WO2020197242A1 - 혈우병b 질환 모델 랫드 - Google Patents

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WO2020197242A1
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rat
hemophilia
cells
cell
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이재영
배희숙
신혜정
송동우
김운기
이규준
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주식회사 툴젠
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    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)

Definitions

  • the present invention relates to a hemophilia B disease rat and a method for producing the same, and more particularly, to a hemophilia B disease rat with a knock-down or knock-out of the F9 factor and a method for producing the same. .
  • Hemophilia B or Christmas disease is an inherited X-linked febrile hemorrhagic disease caused by defects in coagulation factor 9. Hemophilia B not only does not stop bleeding continuously at the wound site, but also causes complications such as hemophilia arthrosis as spontaneous bleeding occurs in joints or muscles. In this situation, it is necessary to develop a new treatment that is fundamental and effective, and it is necessary to develop a better animal model to evaluate the efficacy and safety of drugs.
  • the present invention is to provide a rat deficient in F9 factor as a model for hemophilia B disease.
  • a rat animal model can sufficiently show the symptoms of hemophilia B disease, more specifically spontaneous bleeding, which will provide an important tool for future therapeutic development.
  • a hemophilia B disease rat in order to manufacture a hemophilia B disease rat, it is intended to provide a composition including a genetic manipulation technology capable of artificially manipulating the F9 gene.
  • the present application is to provide various uses using the hemophilia B disease rat.
  • One aspect disclosed in the present application relates to a hemophilia B disease rat in which an artificial modification in the genome has occurred.
  • the hemophilia B disease rat in which the artificial modification in the genome has occurred includes the F9 gene in which some or all of the F9 gene is artificially engineered and/or modified.
  • the artificially engineered F9 gene is an exon, an intron, a regulatory region, a 5'end or a site adjacent to it, a 3'end or a site adjacent to it or a splicing site. (splicing site) includes artificial transformation.
  • the modification of the F9 gene nucleic acid sequence includes, but is not limited to, the addition, deletion or substitution of one or more nucleotides in the genome.
  • It may include a knock-down of the nucleic acid sequence or a portion thereof in the F9 gene.
  • hemophilia B rats may contain an artificially modified F9 factor.
  • the artificially modified F9 factor includes alteration and/or substitution of one or more amino acid sequences.
  • amino acids can be changed to amino acids with similar properties.
  • amino acids may be changed to amino acids having different properties.
  • the alteration and/or substitution of the amino acid can control the amount of protein expression.
  • amino acid alteration and/or substitution may affect the structure and function of the protein.
  • the hemophilia B rat contains F9 factor with no expression or reduced expression level, or the hemophilia B rat contains F9 factor with reduced or lost function.
  • One aspect disclosed in the present application relates to a cell comprising an artificially modified F9 factor and/or a gene encoding the same.
  • the cells may be transformed stem cells, embryonic cells, or somatic cells.
  • the transformed cells contain an artificially modified F9 gene.
  • the transformed cell may include a gene in which the addition, deletion or substitution of nucleotides has occurred in one or more regions in the F9 gene.
  • the F9 gene may be a knock-down (knock-down) and / or knock-out (knock-out) cells.
  • the transformed cells may include genetic engineering techniques targeting F9 factor, that is, artificial nuclease, antisense RNA, dominant negative mutant F9, or ribozyme.
  • F9 factor that is, artificial nuclease, antisense RNA, dominant negative mutant F9, or ribozyme.
  • the transformed cell comprises a CRISPR-Cas system, ZFN, TALEN, or a mega nuclease, or a nucleic acid encoding the same.
  • the transformed cell contains small interfiering (siRNA), short hairpin RNA (shRNA), or microRNA, or contains a nucleic acid encoding the same.
  • siRNA small interfiering
  • shRNA short hairpin RNA
  • microRNA or contains a nucleic acid encoding the same.
  • the transformed cell contains a dominant negative mutant F9 targeting the F9 factor, or a ribozyme for a nucleic acid encoding the F9 factor, or contains a nucleic acid encoding the same.
  • the genetic engineering technology is included in various forms within the cell.
  • it may be in the form of a vector containing a nucleic acid encoding the genetic engineering technology.
  • the transformed cell may be a cell with no F9 factor or a reduced expression level.
  • the transformed cells may be cells in which the function of the F9 factor is lost or decreased.
  • the transformed cells may be cells deficient in the F9 factor.
  • the transformed cells can form cell colonies.
  • the cell colony may be a single cell cultured from a single cell.
  • One aspect of the present application relates to a rat comprising an artificially modified F9 factor.
  • the F9 gene is knock-down (knock-down) or knock-out (knock-out), the expression or function of the F9 factor downregulation (downregulation) or it relates to a rat completely lost.
  • knock-down knock-down
  • knock-out knock-out
  • downregulation the expression or function of the F9 factor downregulation (downregulation) or it relates to a rat completely lost.
  • it may be used interchangeably as'rat with artificial deformation'.
  • Rats with the artificial transformation may have bleeding symptoms (continuous bleeding, spontaneous bleeding).
  • Rats in which the artificial transformation has occurred may have spontaneous bleeding and/or external bleeding.
  • the artificially deformed rat comprises spontaneous bleeding in the tissue.
  • the tissues can be joints, muscles and eyes.
  • the genetic engineering technology that causes artificial modification in the F9 gene is one or more selected from technology using artificial nuclease, technology using antisense RNA, technology using mutant genes or proteins, etc. .
  • the F9 genetic engineering technology disclosed in the present application may be one or more selected from the group consisting of an artificial nuclease CRISRP-Cas system, ZFN, TALEN, and mega-nuclease.
  • the artificial nuclease may form a complementary bond with a nucleic acid sequence of all or part of the F9 gene.
  • the artificial nuclease may artificially modify the F9 gene by removing the entire F9 gene, or by deleting, substituting, or inserting nucleotides from the outside.
  • the artificial nuclease is complementary to a partial nucleic acid sequence of an exon region, an intron region, a regulatory region, a splicing site, a 5'terminal portion or a region adjacent thereto, a 3'terminal portion or a region adjacent thereto,
  • the F9 gene can be artificially modified.
  • the F9 genetic engineering technology disclosed in the present application relates to an antisense RNA technology that complementarily binds the F9 gene.
  • the genetic manipulation technology using the antisense RNA may be any one or more of small interfiering RNA (hereinafter referred to as'siRNA'), short hairpin RNA (hereinafter referred to as'shRNA'), and microRNA (hereinafter referred to as'miRNA').
  • the antisense RNA may form a complementary bond with a partial nucleic acid sequence of the F9 gene, and may regulate the expression of the F9 gene protein.
  • the present application may provide a dominant negative mutant, ribozyme, intracellular antibody, peptide, or small molecule for controlling F9 factor function and expression.
  • composition for genetically engineering F9 for producing a hemophilia B disease model rat comprising: guide RNA or DNA encoding the same; And editor protein or DNA encoding it, wherein the guide RNA has a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 21 to 25, and the guide RNA is characterized in that all or part of the F9 gene sequence is a target sequence,
  • the editor protein includes a Cas9 protein derived from Streptococus pyogenes, and the guide RNA and the editor protein form a guide RNA-editor protein complex to cause artificial modification of the F9 gene. It is characterized.
  • the guide RNA and the editor protein may exist in the form of a complexed RNP (ribonucleoprotein).
  • DNA encoding the guide RNA and DNA encoding the editor protein may exist in a vector form.
  • RNA having a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 21 to 26 is provided.
  • the present specification is to provide a composition for producing a rat model of hemophilia B disease.
  • One aspect of the content disclosed by this application relates to a composition for engineering or modifying the F9 gene.
  • the composition for manipulating or modifying the F9 gene may include the artificial nuclease or a nucleic acid encoding the same.
  • the artificial nuclease can be any one or more of TALEN, ZFN, mega nuclease or CRISPR-enzyme system.
  • the composition for genetic manipulation of F9 may include a guide RNA capable of forming a complementary bond with some nucleic acid sequences in the F9 gene, and a Cas9 enzyme or a complex thereof.
  • composition for F9 genetic manipulation may include antisense RNA, such as siRNA or shRNA, capable of forming a complementary bond with some nucleic acid sequences in the F9 gene.
  • antisense RNA such as siRNA or shRNA
  • composition for genetic manipulation of F9 may include a dominant negative mutant F9 factor or ribozyme.
  • the composition may contain one or more guide RNAs and Cas9 enzymes or complexes thereof, antisense RNA, and any one or more of the dominant negative mutant F9 factor.
  • composition may be provided in the form of an expression cassette.
  • the F9 genetic engineering technology is included in the composition in the form of a viral vector, a non-viral vector or a non-vector.
  • composition includes a technique for engineering F9 gene in the form of a ribonucleoprotein (RNP).
  • RNP ribonucleoprotein
  • the composition comprises a recombinant expression vector comprising F9 genetic engineering technology.
  • An aspect of the present application includes the step of delivering a genetic engineering technology into rat cells to artificially modify the F9 gene.
  • the F9 genetic engineering technology may be delivered using a naked nucleic acid vector, a non-viral vector, or a viral vector.
  • in order to prepare a rat in which the artificial modification has occurred may include the step of introducing an F9 genetic manipulation technique using a non-viral vector in the rat cell.
  • the guide RNA-Cas9 complex may be delivered intracellularly by a microinjection method. That is, it can be delivered in the form of ribonucleoprotein (RNP).
  • RNP ribonucleoprotein
  • the guide RNA-Cas9 complex refers to a complex formed through the interaction of guide RNA and CRISPR enzyme.
  • Rat-derived cells transformed with a recombinant expression vector for artificially modifying the F9 gene may be proliferated and cultured according to a method known in the art.
  • Another aspect of the present application may include selecting a transformed cell comprising the F9 target genetic engineering technology.
  • the transformed cells are selected from colonies using at least one of an antibiotic resistance gene, an antigen-antibody reaction, a fluroscent protein, and a surface marker gene. can do.
  • One aspect disclosed herein relates to a method for producing F9 genetically engineered rats using a method of transplanting embryonic cells.
  • the artificial nuclease specifically binds to the F9 gene site in the embryo to cause a change in the cellular chromosome, thereby forming an artificially modified F9 gene
  • One aspect disclosed in the present specification is the production of a transgenic rat for a hemophilia B disease model in which the F9 gene is artificially modified and knocked out by transplanting the nucleus of a nuclear donor cell into which a recombinant vector has been introduced into an enucleated egg It relates to a method and a rat for hemophilia B disease model prepared thereby.
  • hemophilia B disease rats are produced by somatic cell nuclear transfer (SCNT) using a transformed cell line artificially modified and knocked out of the F9 gene.
  • SCNT somatic cell nuclear transfer
  • hemophilia B disease rat production method The hemophilia B disease rat production method
  • step (d) microinjecting and fusing the nuclear donor cells of step (b) into the enucleated oocytes of step (c);
  • each step may be understood by referring to a method for preparing a cloned animal using a conventional somatic cell nuclear transfer technique known in the art.
  • a method for producing a hemophilia B disease model rat comprising an artificial modification in the F9 gene, including: F9 genetic manipulation for producing the hemophilia B disease model rat in rat cells By contacting the composition, this results in an artificial modification in the F9 gene of the cell; And introducing the cells into a rat to prepare a hemophilia B disease model rat.
  • the contacting may be performed by one or more methods selected from electroporation, liposomes, plasmids, viral vectors, nanoparticles, and PTD (Protein translocation domain) fusion protein methods.
  • an animal model for drug screening for hemophilia B treatment can be provided using a novel hemophilia B disease rat. Or more specifically, it is possible to provide an animal model for drug screening for preventing or treating hemophilia B natural bleeding.
  • the drug screening method for hemophilia B is the drug screening method for hemophilia B
  • the candidate material is preferably any one or more selected from the group consisting of peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts and animal tissue extracts, but is not limited thereto.
  • the compound may be a novel compound or a known compound. At this time, the compound may be forming a salt.
  • a hemophilia B disease rat it is possible to provide a hemophilia B disease rat. Specifically, a hemophilia B disease rat in which the F9 factor is artificially modified may be provided.
  • hemophilia B disease rat provided in the present specification is not only useful for studying the mechanism that is genetically similar to humans and is the exact cause of the disease, but is also used in various ways such as animal modeler, optimal for drug screening, search for therapeutic substances for hemophilia B disease, and development of diagnostic methods. Therefore, it will be very useful as an animal model of hemophilia B disease.
  • FIG. 1 is a graph comparing and analyzing F9 (+/+) rats and F9 (-/-) rats, (a) Appt (activated partial trombo) of F9 (+/+) rats and F9 (-/-) rats Plastine time) is compared and analyzed. (b) shows a graph comparing and analyzing thrombin times of F9 (+/+) rats and F9 (-/-) rats. (c) shows a graph comparing platelet counts of F9 (+/+) rats and F9 (-/-) rats.
  • FIG. 3 is a photograph showing the results of observing and performing hematoxylin and eosin staining (H&E staining) by cutting out only the painful area of the F9 rat in order to confirm the morphology of the pain area of the F9 rat.
  • H&E staining hematoxylin and eosin staining
  • FIG. 4 is a photograph showing spontaneous bleeding in rats in which the F9 gene is knocked out.
  • 5 is a photograph showing symptoms appearing on the soles of rats in which the F9 gene is knocked out.
  • 6 is a photograph showing symptoms appearing in the eyes of rats in which the F9 gene is knocked out.
  • Fig. 7 is a photograph showing symptoms in young livestock of rats in which the F9 gene is knocked out.
  • FIG. 8 is a photograph showing the results of performing hematoxylin and eosin staining (H&E staining) in order to observe the histological changes of the femoral muscles of F9 (+/+) rats and F9 (-/-) rats. .
  • Transformation, genetic modification refers to artificially modifying the polynucleotide contained in the animal genome in a cell. The modification is to remove a part of the polynucleotide (polynucleotide) contained in the animal genome (animal genome) in the cell, replace a part, and the nucleotide (nucleotide) or polynucleotide in the animal genome (animal genome) polynucleotide).
  • transformation in the present application includes adding, altering or removing proteins or RNAs that can be expressed in cells.
  • Transformed cell means a cell containing a transformed portion of the genome of an animal within a cell.
  • Transgenic animal means an animal containing at least one transformed cell.
  • Animal F0 may comprise a first transgenic cell.
  • the animal F0 is capable of producing progeny Fl.
  • the one or more cells included in the F1 and F1 or less progeny may include an animal genome including a portion having the same nucleotide sequence as the transformed portion of the animal's genome in the first transgenic cell. .
  • The'transgenic animal' of the present application includes the F0, F1, and F1 or less offspring.
  • Disease model animal refers to an animal with a disease very similar to human disease. The significance of disease model animals in human disease research is based on the physiological or genetic similarity between humans and animals. In disease research, biomedical disease model animals provide materials for research on various causes, pathogenesis, and diagnosis of diseases. Through the study of disease model animals, genes related to diseases can be identified, and interactions between genes can be understood. It is possible to obtain basic data to determine the possibility of practical use through the actual efficacy and toxicity test of the developed new drug candidate.
  • Animal refers to any mammal, rodent, etc. other than humans.
  • the animal includes animals of all ages, including embryos, fetuses, newborns and adults.
  • Animals for use herein are available, for example, from commercial sources. These animals are laboratory animals or other animals, rabbits, rodents (e.g. mice, rats, hamsters, gerbils and guinea pigs), cattle, sheep, pigs, goats, horses, dogs, cats, birds (e.g., Chickens, turkeys, ducks, geese), primates (eg, chimpanzees, monkeys, rhesus monkeys). The most preferred animals are rats.
  • rodents e.g. mice, rats, hamsters, gerbils and guinea pigs
  • cattle sheep, pigs, goats, horses, dogs, cats
  • birds e.g., Chickens, turkeys, ducks, geese
  • primates eg, chim
  • Engineerered nuclease refers to an artificial nuclease and/or a system containing the same that can damage or destroy a specific nucleic acid site, for example, a specific DNA site by binding to an arbitrary gene. It's a term. It is also referred to as “target-specific (endo) nuclease” or “gene scissors”. The artificial nuclease is a sequence-specific endonuclease.
  • Sequence-specific endonuclease or “sequence-specific nuclease”, unless specifically indicated otherwise, recognizes and binds to a polynucleotide, such as a target gene, in a specific nucleotide sequence, and the polynucleotide Refers to a protein that catalyzes single- or double-strand breaks in. Since a nucleic acid can be cut by specifically recognizing a specific sequence, it is very useful for gene editing technology. For example, there are zinc finger protein (ZFN), transcription activator-like effector protein (TALEN), RNA-guided endonuclease (RGEN) including the CRISPR/Cas system.
  • ZFN zinc finger protein
  • TALEN transcription activator-like effector protein
  • RGEN RNA-guided endonuclease
  • CRISPR-enzyme system is a complex containing a protein that can cut a portion of a target site by interacting with a target site on the genome of an animal in a cell or a target site of an exo-polynucleotide. it means.
  • the CRISPR-enzyme system may include a guide nucleic acid and a CRISPR enzyme.
  • “Knock-out” refers to a modification on the gene sequence that results in the deterioration of the function of the target gene, preferably whereby the target gene expression is not detectable or meaningless.
  • the knockout of the F9 gene means that the function of the F9 gene is substantially lowered so that the expression cannot be detected or exists only at an insignificant level.
  • the knockout transformant may be a transgenic animal having a heterozygous knockout of the F9 gene or a homozygous knockout of the F9 gene.
  • Knockout includes, for example, exposing the animal to a substance that promotes target gene modification, introducing an enzyme that promotes recombination at a target gene site, or other methods of directing target gene modification after birth, a target gene. Also included are conditional knockouts in which the deformation of can occur.
  • Target gene refers to a nucleic acid that encodes a polypeptide in a cell, unless specifically stated otherwise.
  • Target sequence refers to a portion of a target gene, for example, one or more exon sequences of a target gene, intron sequences or regulatory sequences of a target gene, or exon and intron sequences of a target gene, introns, unless specifically indicated otherwise. And regulatory sequences, exons and regulatory sequences, or combinations of exons, introns and regulatory sequences.
  • “Cultivation” is the growth of living organisms or parts of living organisms (organs, tissues, cells, etc.) under appropriately artificially controlled environmental conditions.
  • external conditions include temperature, humidity, light and gaseous composition (carbon dioxide or oxygen). Partial pressure), etc. are important, and the most important direct influence on the organism to be cultured is the medium (incubator), which is the direct environment of the organism and the supply of various nutrients necessary for survival or proliferation.
  • “In vitro culture” refers to a series of laboratory processes in which cells are cultured in a laboratory incubator under conditions similar to the internal environment in a manner that is distinguished from the state in which cells grow in the body.
  • Cell refers not only to the specific target cell, but also to the progeny or potential progeny of such a cell. Since certain modifications can occur laterally by mutation or environmental influence, such progeny may In fact, it will not be identical to the parental cell, but is still included within the term and scope used herein.
  • modified or “engineered” applied to a nucleic acid are used interchangeably herein, and refer to artificial modification in the nucleic acid sequence constituting a gene.
  • the modification may include deletion, substitution, insertion or inversion of one or more nucleic acids.
  • Modified or organized nucleic acid sequences may appear in the form of altering, for example, increasing, promoting, decreasing or losing the expression and/or functional activity of these nucleic acids or expression products thereof.
