KR20230136479A

KR20230136479A - 동물세포의 유전자 교정을 위한 CRISPR-Cas9 벡터 개발

Info

Publication number: KR20230136479A
Application number: KR1020220034313A
Authority: KR
Inventors: 김근필; 박서정; 최의환
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2022-03-18
Filing date: 2022-03-18
Publication date: 2023-09-26

Abstract

본 발명은 CRISPR Cas9 벡터 및 이의 용도에 관한 것으로, 유전자 교정 효율이 증가된 CRISPR Cas9 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 CRISPR Cas9 벡터는 RAD51 유전자를 발현하며, 본 발명의 CRISPR Cas9 벡터를 이용하는 경우 유전자 교정의 효율이 약 2배 이상 증가하므로 보다 높은 효율과 정확성으로 유전자를 교정할 수 있다.

Description

동물세포의 유전자 교정을 위한 CRISPR-Cas9 벡터 개발{Development of CRISPR-Cas9 vector for genome editing in animal cells}

본 발명은 CRISPR-Cas9 벡터 및 이의 용도에 관한 것으로, 유전자 교정 효율이 증가된 CRISPR Cas9 벡터에 관한 것이다.

Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) 시스템은 박테리아와 고세균에서 2차 방어 면역체계로서 작용하는 시스템이다. 바이러스가 박테리아를 감염시킬 때, 해당 시스템이 바이러스의 DNA 조각을 박테리아의 유전체 상으로 통합한다. 이후 2차 침입 시에 박테리아에 존재하는 바이러스의 DNA 서열이 전사되면서 해당 전사체가 뉴클레아제를 자신에 대해 상보적인 DNA 서열로 이동시켜 침입한 바이러스의 유전체를 파괴하도록 한다.

CRISPR/Cas9 시스템은 진핵 생물에서 유전자 편집 기술로서 발전되었으며, 이를 위해서는 Cas9 단백질과 서열인식 RNA, trans-activating crispr RNA 세 요소가 필수적이다. 이 때 서열인식 RNA, 및 trans-activating crispr RNA는 하나의 RNA로 합성하여 single guide RNA (sgRNA)로서 새롭게 유전자 편집 기술에서 사용되고 있다. 서열인식 RNA, trans-activating crispr RNA를 함께 일컬어 gRNA라고 하는데, gRNA의 구조는 Cas9 활성효율에 큰 영향을 끼친다. 이때 여러 연구들을 통해 두 종류의 gRNA를 따로 사용하는 것보다 하나의 형태로 합쳐진 sgRNA로서 작용하는 것이 더 높은 Cas9 활성효율을 나타낸다는 결론이 도출되었다.

sgRNA는 표적 DNA 서열과 상보적으로 결합을 이루고 동시에 Cas9과 결합하여 Cas9이 표적 DNA에 대해 기능할 수 있도록 한다. Cas9 단백질은 뉴클레아제로서 sgRNA에 의해 표적 서열로 이동하여, 유전체 상에 존재하는 PAM (Protospacer adjacent motif) 서열 덕분에 유전체와의 결합이 가능해지며 특정 지역에 DNA 이중가닥 절단을 형성한다. 이에 대해서 DNA 이중가닥 손상 수선과정이 일어나게 되고, 수선 과정에서 변화된 서열로 인해 해당 유전자의 정상적인 발현이 어려워지게 되어 유전자의 제대로 된 기능을 수행하지 못하게 된다.

뉴클레아제에 의해 DNA 상에 이중가닥손상이 발생하게 되면 해당 손상에 대한 수선과정이 일어나게 된다. 이때 수선과정은 손상 부위의 일정 부분을 삭제한 후 손상된 각 DNA 말단을 단순히 연결하는 비상동말단연결 (Non-homologous end joining, NHEJ), 상동염색분체 혹은 자매염색분체로부터 손상이 발생한 부위에 대한 상동 서열을 얻어 그를 기반으로 수선을 시행하는 상동 재조합(Homology-directed repair, HDR) 등이 있다.

이 때 RAD51은 이중가닥손상 이후 발생하는 상동 재조합을 통한 수선과정에서 상동염색분체 혹은 자매염색분체로부터 손상부위에 대한 수선 정보를 얻을 수 있도록 상동성 탐색을 가능하게 하여, 손상이 일어난 부위에서 적절한 재조합이 이뤄질 수 있도록 하는 기능을 담당한다.

표적 유전체 편집은 유전체 상 특정 지역을 인식하고 작용하는 뉴클레아제를 사용하여 특정 유전자의 기능 및 특징에 대한 연구를 가능하게 하는 기술이다. 이러한 표적 유전체 편집 기술 중에는 Zinc-finger nuclease (ZFNs), Transcription activator-like effector nuclease (TALENs), 및 상술한 Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) system 등이 있다. 앞서 소개한 표적 유전체 편집 기술 중에서 ZFNs, TALENs과 같은 경우에는 기술 자체가 복잡할 뿐만 아니라 비용이 크게 들기 때문에, 주로 CRISPR-Cas9 시스템에 대한 선호도가 더 높게 나타난다. 또한 세포 및 동물모델의 종류에 대한 제한 없이 다양하게 적용이 가능하여 간단하고 경제적으로 질병에 대한 치료 및 분석 방법으로 쓰인다. 이러한 대중성에도 불구하고 CRISPR-Cas9 시스템은 여전히 제한점을 가지고 있다.

