체의 양성탐지빈도(occurrence)가 높을수록 기억형 경도인지장애(aMCI)의 위험이 높아짐을 확인하여, 이에 대한 치매 진단용 바이오마커를 제공함으로써, 향후 알츠하이머병으로 발병할 가능성이 높은 고위험군을 미리 선별하여, 알츠하이머병을 조기에 진단하고 치료할 기반을 제공하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 60세 이상의 한국인 노인 10명의 혈청 내 존재하는 자가항체의 분포를 나타낸 도이다. Occurrence(빈도)는 전체 10명 중에서 양성자가항체(positive autoantibody)의 수를 의미한다.
도 2는 정상인 5명과 알츠하이머 질환 환자 5명의 자가항체 수를 비교한 도이다.
도 3은 정상군, 경도인지장애군, 알츠하이머질환군에서 혈청 샘플 내 전체 IgG 양(total IgG level)을 나타낸 도이다. 일원분산분석(one-way ANOVA test)을 수행한 결과, 세 그룹간 전체 IgG 양(total IgG level)은 차이가 없었다(p=0.227). 두번 반복해서 실험한 결과의 도이며, 각각의 점은 한 대상(subject)을 나타내고, 바(bar)는 평균 표준편차 오류(error)를 나타낸다.
도 4는 자가항체 양(level)을 전체 IgG 양(total IgG level)으로 정규화(normalization)한 후, 정상인지군, 경도인지장애군 및 알츠하이머질환군 간에 이들 자가항체 양(level)의 차이를 비교한 도이다. 각각의 점은 한 대상(subject)을 나타내고, 바(bar)는 평균 표준편차 오류(error)를 나타낸다.
도 5a는 항-ATCAY IgG 양(level)과 MMSE 점수와의 연관성(correlation)을 나타낸 도이다.
도 5b는 항-ATCAY IgG 양(level)과 K-MoCA 점수와의 연관성(correlation)을 나타낸 도이다.
도 6a는 정상인지군과 경도인지장애군 간에 항-ATCAY IgG 자가항체의 ROC 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 6b는 정상인지군과 알츠하이머질환군 간에 항-ATCAY IgG 자가항체의 ROC 곡선을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 ATCAY(Ataxia, Cerebellar, Cayman Type), NME7(NME/NM23 Family Member 7) 및 NOL3(Nucleolar Protein 3)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 포함하는 경도인지장애 진단 키트를 제공한다.
상기 ATCAY(Ataxia, Cerebellar, Cayman Type)는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하며, 상기 NME7(NME/NM23 Family Member 7) 은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하며, 상기 NOL3(Nucleolar Protein 3)은 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 ATCAY(Ataxia, Cerebellar, Cayman Type)는 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 포함하는 것이 바람직하며, 상기 NME7(NME/NM23 Family Member 7)은 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 포함하는 것이 바람직하며, 상기 NOL3(Nucleolar Protein 3)는 서열번호 6으로 기재되는 염기서열을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은 ATCAY(Ataxia, Cerebellar, Cayman Type) 단백질을 포함하는 치매 진단 키트를 제공한다.
또한, 본 발명의 진단 키트는 상기 ATCAY, NME7 및 NOL3로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 자가항체에 특이적인 항원 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(Conjugate); 상기 표지체와 발색반응 할 발색기질 용액 세척액 또는 효소반응 정지 용액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
또한, 상기 ATCAY, NME7 및 NOL3로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질은 고체기판에 결합되는 것을 특징으로 하며, 상기 고체기판은 니트로셀룰로오스 막, PVDF 막, 폴리비닐(Polyvinyl) 또는 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트 및 유리로된 슬라이드 글라스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하나 이에 한정되지 않는다.
상기 2차 항체는 발색반응을 하는 통상의 발색제로 표지되는 것이 바람직하며, HRP(Horseradish peroxidase), 알칼리성 인산분해효소(Alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(Coloid gold), FITC(Poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(Rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질(Fluorescein) 및 색소(Dye)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 표지체가 사용될 수 있다.
상기 발색을 유도하는 기질은 TMB(3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 및 OPD(o-phenylenediamine)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하나 이에 한정되지 않는다.
상기 키트는 상기 항원항체 결합 반응 및 검출체의 결합반응 후, 남은 물질들을 제거하기 위한 세척액을 추가로 포함할 수 있다. 상기 세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02 M 인산염 완충용액, 0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20(Tween 20)으로 구성된 완충용액(PBST)이 더욱 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 세척액은 항원항체 결합반응 후 항원항체 결합체에 검출체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응 정지용액은 바람직하게는 황산 용액(H2SO4)이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 1) ATCAY, NME7 및 NOL3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질이 코팅된 고정체에 피검체 유래 시료를 가하여 항원-항체 반응시키는 단계;
2) 상기 단계 1)을 통해 생성된 항원-항체 반응물을 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계; 및
3) 상기 검출된 자가항체량이 정상인에 비해 증가된 피검체를 경도인지장애에 걸렸거나 걸릴 가능성이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는 경도인지장애 진단의 정보를 제공하기 위해 자가 항체를 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) ATCAY 단백질이 코팅된 고정체에 피검체 유래 시료를 가하여 항원-항체 반응시키는 단계;
2) 상기 단계 1)을 통해 생성된 항원-항체 반응물을 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계; 및
3) 상기 검출된 자가항체량이 정상인에 비해 증가된 피검체를 치매에 걸렸거나 걸릴 가능성이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는 치매 진단의 정보를 제공하기 위해 자가 항체를 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 피검체 유래 시료는 인간의 혈청, 혈장 및 혈액으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하며, 상기 고정체는 니트로셀룰로오스 막, PVDF 막, 폴리비닐(Polyvinyl) 또는 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하며, 상기 항원-항체 반응은 효소면역분석법, 방사능면역분석법, 샌드위치 측정법, 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법, 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 생물학적 시료가 흡수되는 샘플패드(sample pad);
ATCAY(Ataxia, Cerebellar, Cayman Type), NME7(NME/NM23 Family Member 7) 및 NOL3(Nucleolar Protein 3)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상과 결합하는 결합 패드(conjugate pad);
상기 단백질의 각 항체를 포함하는 반응선(test line) 및 대조선(control line)이 처리되어 있는 반응막(membrane);
잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드(absorption pad); 및
지지체를 포함하는 경도인지장애 진단용 스트립을 제공한다.
또한, 본 발명은 생물학적 시료가 흡수되는 샘플패드(sample pad);
ATCAY(Ataxia, Cerebellar, Cayman Type)와 결합하는 결합 패드(conjugate pad);
상기 단백질의 각 항체를 포함하는 반응선(test line) 및 대조선(control line)이 처리되어 있는 반응막(membrane);
잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드(absorption pad); 및
지지체를 포함하는 치매 진단용 스트립을 제공한다.
상기 생물학적 시료는 혈액이며, 상기 반응막은 니트로셀룰로스, 셀룰로스, PVDF(Poly ethylene terephthalate), PES(polyethersufone), 유리섬유 또는 나일론이며, 상기 흡수패드는 셀룰로오스, 무명 또는 친수다공성 폴리머인 것을 특징으로 하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 도시지역(경기도 안산)을 대상으로 2009년부터 2010년 사이에 수집된 60세 이상의 정상인, 경도인지장애 및 치매 환자의 혈청을 얻어, 교육 점수, MMSE 점수, CDR 점수 및 apoE의 유전자형 분석을 하여, 교육 점수 및 MMSE 점수는 경도인지장애 환자그룹와 알츠하이머병 환자그룹에서 낮게 나타났으며, CDR 점수는 경도인지장애 환자와 알츠하이머병 환자에서 증가하였고, apo E4 대립 유전자의 비율은 경도인지장애 환자와 알츠하이머병 환자에서 높게 나타남을 확인하였다(표 1 참조).
또한, 본 발명자들은 60세 이상의 한국인 노인 10명의 혈청 내 존재하는 자가항체의 종류와 분포를 알아보기 위하여 HuProt proteome microarray 데이터로부터 자가항체 프로파일(profile)을 분석하여, 자가항체 양성 신호(signal)를 보이는 단백질 프로브(probe)들은 면역글로불린(immunoglobulin) 분자들을 제외하고 총 434개 단백질에 대한 자가항체가 검출되었고, 총 434개 단백질에 대한 자가항체 중 269개(62%)의 자가항체는 개인특이적(individual-specific)이었고, 5개(1.2%)의 자가항체는 모든 혈청에서 검출됨을 확인하였다(도 1 및 표 2 참조).