  • Nuclear donor cell refers to a cell or nucleus of a cell that transfers the nucleus to a nuclear receptor, a recipient egg. "Ovum” preferably refers to a mature egg that has reached the middle of the second meiosis. In the present specification, rat somatic cells or stem cells may be used as the nuclear donor cells.
  • a “somatic cell” is a cell other than a germ cell among cells that make up a multicellular organism, and is a differentiated cell that specializes for some purpose and does not become a cell other than that, and a cell that has several types of different functions. It includes cells that have the ability to differentiate.
  • “Stem cell” means a cell that can develop into any tissue. There are two existing characteristics. First, it has the ability to differentiate itself into cells with specific functions depending on the environment, self-renewal, which creates oneself by repetitive division.
  • Nuclear transfer refers to the introduction of a donor nucleus obtained from another cell into the oocyte after removing the nucleus from the oocyte. “Nuclear transfer” is a step of removing a nucleus from an animal oocyte and then introducing a donor nucleus obtained from an animal cell, a reprogramming step, a differentiation step, and It includes a technique of obtaining an animal containing the same genetic information as an animal cell containing a donor nucleus through a surrogate mother transplantation step.
  • Somatic cell nuclear transfer refers to a nuclear transfer in the case where a cell containing the donor nucleus is a somatic cell.
  • The'somatic cell nuclear transfer (SCNT)' is the same as the somatic cell through the above-mentioned steps when the animal cell containing the donor nucleus is a somatic cell. It includes techniques for obtaining animals that contain genetic information.
  • Transgenic animals can be produced through delivery to cells containing the donor nucleus.
  • a transgenic animal can be prepared through somatic cell microinjection and then somatic cell nuclear transfer (SCNT).
  • SCNT somatic cell nuclear transfer
  • “Medium” or “medium composition” refers to a mixture for growth and proliferation of cells, etc. in vitro containing essential elements such as sugar, amino acids, various nutrients, serum, growth factors, minerals, etc. essential for the growth and proliferation of cells.
  • Treatment means an approach to obtain beneficial or desirable clinical outcomes.
  • beneficial or desirable clinical outcomes include, but are not limited to, alleviation of symptoms, reduction of disease range, stabilization of disease state (i.e., not exacerbation), delay or decrease in disease progression, disease state Amelioration or temporal mitigation and mitigation (partially or entirely) of, detectable or undetectable.
  • Treatment refers to both therapeutic treatment and prophylactic or preventative measures. Such treatments include the disorder to be prevented as well as the treatment required for a disorder that has already occurred. “Palliating” the disease is a reduction in the extent and/or undesirable clinical signs of the disease state and/or a delayed or prolonged time course of progression compared to untreated. Means to lose.
  • “About” means 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 for a reference amount, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight or length. , Means an amount, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight or length varying by 3, 2 or 1%.
  • Hemophilia B or Christmas disease is an inherited X-linked recessive hemorrhagic disease caused by the binding of factor F9 (coagulation factor 9, FIX). Hemophilia B is a disease associated with a deficit in the amount or function of F9 factor.
  • hemophilia symptoms i.e., bleeding
  • central nervous system trauma or bleeding including lumbar spine, epidural anesthesia, etc.
  • space bleeding behind the peritoneum extraction including anesthesia, severe gastrointestinal bleeding, upper respiratory and respiratory tract bleeding, intra-articular Hemorrhage and muscle bleeding, superficial hematoma, oral bleeding, hypoplasia, nasal bleeding, mild hematuria, and excessive menstruation.
  • intra-articular bleeding refers to the appearance of knees, elbows, ankles, shoulders, hips (high joints), and wrists.
  • spontaneous bleeding also known as spontaneous bleeding or spontaneous internal bleeding, refers to bleeding that occurs suddenly without any signs of daily life without trauma or special factors, and spontaneous bleeding in joints and/or muscles. Symptoms often appear in hemophilia B. The spontaneous bleeding may occur in one or more of joints, muscles, gastrointestinal tract, kidney, brain, nose, and eyes. Such spontaneous bleeding causes complications, and a symptom of joint deformity and inflammation due to repetitive intra-articular bleeding is one of the typical symptoms of hemophilia. Accordingly, it is important to develop a spontaneous bleeding prevention or treatment for hemophilia B treatment.
  • External bleeding refers to visible bleeding outside the body. In other words, it means that bleeding occurs due to trauma such as cuts, tooth extractions, and symptoms that do not stop bleeding at the surgical site.
  • Fractor9 (hereinafter referred to as'F9') is one of the blood clotting factors and is an essential protein for the formation of blood clots.
  • the F9 factor refers to any type of factor 9 molecule having representative properties of the ninth blood coagulation factor.
  • Factor F9 is a single-chain glycoprotein in plasma that plays an essential role in the endogenous coagulation pathway, and factor 9a (FIXa), an activated form of factor F9 in the endogenous coagulation pathway, interacts with factor 8a, phospholipids, and calcium ions. It forms a "tenase” complex that converts the factor to factor 10a.
  • This F9 factor consists of a Gla domain, two EGF domains (EGF-1 and EGF-2), an AP region, and a serine protease domain.
  • the “mutated F9 factor” may be an F9 factor in which protein function is reduced or lost due to artificially modified or artificially engineered.
  • Wild type refers to the most commonly seen gene in nature or any allele designated as normal. For example, it may be a normal gene form that does not show a specific disease.
  • artificially modified or artificially engineered refers to a state that has been artificially modified, not as it exists in the natural state.
  • the artificially modified state may be a modification that artificially generates a mutation in a wild-type gene.
  • the unnaturally modified F9 gene may be used interchangeably with the term artificial F9 gene.
  • the F9 factor is, for example, NCBI Accession No. It may be the F9 gene expressed by NM_031540, but is not limited thereto.
  • Means for artificially manipulating genes include technology using an artificial nuclease, technology using antisense RNA, and technology using mutant genes or proteins.
  • “Artificially engineered nucleases” include any type of nuclease that can be cut by recognizing a specific location on the genome of interest.
  • the artificial nuclease can cause double strand break (DSB) by recognizing a specific nucleotide sequence in the genome of prokaryotic cells and/or animal and plant cells (eg, eukaryotic cells) including human cells.
  • the double helix cleavage may cut the double helix of DNA to create a blunt end or a cohesive end.
  • DSB can be efficiently repaired in cells by homologous recombination or non-homologous end-joining (NHEJ) mechanisms.In this process, artificial nucleases replace and insert one or more nucleotides. And an enzyme capable of causing deletion and the like.
  • an artificial nuclease that causes artificial modification in a gene is a TALEN in which a transcription activator-like effector domain and a cleavage domain derived from a plant pathogenic gene, a domain that recognizes a specific target sequence on the genome, are fused.
  • transcription activator-like effector nuclease transcription activator-like effector nuclease
  • zinc-finger nuclease zinc-finger nuclease
  • meganuclease CRISPR-enzyme protein
  • Cpf1 protein Cpf1 protein
  • the artificial nuclease may form a complementary bond with a nucleic acid sequence of all or part of a gene.
  • the artificial nuclease can artificially modify the gene by removing the entire gene, or by deleting, replacing, or inserting nucleotides from the outside of some nucleic acid sequence in the F9 gene.
  • the artificial nuclease complementarily binds to some of the nucleic acid sequences of the exon region, intron region, regulatory region, splicing site, 5'end portion or region adjacent thereto, 3'terminal portion or region adjacent thereto, and F9 Genes can be artificially modified.
  • the object of the “artificial manipulation” may be a target nucleic acid, gene, chromosome or protein.
  • the artificial nuclease may manipulate or modify a target sequence in a gene to regulate the amount, activity, or function of the expressed protein, or may express a modified protein.
  • the artificial nuclease may manipulate or modify a target sequence in a gene to inhibit, inhibit, reduce, promote or increase the amount of protein expression.
  • the artificial nuclease can suppress, inhibit, decrease, promote or increase protein expression activity by manipulating or modifying a target sequence in a gene.
  • the artificial nuclease may manipulate or modify a target sequence in a gene, thereby removing, decreasing, adding or enhancing the function of a protein.
  • Any one or more of the above genetic manipulation techniques may act in the stages of transcription and translation of genes.
  • any one or more of the above genetic engineering techniques may promote or inhibit transcription by manipulating or modifying a target sequence that regulates transcription.
  • any one or more of the above genetic engineering techniques can control protein expression by manipulating or modifying a target sequence that regulates protein expression.
  • the CRISPR-enzyme system can be used as a means for artificially manipulating genes.
  • the CRISPR-enzyme system consists of a guide nucleic acid and/or an editor protein.
  • guide nucleic acid refers to a nucleotide sequence capable of recognizing a target nucleic acid, gene or chromosome, and interacting with an editor protein.
  • the guide nucleic acid may form a complementary bond with a target nucleic acid, a gene, or some nucleotide in a chromosome.
  • the guide nucleic acid may be in the form of a target DNA-specific guide RNA, a DNA encoding the guide RNA, or a DNA/RNA mixture.
  • the guide nucleic acid may be a guide RNA.
  • the “guide RNA” may be transcribed in vitro, and in particular, may be transcribed from an oligonucleotide double strand or a plasmid template, but is not limited thereto.
  • Editor protein refers to a peptide, polypeptide or protein that directly binds to a nucleic acid, or which does not bind directly, but can interact.
  • the editor protein is conceptually referred to as “artificially engineered nuclease” or RGEN (RNA-Guided Endonuclease).
  • the editor protein may be a CRISPR enzyme.
  • CRISPR enzyme is a major protein component of the CRISPR-enzyme system, and refers to a nuclease capable of recognizing a target sequence and cutting DNA by mixing or forming a complex with a guide RNA.
  • the CRISPR enzyme is known to those skilled in the art, and see Korean Patent Publication No. 10-2018-00187457 .
  • the CRISPR enzyme is used herein as a concept including all variants capable of acting as endonucleases or nickases activated in cooperation with guide RNA in addition to native proteins.
  • an activated endonuclease or nickase target DNA cleavage can be brought, and genome editing can be brought about using this.
  • an inactivated variant it can be used to regulate transcription or to separate the desired DNA.
  • the isolated Cas protein may also be in a form that is easy to be introduced into cells.
  • the Cas protein may be linked to a cell penetrating femtide or a protein transduction domain.
  • the protein transduction domain may be poly-arginine or a TAT protein derived from HIV, but is not limited thereto. Since various types of cell penetrating peptides or protein transduction domains are known in the art in addition to the above-described examples, those skilled in the art are not limited to the above examples and may apply various examples to the present specification.
  • Zinc finger DNA binding protein (or binding domain) is a protein that binds DNA in a sequence-specific manner through one or more zinc fingers, which are amino acid sequence regions within a binding domain whose structure is stabilized through coordination of zinc ions, or It is a domain within a larger protein.
  • the term “zinc finger DNA binding protein” is primarily abbreviated as zinc finger protein or ZFP.
  • the zinc-finger nuclease includes a zinc-finger protein engineered to bind to a target gene and a target site of a cleavage domain or a cleavage half-domain.
  • the ZFN may be an artificial restriction enzyme including a zinc-finger DNA binding domain and a DNA cleavage domain.
  • the zinc-finger DNA binding domain may be engineered to bind to the selected sequence.
  • Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al, (2001) Nature Biotechnol. 19: 656-660; Segal et al.
  • engineered zinc finger binding domains may have novel binding specificities.
  • Operation methods include, but are not limited to, rational design and various types of selection. Rational design includes, for example, the use of a database comprising triple (or quadruple) nucleotide sequences, and individual zinc finger amino acid sequences, wherein each triple or quadruple nucleotide sequence is of a zinc finger that binds to a specific triple or quadruple sequence. Associated with one or more sequences.
  • zinc finger domains and/or multi-finger zinc finger proteins are by any suitable linker sequence, e.g., a linker comprising a linker of 5 or more amino acids in length. Can be linked together. Examples of linker sequences having a length of 6 or more amino acids are described in US Patent No. 6,479,626; 6,903,185; See 7,153,949.
  • the proteins described herein may contain any combination of suitable linkers between each zinc finger of the protein.
  • Nucleases such as ZFN contain a cleavage domain and/or a cleavage half-domain that is a nuclease active moiety.
  • the cleavage domain may be a cleavage domain derived from a nuclease different from the zinc-finger DNA binding domain, that is, a heterologous cleavage domain.
  • the cleavage half-domain may be a fusion protein derived from any nuclease or a portion thereof requiring dimerization for cleavage activity. If the fusion protein comprises a cleavage half-domain, generally two fusion proteins may be required for cleavage. Alternatively, a single protein comprising two truncated half-domains can be used.
  • the two truncated half-domains may be derived from the same endonuclease (or functional fragments thereof), or each truncated half-domain may be derived from a different endonuclease (or functional fragments thereof).
  • the target sites of the two fusion proteins are positioned so that the cleavage-half domains are spatially oriented with respect to each other by the binding of the two fusion proteins and their respective target sites, so that the cleavage half-domain is, for example, dimeric. It is preferred that they are arranged in a relationship that allows the formation of functional cleavage domains by embodiment.
  • TALEN refers to a nuclease capable of recognizing and cutting a target region of DNA.
  • the TALEN is a fusion protein comprising a TALE domain and a nucleotide cleavage domain.
  • TAL effector nuclease and “TALEN” may be used interchangeably.
  • TAL effectors are known as proteins secreted through their type secretion system when Xanthomonas bacteria infect various plant species.
  • the protein can activate the expression of plant genes that aid in bacterial infection by binding with promoter sequences in the host plant.
  • the protein recognizes the plant DNA sequence through a central repeat domain consisting of a variable number of amino acid repeats up to 34.
  • TALE domain or “TALE” is a polypeptide comprising one or more TALE repeat domains/units. This repeat domain is involved in the binding of TALE to its cognate target DNA sequence.
  • a single “repeat unit” (also referred to as “repeat”) is typically 33-35 amino acids long and exhibits at least some sequence homology with other TALE repeat sequences in the naturally occurring TALE protein.
  • the TALE domain is a protein domain that binds to nucleotides in a sequence-specific manner through one or more TALE-repeat modules.
  • the TALE DNA binding domain includes at least one TALE-repeat module, more specifically 1 to 30 TALE-repeat modules, but is not limited thereto.
  • TALE DNA binding domain TALE domain
  • TALE effector domain may be used interchangeably.
  • the TALE DNA binding domain may comprise half of the TALE-repeat module.
  • the entire contents disclosed in International Publication No. WO/2012/093833 or US 2013-0217131 are incorporated herein by reference.
  • the meganucleases may be, but are not limited to, naturally-occurring meganucleases and they recognize 15-40 base pair cleavage sites, which are usually classified into 4 families: LAGLIDADG family, GIY-YIG family, His-Cyst box family, and HNH family.
  • Exemplary meganucleases are I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-SceI, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI , I-TevI, I-TevII and I-TevIII.
  • the artificially engineered meganuclease is a genetically engineered meganuclease to have a novel binding specificity.
  • a naturally-occurring or artificially engineered DNA binding domain derived from a meganuclease is linked to a cleavage domain derived from a heterologous nuclease (e.g., FokI) to cause one or more genetic modifications in the gene, thereby knocking down (Knock- down) or knock-out.
  • a heterologous nuclease e.g., FokI
  • Antisense RNA uses RNA interference (RNA silencing), and small RNAs (sRNAs) interfere with, degrade, or in some cases destroy mRNA, and protein synthesis information is not transmitted in the middle. Do not let it. Antisense RNA can be used to control the expression of genetic information.
  • RNA interference RNA silencing
  • sRNAs small RNAs
  • expression of a gene can be attenuated or destroyed using antisense RNA technology.
  • the genetic engineering technology using the antisense RNA is any of small interfiering RNA (hereinafter referred to as'siRNA'), short hairpin RNA (hereinafter referred to as'shRNA') and microRNA (hereinafter referred to as'miRNA'). There can be more than one.
  • the antisense RNA may form a complementary bond with a partial nucleic acid sequence of a gene, and may regulate gene protein expression.
  • a complementary bond with some nucleic acid sequences in an exon region, an intron region, a regulatory region, a splicing site, a 5'end portion or a region adjacent thereto, a 3'end portion or a region adjacent thereto.
  • a dominant negative mutant, ribozyme, intracellular antibody, peptide, or small molecule may be used to manipulate the factors expressed by the gene rather than direct gene manipulation.
  • a factor that does not function normally may be expressed.
  • a peptide or small molecule may be used to induce a target factor to function in a cell.
  • the material for genetic manipulation may be delivered using a naked nucleic acid vector, a non-viral vector, or a viral vector.
  • the vector may be a viral or non-viral vector (eg, a plasmid).
  • vector can transfer a gene sequence to a cell.
  • vector construct expression vector
  • gene transfer vector refer to any nucleic acid construct capable of directing expression of a gene of interest and capable of delivering a gene sequence to a target cell.
  • a known expression vector such as a plasmid vector, a cozmid vector, or a bacteriophage vector
  • the vector is according to any known method using DNA recombination technology. It can be easily prepared by a person skilled in the art.
  • the “gene transfer vector” refers to any nucleic acid construct capable of directing expression of a gene of interest and capable of transferring a gene sequence to a target cell.
  • the term encompasses cloning, and incorporating expression vehicles as well as vectors.
  • the vector may be a recombinant expression vector.
  • it may be a vector containing a material for genetic manipulation.
  • Recombinant expression vector for artificially modifying the gene may include a promoter (promoter).
  • promoter a promoter in the art can be used.
  • A'promoter' is a regulatory sequence that is a region of a nucleic acid sequence in which transcription initiation and rate are regulated. These promoters may contain a genetic element capable of initiating specific transcription of a nucleic acid sequence by binding of transcription factors such as RNA polymerase and other regulatory proteins.
  • the terms'effectively positioned','effectively bound','under control' and'under transcriptional control' refer to the correct position and/or orientation of action in relation to the nucleic acid sequence where the promoter regulates transcription initiation and expression of the sequence. Means to be placed.
  • the promoter may be an endogenous promoter or an exogenous promoter within the target region.
  • the promoter may be a promoter recognized by RNA polymerase II or RNA polymerase III.
  • the promoter may be a constitutive promoter, an inducible promoter, a target specific promoter, a viral promoter or a non-viral promoter.
  • the promoter may use a suitable promoter according to the control region (ie, guide RNA, CRISPR enzyme).
  • a suitable promoter ie, guide RNA, CRISPR enzyme.
  • useful promoters for guideRNAs may be H1, EF-1a, tRNA or U6 promoters.
  • useful promoters for editor proteins can be CMV, EF-1a, EFS, MSCV, PGK or CAG promoters.
  • the recombinant expression vector for artificially modifying the gene may include a reporter gene, and the report gene may include a reporter system.
  • the recombinant expression vector for artificially modifying the gene may include a selection marker, and the selection marker includes an antibiotic resistance gene such as a kanamycin resistance gene, a neomycin resistance gene, a green fluorescent protein, and a fluorescence such as a red fluorescent protein. Protein and the like are included, but are not limited thereto.
  • the recombinant expression vector for artificially modifying the gene may additionally include a protein separation, purification or identification tag sequence.