Cas9 단백질의 표적에 대한 특정성은 sgRNA의 약 20nt의 뉴클레오타이드 서열과 유전체 상 존재하는 PAM 서열의 존재유무 등에 의해서 결정된다. 이 때 sgRNA의 타겟팅 서열과 유전체 상 표적서열 간의 상보성이 완전하게 일치하지 않더라도 결합이 이뤄지는 염기 불일치 (base mismatch) 결합으로 인해 표적 외 편집 (off-target editing) 이 일어날 수 있게 된다. 혹은 sgRNA의 이차구조가 sgRNA와 표적유전자 간의 결합을 방해하기도 한다. 또한 유전체 상의 후성학적인 변화가 추가됨으로서 sgRNA의 결합이 어려워질 수도 있다. 또한 다른 종류의 효소와는 다르게, Cas9의 경우 sgRNA와 protospacer DNA와 에너지 측면에서 매우 안정적인 결합을 이루면서 쉽게 분리되지 않는다. 효소와 기질의 차원에서 바라보았을 때, 효소-기질 복합체가 결합을 하고 나면 효소의 기능에 의해서 효소-생성물 복합체가 형성된다. 이 때 효소-생성물 복합체로부터 효소가 얼마나 빨리 분리되는지 여부에 따라서 효소가 다른 기질과도 결합하여 기능을 원활하게 수행할 수 있는지가 결정되는 것인데, Cas9은 기질에 대해서 에너지적으로 안정적인 결합을 만드는 특성으로 인해, 다른 기질과의 반응을 통한 유전자 편집 기능을 계속적으로 완전하게 나타내지 못한다. 따라서, 표적 외 편집의 빈도를 줄임과 동시에 알맞은 표적에 대해서만 유전자편집이 일어날 수 있도록 하는 기술 및 Cas9의 기능이 완전히 이뤄질 수 있도록 하는 기술이 아직 부족한 실정이다.

1) Jinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821. (2012). 2) Gasiunas, Giedrius et al. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America vol. 109,39 (2012): E2579-86. 3) Sander, J., Joung, J. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol 32, 347-355.

본 발명자들은 CRISPR/Cas9 시스템의 유전자 편집 효율을 개선하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, RAD51을 CRISPR/Cas9 시스템과 함께 과발현을 유도할 경우 CRISPR/Cas9 시스템의 표적 유전자 편집 작용의 효율을 개선시킴을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 RAD51 유전자를 포함하는 CRISPR/Cas9 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 벡터를 포함하는 유전체 편집용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 RAD51 단백질 및 Cas9 단백질을 발현하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명에서, "RAD51 단백질"은 RAD51 유전자에 의해 인코딩되는 단백질로, DNA 이중 가닥의 손상 회복을 보조하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서, "Cas9 단백질”은 CRISPR/Cas9 시스템의 주요 단백질 구성 요소로, crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)와 복합체를 형성하여 활성화된 엔도뉴클레아제 또는 nickase를 형성한다.

Cas9 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, Cas9 단백질은 단백질 전달 도메인(protein transduction domain)과 연결될 수 있다. 상기 단백질 전달 도메인은 폴리-아르기닌 또는 HIV 유래의 TAT 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 나아가, 상기 Cas9 단백질은 그 목적에 따라 당업자에 의해 추가적인 도메인이 적절하게 연결될 수 있다.

또한, 상기 Cas9 단백질은 야생형 Cas9 뿐만 아니라, 불활성화된 Cas9 (dCas9), 또는 Cas9 니케이즈 (nickase)와 같은 Cas9의 변이체를 모두 포함할 수 있다. 상기 불활성화된 Cas9은 dCas9에 FokI 뉴클레아제 도메인을 연결한 RFN (RNA-guided FokI Nuclease), 또는 dCas9에 전사활성인자 (transcription activator) 또는 억제자 도메인 (repressor domain)을 연결한 것일 수 있고, 상기 Cas9 니케이즈는 D10A Cas9 또는 H840A Cas9일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 Cas9 단백질은 그 유래에도 제한되지 않는다. 예컨대 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 파이오제네스 (Streptococcus pyogenes), 프란시셀라 노비시다 (Francisella novicida), 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 리스테리아 이노큐아 (Listeria innocua), 또는 스트렙토코커스 뮤탄스 (Streptococcus mutans) 유래일 수 있다.

본 발명의 일구현예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 표적 서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 추가적으로 포함한다.

본 발명에서, "가이드 RNA(guide RNA)"는 두 개의 RNA, 즉, crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA(transactivating crRNA)로 구성될 수 있다. 또는 crRNA 및 tracrRNA의 주요 부분의 융합으로 제조된 sgRNA (single guide RNA)일 수 있다. 또한, 상기 가이드 RNA는 crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 dual RNA 일 수 있다.

3세대 유전자 가위로 알려진 RGEN은 Cas 단백질 및 dual RNA로 구성되거나, Cas 단백질 및 sgRNA로 구성될 수 있다. 가이드 RNA는 sgRNA 또는 dualRNA의 crRNA의 5' 말단에 하나 이상의 추가의 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, RNA 또는 상기 RNA를 코딩하는 DNA형태로 세포 내로 전달될 수 있다.

본 발명의 일구현예에 있어서, 상기 RAD51 단백질은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열에 의하여 인코딩되는 것이다.

본 발명의 일구현예에 있어서, 상기 RAD51 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 일구현예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 네이키드 DNA 이거나, 또는 유전자 운반체에 포함되어 있는 것이다.

본 발명의 일구현예에 있어서, 상기 유전자 운반체는 벡터이다.

본 발명의 일구현예에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 또는 바이러스 벡터이다.

본 발명에서, "벡터"란, 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명에서 용어, "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

예를 들어, 본 발명의 Cas9 및 RAD51 단백질을 인코딩하는 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결시킴으로써, 상기 인코딩 서열의 발현은 이 프로모터의 영향 또는 조절 하에 있게 된다. 재조합 벡터와의 작동 가능한 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서와 같은 발현 조절요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함할 수 있으며, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.

상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 또는 바이러스 벡터 등을 포함할 수 있으며 구체적으로는 바이러스 벡터일 수 있다.

i) 플라스미드 (벡터)

본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 운반하는 운반체로서 플라스미드 (벡터)가 이용될 수 있다. 벡터에 포함되는 폴리뉴클레오타이드는 적합한 발현 카세트 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 카세트에서 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 서열에 결합된 프로모터는, 동물세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 보다 바람직하게는 인간 세포에서 작동하여 뉴클레오타이드 서열의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV (cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV 의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 더 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 프로모터는 인간 CMV (hCMV)의 IE (immediately early) 유전자로부터 유래된 프로모터 또는 EF1 알파 프로모터이며, 가장 바람직하게는 hCMV IE 유전자의 프로모터/인핸서 및 엑손 1 전체서열부터 엑손 2 의 ATG 개시코돈 직전까지를 포함하는 5'-UTR (untranslated region)이다.