또한, 본 발명자들은 알츠하이머 질환 환자에 많이 존재하는 자가항체(AD-abundant autoantibody)를 탐색하기 위해 HuProt proteome microarray 데이터로부터 정상인 5명과 알츠하이머 질환 환자 5명의 자가항체 프로파일(profile)을 비교 및 분석하여 알츠하이머 질환 환자의 평균 자가항체 개수는 정상인에 비해 1.5배 많으며(도 2 참조), 알츠하이머 질환 환자에서 많이 존재하는(AD-abundant) 자가항원은 PAIP2, SURF5, HIST1H3F 및 C4orf40임을 확인하였고(표 3 참조), DAVID(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)를 사용한 기능(functional enrichment) 분석을 통해 알츠하이머 질환 환자에서 많이 존재하는 항원들은 막이 없는 것과 결합한 세포소기관(non-membrane bounded organelle)과 단백질 위치(protein localization)와 연관성이 높으며, ErbB 신호전달경로(signaling pathway)와 관련된 항원단백질임을 확인하였다(표 4 및 표 5 참조).
또한, 본 발명자들은 HuProt proteome microarray를 수행하여 자가항체 양성 신호를 나타내는 단백질 프로브(probe) 중에서 12개의 단백질 프로브(probe)들을 선별하고, 상기와 같이 선별된 12개 항원단백질에 대하여 성별과 나이(±2)를 매칭한 정상과 치매환자 각각 5명으로 구성된 발굴용 샘플(discovery set)에서 간접효소면역측정법(indirect ELISA assay)을 이용하여, 이들 12개 항원단백질 중 ATCAY, HIST1H3F, NME7, NOL3, PAIP2에 대한 자가항체 ELISA AU 값과 칩 데이터 간에 유의적으로 높은 연관성(correlation)을 확인하였다(표 7 참조).
또한, 본 발명자들은 자가항체 ELISA AU 값과 칩 데이터 간에 유의적으로 높은 연관성(correlation)을 보인 ATCAY, HIST1H3F, NME7, NOL3 및 PAIP2 5개 항원의 자가항체들이 알츠하이머와 경도인지장애에 대한 바이오마커로서 활용될 수 있는지를 성별과 나이를 매칭한 정상군, 기억형 경도인지장애군(amnestic mild cognitive impairment, aMCI) 및 알츠하이머 환자군 각각 44명으로 구성된 검증용 샘플(validation sample set)에서 간접효소면역측정법(indirect ELISA assay)을 이용하여, 항-ATCAY 자가항체 IgG 양(level)과 항-NME7 자가항체 IgG 양(level)이 정상인지군, 경도인지장애군 (MCI), 알츠하이머질환군 사이에서 통계적으로 유의한 차이가 있음을 확인하였고(표 8 참조), 특히 항-ATCAY IgG 양(level)은 정상인지군에 비해 알츠하이머질환그룹에서 높게 나타나며, 항-NME7 IgG 양(level)은 경도인지장애군에 비해 알츠하이머질환그룹에서 유의적으로 높게 나타나며, 항-PAIP2 IgG 양(level)은 정상인지군에 비해 경도인지장애군에서 유의적으로 높은 것을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 정상군, 경도인지장애군, 알츠하이머질환군의 전체 IgG 양(total IgG level)이 자가항체 양(level)에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 혈청 샘플 내 전체 IgG 양(total IgG level)을 직접효소면역측정법(indirect ELISA assay)으로 측정하여, 혈청 내 전체 IgG 양(total IgG level)은 정상군, 경도인지장애군, 알츠하이머질환군 세 그룹 간에 차이는 없었으나(도 3 참조), ATCAY, HIST1H3F, NME7, NOL3, PAIP2 5개 자가항체 양(level)과는 모두 유의적으로 양의 연관을 보였으며, 특히 항-NME7 IgG 양(level)은 전체 IgG 양(total IgG level)과 높은 연관성(rs=0.473, p<0.001)을 나타냄을 확인하였다(표 9 참조).
또한, 본 발명자들은 자가항체 양(level)을 전체 IgG 양(total IgG level)으로 정규화(normalization)한 후, 정상인지군, 경도인지장애군 및 알츠하이머질환군 간에 이들 자가항체 양(level)의 차이를 비교하여, 정상인지군과 알츠하이머질환군 간의 항-ATCAY IgG 양(level)차에 대한 유의성이 높아진 것을 확인하였다(도 4 참조).
또한, 본 발명자들은 간이정신상태검사인 MMSE 점수와, 경도인지장애 검진을 위한 K-MoCA 점수 및 CDR 점수로 MMSE 점수와 K-MoCA 및 CDR 점수와의 연관성(correlation)을 스피어맨 순위 상관 시험(Spearman rank correlation test)을 통해 확인하여, 항-ATCAY IgG 양(level)과 인지기능이 연관성이 있음을 확인하였다 (도 5a 및 5b 참조).
또한, 본 발명자들은 정상인지군, 경도인지장애군 및 알츠하이머질환군 간에 자가항체의 양성탐지 빈도(occurrence)를 확인하고 이를 이용한 위험도평가(risk assessment)를 실시하여, 항-PAIP2 IgG와 항-ATCAY IgG를 결합한 두 개 자가항체 양성탐지빈도(occurrence)가 높을수록 알츠하이머 질환의 위험이 높아지고, 항-NOL3 IgG와 항-NME7 IgG를 결합한 두개 자가항체의 양성탐지빈도(occurrence)가 높을수록 기억형 경도인지장애(aMCI)의 위험이 높아짐을 확인하였다(표 10 참조).
아울러, 본 발명자들은 ATCAY 자가항체가 정상인지군과 비교하여 경도인지장애군 및 알츠하이머질환군에 대해 변별력이 있음을 확인하였다(표 11, 도 6a 및 6b 참조).
따라서, 알츠하이머질환군에서 항-ATCAY IgG와 항-NME7 IgG 양(level)이 높게 나타나며, 경도인지장애군에서 항-PAIP2 IgG 양(level)이 높게 나타남을 확인하고, 항-PAIP2 IgG와 항-ATCAY IgG를 결합한 두개 자가항체 양성탐지빈도(occurrence)가 높을수록 알츠하이머 질환의 위험이 높아지고, 항-NOL3 IgG와 항-NME7 IgG를 결합한 두개 자가항체의 양성탐지빈도(occurrence)가 높을수록 기억형 경도인지장애(aMCI)의 위험이 높아짐을 확인하여, PAIP2, ATCAY, NOL3, NME7, HIST1H3F의 자가항원에 대항하는 자가항체가 기억형 경도인지장애(aMCI) 또는 알츠하이머 진단을 위한 바이오마커로 활용될 수 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 정상인, 경도인지장애 환자, 알츠하이머병 환자의 통계학적 자료 및 apoE 유전자형 분석
도시지역(경기도 안산)을 대상으로 population-based geriatric cohort study를 위해 2009년부터 2010년 사이에 수집된 60세 이상의 정상인, 경도인지장애 및 치매환자의 혈청을 얻어, 상기 샘플을 발굴용 샘플(discovery set)과 검증용 샘플(validation set)로 구성하였다. 발굴용 샘플(discovery set)은 인간 단백질체 마이크로어레이(human proteome microarray)를 이용한 자가항체 프로파일링을 위하여 성별과 나이(±2)를 매칭한 정상과 치매환자 각각 5명으로 구성되었으며, 검증용 샘플(validation set)은 AD-abundant 자가항체의 검증(validation)을 위하여 성별과 나이를 매칭한 정상군, 기억형 경도인지장애군(amnestic mild cognitive impairment, aMCI) 및 알츠하이머 환자군 등 3그룹별로 각각 44명을 포함하였다. 상기 환자그룹에 대해 성별, 나이, 교육 점수(education score), 간이정신상태검사(Mini-Mental State Examination: MMSE), 치매임상평가척도(Clinical Dementia Rating: CDR) 및 apo E(Apolipoprotein E)의 유전자형을 하기와 같은 방법으로 분석하였다.