  • the tag sequence include GFP, GST (Glutathione S-transferase)-tag, HA, His-tag, Myc-tag, T7-tag, and the like, but the tag sequence of the present invention is not limited by the above examples.
  • the recombinant expression vector for artificially modifying the gene is a replication origin, enhancer, any essential ribosome binding site, kozak consensus sequence, polyadenylation site, splice donor and receptor site, transcription termination. Sites, 5'flanking non-transcriptional sequences, inteins and/or 2A sequences, and the like.
  • the above genetic engineering techniques can be delivered into cells using viruses.
  • RNA-based viral vector may be used for the viral delivery.
  • the RNA-based viral vector may include an Oncoretroviral vector, a lentiviral vector, and a human foamy viral vector. Not limited.
  • a DNA-based viral vector may be used.
  • the DNA-based viral vector is adenovirus, adeno-associated virus, Epstein-Barr virus, and Herpes simplex virus. ), and poxvirus, but is not limited thereto.
  • the material for genetic manipulation may be delivered into a subject using one or more vectors.
  • the editor protein and the guide RNA may be encoded and delivered in different vectors.
  • the material for genetic manipulation is delivered in the genome using two or more vectors, it may be delivered using the same or different types of vectors.
  • guide nucleic acids can be delivered using plasmids while editor proteins can be delivered using viral vectors.
  • the material for genetic manipulation may be delivered into cells using a non-virus.
  • a naked nucleic acid vector may be used.
  • the naked nucleic acid vector may be a circular nucleic acid vector or a linear nucleic acid vector. May be, but is not limited thereto.
  • the non-viral delivery can use a non-viral vector.
  • the non-viral vector is artificial chromosome, liposome, polymer, lipid-polymer hybrid, inorganic nanoparticle, and organic nanoparticle. nanoparticle), but is not limited thereto.
  • the non-viral delivery is microinjection, gene gun, electroporation, sonoporation, photoporation, magnetofection ( magnetofection), and hydroporation, but is not limited thereto.
  • Microinjection means the injection of a substance into an organ, manipulation, cell, or organelle within a living organism.
  • the material may include a chemical compound, a polynucleotide, or a polypeptide.
  • the microinjection may include gamete microinjection, embryo microinjection, somatic cell microinjection, and the like.
  • the embryo microinjection refers to microinjection of a material containing polynucleotides into an embryo. After microinjection of a material containing polynucleotides into an embryo, a transgenic animal is transferred through a differentiation step, etc. Include the skills you get.
  • the somatic cell microinjection refers to microinjection of a material containing polynucleotides into somatic cells. After microinjection into the somatic cells, a transgenic animal can be obtained by a nuclear transfer method.
  • the guide RNA-editor protein complex may be delivered intracellularly by a microinjection method. That is, it can be delivered in the form of ribonucleoprotein (RNP).
  • RNP ribonucleoprotein
  • the guide RNA-editor protein complex refers to a complex formed through the interaction of guide RNA and CRISPR enzyme.
  • the animal model using the mouse (mice) cannot reveal some symptoms due to hemophilia, so research is being continued to develop an animal model similar to the disease-causing mechanism and symptoms of hemophilia patients.
  • mice do not show spontaneous bleeding in tissues such as joints and muscles, which is one of the representative symptoms of hemophilia B. It is not enough.
  • other mammalian animal species such as dogs have limitations in their use as animal models in terms of reproduction and cost compared to rodents.
  • hemophilia B disease rat As an animal for a hemophilia B disease model, to provide a hemophilia B disease rat.
  • the hemophilia B disease rat 1) contains an artificially modified F9 gene, 2) has an artificially modified F9 factor, and 3) bleeding symptoms (eg, persistent bleeding and/or spontaneous bleeding) It is characterized by being able to appear. For this reason, the hemophilia B disease rat has the advantage of being an appropriate animal model for hemophilia B disease.
  • hemophilia B disease rat in which an artificial modification in the genome has occurred.
  • the hemophilia B disease rat in which the artificial modification in the genome has occurred includes the F9 gene in which some or all of the F9 gene is artificially engineered and/or modified.
  • the hemophilia B disease rat model may have downregulation or loss of the expression or function of the F9 factor.
  • the F9 gene may have been knocked down or knocked out, but is not limited thereto.
  • the'rat containing an artificially modified F9 factor or a nucleic acid encoding the same' may be used interchangeably with the'humanly modified rat'.
  • the'artificially modified F9 gene' will be described in detail.
  • the artificially modified F9 gene is an exon, an intron, a regulatory region, a 5'end or a site adjacent to it, a 3'end or a site adjacent to it or a splicing site. (splicing site) includes artificial transformation.
  • the artificially modified F9 gene may include one or more artificial modifications in a region within the first exon region or the second exon region.
  • the artificially modified F9 gene may include one or more artificial modifications in a region within a regulatory region (enhancer, promoter, 3'UTR and/or non-coding sequence of a polyadenylation signal).
  • the artificially modified F9 gene may include one or more artificial modifications at the 5'end or a region adjacent thereto, or a region within the 3'end or an adjacent region thereof.
  • the artificially modified F9 gene may include one or more artificial modifications in a region of a splicing site.
  • One region to be modified ('target site') of the F9 gene is about 1bp, about 2bp, about 3bp, about 4bp, about 5bp, about 6bp, about 7bp, about 8bp, about 9bp, about 10bp, about 11bp in the gene , About 12bp, about 13bp, about 14bp, about 15bp, about 16bp, about 17bp, about 18bp, about 19bp, about 20bp, about 21bp, about 22bp, about 23bp, about 24bp, about 25bp, about 26bp, about 27bp, about It may be a contiguous nucleotide sequence site of 28 bp, about 29 bp, about 30 bp, about 40 bp, or about 50 bp.
  • the target region of the F9 gene may be a continuous nucleotide sequence region having a length within two numerical ranges selected from the immediately preceding sentence.
  • the target site of the F9 gene may be a continuous nucleotide sequence site having a length of at least one value selected from the previous sentence.
  • the modification of the F9 gene nucleic acid sequence includes, but is not limited to, the addition, deletion or substitution of one or more nucleotides in the genome.
  • It may include a knock-down of the nucleic acid sequence or a portion thereof in the F9 gene.
  • the modification of the F9 gene may be induced by one or more of the following:
  • a deletion of all or part of the F9 gene e.g., 1 bp or more nucleotides of the F9 gene, such as 1 to 50 1 to 30, 1 to 27, 1 to 25, 1 to 23, 1 to 20, Deletion of 1 to 15, 1 to 10, 1 to 5, 1 to 3, or 1 nucleotide;
  • nucleotide 1 to 30, 1 to 27, 1 to 25, 1 to 23, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 5 , Substitution of 1 to 3, or 1 nucleotide, and
  • nucleotides such as 1 to 30, 1 to 27, 1 to 25, 1 to 23, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 5, 1 to Insertion of 3 or 1 nucleotide (each independently selected from A, T, C and G) at any position in the foreign gene.
  • the transcription amount of the F9 gene is decreased or lost, the F9 factor expression is decreased or lost, or the function and/or activity of the F9 factor is It can be degraded or inactivated.
  • nucleic acid sequence alterations in the regulatory region, splicing site, 5'end or adjacent site thereof, 3'end decrease or loss of the transcription amount of the F9 gene, the F9
  • the reduction or loss of factor expression, or the function and/or activity of the F9 factor may be decreased or inactivated.
  • the hemophilia B disease rat in which the genome has been artificially modified may have all of the F9 gene removed. That is, it may include a modification in which the entire F9 gene has been removed by artificial manipulation or modification.
  • some nucleic acid sequences at both ends and/or adjacent regions at both ends may be cut and/or removed simultaneously or sequentially. In another embodiment, all of the F9 gene may be removed.
  • hemophilia B rats may contain an artificially modified F9 factor.
  • the artificially modified F9 factor may be an F9 factor having one or more amino acid sequences altered.
  • One or more amino acids in the F9 factor may be changed to amino acids having similar properties.
  • the hydrophobic amino acid in the F9 polypeptide can be changed to another hydrophobic amino acid.
  • the hydrophobic amino acid is one of glycine, alanine, valine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, tyrosine or arginine or histidine.
  • the acidic amino acid in the F9 polypeptide can be changed to another acidic amino acid.
  • the acidic amino acid is either glutamic acid or aspartic acid.
  • a polar amino acid in the F9 polypeptide may be changed to another polar amino acid.
  • the polar amino acid is one of serine, threonine, asparagine or glutamine.
  • One or more amino acids in the F9 factor may be changed to amino acids having different properties.
  • hydrophobic amino acid in the F9 polypeptide may be changed to any one of the polar amino acids serine, threonine, asparagine and glutamine.
  • hydrophobic amino acid in the F9 polypeptide may be changed to any one of the acidic amino acids glutamic acid or aspartic acid.
  • hydrophobic amino acid in the F9 polypeptide may be changed to any one of the basic amino acids arginine and histidine.
  • the polar amino acid in the F9 polypeptide may be changed to any one or more of the hydrophobic amino acids glycine, alanine, valine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, tyrosine, and tryptophan.
  • the acidic amino acid in the F9 polypeptide may be changed to the basic amino acid arginine or histidine.
  • the basic amino acid in the F9 polypeptide may be changed to the acidic amino acid glutamic acid or aspartic acid.
  • the amount of protein expression may be adjusted.
  • amino acid alteration and/or substitution may affect the structure and function of the protein.
  • the hemophilia B rat may contain F9 factor with no expression at all, suppression of expression, and/or reduced expression level by artificial modification of the F9 factor.
  • the hemophilia B rat may contain a F9 factor whose function is reduced or lost.
  • Rats with the artificial transformation may have bleeding symptoms (continuous bleeding, spontaneous bleeding).
  • the artificially deformed rat may have spontaneous bleeding and/or external bleeding.
  • the artificially deformed rat comprises spontaneous bleeding in the tissue.
  • the artificially deformed rat In another embodiment, the artificially deformed rat,
  • the tissues can be joints, muscles and eyes.
  • the artificially deformed rat may exhibit spontaneous bleeding that does not appear in mice.
  • Rats have high genetic similarity to humans, and possess all of the advantages as an animal model for mice. For example, rats are more similar to humans than other types of animals in terms of nutrition and metabolic physiology, and their weight ratios such as muscles and organs are similar to those of humans, and in terms of endocrine and reproduction, the determination of the sex cycle is It is more convenient, more regular, and has a high similarity to humans in terms of menstrual cycles.
  • the rat has a shorter growth period compared to the mouse, has almost the same reproductive capacity, and has a larger body, so that surgical operation is easier.
  • the rat can collect a larger amount when sampling, and the symptoms of the disease appearing in mammals appear more similar to that of humans compared to that of mice, which is a reliable disease animal model.
  • Various bleeding symptoms are one of the representative symptoms of hemophilia B disease.
  • spontaneous bleeding symptoms are one of the representative symptoms of hemophilia B disease.
  • the mouse model which is an animal model for hemophilia B disease, which has been generally used in the past, did not exhibit the above-described various bleeding symptoms and thus could not be an effective animal model.
  • mammalian animal species such as dogs have the advantage of being able to produce model animals that are more similar to humans, but there is a problem that it is difficult to use as an animal model because breeding is not easy and the experiment costs are too high.
  • the hemophilia B disease rat model provided herein is characterized in that 1) various bleeding symptoms (e.g., natural bleeding), which are representative symptoms of hemophilia B disease, occur, and is suitable as an animal model for hemophilia B disease, 2) There is an advantage that it can be used as an efficient animal model thanks to the advantages of the rat itself, such as easy reproduction and low cost. Therefore, the hemophilia B disease rat model is an animal model that overcomes the limitations of the existing mouse model, and is not only suitable for the development and production of therapeutic agents, but also a good animal model for evaluating toxicity and stability.
  • various bleeding symptoms e.g., natural bleeding
  • hemophilia B disease rat model is an animal model that overcomes the limitations of the existing mouse model, and is not only suitable for the development and production of therapeutic agents, but also a good animal model for evaluating toxicity and stability.
  • Rats belong to the genus Muridae and Rattus, and are distinguished from the mice corresponding to the genus Mus. These rats are Winstar rats, long-Evans rats, Sprague Dawley rats, Zucker rats, Biobreeding rats, Brattleboro There are brattleboro rats and hairless rats.
  • Rats disclosed by the present specification may use any known type that can be appropriately selected and used by a person skilled in the art.
  • One aspect disclosed in the present application relates to a cell comprising an artificially modified F9 factor and/or a gene encoding the same.
  • the cells can be used to prepare the hemophilia B disease rat model.
  • the cells may be used independently from the hemophilia B disease rat model depending on the purpose.
  • the cells may be transformed stem cells, embryonic cells, or somatic cells.
  • the cells are cumulus cells, epithelial cells, fibroblasts, neurons, keratinocytes, hematopoietic cells, melanocytes, chondrocytes, macrophages, monocytes, muscle cells, B lymphocytes, T lymphocytes,
  • embryonic stem cells embryonic germ cells, embryo-derived cells, placental cells, and embryonic cells.
  • adult stem cells derived from various tissues of origin, for example, stem cells derived from tissues such as fat, uterus, bone marrow, muscle, placenta, umbilical cord blood or skin (epithelial) may be used.
  • Non-human host embryos generally comprise a 2-cell stage, a 4-cell stage, a 4-cell stage, an 8-cell stage, a 16-cell stage, a 32-cell stage, a 64-cell stage, a morula or blastocyst. It can be an embryo.
  • the cell may be a hepatocyte cell.
  • the embryonic cells, somatic cells, or stem cells may be obtained from a method of preparing a surgical specimen or a biopsy specimen using a conventional method known in the art.
  • A'transformed cell' may be a somatic cell or embryonic cell containing a transformed portion of the genome within the cell.
  • transformed somatic cells or embryonic cells may be used interchangeably with the term transformed cells.
  • the transformed cell includes a second cell obtained by dividing from a first cell containing a transformed portion. At this time, the second cell obtained by division includes a portion having the same nucleotide sequence as the transformed portion of the first cell.
  • the transformed cells contain an artificially modified F9 gene.
  • the artificially modified F9 gene is as described above.
  • the transformed cell may include a gene in which the addition, deletion or substitution of nucleotides has occurred in one or more regions in the F9 gene.
  • the F9 gene may be a knock-down (knock-down) and / or knock-out (knock-out) cells.
  • the transformed cell may be a cell with no F9 factor or a reduced expression level.
  • the transformed cells may be cells in which the function of the F9 factor is lost or decreased.
  • the transformed cells may be cells deficient in the F9 factor.
  • the transformed cell may include a material for genetic manipulation targeting F9 factor, that is, an artificial nuclease, antisense RNA, dominant negative mutant F9, or ribozyme.
  • the transformed cell comprises a CRISPR-Cas system, ZFN, TALEN, or a mega nuclease, or a nucleic acid encoding the same.
  • the transformed cell contains small interfering RNA (siRNA), short hairpin RNA (shRNA), or microRNA, or contains a nucleic acid encoding the same.
  • siRNA small interfering RNA
  • shRNA short hairpin RNA
  • microRNA or contains a nucleic acid encoding the same.
  • the transformed cell contains a dominant negative mutant F9 targeting the F9 factor, or a ribozyme for a nucleic acid encoding the F9 factor, or contains a nucleic acid encoding the same.
  • the material for genetic manipulation is included in various forms in cells.
  • it may be in the form of a vector containing a nucleic acid encoding the material for genetic manipulation.
  • the transformed cells can form cell colonies.
  • the cell colony may be a single cell cultured from a single cell.
  • the cell colony may be a colony formed only of cells in which all of the F9 factors are knocked down or knocked out.
  • the cell colony may be a chimeric cell colony including cells containing a knockdown or non-knocked-out normal F9 factor.
  • the present specification is to provide a composition for F9 genetic manipulation.
  • One aspect of the subject matter disclosed by the present application relates to a composition for artificially manipulating or modifying the F9 gene.
  • the composition for manipulating or modifying the F9 gene may include the artificial nuclease or a nucleic acid encoding the same.
  • the artificial nuclease can be any one or more of TALEN, ZFN, mega nuclease or CRISPR-enzyme system.
  • composition for genetic manipulation of F9 may include antisense RNA, for example, siRNA or shRNA, which can form a complementary bond with some nucleic acid sequences in the F9 gene.
  • antisense RNA for example, siRNA or shRNA, which can form a complementary bond with some nucleic acid sequences in the F9 gene.
  • composition for manipulating or modifying the F9 factor or a gene encoding it may include a dominant negative mutant F9 factor or ribozyme.
  • the composition may contain any one or more of a dominant negative mutant, an intracellular antibody, a peptide, and a small molecule that inhibits or decreases the F9 protein function.
  • the composition may contain one or more guide RNAs and Cas9 enzymes or complexes thereof, antisense RNA, and any one or more of the dominant negative mutant F9 factor.
  • composition may be provided in the form of an expression cassette.
  • Composition 1 including CRISPR-Cas system-Overview
  • composition for F9 genetic manipulation comprising a CRISPR-Cas system.
  • the composition is
  • It may contain an editor protein or DNA encoding it
  • the editor protein is a CRISPR enzyme, as described above.
  • the CRISPR enzyme may be a Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes.
  • the guide RNA may be homologous to the target sequence in the F9 gene, or may form a complementary bond.
  • the F9 gene or nucleic acid sequence may be cut or modified by the editor protein of the guide RNA-editor protein complex.
  • Composition 2 including CRISPR-Cas system-Target sequence of guide RNA
  • the composition comprising the CRISPR Cas system includes a guide RNA.
  • the guide RNA includes a sequence homologous to the target sequence or capable of complementary binding to the target sequence.
  • the target sequence will be described in detail.
  • Target sequence is a nucleotide sequence present in a target gene or nucleic acid, specifically, a partial nucleotide sequence of a target region in a target gene or nucleic acid
  • target region is a guide nucleic acid-editor protein in the target gene or nucleic acid. It is a site that can be deformed.
  • target sequence may be used as a term that refers to both types of nucleotide sequence information.
  • the target sequence may refer to the sequence information of the transcribed strand of the target gene DNA, or may refer to the nucleotide sequence information of the non-transcribed strand.
  • the target gene may be an F9 gene.
  • the target sequence in the F9 gene may be a sequence of 10 to 35 consecutive nucleotides located in the exon region in the F9 gene.
  • the target sequence may be 10 to 35 nucleotide sequence, 15 to 35 nucleotide sequence, 20 to 35 nucleotide sequence, 35 to 35 nucleotide sequence, or 30 to 35 nucleotide sequence.
  • the target sequence may be a 10 to 15 nucleotide sequence, a 15 to 20 nucleotide sequence, a 20 to 25 nucleotide sequence, a 25 to 30 nucleotide sequence, or a 30 to 35 nucleotide sequence.
  • the target sequence in the F9 gene may be a sequence of 10 to 35 consecutive nucleotides located in the promoter region in the F9 gene.
  • the target sequence may be 10 to 35 nucleotide sequence, 15 to 35 nucleotide sequence, 20 to 35 nucleotide sequence, 35 to 35 nucleotide sequence, or 30 to 35 nucleotide sequence.
  • the target sequence may be 10 to 15 nucleotide sequences, 15 to 20 nucleotide sequences, 20 to 25 nucleotide sequences, 25 to 30 nucleotide sequences, or 30 to 35 nucleotide sequences.