본 발명에서 이용되는 발현 카세트는 폴리아네닐화 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어 소성장 호르몬 터미네이터(Gimmi, E. R., et al., Nucleic Acids Res. 17:6983-6998 (1989)), SV40 유래 폴리 아데닐화 서열(Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12:5386-5393 (1992)), HIV-1 polyA(Klasens, B. I. F., et al., Nucleic Acids Res. 26:1870-1876 (1998)), beta-글로빈 polyA(Gil, A., et al, Cell 49:399-406 (1987)), HSV TK polyA(Cole, C. N. and T. P. Stacy, Mol. Cell. Biol. 5:2104-2113 (1985)) 또는 폴리오마바이러스 polyA(Batt, D. B and G. G. Carmichael, Mol. Cell. Biol. 15:4783-4790 (1995))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

ii) 레트로바이러스

레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고, 대량의 외래 유전 물질을 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다.

레트로바이러스 벡터를 구축하기 위하여, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로바이러스 지놈에 삽입되어 복제 불능의 바이러스를 생산한다. 비리온을 생산하기 위하여, gag, pol 및 env 유전자를 포함하지만 LTR (long terminal repeat)와 ψ서열은 없는 패키징 세포주를 구축한다 (Mann et al., Cell, 33:153-159 (1983)). 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열, LTR 및 ψ서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 상기 세포주에 이입하면, ψ서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하며, 이 전사체는 바이러스로 패키징되고, 바이러스는 배지로 배출된다(Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513 (1988)). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 농축하여 유전자 전달 시스템으로 이용한다.

2 세대 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달이 발표되었다. Kasahara 등(Science, 266:1373-1376 (1994))은 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스의 변이체를 제조하였고, 여기에서 EPO (erythropoietin) 서열을 엔벨로프 부위에 삽입하여 새로운 결합 특성을 갖는 키메릭 단백질을 생산하였다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열도 이와 같은 2 세대 레트로바이러스 벡터의 구축 전략에 따라 레트로바이러스에 탑재될 수 있다.

iii) 아데노바이러스

아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기, 조작의 편의성, 높은 타이터, 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200bp 의 ITR (inverted terminal repeat)를 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스-엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역 (E1A 및 E1B)은 전사 및 숙주세포 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 인코딩한다. E2 영역 (E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 인코딩한다.

현재 개발된 아데노바이러스 벡터 중에서, E1 영역이 결여된 복제 불능 아데노바이러스가 많이 이용되고 있다. 한편, E3 영역은 통상적인 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다 (Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551 (1982); 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073(1989)). 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 결실된 E1 영역 (E1A 영역 및/또는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 뉴클레오타이드 서열은 결실된 E4 영역에도 삽입될 수 있다.

본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어, "결실" 은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다. 또한, 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105％ 까지 패킹할 수 있기 때문에, 약 2 kb 를 추가적으로 패키징 할 수 있다(Ghosh-Choudhury et al., EMBOJ., 6:1733-1739 (1987)). 따라서, 아데노바이러스에 삽입되는 상술한 외래 서열은 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.

아데노바이러스는 42 개의 상이한 혈청형 및 A-F 의 서브그룹을 갖는다. 이 중에서, 서브그룹 C 에 속하는 아데노바이러스 타입 5 가 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 얻기 위한 가장 바람직한 출발물질이다. 아데노바이러스 타입 5 에 대한 생화학적 및 유전적 정보는 잘 알려져 있다. 아데노바이러스에 의해 운반되는 외래 유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며, 이에 숙주세포에 대해 유전적 독성이 매우 낮다. 따라서, 아데노 바이러스 유전자 전달 시스템을 이용한 유전자 치료가 안전할 것으로 판단된다.

iv) AAV 벡터

아데노-관련 바이러스 (AAV)는 비분열 세포를 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제 5,139,941 호 및 제 4,797,368 호에 상세하게 개시되어 있다.

유전자 전달 시스템으로서의 AAV 에 대한 연구는 LaFace et al, Viology, 162:483486 (1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21:928-933 (1993), Walsh et al, J. Clin. Invest., 94:1440-1448 (1994) 및 Flotte et al., Gene Therapy, 2:29-37 (1995)에 개시되어 있다.

전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열을 포함하는 플라스미드 (McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963-1973 (1988); 및 Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828 (1989)) 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드 (McCarty et al., J. Virol., 65:2936-2945 (1991))를 동시 형질전환 시켜 제조된다.

v) 다른 바이러스 벡터

다른 바이러스 벡터들도 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열을 생체 내로 운반하는 데 이용할 수 있다. 배시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657 (1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492 (1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148 (1986) 및 Coupar et al., Gene, 68:1-10 (1988)), 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62 (1999)) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415 (1995)) 로부터 유래된 벡터들도 상기 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 운반할 수 있는 운반 시스템으로 이용할 수 있다.

vi) 리포좀

리포좀은 수상에 분산된 인지질에 의해 자동적으로 형성된다. 외래 DNA 분자를 리포좀으로 성공적으로 세포 내로 운반한 예는 Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190 (1982) 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176 (1987)에 개시되어 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열을 내포한 리포좀은 엔도사이토시스, 세포 표면에로의 흡착 또는 플라즈마 세포막과의 융합 등의 기전을 통해 세포와 상호작용하여 세포 내로 폴리뉴클레오타이드 서열을 운반한다.