구체적으로, 설문지를 통해 환자의 교육 점수를 수집하였으며, 설문 항목은 초(6년), 중(3년), 고(3년), 대학교(4년), 대학원(2년) 순으로 나누어져 있으며 전체 교육연수를 합하여 기재하도록 하여 수치화하였다. 치매 진단은 Diagnosis and Statistical Manual of Mental Disorders, fourth edition (DSM-IV)에서 제시한 기준을 따랐으며, 경도인지장애는 Petersen/Winblad criteria를 따랐다. 신경정신학적 검사로는 간이정신상태검사(Mini-Mental State Examination, MMSE)와 몬트리올 인지평가(Montreal Cognitive Assessment, MoCA)가 시행되었으며, 본 연구에서는 MMSE-KC(Korean version of MMSE in the Korean version of CERAD Assessment Packet)와 K-MoCA를 사용하였다. MMSE 점수는 중도인지장애의 경우 0~19점, 경도인지장애의 경우 20~23점, 정상인의 경우 24~30점으로 그 정도에 따라 수치화하였다. 치매임상평가척도(Clinical Dementia Rating Scale, CDR)는 최성혜 등(2001)에 의하여 번안된 한국판 expanded Clinical Dementia Rating 척도를 사용하였으며, CDR 점수의 경우, 정상의 경우는 0점, 치매가 의심스러운 경우 0.5점, 경도치매의 경우 1점, 중증 치매의 경우 2점 이상으로 수치화하였다. ApoE 유전자형 분석은 SNaPshot system(Applied Biosystems, Forster City, CA, USA)을 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다. ApoE는 알츠하이머의 발병 위험을 높이는 대표적인 위험 유전자로 E4(ApoE4) 유전자형을 가지는 경우 우리나라에서 이 유전자형이 없는 사람에 비해 그 대립 유전자를 1개 가지고 있을 경우 약 2.7배, 2개 가지고 있는 경우 17.4배 정도 알츠하이머병의 위험성이 높아지는 것으로 보고되고 있다. 간략히 그 분석 과정을 설명하면, 엑스텐션프라이머(extension primer)를 이용하여 1차 PCR 반응을 한 후, 합성에 이용되지 않는 프라이머와 dNTP를 제거하고 그 PCR 산물을 정제하였다. 그 산물은 다시 SNaPshot ready Reaction Mix 및 SNaPshot primer와 섞어 2차 PCR 반응을 수행하고 이 PCR 산물을 서열분석하여 유전자형을 결정하였다.
그 결과, 교육 점수 및 MMSE 점수는 각각 통계학적인 유의성을 가지면서 MCI 환자그룹와 알츠하이머병 환자그룹에서 낮게 나타났으며, CDR 점수는 통계학적인 유의성을 가지면서 MCI 환자와 알츠하이머병 환자에서 증가하였고, apoE의 유전자형 분석결과, apo E4 대립 유전자의 비율이 MCI 환자와 알츠하이머병 환자에서 높게 나타났다(표 1).
[표 1]
정상인, MCI 환자, 알츠하이머병 환자의 통계학적 자료 및 apoE 유전자형 분석
Figure PCTKR2017004836-appb-I000001
모든 수치는 평균(mean)±표준편차(SD)로 나타내었다.
a는 독립표본 t-검정(independent t-test)에 의해 그룹들 간 차이가 유의함을 나타낸다.
b는 일원분산분석(one-way ANOVA test)에 의해 그룹들 간 차이가 유의함을 나타낸다.
< 실시예 2> 단백질체 마이크로어레이 ( proteome microarray )를 이용한 자가항체 (autoantibody) 분석
60세 이상의 한국인 노인 10명의 혈청 내 존재하는 자가항체의 종류와 분포를 알아보기 위하여 HuProt proteome microarray 데이터로부터 자가항체 프로파일(profile)을 하기와 같은 방법으로 분석하였다.
구체적으로, 사람 혈청(serum)의 자가항체 프로파일을 조사하기 위해 19,000여개의 단백질 항원이 점적되어(spotted) 있는 HuProt microarray (CDI Laboratories, Baltimore, MD, USA)를 사용하였다. 단백질 마이크로어레이 칩에 점적된 단백질들은 yeast(Saccharomyces cerevisiae)에서 GST-fusion protein으로 발현되었으며, 각각의 단백질들은 중복(duplicate)으로 찍혀있다. 마이크로어레이 실험방법은 제조사에서 제공한 매뉴얼에 따라 진행하였으며, 그 방법은 하기와 같다. 마이크로어레이 칩에 3ml blocking buffer[5% BSA in TBST (TBS, 0.1% tween 20)]를 첨가하여 실온에서 2시간 동안 블로킹(blocking) 시킨 후, 혈청 샘플을 블로킹버퍼(blocking buffer)로 1:500으로 희석하여 3ml을 칩에 첨가하고 실온에서 1시간 반응시켰다. 다음으로 칩에 4ml TBST 버퍼를 첨가하여 10분간 실온에서 흔들어서(shaking incubation) 칩을 씻어주며, 이를 3회 반복한 후, 블로킹버퍼(blocking buffer)에 1:1000으로 희석한 Cy5-conjugated goat anti-human IgG (H+L) (Abcam, Cambridge, UK)를 3ml 처리하고, TBST로 3회 씻어주고 말린 뒤 마이크로어레이 칩을 GenePix 4000B Florescence scanner (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 635nm 파장에서 스캐닝하여 이미지를 TIFF format으로 저장하였다.
스캐닝된 이미지는 GenePix Pro software 6.0 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)과 Huprot proteome microarray 제조사에서 제공한 GAL file을 이용하여 점적된 단백질 스팟(spot)들의 정보를 맞추고(align) 정량(quantitation)하였다. 스팟의 신호강도(Spot intensity signal)값은 F635 median(the median of all the feature pixel intensities) - B635 (the median of all the background pixel intensities)으로 정의하였고, 특정 단백질 프로브(probe)의 신호강도(intensity signal)값이 모든 프로브(probe)들의 신호강도(intensity signal)값의 3 시그마 (3 standard deviations)보다 클 경우 그 단백질 프로브(probe)를 자가항체 양성 신호(autoantibody positive signal)로 간주하였다.
그 결과, 자가항체 양성 신호(signal)를 보이는 단백질 프로브(probe)들은 면역글로불린(immunoglobulin) 분자들을 제외하고 총 434개 단백질에 대한 자가항체가 검출되었고, 개인당 평균 82.0±41.1개의 자가항체가 존재하는 것을 확인하였고, 총 434개 단백질에 대한 자가항체 중 269개(62%)의 자가항체는 개인특이적(individual-specific)이었고, 5개(1.2%)의 자가항체는 모든 혈청에서 검출됨을 확인하였다(도 1 및 표 2).
[표 2]
60세 이상 한국인 노인의 혈청 내에 많이 존재하는 자가항체들
Figure PCTKR2017004836-appb-I000002
*는 occurrence가 7이상임을 나타낸다.
<실시예 3> 알츠하이머 질환 연관 자가항체의 분석
<3-1> 알츠하이머 질환 환자의 자가항체 및 항원 확인
알츠하이머 질환 환자에 많이 존재하는 자가항체(AD-abundant autoantibody)를 탐색하기 위하여 상기 <실시예 2>와 같은 방법으로 HuProt proteome microarray 데이터로부터 정상인 5명과 알츠하이머 질환 환자 5명의 자가항체 프로파일(profile)을 비교 및 분석하였다.
그 결과, 알츠하이머 질환 환자의 평균 자가항체 개수는 98.0±39.9로 정상인 (66.0±39.6)에 비해 1.5배 많았으며(도 2), 알츠하이머 질환 환자에서 많이 존재하는(AD-abundant) 자가항원은 PAIP2, SURF5, HIST1H3F 및 C4orf40 임을 확인하였다 (표 3). 또한 DAVID(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)를 사용한 기능(functional enrichment) 분석을 통해 알츠하이머 질환 환자에서 많이 존재하는 항원들은 유전자 생산물의 위치에 대하여 다루는 세포요소 온톨로지(GO cellular component)에서 막이 없는 것과 결합한 세포소기관(non-membrane bounded organelle)과 연관성이 높으며, 생물학적으로 다양한 목적에 대하여 다루는 생물학적 과정 온톨로지(GO biological process)에서 단백질 위치(protein localization)와 연관성이 높으며, KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 생화학 경로(pathway) 관련 데이터베이스에서 ErbB 신호전달경로(signaling pathway)와 관련된 항원단백질이 유의적으로 분포하고 있음을 확인하였다(표 4 및 표 5).