  • the target sequence in the F9 gene may be a sequence of 10 to 35 consecutive nucleotides located in the intron region in the F9 gene.
  • the target sequence may be 10 to 35 nucleotide sequence, 15 to 35 nucleotide sequence, 20 to 35 nucleotide sequence, 35 to 35 nucleotide sequence, or 30 to 35 nucleotide sequence.
  • the target sequence may be 10 to 15 nucleotide sequences, 15 to 20 nucleotide sequences, 20 to 25 nucleotide sequences, 25 to 30 nucleotide sequences, or 30 to 35 nucleotide sequences.
  • the target sequence in the F9 gene may be a sequence of 10 to 35 consecutive nucleotides located in an enhancer region in the F9 gene.
  • the target sequence may be 10 to 35 nucleotide sequence, 15 to 35 nucleotide sequence, 20 to 35 nucleotide sequence, 35 to 35 nucleotide sequence, or 30 to 35 nucleotide sequence.
  • the target sequence may be 10 to 15 nucleotide sequences, 15 to 20 nucleotide sequences, 20 to 25 nucleotide sequences, 25 to 30 nucleotide sequences, or 30 to 35 nucleotide sequences.
  • the target sequence in the F9 gene may be a promoter, enhancer, 3'UTR, polyadenyl (polyA) or a contiguous 10 to 35 nucleotide sequence located at a mixed portion thereof in the F9 gene.
  • the target sequence may be 10 to 35 nucleotide sequence, 15 to 35 nucleotide sequence, 20 to 35 nucleotide sequence, 25 to 35 nucleotide sequence, or 30 to 35 nucleotide sequence.
  • the target sequence may be a 10 to 15 nucleotide sequence, a 15 to 20 nucleotide sequence, a 20 to 25 nucleotide sequence, a 25 to 30 nucleotide sequence, or a 30 to 35 nucleotide sequence.
  • the target sequence in the F9 gene may be a sequence of 10 to 35 consecutive nucleotides located in an exon, an intron, or a mixed portion thereof in the F9 gene.
  • the target sequence may be 10 to 35 nucleotide sequence, 15 to 35 nucleotide sequence, 20 to 35 nucleotide sequence, 25 to 35 nucleotide sequence, or 30 to 35 nucleotide sequence.
  • the target sequence may be a 10 to 15 nucleotide sequence, a 15 to 20 nucleotide sequence, a 20 to 25 nucleotide sequence, a 25 to 30 nucleotide sequence, or a 30 to 35 nucleotide sequence.
  • the target sequence in the F9 gene may include a mutant portion in the F9 gene (eg, a portion different from the wild-type gene) or may be a contiguous 10 to 35 nucleotide sequence.
  • the “mutation” refers to a change in the nucleotide sequence of the DNA of the gene, and is modified by deletion, insertion, or substitution of one or more nucleotides within the nucleotide sequence of the DNA of the gene. Includes everything that has been done. At this time, the sequence in which the mutation occurred in the gene is referred to as a “mutation sequence”. In addition, mutations include all those modified by deletion, insertion, or substitution of some amino acids of the protein encoded by the gene due to the mutation in the gene.
  • the one or more mutations may be naturally occurring mutations.
  • the at least one mutation may be a synonymous mutation that does not affect the expression of the target protein.
  • one or more mutations are mutations that do not affect drug responsiveness, side effects, or resistance to drugs for a specific disease (cancer, diabetes, hypertension, etc.). I can.
  • the target sequence may be 10 to 35 nucleotide sequence, 15 to 35 nucleotide sequence, 20 to 35 nucleotide sequence, 25 to 35 nucleotide sequence, or 30 to 35 nucleotide sequence.
  • the target sequence may be a 10 to 15 nucleotide sequence, a 15 to 20 nucleotide sequence, a 20 to 25 nucleotide sequence, a 25 to 30 nucleotide sequence, or a 30 to 35 nucleotide sequence.
  • the target sequence disclosed by the present specification may be a sequence of 10 to 35 consecutive nucleotides located in an exon region in the F9 gene or an exon, an intron, or a mixture thereof.
  • the target sequence may be 10 to 35 nucleotide sequence, 15 to 35 nucleotide sequence, 20 to 35 nucleotide sequence, 25 to 35 nucleotide sequence, or 30 to 35 nucleotide sequence.
  • the target sequence may be a 10 to 15 nucleotide sequence, a 15 to 20 nucleotide sequence, a 20 to 25 nucleotide sequence, a 25 to 30 nucleotide sequence, or a 30 to 35 nucleotide sequence.
  • the target sequence in the F9 gene may be a contiguous 10 to 35 nucleotide sequence adjacent to the 5'end and/or 3'end of the PAM (proto-spacer-adjacent Motif) sequence in the nucleic acid sequence of the F9 gene.
  • the PAM sequence may be, for example, one or more of the following sequences (described in the 5'to 3'direction).
  • N is A, T, C or G
  • N is A, T, C or G
  • N is each independently A, T, C or G, R is A or G, and Y is C or T;
  • NNAGAAW N is each independently A, T, C or G, and W is A or T;
  • N is each independently A, T, C or G
  • N is each independently A, T, C or G, and R is A or G
  • TTN (N is A, T, C or G).
  • the PAM sequence may be NGG (N is A, T, C or G).
  • the target sequence may be one or more sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 6.
  • the guide RNA may include a sequence that is homologous to or complementary to one or more target sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 6.
  • Composition 3 including CRISPR-Cas system-Complete guide RNA sequence
  • the guide RNA further includes a sequence portion capable of forming a complex with the Cas9 protein, as well as a sequence having homology with the above-described target sequence or a sequence capable of complementary binding thereto.
  • the sequence may vary depending on the origin of the Cas9 protein.
  • the guide RNA is a target sequence and 5'-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCUGUGGCACCGAGUCUG It may include a sequence portion represented by ).
  • the guide RNA when the CRISPR-Cas system includes a Cas9 protein derived from Campylobacter jejuni as an editor protein, the guide RNA is a target sequence and 5'-GUUUUAGUCCCUGAAAAGGGACUAAAAUAAAGAGUUUGCGGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCU-3'(SEQ ID NO: 28 It may include a sequence portion represented by ). In one embodiment, the guide RNA may include a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 21 to 26.
  • Composition 4 containing CRISPR-Cas system-editor protein
  • the composition containing the CRISPR-Cas system contains an editor protein.
  • the editor protein is a Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes, a Cas9 protein derived from Campylobacter jejuni, and a Cas9 protein derived from Streptococcus thermophilus.
  • Streptococcus aureus (Streptococcus aureus) derived from Cas9 protein
  • Neisseria meningitidis Neisseria meningitidis
  • the editor protein may be a Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes.
  • Composition 6 including CRISPR-Cas system-Guide nucleic acid-editor protein complex
  • the guide nucleic acid and the editor protein forming a complementary bond with the F9 gene may form a guide nucleic acid-editor protein complex.
  • the guide nucleic acid-editor protein complex may be formed outside the cell.
  • the guide nucleic acid-editor protein complex may be formed in the cytoplasm of a cell.
  • the guide nucleic acid-editor protein complex may be formed in a nucleus within a cell.
  • the editor protein can recognize the F9 gene or PAM present in the nucleic acid sequence.
  • the guide nucleic acid may be complementary to the F9 gene or nucleic acid sequence.
  • the F9 gene or nucleic acid sequence may be cut or modified by the editor protein of the guide nucleic acid-editor protein complex.
  • Composition 5 including CRISPR-Cas system-Form of CRISPR-Cas system
  • the CRISPR-Cas system may be included in the composition in the form of a viral vector, a non-viral vector or a non-vector.
  • the CRISPR-Cas system may exist in the form of a ribonucleoprotein (RNP) in which a guide RNA and a CRISPR enzyme form a complex.
  • RNP ribonucleoprotein
  • the CRISPR-Cas system may be included in a vector in the form of a nucleic acid.
  • the vector may be a viral vector or a non-viral vector.
  • the CRISPR-Cas system may be included in one vector.
  • the CRISPR-Cas system may be included in two or more vectors.
  • the two vectors may be the same type of vector or different types of vectors.
  • One aspect of the present application relates to a method for producing a rat cell comprising an artificial modification in the F9 gene.
  • the manufacturing method includes contacting a rat cell with a composition for F9 genetic manipulation. Furthermore, the manufacturing method includes culturing the transformed cells; And/or selecting the transformed cells.
  • the manufacturing method includes, as an important component, artificially modifying the F9 gene of rat cells.
  • the above-described composition for genetic manipulation of F9 may be used.
  • the manufacturing method may include contacting the rat cell with a composition for genetic manipulation of F9.
  • the rat cells may be somatic cells, embryonic cells, or embryonic stem cells.
  • the contacting may be performed by one or more methods selected from electroporation, liposomes, plasmids, viral vectors, nanoparticles, and PTD (Protein translocation domain) fusion protein methods.
  • the contacting may be performed in vitro .
  • Cells transformed using the above genetic engineering technology can form colonies.
  • Cell colonies containing transformed cells are as described above.
  • Rat-derived cells transformed with a recombinant expression vector for artificially modifying the F9 gene may be proliferated and cultured according to a method known in the art.
  • Appropriate media are developed for the cultivation of animal cells and, in particular, rodent animal cells, or any use that can be prepared in the laboratory with appropriate components necessary for animal cell growth, such as anabolic carbon, nitrogen and/or micronutrients Any possible medium can be used.
  • the medium is any basic medium suitable for animal cell growth, as a non-limiting example, and the basic medium generally used for culture includes MEM (Minimal Essential Medium), DMEM (Dulbecco modified Eagle Medium), RPMI (Roswell Park Memorial Institute). Medium), K-SFM (Keratinocyte Serum Free Medium), and in addition, any medium used in the industry can be used without limitation.
  • MEM Minimal Essential Medium
  • DMEM Dulbecco modified Eagle Medium
  • RPMI Roswell Park Memorial Institute
  • K-SFM Keratinocyte Serum Free Medium
  • any medium used in the industry can be used without limitation.
  • ⁇ -MEM medium GEBCO
  • K-SFM medium K-SFM medium
  • DMEM medium Welgene
  • MCDB 131 medium Welgene
  • IMEM medium GEM/F12 medium
  • PCM medium M199/F12 (mixture) (GIBCO)
  • MSC expansion medium Chemicon
  • anabolic sources of carbon, nitrogen and micronutrients such as, but not limited to, serum sources, growth factors, amino acids, antibiotics, vitamins, herbals, and/or sugar sources can be added.
  • Another aspect of the present application may include selecting a transformed cell comprising the F9 target genetic engineering technology.
  • the transformed cells are selected from colonies using at least one of an antibiotic resistance gene, an antigen-antibody reaction, a fluroscent protein, and a surface marker gene. can do.
  • F9 target genetic engineering techniques for example, cells containing guide RNA and Cas9 protein can measure a fluorescence signal. Therefore, it can be distinguished from cells that do not contain the above genetic engineering technology.
  • the manufacturing method may be a method for manufacturing F9 genetically engineered rats using a CRISPR/Cas system.
  • the manufacturing method may be a method of manufacturing an F9 genetically engineered rat using embryonic cell transplantation.
  • the manufacturing method may be a method of manufacturing F9 genetically engineered rats using nuclear donor cells.
  • One aspect disclosed herein relates to a method for producing F9 genetically engineered rats using a method of transplanting embryonic cells.
  • composition for genetic manipulation of F9 may be performed using a conventional method known in the art.
  • the F9 genetic manipulation composition is contacted with embryonic cells using known methods such as electroporation or microinjection by forming a guide RNA and Cas9 complex in vitro . I can make it.
  • composition for F9 genetic manipulation may be introduced into a cell using one or more vectors, and may form a complex within the cell to bind to the target sequence of the F9 gene.
  • One aspect disclosed in the present specification is a method for preparing a transgenic rat for a hemophilia B disease model in which the F9 gene is artificially knocked out by transplanting the nucleus of a nuclear donor cell into which a recombinant vector has been introduced into an enucleated egg to produce a litter It relates to a rat for hemophilia B disease model produced thereby.
  • hemophilia B disease rats are produced by somatic cell nuclear transfer (SCNT) using a transformed cell line artificially knocked out of the F9 gene.
  • SCNT somatic cell nuclear transfer
  • hemophilia B disease rat production method The hemophilia B disease rat production method
  • step (d) microinjecting and fusing the nuclear donor cells of step (b) into the enucleated oocytes of step (c);
  • each step may be understood by referring to a method for preparing a cloned animal using a conventional somatic cell nuclear transfer technique known in the art.
  • an animal model for hemophilia B disease research and/or treatment is provided using a novel hemophilia B disease rat.
  • the hemophilia B disease rat may be used to determine the cause and/or mechanism of the hemophilia B disease, symptoms for the disease, and search for therapeutic substances.
  • the hemophilia B animal model rat shows a pathological mechanism similar to that of human hemophilia B patients, and is very useful as an animal model for human hemophilia B treatment research.
  • an animal model for screening a drug for treating hemophilia B may be provided using a novel hemophilia B disease rat. Or more specifically, it is possible to provide an animal model for drug screening for preventing or treating hemophilia B natural bleeding.
  • the rat model of the present application artificially modifies the F9 gene to reduce or lose the expression of the F9 protein, and/or decrease or lose the F9 protein function, so that natural bleeding may occur in the knee joint, muscles, eyes, etc., and spontaneous bleeding As a result, joints, muscles, and eyes become swollen or inflamed.
  • the hemophilia B disease model is very useful as an animal model for hemophilia B treatment, that is, drug screening. That is, the hemophilia B disease model can be used to determine whether hemophilia B is caused, as well as to identify the mechanism of hemophilia B disease, search for therapeutic substances, and develop diagnostic methods by administering a therapeutic agent currently under development.
  • the drug screening method for hemophilia B is the drug screening method for hemophilia B
  • the candidate material is preferably any one or more selected from the group consisting of peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts and animal tissue extracts, but is not limited thereto.
  • the compound may be a novel compound or a known compound. At this time, the compound may be forming a salt.
  • Administration of the candidate substance to the hemophilia B disease rat in step (b) may be performed in any convenient manner, such as injection, transfusion, implantation, or transplantation.
  • the route of administration is subcutaneously, intradermaliy, intratumorally, intraodally, intramedullary, intramuscularly, intravenous, intralymphatic, and intraperitoneal. (Intraperitoneally) or the like may be selected, but is not limited thereto, and the candidate substance in the rat may be administered according to an appropriate dosage, administration method, or characteristics of the candidate substance.
  • Rat_F9_Exon1_gRNA1_target DNA GCCATCATGGCAGACGCTCC SEQ ID NO.
  • Rat_F9_Exon1_gRNA2_target DNA TGCTGAGTAGATAGCCCAGA SEQ ID NO. 2
  • Rat_F9_Exon2_gRNA3_target DNA TGGACGGGTAAGAATTTTGG SEQ ID NO. 3
  • Rat_F9_Exon2_gRNA6_target DNA CGTCCAAAGAGATATAACTC SEQ ID NO. 6
  • the deep-squencing primer used to identify indels generated by these six guide RNAs in the embryo pool is as follows.
  • Rat_F9_exon1_2nd_R GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGACATGCTGCCTGCTACAAT SEQ ID NO. 12
  • Rat_F9_exon2_2nd_F ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCCAAAGAGAAATTAGCTATGGAA SEQ ID NO. 13
  • Rat_F9_exon2_2nd_R GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCGTGCTTCTTCAAAACTGC SEQ ID NO. 14
  • sgRNA is produced by Phusion-mediated polymerization in two parts (Forward: GAAATTAATACGACTCACTATAGCGTCCAAAGAGATATAACTCAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
  • Reverse primer AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC
  • the sequence of the synthesized sgRNA is as follows.
  • RNA synthesis sequence for rat F9 gene KO Name sgRNA synthesis sequence Sequence number Rat_F9_Exon1_gRNA1_synthesis seq GAAATTAATACGACTCACTATAGGCCATCATGGCAGACGCTCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC SEQ ID NO. 15 Rat_F9_Exon1_gRNA2_ synthesis seq GAAATTAATACGACTCACTATAGTGCTGAGTAGATAGCCCAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC SEQ ID NO.
  • RNA for rat F9 gene KO Name sgRNA synthesis sequence Sequence number Rat_F9_Exon1_gRNA1 GCCAUCAUGGCAGACGCUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC SEQ ID NO. 21
  • Rat_F9_Exon1_gRNA2 UGCUGAGUAGAUAGCCCAGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC SEQ ID NO.
  • Rat_F9_Exon2_gRNA3 UGGACGGGUAAGAAUUUUGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC SEQ ID NO.
  • Rat_F9_Exon2_gRNA4 CUUUGGACGGGUAAGAAUUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC SEQ ID NO.
  • Rat_F9_Exon2_gRNA5 UGAGUUAUAUCUCUUUGGACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC SEQ ID NO. 25
  • Rat_F9_Exon2_gRNA6 CGUCCAAAGAGAUAUAACTCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC SEQ ID NO. 26
  • a fertilized egg knocked out of the F9 gene using CRISPR/Cas9 was transplanted into a surrogate mother to produce livestock.
  • Fertilized eggs were administered to a 5-week-old female Chaeran-yong at 11 am on Day-3 with PMSG-versus microbial (15IU) to standardize luteinizing hormone.
  • PMSG-versus microbial (15IU) to standardize luteinizing hormone.
  • hCG-reversing microorganisms 15IU were administered to the female chaeran, and the day of ovulation was uniformized, followed by crossing with WT males.
  • M2 medium-SIGMA washing medium
  • mR1ECM-ark-resource 4 rat culture medium-100 ⁇ l drops, covered with paraffin oil
  • the M2 medium was taken out, and the bulge of the fallopian tube was torn while looking at the microscope to remove the fertilized egg.
  • 4 drops of M2 medium -100 ⁇ l were made and washed
  • 4 drops of mR1ECM medium -100 ⁇ l were made and washed.
  • the fertilized eggs were quickly put into a pre-made mR1ECM medium-100 ⁇ l (covered with paraffin oil) in an incubator to give a stabilizer.
  • the fertilized eggs were taken out of the incubator, washed in 4 drops of 100 ⁇ l of mR1ECM medium, and washed in 4 drops of 100 ⁇ l of M2 medium. Then, in order to electroporate sgRNA: Cas9 protein/8 into a fertilized egg (BEX-Gene editor1), it was mixed in a ratio of 0 ⁇ g:320 ⁇ g and incubated for 15 minutes and used. For electroporation, a total of 40 cells were used at a time, and Pd: 30 V, Pd on: 3.00 ms, Pd off: 97.0 ms, and Pd cycle: 7.
  • GnRH-MSD animal Health 21 ⁇ g was injected to 7-8 week old females to uniformize the surrogate mother. After confirming the vaginal quality of the surrogate mother on Day 1, a surrogate mother capable of fertilized egg transplantation was selected, and then the male and surrogate mother who had previously undergone vasectomy on Day-0 were crossed. Only fertilized eggs grown in 2-cells from fertilized eggs cultured for one day were selected and transplanted into the bulge of the surrogate mother. When a live birth is born from a pregnant surrogate mother, the ear is cut and genotyping is performed to check the animal's traits.
  • the ear of the mouse is cut and gDNA is extracted to confirm the animal's traits.