본 발명에서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열이 네이키드(naked) 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드(벡터)에 탑재된 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479 (1980); 및 Harland 와 Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099 (1985)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456 (1973); 및 Chen 과 Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752 (1987)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841 (1982); 및 Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718 (1986)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87 (1980); Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190 (1982); 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176 (1987)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190 (1985)) 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572 (1990)) 방법에 의해 폴리뉴클레오타이드 서열을 세포 내로 도입시킬 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열이 바이러스 벡터에 기초하여 제작된 경우에는 당업계에 공지된 다양한 바이러스 감염 방법에 따라 폴리뉴클레오타이드 서열을 세포 내로 운반할 수 있다. 바이러스 벡터를 이용한 숙주 세포의 감염은 상술한 인용문헌에 기재되어 있다.

vii) 2A 펩타이드

2A 펩타이드는 약 18-22개의 아미노산으로 이루어진 구조로서, 진핵생물에서 번역(translation)이 일어나면서 형성되는 폴리펩타이드 내의 해당 부분에서 절단이 발생하도록 하는 바이러스 유래 올리고펩타이드이다. 결과적으로 하나의 프로모터(promoter)에 대해서 2가지 이상의 단백질이 만들어질 수 있게 된다. 종류의 따라 F2A (foot-and-mouth disease virus), E2A (equine rhinitis A virus), P2A (porcine teschovirus-1 2A), T2A (thosea asigna virus 2A) 등이 있다. 유전체 상에 2A에 해당하는 뉴클레오타이드가 전사 및 번역되어 펩타이드를 형성하게 되면 2A는 종류와 관계없이 펩타이드의 C-terminal에 글리신-프롤린(glycyl-prolyl) 펩타이드 결합을 생성하고, 그 구역에서 리보솜 생략(ribosome skipping) 과정이 일어난다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 RAD51 단백질 및 Cas9 단백질을 발현하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유전체 편집용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "유전체 편집 (genome editing)"은 인간세포를 비롯한 동식물 세포의 유전체 염기서열에 표적화된 돌연변이를 도입할 수 있는 기술로서, 특정 유전자를 넉-아웃 (knock-out) 또는 넉-인 (knock-in)하거나, 단백질을 생성하지 않는 비-코딩 DNA 서열에 변이를 도입하는 것을 말한다. 본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 유전체 편집은 유전자 넉-아웃을 의미하며 넉-인에도 적용될 수 있다.

또한, 유전체 편집을 통해 유전체상의 DNA를 결실, 중복, 역위, 교체 또는 재배열시킬 수 있다.

본 발명에서, "결실"이란, 염색체의 일부 또는 DNA 상 염기의 일부가 누락되어 일어나는 돌연변이를 말한다.

본 발명에서, "중복"이란, 게놈 내에 같은 유전자가 2개 또는 그 이상 존재하는 것을 말한다.

본 발명에서, "역위"는 게놈의 일부가 원래의 게놈과 비교할 때 거꾸로 배치된 것을 말한다.

본 발명에서, "교체"는 하나의 뉴클레오티드 서열이 서로 교체되는 것(즉, 정보를 지닌 서열의 교체)를 의미하며, 반드시 하나의 폴리뉴클레오티드가 다른 폴리뉴클레티드로 화학적 또는 물리적으로 교체되는 것만을 의미하는 것은 아니다.

본 발명에서, "재배열"이란 염색체 상의 유전자의 위치 및 순서의 변화를 일으키는 구조적 변화를 의미하며, 트랜스포존 등과 같이 전이인자가 삽입되는 것도 포함된다. 아울러, DNA 분자 내에서 염기 재배열에 의한 유전 정보의 변환을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 RAD51 단백질 및 Cas9 단백질은 별도의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩 되는 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 RAD51 단백질 및 Cas9 단백질은 단일의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩 되는 것이다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 RAD51 단백질 및 Cas9 단백질을 발현하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주세포를 제공한다.

상기 "숙주 세포"는 하나 이상의 DNA 또는 벡터가 "세포 내 도입"되는 진핵 또는 원핵 세포를 가리키며, 특정 대상 세포만이 아니라 그 자손 혹은 잠재적 자손까지도 가리키는 것으로 이해되어야 한다. 돌연변이 혹은 환경적 영향에 의해 상기 자손이 부모 세포와 완전히 동일하지 않더라도, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 상기 용어의 범주 내에서 여전히 포함될 수 있다. 본 발명에서 상기 숙주세포는 상기 RAD51 단백질 및 Cas9 단백질을 발현하는 폴리뉴클레오타이드(예컨대, 바이러스 벡터)가 도입된 것으로, 이로부터 Cas9을 인코딩하는 뉴클레오티드를 패키징하는 바이러스를 수득할 수 있다. 구체적으로, 상기 형질전환 세포의 배양액 또는 상기 세포의 용해물로부터 상기 바이러스를 수득할 수 있다.

상기 세포는 E. coli와 같은 원핵세포, 이스트, 진균, 원생동물, 고등식물, 곤충 등의 진핵 세포, CHO, HeLa, HEK293, COS-1과 같은 포유류 세포 등이 포함될 수 있으며, 상기 예시에 제한되는 것은 아니다.

또한, 체세포, 생식세포, 역분화줄기세포 (induced pluripotent stem cells), 성체줄기세포 등 인간의 모든 세포에 적용할 수 있다.

상기 체세포는 배아 뿐 아니라 어린아이, 성인의 몸에서 얻을 수 있는 생식세포를 제외한 모든 세포를 말하며, 이들로부터 유래된 유전자변형 세포들까지 포함될 수 있다. 또한, 상기 성체줄기세포는 인간 배아 (embryo), 신생아 및 성인의 몸에서 얻을 수 있는 모든 성체줄기세포들 뿐만 아니라 제대혈유래 줄기세포 (cord blood stem cells), 태반유래 줄기세포 (placenta stem cells), 탯줄줄기세포 (Wharton's jelly stem cells), 양수줄기세포 (amniotic fluid stem cells), 양막상피줄기세포 (amniotic epithelial cells) 등 배외줄기세포 (extraembryonic stem cells)들과 이들로부터 파생된 유전자변형 세포들을 포함할 수 있다.