[표 3]
알츠하이머 질환 환자에서 많이 존재하는 자가항원
Figure PCTKR2017004836-appb-I000003
*는 알츠하이머 occurrence가 3이상이며 Delta가 2이상임을 나타낸다.
[표 4]
DAVID를 사용하여 알츠하이머 질환 환자들에서 자가항원의 enrichment 분석한 결과
Figure PCTKR2017004836-appb-I000004
*는 Delta가 1이상임을 나타낸다.
**는 Enrichment score가 1.5초과임을 나타낸다.
***는 p<0.05임을 나타낸다.
[표 5]
알츠하이머 질환 환자에서 자가항체와 관련된 KEGG 경로(pathway)
Figure PCTKR2017004836-appb-I000005
*는 Delta가 1이상임을 나타낸다.
**는 p<0.05임을 나타낸다.
<3-2> 정상과 알츠하이머 질환 환자들로 구성된 발굴용 샘플(discovery sample set)에서 자가항체의 검증
HuProt proteome microarray 결과를 검증하기 위하여 상기 <실시예 1>의 성별과 나이(±2)를 매칭한 정상과 치매환자 각각 5명으로 구성된 발굴용 샘플(discovery set)에서 자가항체의 검증을 하기와 같은 방법으로 수행하였다.
구체적으로, HuProt proteome microarray를 수행하여 자가항체 양성 신호를 나타내는 단백질 프로브(probe) 중에서 12개의 단백질 프로브(probe)들을 선별하였다. 첫번째로 5명으로 구성된 치매환자군에서 자가항체 occurrence가 3 이상 이면서 정상군과 occurrence가 2 이상 차이를 보여, 자가항체 존재 유무가 대조군과 환자군에서 차이를 보일 가능성이 높으므로, 자가항체 존재유무를 통해서 환자군과 대조군의 구분이 가능한 CHAC2, HIST1H3F, NOL3, PAIP2, RAB11FIP1 및 SURF5 프로브(probe)들을 선별하였으며, 두번째로 자가항체 존재유무보다는 자가항체 양(level)의 차이를 통해서 대조군과 환자군의 구분이 가능한 정상군이나 대조군의 구별없이 자가항체 occurrence가 7 이상을 보이는 ATCAY, CLC, GPBP1, SPANXN2 및 TPM3 프로브(probe)들을 선별하였으며, 마지막으로 알츠하이머 혹은 신경퇴행과 관련된 기능을 수행하거나 기타 neuroimmunity에 관여할 것으로 추정되는 NME7 프로브(probe)와 같은 12개의 단백질 프로브(probe)를 선별하였다(표 6).
상기와 같이 선별된 12개 항원단백질에 대하여 상기 <실시예 1>의 발굴용 샘플(discovery sample set)에서 간접효소면역측정법(indirect ELISA assay)을 이용하여 이들의 자가항체 레벨을 측정하였고 칩 데이터와의 연관성(correlation)을 비교하였다. 96-웰 플레이트 (Thermo Scientific, Roskilde, Denmark)에 상기와 같이 선별된 12개의 재조합단백질(recombinant protein) (표 6 참조)을 coating buffer (0.05M Carbonate/bicarbonate buffer, pH9.6: SIGMA)에 적당한 농도(1ug/ml)로 희석한 후, 희석한 재조합단백질(recombinant protein)을 각 웰당 100㎕씩 첨가하여 4℃에서 하룻밤 동안(overnight) 반응시켰다. 그 후, 플레이트를 300㎕ PBST (PBS에 0.05% Tween 20을 첨가하여 제조)로 씻어 낸 후, 200㎕ blocking buffer (PBST에 5% 탈지분유를 첨가하여 제조)를 첨가하고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 2시간 후, PBST로 씻어 내고 blocking buffer에 1:50으로 희석한 혈청 샘플 희석액 50㎕를 웰에 첨가하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 2시간 후, 플레이트를 PBST로 씻어내고 blocking buffer에 1:5000으로 희석한 HRP가 접합된 이차 항체(HRP-conjugated goat anti-human IgG H&L: Abcam, Cambridge, UK) 100㎕를 첨가한 후, 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 후, PBST로 씻어내고 웰에 100㎕ TMB (Invitrogen, Frederick, MD, USA)를 첨가하여 상온에서 15분 동안 반응시킨 뒤 100㎕ Stop solution (Invitrogen, Frederick, MD, USA)을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 450nm에서 optical density (OD) 값을 측정하였다. Internal variability test와 자가항체 OD값의 정규화(normalization)를 위해 10㎍ 사람의 IgG(Human whole IgG: GenScript, Piscataway, NJ, USA)를 사용하였으며, 자가항체 양(level)은 사람의 IgG(Human whole IgG)의 OD값으로 나누어 하기와 같은 식으로 normalized arbitrary unit (AU)를 산출하여 비교하였다.
Autoantibody AU=
[Autoantibody OD - background OD]/[human whole IgG OD - background OD].
※ background OD: 혈청 샘플을 제외한 단백질이 코팅된 웰의 OD 값
상기와 같이 얻어진 ELISA AU 값과 마이크로어레이 칩 데이터의 연관성(correlation)은 스피어맨 상관분석(Spearman correlation analysis)으로 분석하였다.
그 결과, 이들 12개 항원단백질 중 ATCAY, HIST1H3F, NME7, NOL3, PAIP2에 대한 자가항체 ELISA AU 값과 칩 데이터 간에 유의적으로 높은 연관성(correlation)을 확인하였으며(표 7), 상기 5개의 단백질들은 단백질 칩 결과가 ELISA실험에서도 재현됨을 확인하였다.
[표 6]
선별된 12개의 재조합 단백질들
Figure PCTKR2017004836-appb-I000006
[표 7]
선별된 12개 자가항체에 대한 마이크로어레이 데이터와 ELISA 데이터의 연관성
Figure PCTKR2017004836-appb-I000007
<3-3> 정상인지군과 기억형 경도인지 장애군 및 알츠하이머 질환군으로 구성된 검증용 샘플(validation sample set)에서 자가항체의 검증
상기 <실시예 3-2>에서 자가항체 ELISA AU 값과 칩 데이터 간에 유의적으로 높은 연관성(correlation)을 보인 ATCAY, HIST1H3F, NME7, NOL3, PAIP2 5개 항원의 자가항체들이 알츠하이머와 경도인지장애에 대한 바이오마커로서 활용될 수 있는지를 성별과 나이를 매칭한 정상군, 기억형 경도인지장애군(amnestic mild cognitive impairment, aMCI) 및 알츠하이머 환자군 각각 44명으로 구성된 검증용 샘플(validation sample set)에서 <실시예 3-2>와 같은 간접효소면역측정법(indirect ELISA assay)을 통해 검증하였다.
그 결과, 항-ATCAY 자가항체 IgG 양(level)과 항-NME7 자가항체 IgG 양(level)이 정상인지군, 경도인지장애군 (MCI), 알츠하이머질환군 사이에서 통계적으로 유의한 차이가 있음을 확인하였고(표 8), 특히 항-ATCAY IgG 양(level)은 정상인지군에 비해 알츠하이머질환그룹에서 높게 나타났으며(p=0.019), 항-NME7 IgG 양(level)은 경도인지장애군에 비해 알츠하이머질환그룹에서 유의적으로 높게 나타나며, 항-PAIP2 IgG 양(level)은 정상인지군에 비해 경도인지장애군에서 유의적으로 높은 것을 확인하였다(p=0.046).
[표 8]
정상인지군, 경도인지장애군 (MCI), 알츠하이머질환군의 자가항체 양(level) 비교
Figure PCTKR2017004836-appb-I000008
모든 수치는 평균±표준편차로 나타내었다.
a는 크러스칼-왈라스 검정(Kruskal-Wallis test)에 의해 그룹들 간 차이를 수치화하여 나타낸 것이다.
<3-4> 자가항체와 정상군, 경도인지장애군 , 알츠하이머질환군의 전체 IgG 양(total IgG level)의 연관성 분석
정상군, 경도인지장애군, 알츠하이머질환군의 전체 IgG 양(total IgG level)이 자가항체 양(level)에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 혈청 샘플 내 전체 IgG 양(total IgG level)을 하기와 같은 직접효소면역측정법(indirect ELISA assay)으로 측정하였다.