  • the transduced mouse ear was amplified by PCR using Phusion polymerase taq (New England BioLabs). After that, paired-end deep sequencing was performed using Mi-Seq (lllumina) as the PCR amplified product. Deep sequencing results were analyzed using the online Cas-Analyzer tool ( www.rgenome.net ).
  • mice After analyzing the F9 trait, 10 to 13 weeks old (F1 generation) mice were anesthetized and blood was collected from the abdominal aorta. Thereafter, the blood was soaked in a SST-BD (serum separated tube) tube and incubated for 1 hour at room temperature, and then the serum was separated by rotating 3000 rpm for 15 minutes using a centrifuge. The separated serum was requested to the Green Cross Medical Foundation to conduct a blood coagulation serology test.
  • PTT a screening test that evaluates the function of coagulation factors (F-viii, ix, xi, xii) involved in the intrinsic and extrinsic systems, is a method that directly measures the activity of fibrinogens and PTT.
  • TT Thrombin time
  • H&E staining hematoxylin and eosin staining
  • Formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections were deparaffinized with xylene, and then rehydrated with absolute alcohol. After briefly washing with tap water, the tissue sections were stained with Harris hematoxylin for 5 minutes. The slides were rinsed with tap water for 5 minutes and stained for 30 seconds in 0.2% aqueous ammonia. After washing for 5 minutes with tap water, the slide was immersed in Y eosin for 2 minutes and 30 seconds. Thereafter, the slides were dehydrated twice in 95% alcohol and washed twice in xylene. Finally, the coverslip was observed by attaching it with a xylene-based medium. The result of observing this is shown in FIG.
  • Bleeding analysis was performed using a 16-week-old (F1 generation) control group, F9 +/+ and F9 -/- (see Fig. 3).
  • F9 +/+ and F9 -/- see Fig. 3
  • a 15ml tube that can receive blood was fixed at the bottom of the tail so that the bleeding blood could be received.
  • the tails of three mice were cut off and the time was measured using a stopwatch.
  • video was taken to check the amount of bleeding in real time.
  • the rat animal model is hemophilia B disease symptoms, more specifically spontaneous bleeding
  • the phenomenon can be sufficiently demonstrated, which will provide an important tool for future therapeutic development.
  • the present application intends to provide an F9 genetically engineered composition for manufacturing a hemophilia B disease rat model in order to manufacture a hemophilia B disease rat, which can be used to prepare the hemophilia B disease rat.

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Abstract

본 발명은 혈우병B 질환 랫드 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 F9인자가 넉다운(knock-down) 또는 넉아웃(knock-out) 된 혈우병B 질환 랫드(rat) 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

혈우병B 질환 모델 랫드
본 발명은 혈우병B 질환 랫드 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 F9인자가 녹다운(knock-down) 또는 녹아웃(knock-out) 된 혈우병B 질환 랫드(rat) 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
혈우병B 또는 크리스마스병은 제9응고 인자의 결함으로 인해 생기는 유전성 X-연관 열성 출혈성 질환이다. 혈우병B는 상처 부위에 계속해서 피가 멈추지 않는 것뿐만 아니라 관절이나 근육에 자연 출혈이 발생하면서 혈우병성 관절증과 같은 합병증 유발도 크게 문제되고 있다. 이러한 상황에서 근본적이면서 효과적인 새로운 치료법 개발이 필요하며, 약물의 효능 및 안정성 평가를 위해 더 나은 동물 모델 개발이 필요한 실정이다.
종래 혈우병B 동물모델로 생쥐(mice)는 관절이나 근육 등 조직 내에 자연 출혈(spontaneous bleeding)현상이 거의 나타나지 않은 문제점이 있으며(Yen C.T., Fan M.-N., Yang Y.-L., Chou S.-C., Yu I.-S., Lin S.-W. Thromb. J. 2016;14:22. 참고) 이러한 혈우병 B 질병 생쥐는 약물 개발 및 생산에 활용하기 적절하지 않다. 이에 따라, 혈우병 B에 대한 동물 모델로 인간과 유전적으로 보다 유사하면서, 혈우병 B의 질병 증상을 잘 나타내는 동물 모델에 대한 필요성이 제기되었고, 또한 바이오 메디컬 분야에서 비교적 저렴한 비용으로 정확한 혈우병B 질환을 연구할 수 있는 동물 모델을 활용하고자 하는 요구가 증가되고 있다.
이에 본 발명은 혈우병B 질병 모델로 F9인자가 결핍된 랫드를 제공하고자 한다. 이러한 랫드(rat) 동물 모델은 혈우병B 질병 증상, 보다 구체적으로 자연 출혈(spontaneous bleeding) 현상을 충분히 보여줄 수 있으며, 이는 향후 치료제 개발에 중요한 도구를 제공할 것이다.
본 출원에서는 혈우병B 질환 랫드(rat) 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 출원에서는 혈우병B 질환 랫드(rat)를 제조하기 위하여, F9유전자를 인위적으로 조작할 수 있는 유전자 조작 기술을 포함하는 조성물을 제공하고자 한다.
본 출원은 상기 혈우병B 질환 랫드(rat)를 이용한 다양한 용도를 제공하고자 한다.
전술한 과제를 달성하기 위하여, 본 명세서에서는 혈우병B 질환 모델용 동물로서, 혈우병B 질환 랫드를 제공하고자 한다.
본 출원에서 개시하는 일 태양은 게놈 내 인위적 변형이 일어난 혈우병B 질환 랫드(rat)에 관한 것이다.
상기 게놈 내 인위적 변형이 일어난 혈우병B 질환 랫드는 F9 유전자 내 일부 또는 전부가 인위적으로 조작 및/또는 변형된 F9 유전자를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 인위적으로 조작된 F9 유전자는 엑손(exon), 인트론(intron), 조절영역(regulatory region), 5'말단 또는 그의 인접한 부위, 3'말단 또는 그의 인접한 부위 또는 스플라이싱 자리(splicing site) 등에 인위적 변형을 포함한다.
상기 F9 유전자 핵산서열 변형은 하나 이상의 뉴클레오타이드의 부가, 결실 또는 게놈으로의 치환을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
F9 유전자 내 핵산 서열의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입,
F9 유전자 내 핵산 서열의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실,
F9 유전자 내 핵산 서열의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환,
F9 유전자 내 핵산 서열 또는 이의 부분의 녹다운(knock-down) 등을 포함할 수 있다.
상기 게놈 내 인위적 변형은 F9인자의 돌연변이를 유발할 수 있다. 즉, 혈우병B 랫드는 인위적으로 변형된 F9 인자를 포함할 수 있다.
상기 인위적 변형된 F9인자는 하나 이상의 아미노산 서열의 변경 및/또는 치환을 포함한다.
예를 들어, 상기 아미노산은 비슷한 성질을 가진 아미노산으로 변경될 수 있다. 또는 상기 아미노산은 상이한 성질을 가진 아미노산으로 변경될 수 있다.
상기 아미노산의 변경 및/또는 치환은 단백질 발현량을 조절할 수 있다.
또는, 상기 아미노산의 변경 및/또는 치환은 단백질의 구조, 기능에 영향을 줄 수 있다.
따라서, 상기 F9 인자의 인위적 변형에 의해 상기 혈우병B 랫드는 발현을 아예 하지 않거나 발현량이 감소된 F9 인자를 포함하거나, 또는 상기 혈우병B 랫드는 기능이 저하되거나 상실된 F9 인자를 포함한다.
본 출원에서 개시하는 일 태양은 인위적으로 변형된 F9 인자 및/또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 세포에 관한 것이다.
상기 세포는 형질 전환된 줄기세포, 배아세포 또는 체세포일 수 있다.
상기 형질 전환 세포는 인위적으로 변형된 F9유전자를 포함한다.
일 실시예로, 상기 형질 전환 세포는 F9 유전자 내 하나 이상의 일 영역에 뉴클레오타이드의 부가, 결실 또는 치환이 일어난 유전자를 포함할 수 있다.
다른 실시예로, 상기 F9 유전자가 넉다운(knock-down) 및/또는 넉아웃(knock-out)된 세포 일 수 있다.
상기 형질 전환 세포는 F9인자를 타겟 하는 유전자 조작 기술 즉, 인위적 뉴클레아제, 안티센스 RNA, dominant negative mutant F9, 또는 리보자임 등을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 형질 전환 세포는 CRISPR-Cas system, ZFN, TALEN 또는 메가 뉴클레아제를 포함하거나, 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함한다.
또는 예를 들어, 상기 형질 전환 세포는 small interfiering(siRNA), short hairpin RNA(shRNA) 또는 microRNA를 포함하거나, 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함한다.
또는 예를 들어, 상기 형질 전환 세포는 F9 인자를 타겟 하는 dominant negative mutant F9, 또는 F9 인자를 암호화하는 핵산에 대한 리보자임(ribozyme)을 포함하거나 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함한다.
상기 유전자 조작 기술은 세포 내 다양한 형태로 포함된다 예를 들어, 유전자 조작 기술을 암호화하는 핵산을 포함하고 있는 벡터의 형태일 수 있다.
상기 형질 전환 세포는 F9 인자가 아예 없거나 또는 발현량이 감소된 세포일 수 있다.
상기 형질 전환 세포는 F9 인자의 기능이 상실되거나 또는 저하된 세포일 수 있다.
상기 형질 전환 세포는 F9 인자가 결핍된 세포일 수 있다.
상기 형질전환 세포는 세포 콜로니를 형성할 수 있다. 상기 세포 콜로니는 단일 세포로부터 배양된 단일 세포일 수 있다.
본 출원의 일 태양은 인위적으로 변형된 F9 인자를 포함하는 랫드에 관한 것이다.
즉, F9 유전자가 넉다운(knock-down) 또는 넉아웃(knock-out)되어 F9 인자의 발현 또는 기능이 하향조절(downregulation) 또는 아예 상실된 랫드에 관한 것이다. 이하, '인위적 변형이 일어난 랫드'라고 혼용하여 사용될 수 있다.
상기 인위적 변형이 일어난 랫드는 출혈증상(지속적 출혈, 자연출혈)이 나타날 수 있다.
상기 인위적 변형이 일어난 랫드는 자연 출혈(spontaneous bleeding) 및/또는 외출혈(external bleeding)이 일어날 수 있다.
임의의 구현예에서, 상기 인위적 변형이 일어난 랫드는 조직 내 자연 출혈(spontaneous bleeding)을 포함한다.
상기 조직 내 자연 출혈에 의한 염증; 및/또는
상기 조직 내 자연 출혈에 의한 붓기
를 포함한다.
예를 들어, 상기 조직은 관절, 근육 및 눈일 수 있다.
본 명세서에서는 F9 유전자를 인위적으로 조작하기 위한 F9 유전자 조작 기술을 제공하고자 한다.
상기 F9 유전자 내 인위적 변형을 야기하는 유전자 조작 기술은 인위적 뉴클레아제를 이용한 기술, 안티센스 RNA를 이용한 기술 및 돌연변이 유전자 또는 단백질을 이용한 기술 등 중에 선택된 1이상이며, 다만 유전자 조작기술은 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 개시하는 상기 F9 유전자 조작 기술은 인위적 뉴클레아제인 CRISRP-Cas system, ZFN, TALEN 및 mega-nuclease로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 인위적 뉴클레아제는 F9 유전자 전체 또는 일부의 핵산 서열과 상보적 결합을 형성할 수 있다.
상기 인위적 뉴클레아제는 F9 유전자 전체를 제거하거나 또는, F9 유전자 내 일부 핵산 서열 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 외부로부터 뉴클레오타이드의 삽입(insertion)시킴으로써, F9 유전자를 인위적으로 변형시킬 수 있다.
상기 인위적 뉴클레아제는 F9 유전자 내 엑손 영역, 인트론 영역, 조절 영역, 스플라이싱 자리, 5' 말단 부분 또는 이와 인접한 영역, 3'말단 부분 또는 이와 인접한 영역의 일부 핵산 서열과 상보적 결합하여, F9 유전자를 인위적으로 변형시킬 수 있다.
본 출원에서 개시하는 상기 F9 유전자 조작 기술은 F9 유전자와 상보적 결합하는 안티센스 RNA 기술에 관한 것이다.
상기 안티센스 RNA를 이용한 유전자 조작 기술은 small interfiering RNA(이하 'siRNA' 라고 함), short hairpin RNA(이하 'shRNA' 라고 함) 및 microRNA(이하 'miRNA'라고 함) 중 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 안티센스 RNA는 F9 유전자 일부 핵산 서열과 상보적 결합을 형성할 수 있고, F9 유전자 단백질 발현을 조절할 수 있다.
예컨대, F9 유전자 내 엑손 영역, 인트론 영역, 조절 영역, 스플라이싱 자리, 5' 말단 부분 또는 이와 인접한 영역, 3'말단 부분 또는 이와 인접한 영역의 일부 핵산 서열과 상보적 결합을 형성할 수 있다.
또는, 본 출원에서는 F9 인자 기능 및 발현을 조절하기 위한 dominant negative mutant, ribozyme, intracellular antibody, peptide 또는 small molecule를 제공할 수 있다.
본 명세서에서는 다음을 포함하는 혈우병 B 질환 모델 랫드(rat) 제조를 위한 F9 유전자 조작용 조성물을 제공한다: 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 DNA; 및 에디터 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA, 이때, 상기 가이드 RNA는 서열번호 21 내지 25로 이뤄진 군에서 선택된 서열을 가지며, 상기 가이드 RNA는 F9 유전자 서열의 전부 또는 일부를 표적 서열로 하는 것을 특징으로 하고, 상기 에디터 단백질은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococus pyogenes)에서 유래된 Cas9 단백질을 포함하고, 상기 가이드 RNA와 상기 에디터 단백질은 가이드 RNA-에디터 단백질 복합체를 형성하여 상기 F9 유전자에 인위적인 변형을 일으킬 수 있는 것을 특징으로 한다.
일 구현예로, 상기 가이드 RNA와 상기 에디터 단백질이 복합체를 형성한 RNP(ribonucleoprotein) 형태로 존재할 수 있다.
일 구현예로, 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 상기 에디터 단백질을 암호화하는 DNA가 벡터 형태로 존재할 수 있다.
본 명세서에서는 서열번호 21 내지 26으로 이뤄진 군에서 선택된 서열을 가지는 가이드 RNA를 제공한다.
본 명세서는 혈우병B 질환 랫드 모델 제조용 조성물을 제공하고자 한다.
본 출원에 의해 개시되는 내용의 일 태양은 F9 유전자를 조작 또는 변형하기 위한 조성물에 관한 것이다.
상기 F9 유전자를 조작 또는 변형하기 위한 조성물은 상기 인위적 뉴클레아제 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인위적 뉴클레아제는 TALEN, ZFN, 메가 뉴클레아제 또는 CRISPR-enzyme 시스템 중 어느 1이상일 수 있다.
일 예로, 상기 F9 유전자 조작용 조성물은 F9 유전자 내 일부 핵산서열과 상보적 결합을 형성할 수 있는 가이드 RNA 및 Cas9 효소 또는 이의 복합체를 포함할 수 있다.
다른 예로, F9 유전자 조작용 조성물은 F9 유전자 내 일부 핵산서열과 상보적 결합을 형성할 수 있는 안티센스 RNA 예를 들어, siRNA 또는 shRNA등을 포함할 수 있다.
다른 예로, F9 유전자 조작용 조성물은 dominant negative mutant F9 인자 또는 ribozyme 등을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 하나 이상의 가이드 RNA 및 Cas9 효소 또는 이의 복합체, 안티센스 RNA 및 dominant negative mutant F9 인자 중 어느 하나 이상을 혼합하여 포함할 수 있다.
상기 조성물은 발현 카세트 형태로 제공될 수 있다.
상기 F9 유전자 조작 기술은 바이러스 벡터, 비바이러스 벡터 또는 비-벡터형태로 조성물에 포함된다.
일 예로, 상기 조성물은 RNP(ribonucleoprotein)형태의 F9 유전자 조작 기술을 포함한다.
다른 예로, 상기 조성물은 F9 유전자 조작기술을 포함하는 재조합 발현벡터를 포함한다.
본 명세서에서는 혈우병B 질환 랫드 제조하는 방법을 제공하고자 한다.
본 출원의 일 태양은 상기 F9 유전자를 인위적으로 변형시키기 위해 유전자 조작 기술을 랫드 세포 내에 전달(delivery)하는 단계를 포함한다.
이때, 상기 F9 유전자 조작 기술은 naked 핵산 벡터(naked nucleic acid vector), 비-바이러스성 벡터(non-viral vector), 또는 바이러스성 벡터(viral vector)를 이용하여 전달될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 인위적 변형이 일어난 랫드를 제조하기 위해서는 랫드 세포 내 비-바이러스벡터를 이용하여 F9 유전자 조작 기술을 도입하는 단계를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 F9 유전자 조작기술이 가이드RNA 및 Cas9일 경우에, 상기 가이드RNA-Cas9 복합체는 미세주입(microinjection)방법에 의해 세포 내 전달될 수 있다. 즉, 리보뉴클레오프로틴(ribonucleoprotein, RNP)의 형태로 전달될 수 있다. 상기 가이드RNA-Cas9 복합체는 가이드RNA와 CRISPR효소의 상호작용을 통해 형성된 복합체를 의미한다.
상기 F9 유전자를 인위적으로 변형시키기 위한 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 랫드 유래 세포는 당업계에 공지된 방법에 따라 증식 및 배양될 수 있다.
본 출원의 다른 태양은 F9 타겟 유전자 조작 기술을 포함하는 형질전환 세포를 선별하는 단계를 포함할 수 있다.
이때, 상기 형질 전환 세포는 항생제 저항성 유전자(antibiotic resistance gene), 항원-항체반응, 형광 단백질(fluroscent protein) 및 표면 마커 유전자(surface marker gene) 중 어느 하나 이상을 이용하여 형질 전환 세포를 콜로니로부터 선별할 수 있다.
본 명세서에서 개시하는 일 태양은 배아 세포를 이식하는 방법을 이용한 F9 유전자 조작 랫드 생산방법에 관한 것이다.
상기 방법은
(a) 랫드의 조직으로부터 분리한 배아 세포를 인위적 뉴클레아제 (메가뉴클레아제, ZFN, TALEN 및/또는 CRISPR-enzyme 시스템)에 노출시키는 것;
(b) 대리모 내 배아들을 이식하는 단계;
(c) 상기 인위적 뉴클레아제는 배아 내 F9 유전자 부위에 특이적으로 결합하여 세포 염색체에 변화를 일으켜, 인위적으로 변형된 F9 유전자를 형성하는 단계; 및
(d) 대리모는 인위적으로 변형된 F9 유전자를 포함하는 랫드를 임신하는 단계
를 포함할 수 있다.
각 단계에 관한 통상적인 기술 내용은 당업계에 공지되어 있는 종래 배아 이식 방법을 참조하여 이해할 수 있을 것이다.
본 명세서에서 개시하는 일 태양은 재조합 벡터가 도입된 핵 공여 세포의 핵을 탈핵된 난자에 이식하여 산자를 생산함으로써, F9 유전자가 인위적으로 변형하여 넉아웃 시킨 혈우병B 질환 모델용 형질전환 랫드의 제조방법 및 이에 의해 제조된 혈우병 B질환 모델용 랫드에 관한 것이다.