또한, 상기 세포는 배양된 세포 (시험관내), 이식편 및 1차 배양물 (시험관내 및 생체외) 및 생체 내 세포일 수 도 있으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 세포로서 그 제한을 두지 않는다.

그러나, 본 발명의 상기 숙주세포는 인간의 배아를 제외한 분리된 형질전환 세포일 수 있다.

본 발명에서, "세포 내 도입"는 당업계에 알려진 공지의 어떠한 방법도 사용할 수 있으며, 형질감염 (transfection) 또는 형질도입 (transduction)에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시킬 수도 있다. 형질감염은 칼슘포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 CRISPR Cas9 벡터는 RAD51 유전자를 발현하며, 본 발명의 CRISPR-Cas9 벡터를 이용하는 경우 유전자 교정의 효율이 약 2배 이상 증가하므로 보다 높은 효율과 정확성으로 유전자를 교정할 수 있다. 그 결과, 특정 질병과 연관된 핵심 유전자를 높은 효율로 비활성화 시킴으로써 해당 질병을 연구할 수 있는 모델을 형성하여 질병 연구 및 치료제 개발에 도움이 될 수 있다.

도 1은 pLentiCRISPR v2-T2A-RAD51-sgGAPDH 벡터 합성 과정을 나타낸 도이다.
도 2는 RAD51의 발현량에 따른 CRISPR-Cas9 시스템의 효율을 비교하기 위한 CRISPR-Cas9 벡터 도입 과정을 나타낸 도이다. 도 2a. pLentiCRISPR v2-Cas9 및 pLentiCRISPR v2-Cas9-T2A-Rad51; 도 2b. pLentiCRISPR v2-Cas9 + pEF1α-RAD51; 도 2c. pLentiCRISPR v2-Cas9 + pDonor 및 pLentiCRISPR v2-Cas9-T2A-Rad51 + pDonor, pLentiCRISPR v2-Cas9 + pEF1α-RAD51 + pDonor; 도 2d. 넉-아웃(knock-out) 및 넉-인(knock-in) 유전체 교정에 대한 모식도.
도 3은 HEK293T(human embryonic kidney 293t) 세포에서의 RAD51의 발현량에 따른 넉-아웃(knock-out) 방식의 GAPDH-targeting CRISPR-Cas9 시스템의 효율을 비교하여 나타낸 도이다.
도 4는 HEK293T (human embryonic kidney 293t) 세포에서의 RAD51의 과발현 여부에 따른 넉-아웃(knock-out) 방식의 유전체 교정 시스템에서의 GADPH 발현 값을 비교하여 정량적으로 나타낸 도이다. 유의 확률은 paired, two-tailed Student’s t test로 측정 및 분석되었다. (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).
도 5는 HEK293T(human embryonic kidney 293t) 세포에서의 RAD51의 발현량에 따른 넉-인(knock-in) 방식의 GAPDH-targeting CRISPR-Cas9 시스템의 효율을 비교하여 나타낸 도이다.
도 6은 HEK293T (human embryonic kidney 293t) 세포에서의 RAD51의 과발현 여부에 따른 넉-인(knock-in) 방식의 유전체 교정 시스템에서의 GADPH 발현 값을 비교하여 정량적으로 나타낸 도이다. 유의 확률은 paired, two-tailed Student’s t test로 측정 및 분석되었다. (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).
도 7은 표적 유전자의 특정 서열에 대해 상보적인 sgRNA 서열을 삽입할 수 있는 pLentiCRISPR v2 벡터 맵을 나타낸 도이다.
도 8은 Rad51 CDS가 삽입된 pLentiCRISPR v2-sgGAPDH-T2A-RAD51 벡터 맵을 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예 1. RAD51 유전자를 삽입한 CRISPR-Cas9 플라스미드 벡터의 제작

본 발명자들은 RAD51 유전자를 삽입한 CRISPR-Cas9 플라스미스 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 먼저 RAD51 유전자를 발현하기 위하여 T2A 펩타이드 서열과 Rad51 CDS 서열을 확보하였다. Rad51 CDS 서열은 서열번호 1에 나타내었고, T2A 펩타이드의 서열은 서열번호 3에 나타내었다. CRISPR-Cas9 플라스미드로는 Cas9 유전자를 포함하는 pLentiCRISPR v2 플라스미드(Addgene, USA)를 사용하였다. 상기 pLentiCRISPR v2 플라스미드의 벡터 맵은 도 5에 나타내었다. 상기 플라스미드 내에 존재하는 Cas9 유전자 서열에 뒤이어 T2A 펩타이드 및 Rad51 CDS 서열을 클로닝한 후, 표적 유전자에 대한 sgRNA 서열을 합성하여 BsmB I enzyme site를 이용하여 표적으로 하는 유전자의 특정 서열에 대한 상보적인 sgRNA 서열을 U6 프로모터에 대해 삽입하였다. 본 발명의 실시예에서 상기 sgRNA는 GAPDH 유전자를 타겟하는 특정 서열을 사용하였다(서열번호 5).

실시예 2. RAD51 유전자를 삽입한 CRISPR-Cas9 플라스미드 벡터의 효율 확인

본 발명자들은 RAD51 유전자의 삽입에 의한 CRISPR-Cas9 시스템의 효율 변화를 측정하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제작한 RAD51 유전자가 삽입된 CRISPR-Cas9 플라스미드(pLentiCRISPR v2-RAD51로 표시)와, RAD51 유전자를 삽입하지 않은 CRISPR-Cas9 플라스미드(pLentiCRISPR v2로 표시)를 각각 인간 세포주에 도입하여 발현시킴으로써, 넉-아웃(knock-out) 및 넉-인(knock-in) 방식의 유전체 교정에서의 교정 효율을 확인하였다.

실시예 2.1. 넉-아웃(knock-out) 방식의 유전체 교정 효율

넉-아웃 방식에 대한 CRISPR-Cas9 벡터 도입

넉-아웃(knock-out) 방식의 유전체 교정에서의 교정 효율을 관찰하기 위한 과정은 다음과 같다.