구체적으로, 혈청 샘플을 coating buffer에 1:500,000로 희석한 후 96-웰 플레이트에 100㎕씩 두 번(duplicate) 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 2시간 후, 300㎕ PBST로 3회 씻어내고 200㎕ blocking buffer(1% BSA in PBS)를 넣어 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 2시간 후, PBST로 씻어내고 blocking buffer에 1:10,000으로 희석한 HRP가 접합된 이차 항체(HRP-conjugated goat anti-human IgG H&L: Abcam, Cambridge, UK)를 100㎕씩 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 후, 씻어내고 100㎕ TMB를 첨가하여 상온에서 15분 동안 반응시키고, 100㎕ stop solution을 첨가하여 30분 이내에 450nm에서 OD 값을 측정하였다.
그 결과, 혈청 내 전체 IgG 양(total IgG level)은 정상군, 경도인지장애군, 알츠하이머질환군 세 그룹 간에 차이는 없었으나(도 3), 상기 <실시예 3-3>에서 검증된 ATCAY, HIST1H3F, NME7, NOL3, PAIP2 5개 자가항체 양(level)과 모두 유의적으로 양의 연관을 보였으며, 특히 항-NME7 IgG 양(level)은 전체 IgG 양(total IgG level)과 높은 연관성(rs=0.473, p<0.001)을 나타내었다(표 9).
[표 9]
전체 IgG(total IgG)와 자가항체간의 연관성 분석
Figure PCTKR2017004836-appb-I000009
자가항체 AU값과 전체 IgG(total IgG) 농도간 연관성을 스피어맨 상관관계 분석(Spearman correlation analysis)을 통해 측정하여 나타내었다.
따라서, 자가항체 양(level)에 대하여 전체 IgG 양(total IgG level)의 영향을 배제하기 위하여 자가항체 양(level)을 전체 IgG 양(total IgG level)으로 정규화(normalization)한 후, 정상인지군, 경도인지장애군 및 알츠하이머질환군 간에 이들 자가항체 양(level)의 차이를 비교하였다. 그 결과, 정상인지군과 알츠하이머질환군 간의 항-ATCAY IgG 양(level)차에 대한 유의성이 높아진 것(p=0.010)을 확인하였다 (도 4).
<3-5> 항-ATCAY IgG 양(level)과 인지기능과의 연관성 분석
항-ATCAY IgG 양(level)과 인지기능과의 연관성을 알아보고자 상기 <실시예 1>에서 얻은 간이정신상태검사인 MMSE 점수와, 경도인지장애 검진을 위한 K-MoCA 점수 및 CDR 점수로 MMSE 점수와 K-MoCA 및 CDR 점수와의 연관성(correlation)을 스피어맨 순위 상관 시험(Spearman rank correlation test)을 통해 확인하였다.
그 결과, 항-ATCAY IgG 양(level)이 높을수록 MMSE 점수(rs=-0.204, p=0.019)와 K-MoCA 점수(rs=-0.242, p=0.005)가 유의적으로 낮은 것을 확인함으로써, 항-ATCAY IgG 양(level)과 인지기능이 연관성이 있음을 확인하였다 (도 5).
<3-6> 정상인지군, 경도인지장애군 및 알츠하이머질환군 간에 자가항체의 양성탐지 빈도(occurence) 확인
정상인지군, 경도인지장애군 및 알츠하이머질환군 간에 자가항체의 양성탐지 빈도(occurrence)를 확인하고 이를 이용한 위험도평가(risk assessment)를 실시하였다. 자가항체 양성탐지빈도는 각각의 자가항체 양(AU)을 전체 IgG 양으로 정규화(normalization)한 값이 정상인지군(n=44)의 이 정규화 값의 평균(mean)+2×표준편차(SD)이상인 값을 가지는 경우를 양성(positive)으로 간주하였다.
그 결과, 항-PAIP2 IgG와 항-ATCAY IgG를 결합한 두 개 자가항체 양성탐지빈도(occurrence)가 높을수록 알츠하이머 질환의 위험이 높아지고(p=0.011, OR=4.03, 95%CI: 1.32-12.37), 항-NOL3 IgG와 항-NME7 IgG를 결합한 두 개 자가항체의 양성탐지빈도(occurrence)가 높을수록 기억형 경도인지장애(aMCI)의 위험이 높아짐(p=0.006, OR=5.73, 95%CI: 1.50-21.87)을 확인함으로써(표 10), PAIP2, ATCAY, NOL3, NME7의 자가항원에 대항하는 자가항체가 기억형 경도인지장애(aMCI) 또는 알츠하이머 진단을 위한 바이오마커로 활용될 수 있음을 확인하였다.
[표 10]
정상인지군, 경도인지장애군 및 알츠하이머질환군에서 자가항체의 양성탐지 빈도(occurrence)와 이를 이용한 위험도평가(risk assessment)
Figure PCTKR2017004836-appb-I000010
자가항체의 빈도(occurrence)는 44명 정상인지군의 자가항체 AU/전체 IgG 농도(total IgG concentration)의 평균+2표준편차(mean+2SD)이상인 경우에 양성 값으로 정의하였다.
a는 카이제곱검정(Chi-square test) 또는 Fisher 정확검정(Fisher exact test)에 의해 두 그룹간 자가항체의 빈도(occurrence) 차이의 유의확률을 나타낸 것으로 p value<0.05를 유의한 값으로 간주하였다.
<3-7> 정상인지군, 경도인지장애군 및 알츠하이머질환군 간에 자가항체의 ROC 분석
ATCAY, NOL3 및 NME7 자가항체가 정상인지군(NC)과 경도인지장애군(MCI) 및 알츠하이머질환군(AD)을 구분할 수 있는지 평가하기 위해 통상적인 방법에 따라 ROC(receive operator characteristic) 분석을 하였다.
그 결과, 도 6a, 6b 및 표 11에 나타낸바와 같이, ATCAY 자가항체의 경도인지장애군에 대한 AUC값은 0.616(p=0.062, 95%CI=0.498~0.734)이였고(도 6a 및 표 11), 알츠하이머질환군에 대한 AUC값은 0.661(p=0.009, 95%CI=0.547~0.775)로 유의미한 값을 나타냈다(도 6b 및 표 11). 따라서 ATCAY 자가항체는 정상인지군과 비교하여 경도인지장애군 및 알츠하이머질환군에 대해 변별력이 있음을 확인하였다.