임의의 구체예에서, 상기 F9 유전자를 인위적으로 변형하여 넉아웃 시킨 형질전환 세포주를 이용하여 체세포 핵 이식 방법(somatic cell nuclear transfer, SCNT)으로, 혈우병B 질환 랫드를 생산한다.
상기 혈우병B 질환 랫드 생산방법은
(a) 랫드의 조직으로부터 분리한 체세포 또는 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 핵 공여 세포 제조하는 것;
(b) F9 유전자 내 일부 또는 전부를 표적하는 인위적 조작 뉴클레아제를 상기 핵 공여 세포에 도입하는 것;
(c) 랫드의 난자로부터 핵을 제거하여 탈핵 난자를 제조하는 것;
(d) 상기 (c) 단계의 탈핵 난자에 (b) 단계의 핵 공여 세포를 미세주입하고 융합시키는 것;
(e) 상기 (d) 단계에서 융합된 난자를 활성화시키는 것; 및
(f) 상기 활성화된 난자를 대리모의 난관에 이식하는 단계
를 포함할 수 있다.
각 단계에 관한 통상적인 기술 내용은 당업계에 공지되어 있는 종래 체세포 핵 이식 기술을 이용한 복제 동물의 제조 방법 등을 참조하여 이해할 수 있을 것이다.
본 명세서에서는, 다음을 포함하는, F9 유전자 내 인위적 변형을 포함하는 혈우병 B 질환 모델 랫드(rat) 제조 방법을 제공한다: 랫드 세포에 상기 혈우병 B 질환 모델 랫드(rat) 제조를 위한 F9 유전자 조작용 조성물을 접촉시키는 것으로, 이로 인해 상기 세포의 F9 유전자 내 인위적인 변형이 일어나고; 및 상기 세포를 랫드에 도입하여 혈우병 B 질환 모델 랫드(rat)를 제조하는 것.
일 구현예로, 상기 접촉시키는 것은 전기천공법(electroporation), 리포좀, 플라스미드, 바이러스 벡터, 나노파티클(nanoparticles) 및 PTD(Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 중 선택되는 1이상의 방법으로 수행될 수 있다.
일 구현에서, CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 형질전환 랫드 제조하는 방법을 제공하고자 한다.
상기 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 형질전환 랫드 제조방법은
(a) 랫드 내 F9 유전자 내 일부 핵산 서열 또는 전부를 타겟하는 CRISPR-enzyme 시스템을 배아 세포 내 도입하는 단계;
(b) 대리모 내 배아들을 이식하는 단계;
(c) 상기 CRISPR-enzyme 시스템은 배아 내 F9 유전자 부위에 특이적으로 결합하여 세포 염색체에 변화를 일으켜, 인위적으로 변형된 F9유전자를 형성하는 단계; 및
(d) 대리모는 인위적으로 변형된 F9 유전자를 포함하는 랫드를 임신하는 단계
를 포함할 수 있다.
본 명세서에서는 기존에 없는 신규한 혈우병B 질환 랫드(rat)를 이용하여, 혈우병B 치료용 약물 스크리닝용 동물 모델을 제공할 수 있다. 또는 보다 구체적으로, 혈우병 B 자연 출혈 예방 또는 치료용 약물 스크리닝용 동물 모델을 제공할 수 있다.
일 구현예에서, 혈우병B에 대한 약물 스크리닝 방법은
(a) 혈우병B 질환 모델 랫드에 혈우병B 경감, 예방 또는 치료를 위한 후보물질을 투여하는 것;
(b) 후보물질 투여 후, 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교 및 분석하는 단계
를 포함할 수 있다.
후보 물질은 펩타이드, 단백질, 비펩타이드성 화합물, 합성화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액 및 동물 조직추출액 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느이상인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 화합물은 신규 화합물이거나 또는 이미 공지된 화합물일 수 있다. 이때, 상기 화합물은 염을 형성하고 있을 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 기술에 따르면, 다음과 같은 효과가 발생한다.
본 명세서에 의해 개시되는 기술에 따르면, 혈우병B 질환 랫드(rat)를 제공할 수 있다. 구체적으로, F9인자가 인위적으로 변형된 혈우병 B 질환 랫드가 제공될 수 있다.
본 명세서에서 제공하는 혈우병B 질환 랫드는 인간과 유전적으로 유사하고 정확한 질병원인 기전을 연구하기 유용할 뿐만 아니라 약물 스크리닝에 최적 동물모데롤서, 혈우병B 질환에 대한 치료물질 탐색, 진단법 개발 등에 다양하게 활용될 수 있으므로, 혈우병B 질환 동물 모델로서 매우 유용할 것이다.
도 1는 F9(+/+) 랫드와 F9(-/-) 랫드를 비교 분석한 그래프로, (a) F9(+/+) 랫드와 F9(-/-)랫드의 Appt (활성화부분트롬보플라스틴시간)을 비교 분석한 그래프를 보여준다. (b)는 F9(+/+) 랫드와 F9(-/-)랫드의 트롬빈 시간을 비교 분석한 그래프를 보여준다. (c)는 F9(+/+) 랫드와 F9(-/-)랫드의 혈소판 수를 비교 분석한 그래프르 보여준다.
도 2는 F9(+/+) 랫드와 F9(-/-) 랫드의 출혈 차이 동일한 시간에 tail cutting 이후 10분간 출혈양을 비교한 사진이다.
도 3은 F9 랫드의 통증 부위의 morphology를 확인하기 위해, F9 랫드의 통증이 있던 부위만을 도려내어 헤마톡실린 및 에오신 염색(H&E 염색)을 수행하고 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.
도 4는 F9유전자가 넉아웃(knock-out) 된 랫드에서 나타나는 자연 출혈(spontaneous bleeding)현상을 나타내는 사진이다.
도 5는 F9유전자가 넉아웃(knock-out) 된 랫드의 발바닥에 나타나는 증상을 보여주는 사진이다.
도 6은 F9유전자가 넉아웃(knock-out) 된 랫드의 눈에 나타나는 증상을 보여주는 사진이다.
도 7은 F9유전자가 넉아웃(knock-out) 된 랫드의 어린 산자에 나타나는 증상을 보여주는 사진이다.
도 8은 F9(+/+) 랫드와 F9(-/-) 랫드의 대퇴부 근육의 조직학적 변화를 관찰하기 위해, 헤마톡실린 및 에오신 염색(H&E 염색)을 수행하고 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사 또는 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 이하에 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 다른 참고문헌은 전체가 참고로 포함된다. 추가로, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
용어의 정의
형질 전환, 형질 전환 세포 및 형질 전환 동물
“형질 전환(Transformation, genetic modification)”은 세포 내 동물의 게놈(animal genome)이 포함하고 있는 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)를 인위적으로 변형하는 것을 의미한다. 상기 변형은 세포 내 동물의 게놈(animal genome)이 포함하는 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)의 일부를 제거하는 것, 일부를 치환하는 것, 및 동물의 게놈(animal genome)에 뉴클레오타이드(nucleotide)나 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)를 삽입하는 것을 포함한다.
본 출원의 용어 “형질 전환”은 세포 내에서 발현될 수 있는 단백질 또는 RNA를 추가, 변경 또는 제거하는 것을 포함한다.
“형질 전환 세포”는 세포 내 동물의 게놈 중 형질 전환된 부분을 포함하고 있는 세포를 의미한다.
“형질 전환 동물”은 적어도 하나의 형질 전환 세포를 포함하고 있는 동물을 의미한다. 동물 F0는 제1형질 전환 세포를 포함할 수 있다. 상기 동물 F0는 자손 F1을 생산할 수 있다. 상기 F1 및 F1이하 자손이 포함하는 하나 이상의 세포는 상기 제1형질 전환 세포 내 동물의 게놈 중 형질 전환된 부분과 동일한 염기 서열을 가지는 부분을 포함하는 동물의 게놈(animal genome)을 포함할 수 있다. 본 출원의 '형질 전환 동물'은 상기 F0, F1, 및 F1이하 자손을 포함한다.
질환 모델 동물
“질환 모델 동물”이란 사람의 질병과 아주 유사한 형태의 질병을 가진 동물을 말한다. 사람의 질병 연구에 있어 질환 모델 동물이 의미를 갖는 것은 사람과 동물들 간의 생리적 또는 유전적인 유사성에 의한다. 질병 연구에 있어 생체의학 질환모델동물은 질병의 다양한 원인과 발병과정 및 진단에 대한 연구용 재료를 제공해주고, 질환 모델 동물의 연구를 통해 질병에 관련된 유전자들을 알아내고, 유전자들 간의 상호작용을 이해할 수 있게 하고, 개발된 신약후보물질의 실제 효능 및 독성 검사를 통해 실용화 가능성의 여부를 판단하는 기초 자료를 얻을 수 있다.
동물 또는 실험동물
“동물” 또는 “실험동물”은 인간 이외의 임의의 포유류, 설치류 등을 말한다. 상기 동물은 배아, 태아, 신생아 및 성인을 포함하는 모든 연령의 동물을 포함한다. 본 명세서에서 사용하기 위한 동물들은, 예를 들어, 상업용 소스로부터 이용할 수 있다. 이런 동물들은 실험용 동물 또는 다른 동물, 토끼, 설치류(예를 들어, 생쥐, 랫드, 햄스터, 게르빌루스 및 기니피그), 소, 양, 돼지, 염소, 말, 개, 고양이, 새(예를 들어, 닭, 칠면조, 오리, 거위), 영장류(예를 들어, 침팬지, 원숭이, 붉은털원숭이)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 가장 바람직한 동물은 랫드다.
인위적 뉴클레아제(Engineered nuclease)
“인위적 뉴클레아제(Engineered nuclease)”는 임의의 유전자에 결합해 특정 핵산 부위, 예를 들어 특정 DNA부위를 절단하여 손상 또는 파괴할 수 있는 인공적 뉴클레아제 및/또는 이를 포함하는 시스템을 통칭하는 용어이다. “표적화 (엔도)뉴클레아제(target-specific (endo)nuclease)” 또는 “유전자 가위”로 표현하기도 한다. 상기 인위적 뉴클레아제는 서열-특이적 엔도뉴클레아제이다. “서열-특이적 엔도뉴클레아제” 또는 “서열-특이적 뉴클레아제”는, 구체적으로 달리 명시되지 않는 한, 특정 뉴클레오타이드 서열에서 폴리뉴클레오타이드, 예컨대, 표적 유전자를 인식하고 결합하여, 상기 폴리뉴클레오타이드에서의 단일- 또는 이중-가닥 파손을 촉매하는 단백질을 가리킨다. 특정 서열을 특이적으로 인식하여 핵산을 절단할 수 있으므로 유전자 편집(Genome editing)기술에 매우 유용하다. 예를 들어, ZFN(zinc finger protein), TALEN(transcription activator-like effector protein), CRISPR/Cas system을 포함하는 RGEN(RNA-guided endonuclease) 등이 있다.
CRISPR-enzyme system
“CRISPR-enzyme system”은 세포 내 동물의 게놈 상의 타겟 사이트 또는 엑소-폴리뉴클레오타이드의 타겟 사이트(target site)와 상호작용하여 타겟 사이트(target site)의 일 부분을 자를 수 있는 단백질을 포함하는 복합체를 의미한다.
CRISPR-enzyme system은 가이드 핵산 및 CRISPR 효소를 포함할 수 있다.
넉아웃(knock-out)
“넉아웃(knock-out)”은 표적 유전자의 기능 저하를 가져다 주는 유전자 서열 상의 변형을 의미하는데, 바람직하게는 이로써 표적 유전자 발현이 탐지 가능하지 않거나 무의미하다. 본 발명에서 F9 유전자의 녹아웃은 F9 유전자의 기능이 실질적으로 저하되어 발현이 탐지될 수 없거나 또는 무의미한 수준으로만 존재하는 것을 의미한다. 녹아웃 형질전환체는 F9 유전자의 이형 접합성 녹아웃 또는 F9 유전자의 동형 접합성 녹아웃을 갖는 형질전환성 동물일 수 있다. 넉아웃에는 예를 들어, 표적 유전자 변형을 증진시키는 물질에 해당동물을 노출시키거나, 표적 유전자 부위에서 재조합을 증진시키는 효소를 도입시키거나 또는 출생 후에 표적 유전자 변형을 지시하는 기타 방법 시, 표적 유전자의 변형이 일어날 수 있는 조건적 넉아웃이 또한 포함된다.
표적 유전자
“표적 유전자”는, 구체적으로 달리 명시되지 않는 한, 세포 내 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 가리킨다. “표적 서열”은, 구체적으로 달리 명시되지 않는 한, 표적 유전자의 일부분, 예를 들어, 표적 유전자의 하나 이상의 엑손 서열, 표적 유전자의 인트론 서열 또는 조절 서열, 또는 표적 유전자의 엑손 및 인트론 서열, 인트론 및 조절 서열, 엑손 및 조절 서열, 또는 엑손, 인트론 및 조절 서열의 조합을 가리킨다.
배양
“배양”은 생물체나 생물체의 일부(기관, 조직, 세포 등)를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 일로써, 이 경우 외적 조건으로 온도, 습도, 빛, 기체 상의 조성(이산화탄소나 산소의 분압) 등이 중요하며, 그 밖에 배양되는 생물체에 가장 중요한 직접적인 영향을 주는 것은 배지(배양기)로, 그 생물체의 직접적인 환경인 동시에 생존이나 증식에 필요한 각종 영양소의 공급장이다.
체외배양
“체외배양”이란 세포 등이 체내에서 자라는 상태와 구분되는 방법으로 실험실의 인큐베이터(incubator)에서 체내의 환경과 유사한 조건으로 배양하는 일련의 실험실 과정을 의미하는 것이다.
세포, 숙주 세포, 또는 변형된 세포
“세포”, “숙주 세포”, “변형된 세포” 등은 특정 대상 세포뿐만 아니라 이런 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 의미한다 특정 변형은 돌연변이 또는 환경 영향에 의해 후대에서 일어날 수 있기 때문에, 이런 자손은 사실상, 부모 세포와 동일하지 않을 것이나 본 명세서에 사용된 용어와 범위 내에 여전히 포함된다.
변형된, 또는 조작된
핵산에 대해 적용된 용어 “변형된” 또는 “조작된”은 본 명세서에서 교환적으로 사용되며, 이는 유전자를 구성하는 핵산서열 내 인위적인 변형을 가한 것을 의미한다. 상기 변경은 하나 이상의 핵산의 결실, 치환, 삽입 또는 역위 등을 포함할 수 있다. 변형된 또는 조직된 핵산 서열은 이들 핵산 또는 이의 발현 생성물의 발현 및/또는 기능적 활성의 변경, 예를 들어, 증가, 촉진, 감소 또는 상실 등의 양태로 나타날 수 있다.
핵 공여 세포
“핵 공여 세포”는 핵 수용체인 수핵 난자로 핵을 전달하는 세포 또는 세포의 핵을 말한다. “난자”는 바람직하게는 제2차 감수분열 중기까지 도달한 성숙난자를 말한다. 본 명세서에서 상기 핵 공여 세포로는 랫드의 체세포 또는 줄기세포를 사용할 수 있다.
체세포(somatic cell)
“체세포(somatic cell)”란, 다세포 생물을 구성하는 세포 중 생식 세포 이외의 세포이며, 어떤 목적으로 특화하여 그 이외의 세포는 되지 않는 분화된 세포와, 몇 종류인가의 다른 기능을 갖는 세포로 분화되는 능력을 갖는 세포를 포함한다.
줄기세포(stem cell)
“줄기세포(stem cell)”는 어떤 조직으로든 발달할 수 있는 세포를 의미한다. 기존적인 특징으로는 두 가지가 있는데, 우선 반복 분열하여 자신을 만들어 내는 자기 재생산(self-renewal), 그리고 환경에 따라 특정한 기능을 지닌 세포로 분화할 수 있는 다분화 능력을 갖는다.
핵 이식(nuclear transfer)
“핵 이식(nuclear transfer)”은 난자(oocyte)로부터 핵(nucleus)을 제거한 뒤 상기 난자(oocyte)에 다른 세포로부터 얻은 공여 핵(donor nucleus)를 도입하는 것을 의미한다. “핵 이식(nuclear transfer)”은 동물의 난자(oocyte)로부터 핵(nucleus)을 제거한 뒤, 동물 세포로부터 얻은 공여 핵(donor nucleus)을 도입하는 단계, 리프로그래밍(reprogramming) 단계, 분화 단계, 및 대리모 이식 단계를 거쳐 공여 핵(donor nucleus)을 포함하는 동물 세포와 동일한 유전 정보를 포함하는 동물을 얻는 기술을 포함한다.
체세포 핵 이식(somatic cell nuclear transfer; SCNT)
“체세포 핵 이식(somatic cell nuclear transfer; SCNT)”은 상기 공여 핵(donor nucleus)을 포함하는 세포가 체세포(somatic cell)인 경우의 핵 이식(nuclear transfer)을 의미한다. 상기 '체세포 핵 이식(somatic cell nuclear transfer; SCNT)'은 상기 공여 핵(donor nucleus)을 포함하는 동물 세포가 체세포(somatic cell)인 경우, 앞서 언급한 단계를 거쳐 상기 체세포(somatic cell)와 동일한 유전 정보를 포함하는 동물을 얻는 기술을 포함한다.
상기 공여 핵(donor nucleus)을 포함하는 세포에 전달(delivery)을 통해 형질 전환 동물을 제작할 수 있다. 예를 들어, 체세포 미세주입(somatic cell microinjection) 한 뒤 체세포 핵 이식(SCNT)을 통해 형질 전환 동물을 제작할 수 있다.
배지 또는 배지 조성물
“배지” 또는 “배지 조성물”은 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외에서 세포 등의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 말한다.
치료
“치료”는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 명세서의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감(부분적이거나 전체적으로), 검출 가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. “치료”는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 “완화(palliating)”하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병 상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.
약
“약”이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1%정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
배경지식 - 혈우병 및 F9 인자
혈우병
“혈우병B” 또는 크리스마스 병은 F9인자(제9 응고 인자, FIX) 결합으로 인해 생기는 유전성 X-연관 열성 출혈성 질환이다. 혈우병B는 F9인자의 양 또는 기능의 결핍과 관련된 질병이다.
이때, 혈우병 증상 즉, 출혈이 나타나는 형태는 중추 신경계 외상 또는 출혈(요추전자, 경막 외 마취 등 포함), 복막 뒤 공간 출혈, 마취를 포함한 발치, 심한 위장관 출혈, 상기도 및 호흡기관 출혈, 관절강 내 출혈 및 근육 출혈, 표재성 혈종, 구강 내 출혈, 치하 출혈, 비 출혈, 경한 혈뇨, 월경 과다 등이 있다. 상기 관절 강 내 출혈은 무릎, 팔꿈치, 발목, 어깨, 엉덩이(고 관절), 손목 등에 나타나는 것을 말한다.