먼저, 인간세포주 HEK293T 세포를 10% 의 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)과 1%의 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin)을 포함하는 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 상기 각각의 pLentiCRISPR v2-RAD51 및 pLentiCRISPR v2 플라스미드 3 ㎍과 양이온성 고분자인 PEI(polyethyleneimine) 20 ㎍이 포함된 혼합물을 세포주가 배양된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)에 처리하여 형질전환하였다. 이후, 각 세포주를 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양하였고, 1 ㎍/㎖의 항생제(puromycin)를 처리하여 pLentiCRISPR v2-RAD51 및 pLentiCRISPR v2 플라스미드를 가지는 세포들만을 수확하였다(도 2a). 또한, RAD51을 포함하는 개별 벡터(pEF1α-RAD51)를 pLentiCRISPR v2 플라스미드를 갖는 세포에 다시 형질전환(플라스미드 1 ㎍, PEI 10 ㎍)하여 24시간 후 수확함으로써, RAD51의 발현 방식에 따른 유전자 교정 효율도 비교할 수 있도록 하였다(도 2b).

GAPDH 발현량에 따른 넉-아웃 방식의 유전체 교정 효율 확인

넉-아웃(knock-out) 방식의 유전체 교정 효율은 웨스턴 블롯(western blot)을 이용한 GAPDH의 발현량을 비교하여 확인하였다.

그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 대조군(HEK293T normal)과 비교하여 pLentiCRISPR v2-sgGAPDH 벡터를 삽입한 세포(pLentiCRISPR v2)에서 CRIPSR-Cas9 시스템의 영향으로 GAPDH의 발현량이 감소하였다. 이 때 대조군(HEK293T normal)과 pLentiCRISPR v2-sgGAPDH 벡터만을 도입한 세포(pLentiCRISPR v2)와 비교하여 CRISPR v2-T2A-RAD51 벡터가 도입되어 RAD51이 과발현되는 세포(pLentiCRISPR v2-RAD51)에서는 GAPDH의 발현량이 더욱 더 감소하는 양상을 나타냈다. 이는 도 3b에서 pEF1α-RAD51 플라스미드를 개별적으로 pLentiCRISPR v2-sgGAPDH 벡터와 함께 도입한 세포에서 보이는 GAPDH 발현량 감소와 동일한 경향성을 나타낸다.

또한, 도 4a 및 4b에서 GADPH 발현 값을 비교하여 정량적으로 나타내었다. 각 조건에서의 GAPDH의 발현량을 비교한 결과, 대조군의 GAPDH 발현량을 100%로 두었을 때 pLentiCRISPR v2-sgGAPDH 벡터를 삽입한 세포(pLentiCRISPR v2)에서는 약 47%의 GAPDH의 발현량을 나타내었다. 그러나 본 발명의 pLentiCRISPR v2-T2A-RAD51 벡터가 도입된 세포(pLentiCRISPR v2-RAD51)에서는 약 25%의 GAPDH 발현량이 나타났다. 즉, pLentiCRISPR v2-sgGAPDH 벡터를 삽입한 세포(pLentiCRISPR v2)에서는 GAPDH의 발현량이 대조군과 비교하여 약 53% 감소하였으며, pLentiCRISPR v2-T2A-RAD51 벡터가 도입된 세포(pLentiCRISPR v2-RAD51)에서는 대조군과 비교하여 약 75%, pLentiCRISPR v2-sgGAPDH 벡터를 도입한 세포(pLentiCRISPR v2)와 비교했을 땐 약 22% 감소된 GAPDH의 발현량을 확인할 수 있었다(도 4a).

상기 결과는 도 4b의 개별 벡터를 이용하여 RAD51을 발현시킨 세포에서도 동일하게 관찰할 수 있었다. pLentiCRISPR v2-sgGAPDH 플라스미드만을 삽입한 세포(pLentiCRISPR v2)에서는 약 56%의 GAPDH의 발현량을 나타내었다. 그러나 pLentiCRISPR v2-sgGAPDH 및 RAD51 벡터 모두가 도입된 세포에서는 약 26%의 GAPDH 발현량이 나타났다. 즉, 대조군의 GAPDH 발현량을 100%로 두었을 때, pLentiCRISPR v2-sgGAPDH 벡터를 삽입한 세포(pLentiCRISPR v2)에서는 GAPDH의 발현량이 대조군과 비교하여 약 44% 감소하였으며, RAD51 벡터가 따로 도입된 세포(pLentiCRISPR v2 + pEF1α-RAD51)에서는 대조군과 비교하여 약 74%, pLentiCRISPR v2-sgGAPDH 벡터를 도입한 세포(pLentiCRISPR v2)와 비교했을 땐 약 30% 감소된 GAPDH의 발현량을 확인할 수 있었다.

결과적으로, 이는 곧 RAD51 플라스미드를 개별적으로 세포에 삽입할 필요없이 CRISPR v2-T2A-RAD51 단일 벡터만으로 CRISPR-Cas9 시스템의 넉-아웃(knock-out) 유전자 교정 기술 효율을 높일 수 있음을 의미한다.

실시예 2.2. 넉-인(knock-in) 방식의 유전체 교정 효율

넉-인 방식에 대한 CRISPR-Cas9 벡터 도입

넉-인(knock-in) 방식의 유전체 교정에서의 교정 효율을 비교하기 위하여, 상기 실시예 2.1의 넉-아웃(knock-out) 방식과 동일한 과정을 수행하였고, 상기 방법에 추가적으로 GAPDH gene에 대한 homology arm을 가지는 donor 플라스미드 2 ㎍을 각각의 pLentiCRISPR v2-RAD51, pLentiCRISPR v2 및 pLentiCRISPR v2 + pEF1α-RAD51을 포함하는 세포주에, PEI 15㎍ 를 이용하여 형질전환하였다. 이들은 형질전환 후 24시간 후에 수확하였다(도 2c).

GAPDH 발현량에 따른 넉-인 방식의 유전체 교정 효율 확인

넉-인(knock-in) 방식의 유전체 교정에 대해 웨스턴 블롯(western blot)을 이용한 GAPDH의 발현량을 비교함으로써 유전체 교정 효율을 확인하였다.