[표 11]
정상인지군, 경도인지장애군 및 알츠하이머질환군 간에 자가항체의 ROC 분석
Figure PCTKR2017004836-appb-I000011
<110> Centers for Disease Control and Prevention
<120> Potential autoantibody biomarkers for the detection and diagnosis
of dementia
<130> 2017FPO-03-001/PCT
<150> KR 2016-0105969
<151> 2016-08-22
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 371
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Gly Thr Thr Glu Ala Thr Leu Arg Met Glu Asn Val Asp Val Lys
1 5 10 15
Glu Glu Trp Gln Asp Glu Asp Leu Pro Arg Pro Leu Pro Glu Glu Thr
20 25 30
Gly Val Glu Leu Leu Gly Ser Pro Val Glu Asp Thr Ser Ser Pro Pro
35 40 45
Asn Thr Leu Asn Phe Asn Gly Ala His Arg Lys Arg Lys Thr Leu Val
50 55 60
Ala Pro Glu Ile Asn Ile Ser Leu Asp Gln Ser Glu Gly Ser Leu Leu
65 70 75 80
Ser Asp Asp Phe Leu Asp Thr Pro Asp Asp Leu Asp Ile Asn Val Asp
85 90 95
Asp Ile Glu Thr Pro Asp Glu Thr Asp Ser Leu Glu Phe Leu Gly Asn
100 105 110
Gly Asn Glu Leu Glu Trp Glu Asp Asp Thr Pro Val Ala Thr Ala Lys
115 120 125
Asn Met Pro Gly Asp Ser Ala Asp Leu Phe Gly Asp Gly Thr Thr Glu
130 135 140
Asp Gly Ser Ala Ala Asn Gly Arg Leu Trp Arg Thr Val Ile Ile Gly
145 150 155 160
Glu Gln Glu His Arg Ile Asp Leu His Met Ile Arg Pro Tyr Met Lys
165 170 175
Val Val Thr His Gly Gly Tyr Tyr Gly Glu Gly Leu Asn Ala Ile Ile
180 185 190
Val Phe Ala Ala Cys Phe Leu Pro Asp Ser Ser Leu Pro Asp Tyr His
195 200 205
Tyr Ile Met Glu Asn Leu Phe Leu Tyr Val Ile Ser Ser Leu Glu Leu
210 215 220
Leu Val Ala Glu Asp Tyr Met Ile Val Tyr Leu Asn Gly Ala Thr Pro
225 230 235 240
Arg Arg Arg Met Pro Gly Ile Gly Trp Leu Lys Lys Cys Tyr Gln Met
245 250 255
Ile Asp Arg Arg Leu Arg Lys Asn Leu Lys Ser Leu Ile Ile Val His
260 265 270
Pro Ser Trp Phe Ile Arg Thr Val Leu Ala Ile Ser Arg Pro Phe Ile
275 280 285
Ser Val Lys Phe Ile Asn Lys Ile Gln Tyr Val His Ser Leu Glu Asp
290 295 300
Leu Glu Gln Leu Ile Pro Met Glu His Val Gln Ile Pro Asp Cys Val
305 310 315 320
Leu Gln Tyr Glu Glu Glu Arg Leu Lys Ala Arg Arg Glu Ser Ala Arg
325 330 335
Pro Gln Pro Glu Phe Val Leu Pro Arg Ser Glu Glu Lys Pro Glu Val
340 345 350
Ala Pro Val Glu Asn Arg Ser Ala Leu Val Ser Glu Asp Gln Glu Thr
355 360 365
Ser Met Ser
370
<210> 2
<211> 376
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Asn His Ser Glu Arg Phe Val Phe Ile Ala Glu Trp Tyr Asp Pro
1 5 10 15
Asn Ala Ser Leu Leu Arg Arg Tyr Glu Leu Leu Phe Tyr Pro Gly Asp
20 25 30
Gly Ser Val Glu Met His Asp Val Lys Asn His Arg Thr Phe Leu Lys
35 40 45
Arg Thr Lys Tyr Asp Asn Leu His Leu Glu Asp Leu Phe Ile Gly Asn
50 55 60
Lys Val Asn Val Phe Ser Arg Gln Leu Val Leu Ile Asp Tyr Gly Asp
65 70 75 80
Gln Tyr Thr Ala Arg Gln Leu Gly Ser Arg Lys Glu Lys Thr Leu Ala
85 90 95
Leu Ile Lys Pro Asp Ala Ile Ser Lys Ala Gly Glu Ile Ile Glu Ile
100 105 110
Ile Asn Lys Ala Gly Phe Thr Ile Thr Lys Leu Lys Met Met Met Leu
115 120 125
Ser Arg Lys Glu Ala Leu Asp Phe His Val Asp His Gln Ser Arg Pro
130 135 140
Phe Phe Asn Glu Leu Ile Gln Phe Ile Thr Thr Gly Pro Ile Ile Ala
145 150 155 160
Met Glu Ile Leu Arg Asp Asp Ala Ile Cys Glu Trp Lys Arg Leu Leu
165 170 175
Gly Pro Ala Asn Ser Gly Val Ala Arg Thr Asp Ala Ser Glu Ser Ile
180 185 190
Arg Ala Leu Phe Gly Thr Asp Gly Ile Arg Asn Ala Ala His Gly Pro
195 200 205
Asp Ser Phe Ala Ser Ala Ala Arg Glu Met Glu Leu Phe Phe Pro Ser
210 215 220
Ser Gly Gly Cys Gly Pro Ala Asn Thr Ala Lys Phe Thr Asn Cys Thr
225 230 235 240
Cys Cys Ile Val Lys Pro His Ala Val Ser Glu Gly Leu Leu Gly Lys
245 250 255
Ile Leu Met Ala Ile Arg Asp Ala Gly Phe Glu Ile Ser Ala Met Gln
260 265 270
Met Phe Asn Met Asp Arg Val Asn Val Glu Glu Phe Tyr Glu Val Tyr
275 280 285
Lys Gly Val Val Thr Glu Tyr His Asp Met Val Thr Glu Met Tyr Ser
290 295 300
Gly Pro Cys Val Ala Met Glu Ile Gln Gln Asn Asn Ala Thr Lys Thr
305 310 315 320
Phe Arg Glu Phe Cys Gly Pro Ala Asp Pro Glu Ile Ala Arg His Leu
325 330 335
Arg Pro Gly Thr Leu Arg Ala Ile Phe Gly Lys Thr Lys Ile Gln Asn
340 345 350
Ala Val His Cys Thr Asp Leu Pro Glu Asp Gly Leu Leu Glu Val Gln
355 360 365
Tyr Phe Phe Lys Ile Leu Asp Asn
370 375
<210> 3
<211> 208
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Gly Asn Ala Gln Glu Arg Pro Ser Glu Thr Ile Asp Arg Glu Arg
1 5 10 15
Lys Arg Leu Val Glu Thr Leu Gln Ala Asp Ser Gly Leu Leu Leu Asp
20 25 30
Ala Leu Leu Ala Arg Gly Val Leu Thr Gly Pro Glu Tyr Glu Ala Leu
35 40 45
Asp Ala Leu Pro Asp Ala Glu Arg Arg Val Arg Arg Leu Leu Leu Leu
50 55 60
Val Gln Gly Lys Gly Glu Ala Ala Cys Gln Glu Leu Leu Arg Cys Ala
65 70 75 80
Gln Arg Thr Ala Gly Ala Pro Asp Pro Ala Trp Asp Trp Gln His Val
85 90 95
Gly Pro Gly Tyr Arg Asp Arg Ser Tyr Asp Pro Pro Cys Pro Gly His
100 105 110
Trp Thr Pro Glu Ala Pro Gly Ser Gly Thr Thr Cys Pro Gly Leu Pro
115 120 125
Arg Ala Ser Asp Pro Asp Glu Ala Gly Gly Pro Glu Gly Ser Glu Ala
130 135 140
Val Gln Ser Gly Thr Pro Glu Glu Pro Glu Pro Glu Leu Glu Ala Glu
145 150 155 160
Ala Ser Lys Glu Ala Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Leu Glu
165 170 175
Pro Glu Ala Glu Ala Glu Pro Glu Pro Glu Leu Glu Pro Glu Pro Asp
180 185 190
Pro Glu Pro Glu Pro Asp Phe Glu Glu Arg Asp Glu Ser Glu Asp Ser
195 200 205
<210> 4
<211> 5049
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
accccccacc ccctcctccc tgcacacaaa agcagcataa attaaccgtc ttcgggaagc 60
cgagcctctg ccagccctga gctgggaaga agcagctacc tcggaggcag ggcgcgcagg 120
cgggcggcga tgagaggggg cgcagccgca gccccgcgct ggggagccca ccgctaaccc 180
tgcaccccac ccacccctgc acaaaagagc tggcgggcgc tggccacgtc gccctgggtg 240
accttcctcg gatgcagaat ccgcccctgc gagcatcctc ttcctcctag gctctgaagg 300
cccggggagc gtgagcgatg cccagctgca cccgggcagg gctcgccttt gtttgccagt 360
aaggaggaga ggctgtctca gctgcagagg ggtcatccct gcttcaagcc agtgcctctt 420
cccagctccc atggggacca ccgaagccac gctccggatg gaaaacgtgg acgtgaagga 480
ggaatggcag gacgaagatc ttcccaggcc actcccagaa gagacggggg tggaactgct 540
tggcagcccg gtggaagaca catcctctcc tcccaacacg ctaaatttca acggagcgca 600
tcgtaagagg aagacgctgg tggccccaga gatcaacatt tctctggatc agagtgaggg 660