“자연 출혈(spontaneous bleeding)”은 자발적 출혈 또는 자연 내 출혈(spontaneous internal bleeding)이라고도 하며, 외상이나 특별한 요인 없이 일상 생활 중 아무런 조짐 없이 갑작스럽게 발생하는 출혈을 말하며, 관절 및/또는 근육 내 자발적 출혈 증상이 혈우병 B에 종종 나타난다. 상기 자연 내 출혈은 관절, 근육, 위장관, 신장, 뇌, 코 및 눈 중 어느 하나 이상에 출혈이 일어날 수 있다. 이러한 자발적 출혈은 합병증을 유발하며, 반복적인 관절 내 출혈에 의해 관절이 변형, 염증이 나타나는 증상은 혈우병에 의해 나타나는 대표적인 증상 중 하나이다. 이에 따라 혈우병B 치료제에 자발적 출혈 예방 또는 치료제를 개발하는 것도 중요하다.
“외출혈(external bleeding)”은 신체 외부의 눈에 보이는 출혈을 말한다. 즉, 베인 상처, 발치, 수술부위 출혈이 멈추지 않는 증상 등 외상에 의해 출혈이 발생하는 것을 말한다.
F9 인자
“Factor9(이하'F9'이라고 함)”은 혈액 응고인자 중 하나로, 혈전형성에 필수적인 단백질이다. 이때, F9인자는 제9혈액 응고 인자의 대표적 특성을 가지는 어떠한 형태의 제9인자 분자를 의미한다. F9인자는 내인성 응고 경로에서 필수적인 역할을 하는 혈장 중의 당일쇄 당단백질이고, 내인성 응고 경로에서 F9인자의 활성화 형태인 제9a인자(FIXa)가 제 8a 인자, 인지질 및 칼슘 이온과 상호작용하여 제 10인자를 제 10a인자로 전환하는 “테나제”복합체를 형성한다. 이러한 상기 F9 인자는 Gla 도메인, 2 개의 EGF 도메인(EGF-1 및 EGF-2), AP 영역, 및 세린 프로테아제 도메인으로 이루어진다.
“돌연변이가 일어난 F9 인자”는 야생형 F9 인자와 달리 자연 발생적 또는 인위적 변형(artificially modified or artificially engineered)이 일어나, 단백질 기능이 저하 또는 상실된 F9 인자일 수 있다.
”야생형”은 자연에서 가장 보편적으로 보이는 유전자 또는 임의의 정상이라고 지정된 대립 유전자를 의미한다. 예를 들어, 특정 질환을 나타내지 않는 정상 상태의 유전자 형태일 수 있다.
“인위적으로 변형된(artificially modified or artificially engineered)”이라는 용어는 자연상태에서 일어나는 존재 그대로의 상태가 아닌, 인위적으로 변형을 가한 상태를 의미한다. 예를 들어, 인위적으로 변형을 가한 상태는 야생형 유전자에 돌연변이를 인위적으로 발생시키도록 하는 변형일 수 있다. 이하에서 비자연적인 인위적으로 변형된 F9유전자는 인위적인 F9 유전자라는 용어와 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 F9인자는 예컨대, NCBI Accession No. NM_031540로 표현되는 F9 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
배경지식 - 유전자의 인위적인 조작 또는 변형 수단
유전자의 인위적인 조작 또는 변형 수단 - 개괄
유전자를 인위적으로 조작하기 위한 수단은 인위적 뉴클레아제를 이용한 기술, 안티센스 RNA를 이용한 기술 및 돌연변이 유전자 또는 단백질을 이용한 기술 등이 있다.
“인위적으로 조작된 뉴클레아제(programmable nuclease)”는 목적하는 유전체 상의 특정 위치를 인식하여 절단할 수 있는 모든 형태의 뉴클레아제를 포함한다. 상기 인위적 뉴클레아제는 원핵 세포, 및/또는 인간세포를 비롯한 동식물 세포(예컨대, 진핵 세포)의 유전체에서 특정 염기서열을 인식해 이중나선절단(double strand break, DSB)을 일으킬 수 있다. 상기 이중나선 절단은 DNA의 이중 나선을 잘라, 둔단(blunt end) 또는 점착종단(cohesive end)을 생성시킬 수 있다. DSB는 세포 내에서 상동재조합(homologous recombination) 또는 비상동재조합(non-homologous end-joining, NHEJ)기작에 의해 효율적으로 수선될 수 있는데, 이 과정에서 인위적 뉴클레아제는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 삽입 및 삭제 등을 일으킬 수 있는 효소이다.
예를 들어, 유전자 내 인위적 변형을 야기하는 인위적 뉴클레아제는 유전체 상의 특정 표적 서열을 인식하는 도메인인 식물 병원성 유전자에서 유래한 TAL 작동자(transcription activator-like effector) 도메인과 절단 도메인이 융합된 TALEN (transcription activator-like effector nuclease), 징크-핑거 뉴클레아제(zinc-finger nuclease), 메가뉴클레아제(meganuclease), CRISPR-enzyme 단백질 또는 Cpf1 단백질 등일 수 있다.
상기 인위적 뉴클레아제는 유전자 전체 또는 일부의 핵산 서열과 상보적 결합을 형성할 수 있다.
상기 인위적 뉴클레아제는 유전자 전체를 제거하거나 또는, F9 유전자 내 일부 핵산 서열 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 외부로부터 뉴클레오타이드의 삽입(insertion)시킴으로써, 유전자를 인위적으로 변형시킬 수 있다.
상기 인위적 뉴클레아제는 유전자 내 엑손 영역, 인트론 영역, 조절 영역, 스플라이싱 자리, 5' 말단 부분 또는 이와 인접한 영역, 3'말단 부분 또는 이와 인접한 영역의 일부 핵산 서열과 상보적 결합하여, F9 유전자를 인위적으로 변형시킬 수 있다.
인위적인 조작의 대상
상기 “인위적인 조작”의 대상은 표적 핵산, 유전자, 염색체 또는 단백질일 수 있다.
일 예로, 상기 인위적 뉴클레아제는 유전자 내 표적 서열을 조작 또는 변형하여, 발현되는 단백질의 양, 활성 또는 기능을 조절할 수도 있고, 또는 변형된 단백질을 발현시킬 수 있다.
예를 들어, 상기 인위적 뉴클레아제는 유전자 내 표적 서열을 조작 또는 변형하여, 단백질 발현 양을 억제, 저해, 감소, 촉진 또는 증가시킬 수 있다.
예를 들어, 상기 인위적 뉴클레아제는 유전자 내 표적 서열을 조작 또는 변형하여, 단백질 발현 활성을 억제, 저해, 감소, 촉진 또는 증가시킬 수 있다.
예를 들어, 상기 인위적 뉴클레아제는 유전자 내 표적 서열을 조작 또는 변형하여, 단백질의 기능을 제거, 저하, 추가 또는 향상시킬 수 있다.
상기 유전자 조작 기술 중 어느 하나 이상은 유전자의 전사와 번역의 단계에서 작용할 수 있다.
예를 들어, 상기 유전자 조작 기술 중 어느 하나 이상은 전사 조절하는 표적 서열을 조작 또는 변형하여, 전사를 촉진 또는 저해할 수 있다.
예를 들어, 상기 유전자 조작 기술 중 어느 하나 이상은 단백질 발현을 조절하는 표적 서열을 조작 또는 변형하여, 단백질 발현을 조절할 수 있다.
CRISPR-enzyme system (가이드핵산 및 에디터 단백질)
유전자를 인위적으로 조작하기 위한 수단으로, CRISPR-enzyme system을 사용할 수 있다.
상기 CRISPR-enzyme system 은 가이드 핵산 및/또는 에디터단백질로 구성된다.
용어 “가이드 핵산”은 표적 핵산, 유전자 또는 염색체를 인지하고, 및 에디터 단백질과 상호작용할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이때, 상기 가이드 핵산은 표적 핵산, 유전자 또는 염색체 내의 일부 뉴클레오타이드와 상보적인 결합을 형성할 수 있다.
상기 가이드 핵산은 표적 DNA 특이적 가이드 RNA, 상기 가이드 RNA를 코딩하는 DNA, 또는 DNA/RNA 혼합의 형태일 수 있다.
상기 가이드핵산은 가이드 RNA일 수 있다.
“가이드 RNA”는 생체 외(in vitro)전사된 것일 수 있고, 특히 올리고 뉴클레오타이드 이중가닥, 또는 플라스미드 주형으로부터 전사된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 가이드 RNA의 설계 및 구성은 당업자에게 공지되어 있으며, 한국공개특허 10-2018-00187457에 상세하게 설명되며, 상기 공개특허 전문이 본 발명의 참고자료로서 본 명세서에 포함된다.
“에디터 단백질”은 핵산과 직접적으로 결합하거나, 또는 직접 결합하지는 않지만 상호작용할 수 있는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 의미한다. 상기 에디터 단백질에 대해서 개념적으로 “인위적으로 조작된 뉴클레아제” 또는 RGEN(RNA-Guided Endonuclease)으로 칭하기도 한다.
일 구체예에서, 상기 에디터 단백질은 CRISPR 효소일 수 있다.
"CRISPR 효소"는 CRISPR-enzyme 시스템의 주요 단백질 구성 요소로, 가이드RNA와 혼합 또는 복합체를 형성하여 표적서열을 인지하고 DNA를 절단할 수 있는 뉴클레아제를 말한다.
CRISPR 효소는 당업자에 공지되어 있으며, 한국공개특허 10-2018-00187457을 참고한다.
상기 CRISPR 효소는 천연형 단백질 외에도 가이드 RNA와 협동하여 활성화된 엔도뉴클레아제(endonuclease) 또는 니카아제(nickase)로 작용할 수 있는 변이체를 모두 포함하는 개념으로 본 명세서에서 사용된다. 활성화된 엔도뉴클레아제 또는 니카아제인 경우, 표적 DNA절단을 가져올 수 있고, 이를 이용하여 유전체 교정을 가지고 올 수 있다. 또한, 불활성화된 변이체인 경우, 이를 이용하여 전사 조절 혹은 목적하는 DNA의 분리를 가져올 수 있다.
상기 분리된 Cas 단백질은 또한 세포 내로 도입되기에 용이한 형태일 수 있다. 그 예로 Cas 단백질은 세포 침투 펨타이드 또는 단백질 전달 도메인 (protein transduction domain)과 연결될 수 있다. 상기 단백질 전달 도메인은 폴리-아르기닌 또는 HIV 유래의 TAT 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 세포 침투 펩타이드 또는 단백질 전달 도메인은 상기 기술된 예 외에도 다양한 종류가 당업계에 공지되어 있으므로, 당업자는 상기 예에 제한되지 않고 다양한 예를 본 명세서에 적용할 수 있다.
징크-핑거 뉴클레아제(zinc-finger nuclease)
“징크 핑거 DNA 결합 단백질”(또는 결합 도메인)은 아연 이온의 배위를 통해 그 구조가 안정화된 결합 도메인 내의 아미노산 서열 영역인 하나 이상의 징크 핑거를 통해서 서열-특이적 방식으로 DNA와 결합하는 단백질, 또는 더 큰 단백질 내의 도메인이다. 용어 “징크 핑거 DNA 결합 단백질”은 주로 징크 핑거 단백질 또는 ZFP로 약기된다.
상기 징크-핑거 뉴클레아제(zinc-finger nuclease, ZFN)는 표적 유전자 및 절단 도메인 또는 절단 하프-도메인의 표적 부위에 결합하도록 조작된 징크-핑거 단백질을 포함한다. 상기 ZFN은 징크-핑거 DNA 결합 도메인 및 DNA 절단 도메인을 포함하는 인공적인 제한효소일 수 있다. 여기서, 징크-핑거 DNA 결합 도메인은 선택된 서열에 결합하도록 조작된 것일 수 있다. 예를 들면, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al, (2001) Nature Biotechnol. 19: 656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416이 본 명세서 참고자료로서 포함될 수 있다. 자연 발생된 징크 핑거 단백질과 비교하여, 조작된 징크 핑거 결합 도메인은 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은 합리적 설계 및 다양한 타입의 선택을 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 합리적 설계는, 예를 들어 삼중 (또는 사중) 뉴클레오티드 서열, 및 개별 징크 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스의 이용을 포함하며, 이때 각 삼중 또는 사중 뉴클레오티드 서열은 특정 삼중 또는 사중 서열에 결합하는 징크 핑거의 하나 이상의 서열과 연합된다.
상기 ZFN에서 표적 유전자 및 표적 서열의 선택, 융합단백질 또는 이를 암호화하는 폴리 뉴클레오타이드의 설계 및 구성은 당업자에게 공지되어 있으며, 참고자료로 미국특허출원 공개 2005/0064474 및 2006/0188987의 전문에 상세하게 설명되며, 상기 공개특허의 전문이 본 발명의 참고자료로서 본 명세서에 포함된다. 또한, 이러한 참고문헌 및 당업계의 다른 문헌에 개시된 대로, 징크 핑거 도메인 및/또는 다중-핑거 징크 핑거 단백질들이 임의의 적절한 링커 서열, 예를 들면 5개 이상의 아미노산 길이의 링커를 포함하는 링커에 의해 함께 연결될 수 있다. 6개 이상의 아미노산 길이의 링커 서열의 예는 미국등록특허 6,479,626; 6,903,185; 7,153,949을 참고한다. 여기 설명된 단백질들은 단백질의 각 징크 핑거 사이에 적절한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
상기 ZFN과 같은 뉴클레아제는 뉴클레아제 활성 부분인 절단 도메인 및/또는 절단 하프-도메인을 포함한다.
일 예로, 상기 절단 도메인은 징크-핑거 DNA 결합 도메인과는 상이한 뉴클레아제로부터 유래한 절단 도메인, 즉 이종성 절단 도메인일수 있다.
또 다른 예로, 상기 절단 하프-도메인은 절단 활성을 위하여 이량체화를 필요로 하는 임의의 뉴클레아제 또는 그것의 일부로부터 유래된 융합 단백질일 수 있다. 융합 단백질이 절단 하프-도메인을 포함하는 경우, 일반적으로 2개의 융합 단백질이 절단에 필요할 수 있다. 또는, 2개의 절단 하프-도메인을 포함하는 단일 단백질이 이용될 수 있다.
2개의 절단 하프-도메인은 동일한 엔도뉴클레아제 (또는 그것의 기능적 단편들)로부터 유래할 수도 있고, 또는 각 절단 하프-도메인이 상이한 엔도뉴클레아제 (또는 그것의 기능적 단편들)로부터 유래할 수도 있다. 또한, 2 개의 융합 단백질의 표적 부위는, 2 개의 융합 단백질과 그것의 각 표적 부위의 결합에 의해 절단-하프 도메인들이 서로에 대해 공간적으로 배향되어 위치됨으로써, 절단 하프-도메인이, 예를 들어 이량체화에 의해 기능성 절단 도메인을 형성할 수 있도록 하는 관계로 배치되는 것이 바람직하다.
TALEN 시스템
“TALEN”은 DNA의 타겟 영역을 인식 및 절단할 수 있는 뉴클레아제를 가리킨다. 상기 TALEN은 TALE 도메인 및 뉴클레오타이드 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 본 명세서에서 “TAL 이펙터 뉴클레아제” 및 “TALEN”로 혼용하여 사용될 수 있다. TAL 이펙터는 크산토모나스 (Xanthomonas) 박테리아가 다양한 식물 종에 감염될 때 이들의 타입 분비 시스템을 통해 분비되는 단백질로 알려져 있다. 상기 단백질은 숙주 식물 내의 프로모터 서열과 결합하여 박테리아 감염을 돕는 식물 유전자의 발현을 활성화시킬 수 있다. 상기 단백질은 34 개 이하의 다양한 수의 아미노산 반복으로 구성된 중심 반복 도메인을 통해 식물 DNA 서열을 인식한다.
“TALE 도메인” 또는 “TALE”는 하나 이상의 TALE 반복 도메인/단위를 포함하는 폴리펩타이드이다. 이 반복 도메인은 TALE과 그것의 동족 표적 DNA 서열의 결합과 관련된다. 단일 “반복 유닛(“반복부”라고도 함)은 전형적으로 33-35 아미노산 길이이며, 자연 발생한 TALE 단백질 내의 다른 TALE 반복 서열과 적어도 일부 서열 상동성을 나타낸다. 상기 TALE 도메인은 하나 이상의 TALE-반복 모듈을 통해 서열-특이적 방식으로 뉴클레오타이드에 결합하는 단백질 도메인이다.
상기 TALE DNA 결합 도메인은 적어도 하나의 TALE-반복 모듈, 보다 구체적으로 1 내지 30개의 TALE-반복 모듈을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에서, “TALE DNA 결합 도메인”, “TALE 도메인” 또는 “TALE 이펙터 도메인”으로 혼용하여 사용될 수 있다.
상기 TALE DNA 결합 도메인은 TALE-반복 모듈의 절반을 포함할 수 있다. 상기 TALE과 관련하여 국제공개특허 WO/2012/093833호 또는 미국공개특허 2013-0217131호에 개시된 내용 전문이 본 명세서에 참고자료로서 포함된다.
메가뉴클레아제
상기 메가뉴클레아제는 이에 제한되는 것은 아니나, 자연-발생 메가뉴클레아제일 수 있고 이들은 15-40개 염기쌍 절단 부위를 인식하는데, 이는 통상 4개의 패밀리로 분류된다: LAGLIDADG 패밀리, GIY-YIG 패밀리, His-Cyst 박스 패밀리, 및 HNH 패밀리. 예시적인 메가뉴클레아제는 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-SceI, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII를 포함한다.
상기 인위적으로 조작된 메가뉴클레아제는 신규한 결합 특이성을 가지도록 유전적으로 조작된 메가뉴클레아제이다. 메가뉴클레아제로부터 유래하는 자연-발생된 또는 인위적으로 조작된 DNA 결합 도메인은 이종성 뉴클레아제(예, FokI)로부터 유래하는 절단 도메인과 연결되어 유전자 내 하나 이상의 유전자 변형을 시킴으로서, 넉다운(Knock-down) 또는 넉아웃(knock-out)할 수 있다.
RNAi 이용
“안티센스 RNA”를 이용한 유전자 조작 기술은 RNA간섭(RNA interference, RNA silencing)을 이용하여, small RNA(sRNAs)가 mRNA를 방해하거나 저하시키거나 경우에 따라서는 파괴하여 단백질 합성정보가 중간에서 전달되지 못하게 한다. 안티센스 RNA를 이용하여 유전정보의 발현을 제어할 수 있다.
예컨대, 유전자의 발현은 안티센스 RNA 기술을 이용하여 약화 또는 파괴할 수 있다.
임의의 구현에에서, 상기 안티센스 RNA를 이용한 유전자 조작 기술은 small interfiering RNA(이하 'siRNA' 라고 함), short hairpin RNA(이하 'shRNA' 라고 함) 및 microRNA(이하 'miRNA'라고 함) 중 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 안티센스 RNA는 유전자 일부 핵산 서열과 상보적 결합을 형성할 수 있고, 유전자 단백질 발현을 조절할 수 있다.
예컨대, 유전자 내 엑손 영역, 인트론 영역, 조절 영역, 스플라이싱 자리, 5' 말단 부분 또는 이와 인접한 영역, 3'말단 부분 또는 이와 인접한 영역의 일부 핵산 서열과 상보적 결합을 형성할 수 있다.
그 외
그 외 직접적인 유전자의 조작이 아닌, 상기 유전자가 발현하는 인자를 조작하기 위해, dominant negative mutant, ribozyme, intracellular antibody, peptide 또는 small molecule를 사용할 수 있다.