그 결과는 도 5a에서 확인할 수 있듯이, CRISPR v2-T2A-RAD51 벡터를 이용한 넉-인 방식의 유전자 교정 기술의 효율도, 상술한 넉-아웃 유전자 교정 기술 효율과 유사하게 증가된 양상을 나타내었다. 이는 또한 도 5b에서 pEF1α-RAD51 플라스미드를 개별적으로 pLentiCRISPR v2-sgGAPDH 벡터와 함께 도입한 세포와 동일한 경향성을 나타낸다.

이에 대한 정량적 결과는 도 6a 및 6b에 나타내었다. 그 결과, pLentiCRISPR v2-sgGAPDH 벡터를 삽입한 세포(pLentiCRISPR v2)에서는 약 40%의 GAPDH의 발현량을 나타내었다. 그러나 본 발명의 pLentiCRISPR v2-T2A-RAD51 벡터가 도입된 세포(pLentiCRISPR v2-RAD51)에서는 약 24%의 GAPDH 발현량이 나타났다. 즉, pLentiCRISPR v2-sgGAPDH 벡터를 삽입한 세포(pLentiCRISPR v2)에서는 GAPDH의 발현량이 대조군(100%)과 비교하여 약 60% 감소하였으며, pLentiCRISPR v2-T2A-RAD51 벡터가 도입된 세포(pLentiCRISPR v2-RAD51)에서는 대조군과 비교하여 약 76%, pLentiCRISPR v2-sgGAPDH 벡터를 도입한 세포(pLentiCRISPR v2)와 비교했을 땐 약 16% 감소된 GAPDH의 발현량을 확인할 수 있었다(도 6a).

상기 동일한 결과는 도 6b에서 개별 벡터를 이용하여 RAD51을 발현시킨 세포에서도 관찰할 수 있었다. pLentiCRISPR v2-sgGAPDH 플라스미드만을 삽입한 세포(pLentiCRISPR v2)에서는 약 58%의 GAPDH의 발현량을 나타내었다. 그러나 pLentiCRISPR v2-sgGAPDH 및 RAD51 벡터 모두가 도입된 세포에서는 약 36%의 GAPDH 발현량이 나타났다. 즉, 대조군의 GAPDH 발현량을 100%로 두었을 때, pLentiCRISPR v2-sgGAPDH 벡터를 삽입한 세포(pLentiCRISPR v2)에서는 GAPDH의 발현량이 대조군과 비교하여 약 42% 감소하였으며, RAD51 벡터가 따로 도입된 세포(pLentiCRISPR v2 + pEF1α-RAD51)에서는 대조군과 비교하여 약 64%, pLentiCRISPR v2-sgGAPDH 벡터를 도입한 세포(pLentiCRISPR v2)와 비교했을 땐 약 22% 감소된 GAPDH의 발현량을 확인할 수 있었다.

이를 통해, CRISPR v2-T2A-RAD51 벡터를 통한 넉-인 유전자 교정 기술의 효율이 넉-아웃 유전자 교정 기술 효율과 유사한 양상을 가진다는 것을 다시 한번 보여주었다.

따라서, 상기 넉-아웃(knock-out) 및 넉-인(knock-in) 방식의 유전체 교정 결과로부터, 단일 플라스미드 벡터 내에서 RAD51 단백질의 과발현을 유도함으로써, 종래의 CRISPR-Cas9 시스템을 이용하여 표적 유전자에 대한 편집을 적용하였을 때보다 유전자 교정 기술의 효율이 약 2배 증가한다는 것을 알 수 있었다.