gtccctgctg tccgatgact tcttggatac ccctgatgac ctggatatta acgtggatga 720
catcgagacc cccgatgaga ccgactcgct ggagttcctg gggaatggca acgaactgga 780
gtgggaagac gacacccccg tggccaccgc caagaacatg cccggggaca gcgcggatct 840
atttggggac ggcacgacgg aggacggcag cgccgccaac gggcgcctgt ggcggacagt 900
gatcatcggg gagcaagagc accgtataga cctgcacatg atccggcctt acatgaaagt 960
ggtcacccac ggagggtact acggcgaagg cctcaacgcc atcatcgtct tcgcagcctg 1020
cttccttcca gacagcagcc tccccgacta ccactacatc atggagaacc tcttcctgta 1080
cgtcatcagc agcttagagc tcctggtggc tgaggactac atgatcgtgt acctgaacgg 1140
tgccacgccc cggcggagga tgcctggaat cggctggctg aagaagtgct accagatgat 1200
cgaccggagg ttgcggaaaa acctgaagtc cttgatcatc gtccacccct cgtggttcat 1260
tcggactgtg ctggccatct ctcgcccttt catcagcgtc aagttcatca acaagatcca 1320
gtacgtgcac agcttggaag acctggagca actcatccct atggaacacg tccagatccc 1380
agactgcgtc ctgcaatacg aagaggaaag actgaaggcc aggagggaga gcgcgaggcc 1440
ccagccggag tttgtgctgc ccaggtctga agagaagcca gaggtggcac cagtggaaaa 1500
caggtctgct ctggtctcag aagatcagga aacaagcatg tcctgaggcg acgtgagcat 1560
aacaaaggac atggaagaag attccagatg ccagaaaacc tctgtcagac gcccactggc 1620
cccagatctc atcctgcctc atcctgagtc ccaatcttcc aagggtgcca gcccctccgt 1680
tcatctctga aacccagcat ccttttcagc tgcttgaaaa cattgtattt ttttttttta 1740
acgatgcagt atttgtgcgt tccagaaaag ggcccagctc tgagcccctc acccttccac 1800
actcacgaac tctcagccga ggaaggcaag aagcgcaggg ggtggcccgc gtggcgtcgg 1860
tggcctccgc tcctgctcgc agcccctgtg gtcagagctg gatacaagat tcaagaccct 1920
tctcttgctt gtcacccgct ccaggttgga gccacagaca cccaccgcca ccccggctgg 1980
gtctgcgtcc tttcctgtgc ctttccctcc agaatgcggc ctcagaccta gaagctcaac 2040
ccccctatga gggccacgtc ctggggtagc tcctgacctc cgaccttatg tccaaatttc 2100
acacccatgg tttttcattt gacccgcccc cttctcgctc ataatgacac ccagctcctt 2160
tgagaggatc agagcccatt gcacaagaag agccgctgcc aaccatcctt gtcctccgat 2220
tgcaaaatga caccccagta atctagaaca ttctcaagcc cctttaactc agatgtcaag 2280
ccaccgggca aaccccgtca atacctccca ccaaggaatg agatatgtgg acctcactgc 2340
tcccccaacc cagcgtcagg ctgggacacg ccaacgctgt tccgggttgg aacagcagag 2400
gctcagaaac tggctctgaa ataggcagac ctagcaagag gaagatacag ggtatcgggc 2460
gtttgagtgt ttcagaagtc attcgggaag ataaatccag tgcgctggcc gcagccacct 2520
gcattcaaag cttggaccag cgggttcttg ttcgggaggc aaatttccct aggaaaaaga 2580
agacagactt ttctaatgtg gtccaaatgc ggatcactgg tcagatggac tctagaagca 2640
ctgagctccc tgtctctgga agtatttaag aaaaggctgg gccaggcacg atggctcacg 2700
cctgtaatcc cagactttgg gaggccgagg caggcggatc acctgaggtg aggagtttga 2760
gaacagcctg gccaacatgg tgaaacctca tctctactaa aaatacaaaa attagccagg 2820
cgtggtggca ggtgcctgta atcccagcta cttgggaggc tgaggcatga gaatcactta 2880
aacctgagag gcagaggtta cagtgagcca agatcgtgcc actgcattcc agcctgggcg 2940
acagagcaag actctgtctc aaaaaaaata aaaaataatc agggcacagt ggctcatgcc 3000
tgtaatccca gcactctggg aggctgaggt gggtggatca cctgaggtca ggagttcaag 3060
accagcctgg tgaacatggc gaaaccccgt ctctaataaa aatacaaaaa ttagccgggc 3120
atggtggtgc atgcctgtaa tcccagctac tcgggaggct gaggcaggag aactgcttga 3180
acccaggagg cagaggttgc agtgatccaa gatcatgcca ctgcactcca gcctgggcaa 3240
caagagcaaa actccgtctc aaaataaaaa gaaaagaaaa gaatggacag tgtttgcaga 3300
gagttgctca cgagtttccc tctaatccta aatgtcttca tgtctatcag tctgagcaga 3360
cggtgagtag ggcgggcaca ttctccaggc ccttcttcct agctctgtgg ttgacctctc 3420
agcaagtgct atccaggctg ggccaaccag acccacaatt aactgagcct cagtgaaagc 3480
gtccagtgca tcttgacctg agacagcaag gaattgcatt tggggttatt ccaacgatga 3540
tggcagggaa ctggtggtat ttagtgctga ggggcagtga tacagaaaga tttgccctgt 3600
gggacagggt cctgcgcgag tcccatcccc aaaagccagc agctcctgcc atgaggaaga 3660
cggggtttct gagcaggctt atgcctgcag gttcctgtgg agccaccggc tgtgacggga 3720
cacctctggg tctcagcatt gccctgggga ggctgggaca tttagggaca tggtagggtt 3780
ttaacatttg tttcccaaat gtcaaatccc gggcacaggg gcaagaccct gtcccgaatt 3840
cccaccccag tgaatggtgt cgctgccaaa gccaacacaa gatgacaaaa gtggctgggt 3900
acggtggctc acgcctataa tcccagcact ttgggagacc gagacaggtg gatcacctga 3960
ggtcaggagt tcgagaccag gctggccaac atggtgaaac cccatctcta ctaaaaatac 4020
aaaaattagc tgggtgtggt ggcgcgcacc tgtagtccca gctactcagg aggctgaggt 4080
agaagaatag ctggaaccca ggaggcagag attgcagtca gccgagattg caccactgca 4140
ctccagcctg ggagacagag caagactgac tcaaaagaaa aaaaatgaca gaagcctgat 4200
tatcagactg cccggaggag acaggctcca gcagatagat gccagccagg cccagctgcc 4260
acgatttgtc ccaggtgacc aaaggcacgc agctccagca tgaatcgttc taacccaaca 4320
gtgacaagaa ctgctgggcc ttaaccgtca tggaagactg gggccgcttc caagtcacag 4380
acaggagacg gggacaggaa agaactcatt ccacccaatc ggacacctaa taattgagtg 4440
tctacagcag caatcaagtg acaagtgagg ccctacctga cccagaaggt gcctgccggc 4500
taaacattct gcccccacca gaaactccag ggggtccgcc cgttatgccg tggcccaccc 4560
acgccccttt ggatcaccag cagtcacaga caacaggcag gcgaaactga agaccccaac 4620
tcagccccag cggaccctcc agagcaaaag aggcccccgg cgaggccacc tgtcggcagg 4680
catgccgagg tcaaacagcc ggggccaccg ttcccagctg ggccacgacc tgcaccgtcc 4740
acagatgggc tttgagatgg atttgtatca gggtgggggg tgtggtttgg ccaaaatgca 4800
atggaccccg acccctcctc gtaaaaggat gttgggtttc cctctggtga cacatgggat 4860
gcgtcataaa ccctccccca aagtcctggt cagcagccca tccttccaac gatgagtttt 4920
gcggtttttc agaacagaaa tgatcactac gattgacgac ggtcgtgatg ttaagacgtc 4980
gtctccatga gctttggggg gacttttatg tggaataaag aaactatcac tgagaaaaaa 5040
aaaaaaaaa 5049
<210> 5
<211> 1656
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
gtaaaactgc cggaaacaga ataatggcgt ctcgtagccc caggcgacag cgtggagggg 60
cgggtctgtc gattggatga acgcagctga gattactccc agccactaag gacgaagagg 120
tggggcggtg gcgtcccacg cctcgtgcga cagtgggcgg ggctttgttg cctgagtaac 180
cgtatgatgg tggtggtggt ggtgtcttcc tgtctcaacg atacctattt tctagtgctg 240
agatcctgag acaatgaatc atagtgaaag attcgttttc attgcagagt ggtatgatcc 300
aaatgcttca cttcttcgac gttatgagct tttattttac ccaggggatg gatctgttga 360
aatgcatgat gtaaagaatc atcgcacctt tttaaagcgg accaaatatg ataacctgca 420
cttggaagat ttatttatag gcaacaaagt gaatgtcttt tctcgacaac tggtattaat 480
tgactatggg gatcaatata cagctcgcca gctgggcagt aggaaagaaa aaacgctagc 540
cctaattaaa ccagatgcaa tatcaaaggc tggagaaata attgaaataa taaacaaagc 600