<110> CHUNG ANG University industry Academic Cooperation Foundation <120> Development of CRISPR-Cas9 vector for genome editing in animal cells <130> PN210541 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1020 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rad51 CDS <400> 1 atggctatgc aaatgcagct tgaagcaagt gcagatactt cagtggaaga agaaagtttt 60 ggtccacagc ctatttcacg gttagagcag tgtggcataa atgccaatga tgtgaagaaa 120 ttagaagaag ccggttacca tacagtggag gctgttgctt atgcaccgaa gaaggaacta 180 ataaatatta agggaattag tgaagccaaa gctgacaaaa ttctgactga ggcagcaaaa 240 ttggttccaa tgggtttcac cacggcaact gagtttcacc agcgccggtc agagatcata 300 cagataacta ctggctccaa agagctggac aagctgcttc aaggtggaat tgagactgga 360 tctatcacag agatgtttgg agaattccga actgggaaga cacagatctg tcatacgttg 420 gctgttacat gccagctccc cattgaccgt ggtggaggtg aagggaaggc catgtacatt 480 gacaccgagg gcacctttag gccggagcgg ctgctagcag tagctgagag atacggtctc 540 tctggcagcg atgtcctaga taatgtagca tatgcgcgag ggttcaacac agaccaccag 600 acccagctcc tttaccaagc gtcagccatg atggtagaat ccaggtatgc actgcttatt 660 gtagacagtg ctactgccct ttacagaaca gactactcag ggcggggaga gctttcagcc 720 aggcaaatgc atttggccag atttctgagg atgctgcttc gacttgctga tgagtttggt 780 gtcgcagtgg taatcaccaa ccaggtagta gcccaagtag atggagcagc catgttcgct 840 gcagatccca aaaaacccat tggagggaac atcatcgctc atgcgtcaac caccaggctg 900 tacctgagaa aaggaagagg ggagaccaga atctgcaaaa tctatgactc tccctgtctt 960 cctgaagctg aagctatgtt tgccattaat gcagatggag tgggcgatgc caaagactga 1020 1020 <210> 2 <211> 339 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rad51 protein <400> 2 Met Ala Met Gln Met Gln Leu Glu Ala Ser Ala Asp Thr Ser Val Glu 1 5 10 15 Glu Glu Ser Phe Gly Pro Gln Pro Ile Ser Arg Leu Glu Gln Cys Gly 20 25 30 Ile Asn Ala Asn Asp Val Lys Lys Leu Glu Glu Ala Gly Tyr His Thr 35 40 45 Val Glu Ala Val Ala Tyr Ala Pro Lys Lys Glu Leu Ile Asn Ile Lys 50 55 60 Gly Ile Ser Glu Ala Lys Ala Asp Lys Ile Leu Thr Glu Ala Ala Lys 65 70 75 80 Leu Val Pro Met Gly Phe Thr Thr Ala Thr Glu Phe His Gln Arg Arg 85 90 95 Ser Glu Ile Ile Gln Ile Thr Thr Gly Ser Lys Glu Leu Asp Lys Leu 100 105 110 Leu Gln Gly Gly Ile Glu Thr Gly Ser Ile Thr Glu Met Phe Gly Glu 115 120 125 Phe Arg Thr Gly Lys Thr Gln Ile Cys His Thr Leu Ala Val Thr Cys 130 135 140 Gln Leu Pro Ile Asp Arg Gly Gly Gly Glu Gly Lys Ala Met Tyr Ile 145 150 155 160 Asp Thr Glu Gly Thr Phe Arg Pro Glu Arg Leu Leu Ala Val Ala Glu 165 170 175 Arg Tyr Gly Leu Ser Gly Ser Asp Val Leu Asp Asn Val Ala Tyr Ala 180 185 190 Arg Gly Phe Asn Thr Asp His Gln Thr Gln Leu Leu Tyr Gln Ala Ser 195 200 205 Ala Met Met Val Glu Ser Arg Tyr Ala Leu Leu Ile Val Asp Ser Ala 210 215 220 Thr Ala Leu Tyr Arg Thr Asp Tyr Ser Gly Arg Gly Glu Leu Ser Ala 225 230 235 240 Arg Gln Met His Leu Ala Arg Phe Leu Arg Met Leu Leu Arg Leu Ala 245 250 255 Asp Glu Phe Gly Val Ala Val Val Ile Thr Asn Gln Val Val Ala Gln 260 265 270 Val Asp Gly Ala Ala Met Phe Ala Ala Asp Pro Lys Lys Pro Ile Gly 275 280 285 Gly Asn Ile Ile Ala His Ala Ser Thr Thr Arg Leu Tyr Leu Arg Lys 290 295 300 Gly Arg Gly Glu Thr Arg Ile Cys Lys Ile Tyr Asp Ser Pro Cys Leu 305 310 315 320 Pro Glu Ala Glu Ala Met Phe Ala Ile Asn Ala Asp Gly Val Gly Asp 325 330 335 Ala Lys Asp <210> 3 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A sequence <400> 3 gagggcagag gaagtctgct aacatgcggt gacgtcgagg agaatcctgg ccca 54 <210> 4 <211> 1086 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lentiCRISPRv2-sgGAPDH T2A-Rad51 CDS <400> 4 ggatccgagg gcagaggaag tctgctaaca tgcggtgacg tcgaggagaa tcctggccca 60 atggctatgc aaatgcagct tgaagcaagt gcagatactt cagtggaaga agaaagtttt 120 ggtccacagc ctatttcacg gttagagcag tgtggcataa atgccaatga tgtgaagaaa 180 ttagaagaag ccggttacca tacagtggag gctgttgctt atgcaccgaa gaaggaacta 240 ataaatatta agggaattag tgaagccaaa gctgacaaaa ttctgactga ggcagcaaaa 300 ttggttccaa tgggtttcac cacggcaact gagtttcacc agcgccggtc agagatcata 360 cagataacta ctggctccaa agagctggac aagctgcttc aaggtggaat tgagactgga 420 tctatcacag agatgtttgg agaattccga actgggaaga cacagatctg tcatacgttg 480 gctgttacat gccagctccc cattgaccgt ggtggaggtg aagggaaggc catgtacatt 540 gacaccgagg gcacctttag gccggagcgg ctgctagcag tagctgagag atacggtctc 600 tctggcagcg atgtcctaga taatgtagca tatgcgcgag ggttcaacac agaccaccag 660 acccagctcc tttaccaagc gtcagccatg atggtagaat ccaggtatgc actgcttatt 720 gtagacagtg ctactgccct ttacagaaca gactactcag ggcggggaga gctttcagcc 780 aggcaaatgc atttggccag atttctgagg atgctgcttc gacttgctga tgagtttggt 840 gtcgcagtgg taatcaccaa ccaggtagta gcccaagtag atggagcagc catgttcgct 900 gcagatccca aaaaacccat tggagggaac atcatcgctc atgcgtcaac caccaggctg 960 tacctgagaa aaggaagagg ggagaccaga atctgcaaaa tctatgactc tccctgtctt 1020 cctgaagctg aagctatgtt tgccattaat gcagatggag tgggcgatgc caaagactga 1080 ggatcc 1086 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgGAPDH <400> 5 ttcctcacct gatgatcttg 20

Claims

RAD51 단백질 및 Cas9 단백질을 발현하는 폴리뉴클레오타이드.
제1항에 있어서, 상기 RAD51 단백질은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열에 의하여 인코딩되는 것인, 재조합 벡터.
제 1 항에 있어서, 상기 RAD51 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 벡터.
제 1 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 네이키드 DNA 이거나, 또는 유전자 운반체에 포함되어 있는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
제 4 항에 있어서, 상기 유전자 운반체는 벡터인, 폴리뉴클레오타이드.
제 5 항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 또는 바이러스 벡터인, 폴리뉴클레오타이드.
RAD51 단백질 및 Cas9 단백질을 발현하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유전체 편집용 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 RAD51 단백질 및 Cas9 단백질은 별도의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩 되는 것인, 유전체 편집용 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 RAD51 단백질 및 Cas9 단백질은 단일의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩 되는 것인, 유전체 편집용 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 유전자 편집은 유전자 넉아웃인, 유전체 편집용 조성물.
RAD51 단백질 및 Cas9 단백질을 발현하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주세포.