tggatttact ataaccaaac tcaaaatgat gatgctttca aggaaagaag cattggattt 660
tcatgtagat caccagtcaa gacccttttt caatgagctg atccagttta ttacaactgg 720
tcctattatt gccatggaga ttttaagaga tgatgctata tgtgaatgga aaagactgct 780
gggacctgca aactctggag tggcacgcac agatgcttct gaaagcatta gagccctctt 840
tggaacagat ggcataagaa atgcagcgca tggccctgat tcttttgctt ctgcggccag 900
agaaatggag ttgttttttc cttcaagtgg aggttgtggg ccggcaaaca ctgctaaatt 960
tactaattgt acctgttgca ttgttaaacc ccatgctgtc agtgaaggac tgttgggaaa 1020
gatcctgatg gctatccgag atgcaggttt tgaaatctca gctatgcaga tgttcaatat 1080
ggatcgggtt aatgttgagg aattctatga agtttataaa ggagtagtga ccgaatatca 1140
tgacatggtg acagaaatgt attctggccc ttgtgtagca atggagattc aacagaataa 1200
tgctacaaag acatttcgag aattttgtgg acctgctgat cctgaaattg cccggcattt 1260
acgccctgga actctcagag caatctttgg taaaactaag atccagaatg ctgttcactg 1320
tactgatctg ccagaggatg gcctattaga ggttcaatac ttcttcaaga tcttggataa 1380
ttagtggtgt ggaaagtaaa gaagtcacag gttgggacat ttagacaaga gtgaatcaca 1440
cacgaggaat gtgttcattc ttttattgtc cgttgtttta acctgactga atacaagatc 1500
aacaagagca ctgtactcct ggcaattatt acatatgtta gaacatggat tttgcactgt 1560
agacaacatt taacaccagt ctatggggta ctgcattgct ttttataaag ttcaaaataa 1620
agatttattt tcaaacaaga aaaaaaaaaa aaaaaa 1656
<210> 6
<211> 1540
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
ggcattcaga gagtagatgc cagtcctggg aaaggcaggg gaggagagga gagccacggc 60
tgacgcttgg ggacagaagg aggagcctga ggaggagaca ggacagagcg tctggagagg 120
caggaggaca ccgagttccc cgtgttggcc tccaggtcct gtgcttgcgg agccgtccgg 180
cggctgggat cgagccccga caatgggcaa cgcgcaggag cggccgtcag agactatcga 240
ccgcgagcgg aaacgcctgg tcgagacgct gcaggcggac tcgggactgc tgttggacgc 300
gctgctggcg cggggcgtgc tcaccgggcc agagtacgag gcattggatg cactgcctga 360
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gcagcacgtg ggtccgggct accgggaccg cagctatgac cctccatgcc caggccactg 540
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tgacgaggcc gggggccctg agggctccga ggcggtgcaa tccgggaccc cggaggagcc 660
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agagctggaa cccgaggctg aagcagaacc agagccggaa ctggagccag aaccggaccc 780
agagcccgag cccgacttcg aggaaaggga cgagtccgaa gattcctgaa ggccagagct 840
ctgacaggcg gtgccccgcc catgctggat aggacctggg atgctgctgg agctgaatcg 900
gatgccacca aggctcggtc cagcccagta ccgctggaag tgaataaact ccggagggtc 960
ggacgggacc tgggctctct ccacgattct ggctgtttgc ccaggaactt agggtgggta 1020
cctctgagtc ccagggacct gggcaggccc aagcccacca cgagcatcat ccagtcctca 1080
gccctaatct gcccttagga gtccaggctg caccctggag atcccaaacc tagcccccta 1140
gtgggacaag gacctgaccc tcctgcccgc atacacaacc catttcccct ggtgagccac 1200
ttggcagcat atgtaggtac cagctcaacc ccacgcaagt tcctgagctg aacatggagc 1260
aaggggaggg tgacttctct ccacataggg agggcttaga gctcacagcc ttgggaagtg 1320
agactagaag aggggagcag aaagggacct tgagtagaca aaggccacac acatcattgt 1380
cattactgtt ttaattgtct ggcttctctc tggactggga gctcagtgag gattctgacc 1440
agtgacttac acaaaaggcg ctctatacat attataatat attcgcttac taaatgaata 1500
aggactttcc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1540

Claims (16)

  1. ATCAY(Ataxia, Cerebellar, Cayman Type), NME7(NME/NM23 Family Member 7) 및 NOL3(Nucleolar Protein 3)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 포함하는 경도인지장애 진단 키트.
  2. ATCAY(Ataxia, Cerebellar, Cayman Type) 단백질을 포함하는 치매 진단 키트.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 자가항체에 특이적인 항원 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(Conjugate); 상기 표지체와 발색반응 할 발색기질 용액 세척액 또는 효소반응 정지 용액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 단백질은 고체기판에 결합되는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 고체기판은 니트로셀룰로오스 막, PVDF 막, 폴리비닐(Polyvinyl) 또는 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 발색기질은 TMB(3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 및 OPD(o-phenylenediamine)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  7. 1) ATCAY, NME7 및 NOL3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질이 코팅된 고정체에 피검체 유래 시료를 가하여 항원-항체 반응시키는 단계;
    2) 상기 단계 1)을 통해 생성된 항원-항체 반응물을 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계; 및
    3) 상기 검출된 자가항체량이 정상인에 비해 증가된 피검체를 경도인지장애에 걸렸거나 걸릴 가능성이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는 경도인지장애 진단의 정보를 제공하기 위해 자가 항체를 검출하는 방법.
  8. 1) ATCAY 단백질이 코팅된 고정체에 피검체 유래 시료를 가하여 항원-항체 반응시키는 단계;
    2) 상기 단계 1)을 통해 생성된 항원-항체 반응물을 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계; 및
    3) 상기 검출된 자가항체량이 정상인에 비해 증가된 피검체를 치매에 걸렸거나 걸릴 가능성이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는 치매 진단의 정보를 제공하기 위해 자가 항체를 검출하는 방법.
  9. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 피검체 유래 시료는 인간의 혈청, 혈장 및 혈액으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 고정체는 니트로셀룰로오스 막, PVDF 막, 폴리비닐(Polyvinyl) 또는 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 항원-항체 반응은 효소면역분석법, 방사능면역분석법, 샌드위치 측정법, 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법, 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 생물학적 시료가 흡수되는 샘플패드(sample pad);
    ATCAY(Ataxia, Cerebellar, Cayman Type), NME7(NME/NM23 Family Member 7) 및 NOL3(Nucleolar Protein 3)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상과 결합하는 결합 패드(conjugate pad);
    상기 단백질의 각 항체를 포함하는 반응선(test line) 및 대조선(control line)이 처리되어 있는 반응막(membrane);
    잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드(absorption pad); 및
    지지체를 포함하는 경도인지장애 진단용 스트립.
  13. 생물학적 시료가 흡수되는 샘플패드(sample pad);
    ATCAY(Ataxia, Cerebellar, Cayman Type)와 결합하는 결합 패드(conjugate pad);
    상기 단백질의 각 항체를 포함하는 반응선(test line) 및 대조선(control line)이 처리되어 있는 반응막(membrane);
    잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드(absorption pad); 및
    지지체를 포함하는 치매 진단용 스트립.
  14. 제 12항 또는 제 13항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액인 것을 특징으로 하는 진단용 스트립.
  15. 제 12항 또는 제 13항에 있어서, 상기 반응막은 니트로셀룰로스, 셀룰로스, PVDF(Poly ethylene terephthalate), PES(polyethersufone), 유리섬유 또는 나일론인 것을 특징으로 하는 진단용 스트립.
  16. 제 12항 또는 제 13항에 있어서, 상기 흡수패드는 셀룰로오스, 무명 또는 친수다공성 폴리머인 것을 특징으로 하는 진단용 스트립.
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