일 예로, 상기 dominant negative mutant를 세포 내에서 발현시켜, 정상적인 기능을 하지 못하는 인자를 발현시킬 수 있다.
또는 다른 예로, peptide 또는 small molecule 등을 이용하여 목표 인자가 세포 내에서 정상적으로 기능하지 못하도록 유도할 수 있다.
배경지식 - 유전자 조작용 물질의 전달(delivery)
유전자 조작용 물질의 전달 - 개괄
이하 전술한 유전자의 인위적인 조작 수단, 즉 유전자 조작용 물질을 유전자 조작의 대상(예를 들어, 세포 등)에 전달하는 방법에 대해 상세히 설명한다.
유전자 조작용 물질의 전달(delivery) 1 - 벡터
유전자 조작용 물질은 naked 핵산 벡터(naked nucleic acid vector), 비-바이러스성 벡터(non-viral vector), 또는 바이러스성 벡터(viral vector)를 이용하여 전달될 수 있다.
상기 벡터는 바이러스 또는 비 바이러스벡터(예를 들어, 플라스미드)일 수 있다.
용어”벡터”는 세포에 유전자 서열을 전달할 수 있다. 전형적으로 “벡터 구조체”, “발현 벡터” 및 “유전자 전달 벡터”는 관심의 유전자 발현을 지시할 수 있고, 표적 세포에 유전자 서열을 전달할 수 있는 임의의 핵산 구조체를 의미한다.
상기 벡터는 세포 내에 도입하여 유전자를 인위적으로 변형시키기 위한 수단으로서 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파지 벡터 등 공지의 발현벡터를 사용할 수 있으며, 벡터는 DNA 재조합 기술을 이용한 임의의 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다.
“유전자 전달 벡터”는 관심의 유전자 발현을 지시할 수 있고, 표적 세포에 유전자 서열을 전달할 수 있는 임의의 핵산 구조체를 의미한다.
따라서, 상기 용어는 클로닝, 및 발현 비히클뿐만 아니라 벡터를 통합하는 것을 포함한다.
상기 벡터는 재조합 발현 벡터일 수 있다. 예를 들어 유전자 조작용 물질을 포함하는 벡터일 수 있다.
상기 유전자를 인위적으로 변형시키기 위한 재조합 발현 벡터는 프로모터(promoter)를 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 당 분야의 프로모터를 이용할 수 있다.
'프로모터'는 전사 개시 및 속도가 조절되는 핵산 서열 영역인 조절 서열이다. 이들 프로모터는, RNA폴리머라제 및 기타 조절 단백질 등의 전사인자가 결합하여 핵산 서열의 특이적인 전사를 개시할 수 있는 유전자 요소를 함유할 수 있다. '유효하게 배치된', '유효하게 결합된', '조절 하에' 및 '전사 조절 하에'란 용어는 프로모터가 서열의 전사 개시 및 발현을 조절하는 핵산 서열과 관련하여 올바른 작용 위치 및/또는 배향으로 배치됨을 의미한다.
예를 들어, 상기 프로모터는 표적 영역 내 내인성 프로모터 또는 외인성 프로모터 일 수 있다. 상기 프로모터는 RNA 중합효소II 또는 RNA 중합효소III에 의해 인식되는 프로모터 일수 있다. 상기 프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 대상 특이적 프로모터, 바이러스 프로모터 또는 비바이러스 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 제어 영역(즉, 가이드RNA, CRISPR 효소)에 따라 적합한 프로모터를 이용할 수 있다. 예를 들어, 가이드RNA를 위해 유용한 프로모터는 H1, EF-1a, tRNA 또는 U6 프로모터일 수 있다. 예를 들어, 에디터 단백질을 위해 유용한 프로모터는 CMV, EF-1a, EFS, MSCV, PGK 또는 CAG 프로모터일 수 있다.
상기 유전자를 인위적으로 변형시키기 위한 재조합 발현 벡터는 리포터(reporter)유전자를 포함할 수 있으며, 상기 리포트 유전자에는 리포터 시스템을 포함할 수 있다.
또한, 상기 유전자를 인위적으로 변형시키기 위한 재조합 발현 벡터는 선택 마커를 포함할 수 있으며, 상기 선택 마커에는 카나마이신 저항성 유전자, 네오마이신 저항성 유전자와 같은 항생제 저항성 유전자, 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질과 같은 형광 단백질 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 유전자를 인위적으로 변형시키기 위한 재조합 발현 벡터는 단백질 분리 정제 또는 확인용 태그 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 태그 서열의 예로는 GFP, GST(Glutathione S-transferase)-tag, HA, His-tag, Myc-tag, T7-tag 등이 있으나, 상기 예들에 의해 본 발명의 태그 서열이 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 유전자를 인위적으로 변형시키기 위한 재조합 발현벡터는 그 외에 복제기원, 인핸서, 임의의 필수 리보솜 결합부위, 코작공통(kozak consensus)서열, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 도너 및 수용체 부위, 전사종결부위, 5'플랭킹 비-전사서열, 인테인 및/또는 2A 서열 등을 포함한다.
유전자 조작용 물질의 전달(delivery) 2 - 바이러스성 전달
상기 유전자 조작 기술은 바이러스를 이용하여 세포 내에 전달될 수 있다.
상기 바이러스성 전달(viral delivery)은 RNA-기반 바이러스성 벡터(RNA-based viral vector)를 이용할 수 있다. 상기 RNA-기반 바이러스성 벡터(RNA-based viral vector)는 온코레트로바이러스 벡터(Oncoretroviral vector), 렌티 바이러스 벡터(Lentiviral vector), 및 인간 포말 바이러스 벡터(Human foamy viral vector)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 바이러스성 전달(viral delivery)은 DNA-기반 바이러스성 벡터(DNA-based viral vector)를 이용할 수 있다. 상기 DNA-기반 바이러스성 벡터(DNA-based viral vector)는 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated virus), 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus), 단순헤르페스바이러스(Herpes simplex virus), 및 수두바이러스(Poxvirus)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
바이러스성 전달(Viral delivery)의 경우, 큰 사이즈(large size) 유전자의 전달(delivery) 효율이 좋다는 장점이 존재한다.
상기 유전자 조작용 물질은 하나 이상의 벡터를 이용하여 대상 내 전달될 수 있다.
예를 들어, 상기 유전자 조작용 물질이 가이드RNA 및 에디터 단백질 일 경우에, 상기 에디터 단백질과 가이드 RNA는 서로 다른 벡터에 암호화되어 전달될 수 있다.
상기 유전자 조작용 물질이 2이상의 벡터를 이용하여 게놈 내 전달될 때, 동일한 종류 또는 상이한 종류의 벡터를 이용하여 전달될 수 있다.
예를 들어, 가이드핵산은 플라스미드를 이용하여 운반될 수 있는 한편 에디터 단백질은 바이러스 벡터를 이용하여 전달될 수 있다.
유전자 조작용 물질의 전달(delivery) 3 - 비-바이러스성 전달
상기 유전자 조작용 물질은 비-바이러스를 이용하여 세포 내에 전달될 수 있다.
상기 비-바이러스성 전달(non-viral delivery)는 naked 핵산 벡터(naked nucleic acid vector를 이용할 수 있다. 상기 naked 핵산 벡터는 환형 핵산 벡터(circular nucleic acid vector) 또는 선형 핵산 벡터(linear nucleic acid vector)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 비-바이러스성 전달은 비-바이러스성 벡터를 이용할 수 있다. 상기 비-바이러스성 벡터는 인공 염색체(artificial chromosome), 리포좀(liposome), 폴리머(polymer), 지질-고분자 혼성체(lipid-polymer hybrid), 무기 나노입자(inorganic nanoparticle), 및 유기 나노입자(organic nanoparticle)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 비-바이러스성 전달(non-viral delivery)은 미세 주입(microinjection), 유전자 총(gene gun), 전기 천공법(electroporation), 소노포레이션(sonoporation), 포토포레이션(photoporation), 마그네토펙션(magnetofection), 및 하이드로포레이션(hydroporation)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
'미세 주입(microinjection)'은 생명체의 기관, 조작, 세포, 또는 세포 내 소기관에 물질을 주사하는 것을 의미한다. 상기 물질은 화학물질(chemical compound), 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide), 또는 폴리펩타이드(polypeptide)를 포함할 수 있다.
상기 미세주입은 생식세포 미세주입(gamete microinjection), 배아 미세주입(embryo microinjection) 및 체세포 미세주입(somatic cell microinjection) 등을 포함할 수 있다.
상기 배아 미세주입(embryo microinjection)은 배아에 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 물질을 미세주입하는 것을 의미하며, 배아(embryo)에 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 물질을 미세주입한 뒤 분화 단계 등을 거쳐 형질 전환 동물을 얻는 기술을 포함한다.
상기 체세포 미세주입(somatic cell microinjection)은 체세포에 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 물질을 미세주입하는 것을 의미한다. 상기 체세포에 미세주입한 뒤 핵 이식 방법에 의해 형질 전환 동물을 얻을 수 있다.
예를 들어, 상기 유전자 조작용 물질이 가이드RNA 및 에디터 단백질일 경우에, 상기 가이드RNA-에디터 단백질 복합체는 미세주입(microinjection)방법에 의해 세포 내 전달될 수 있다. 즉, 리보뉴클레오프로틴(ribonucleoprotein, RNP)의 형태로 전달될 수 있다. 상기 가이드RNA-에디터 단백질 복합체는 가이드RNA와 CRISPR효소의 상호작용을 통해 형성된 복합체를 의미한다.
종래 기술의 한계점
기존에는 혈우병B 동물 모델로서, 생존 주기 및 번식능이 짧고 관리가 용이하며 비용적 측면에서 비교적 저렴힌 생쥐(mice)를 질병 모델용 동물로 많이 활용해왔다. 한편 상기 생쥐(mice)를 이용한 동물 모델은 혈우병에 의한 일부 증상에 대한 소견을 낼 수 없어, 혈우병 환자 질병 유발 기전 및 증상이 유사한 동물 모델을 개발하기 위한 연구가 계속되고 있다.
특히, 기존 혈우병B 질환 동물 모델로 생쥐(mice)는 혈우병B의 대표적 증상 중 하나인 관절, 근육 등 조직 내 자발적 출혈(spontaneous bleeding)이 나타나지 않아 혈우병B 약물 개발 및 생산 등에 질병 동물 모델로 이용하기에는 역부족이다. 또한, 개와 같은 다른 포유류 동물 종은 설치류와 비교하여 번식 및 비용 측면에서 동물 모델로 활용에 한계점이 있다.
이에 따라, 인간과 유전적 유사성, 번식, 비용 및 질환 동물 모델로서 활용하기에 보다 적합한 동물 모델 생산에 대한 필요성이 급증하고 있었으며, 현재까지 랫드(rat)를 이용한 혈우병B 동물 모델은 개발되지 않았다.
혈우병 B 질환 랫드 모델
혈우벙 B 질환 랫드 모델 - 개괄
본 명세서에서는 혈우병B 질환 모델용 동물로서, 혈우병B 질환 랫드를 제공하고자 한다. 상기 혈우병 B 질환 랫드는 1) 인위적으로 변형된 F9 유전자를 포함하고, 2) 이로 인해 인위적으로 변형된 F9인자를 가지고 있으며, 3) 출혈 증상(예를 들어, 지속적 출혈 및/또는 자연출혈)이 나타날 수 있음이 특징이다. 이로 인해, 상기 혈우병 B 질환 랫드는 혈우병 B 질환에 대한 적절한 동물 모델이 될 수 있다는 장점을 가진다.
혈우병 B 질환 랫드 모델의 특징 1 - 인위적으로 변형된 F9 유전자를 포함
본 출원에서 개시하는 일 태양은 게놈 내 인위적 변형이 일어난 혈우병B 질환 랫드(rat)에 관한 것이다. 상기 게놈 내 인위적 변형이 일어난 혈우병B 질환 랫드는 F9 유전자 내 일부 또는 전부가 인위적으로 조작 및/또는 변형된 F9 유전자를 포함한다.
일 실시예로, 상기 혈우병 B 질환 랫드 모델은 F9 인자의 발현 또는 기능이 하향조절(downregulation) 또는 아예 상실되었을 수 있다. 구체적으로, F9 유전자가 넉다운(knock-down) 또는 넉아웃(knock-out) 됐을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하 '인위적으로 변형된 F9 인자 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함되는 랫드'는 '인위적 변형이 일어난 랫드'와 혼용하여 사용될 수 있다. 이하 '인위적으로 변형된 F9 유전자'에 대해서 자세히 설명한다.
인위적으로 변형된 F9 유전자 1 - F9 유전자의 변형 양태
일 구현 예에서, 상기 인위적으로 변형된 F9 유전자는 엑손(exon), 인트론(intron), 조절영역(regulatory region), 5'말단 또는 그의 인접한 부위, 3'말단 또는 그의 인접한 부위 또는 스플라이싱 자리(splicing site) 등에 인위적 변형을 포함한다.
일 예로, 상기 인위적으로 변형된 F9 유전자는 엑손 제1 영역 또는 엑손 제2영역 내 일 영역에 하나 이상의 인위적 변형을 포함할 수 있다.
다른 예로, 상기 인위적으로 변형된 F9 유전자는 조절 영역(인핸서, 프로모터, 3'UTR 및/또는 폴리아데닐화 신호의 비 암호 서열) 내 일 영역에 하나 이상의 인위적 변형을 포함할 수 있다.
또 다른 예로, 상기 인위적으로 변형된 F9 유전자는 5'말단 또는 그의 인접한 부위, 또는 3'말단 또는 그의 인접한 부위 내 일 영역에 하나 이상의 인위적 변형을 포함할 수 있다.
또 다른 예로, 상기 인위적으로 변형된 F9 유전자는 스플라이싱 자리(splicing site)의 일 영역에 하나 이상의 인위적 변형을 포함할 수 있다.
상기 F9 유전자의 변형되는 일 영역 ('타겟 부위')은 상기 유전자 중의 약 1bp, 약 2bp, 약 3bp, 약 4bp, 약 5bp, 약 6bp, 약 7bp, 약 8bp, 약 9bp, 약 10bp, 약 11bp, 약 12bp, 약 13bp, 약 14bp, 약 15bp, 약 16bp, 약 17bp, 약 18bp, 약 19bp, 약 20bp, 약 21bp, 약 22bp, 약 23bp, 약 24bp, 약 25bp, 약 26bp, 약 27bp, 약 28bp, 약 29bp, 약 30bp, 약 40bp 또는 약 50bp의 연속하는 염기서열 부위일 수 있다. 상기 F9 유전자의 타겟 부위는 상기 유전자 중의, 바로 이전 문장에서 선택된 두 개의 수치범위 내 길이를 가지는 연속하는 염기서열 부위일 수 있다. 상기 F9 유전자의 타겟 부위는 상기 유전자 중의, 이전 문장에서 선택된 하나의 수치 이상의 길이를 가지는 연속하는 염기서열 부위일 수 있다.
상기 F9 유전자 핵산서열 변형은 하나 이상의 뉴클레오타이드의 부가, 결실 또는 게놈으로의 치환을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
F9 유전자 내 핵산 서열의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입,
F9 유전자 내 핵산 서열의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실,
F9 유전자 내 핵산 서열의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환,
F9 유전자 내 핵산 서열 또는 이의 부분의 녹아웃(knock-out)
F9 유전자 내 핵산 서열 또는 이의 부분의 녹다운(knock-down) 등을 포함할 수 있다.
예컨대,
상기 F9 유전자의 변형은 다음 중 하나 이상에 의하여 유도된 것일 수 있다:
1) F9 유전자의 전부 또는 일부 결실, 예컨대, F9 유전자의 1bp 이상의 뉴클레오타이드, 예컨대, 1 내지 50개 1 내지 30개, 1 내지 27개, 1 내지 25개, 1 내지 23개, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개, 또는 1개의 뉴클레오타이드의 결실;
2) F9 유전자의 1bp 이상의 뉴클레오타이드, 예컨대, 1 내지 30개, 1 내지 27개, 1 내지 25개, 1 내지 23개, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개, 또는 1개의 뉴클레오타이드의 치환, 및
3) 하나 이상의 뉴클레오타이드, 예컨대, 1 내지 30개, 1 내지 27개, 1 내지 25개, 1 내지 23개, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개, 또는 1개의 뉴클레오타이드 (각각 독립적으로 A, T, C 및 G중에 선택됨)의 외래 유전자의 임의 위치에 삽입.
상기 엑손(Exon) 또는 인트론(introno) 내 하나 이상의 핵산서열 변경의 결과로, 상기 F9 유전자의 전사량 감소 또는 상실, 상기 F9 인자 발현의 감소 또는 상실, 또는 상기 F9 인자의 기능 및/또는 활성이 저하 내지 불활성화될 수 있다.
상기 조절영역(regulatory region), 스플라이싱 사이트(splicing site), 5'말단 또는 그의 인접한 부위, 3'말단 내 하나 이상의 핵산서열 변경의 결과로, 상기 F9 유전자의 전사량 감소 또는 상실, 상기 F9 인자 발현의 감소 또는 상실, 또는 F9 인자의 기능 및/또는 활성이 저하 내지 불활성화될 수 있다.
또 다른 구현 예로, 상기 게놈 내 인위적 변형이 일어난 혈우병B 질환 랫드는 F9 유전자가 모두 제거되었을 수 있다. 즉, 인위적 조작 또는 변형에 의해 F9 유전자가 통째로 제거된 변형을 포함할 수 있다.
일 구현 예로, 상기 F9 유전자는 그 양 말단의 일부 핵산 서열 및/또는 양 말단의 인접한 부위가 동시 또는 순차적으로 절단되거나 및/또는 제거될 수 있다. 또 다른 구현 예로, 상기 F9 유전자는 전부 제거될 수 있다.
인위적으로 변형된 F9 유전자 2 - 인위적으로 변형된 F9 인자
상기 게놈 내 인위적 변형은 F9인자의 돌연변이를 유발할 수 있다. 즉, 혈우병B 랫드는 인위적으로 변형된 F9 인자를 포함할 수 있다.
일 구체 예에서, 상기 인위적 변형된 F9인자는 하나 이상의 아미노산 서열이 변경된 F9인자일 수 있다.
상기 F9 인자 내 하나 이상의 아미노산은 비슷한 성질을 가진 아미노산으로 변경될 수 있다.
예를 들어, 상기 F9 폴리펩타이드 내 소수성 아미노산은 다른 소수성 아미노산으로 변경될 수 있다. 소수성 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신 또는 아르기닌 또는 히스티딘 중 하나이다.
또 다른 예를 들어, 상기 F9 폴리펩타이드 내 산성 아미노산은 다른 산성 아미노산으로 변경될 수 있다. 산성 아미노산은 글루탐산 또는 아스파르트산 중 하나이다.
또 다른 예를 들어, 상기 F9 폴리펩타이드 내 극성 아미노산은 다른 극성 아미노산으로 변경될 수 있다. 극성 아미노산은 세린, 트레오닌, 아스파라긴 또는 글루타민 중 하나이다.
상기 F9 인자 내 하나 이상의 아미노산은 상이한 성질을 가진 아미노산으로 변경될 수 있다.
예를 들어, 상기 F9 폴리펩타이드 내 소수성 아미노산은 극성 아미노산인 세린, 트레오닌, 아스파라긴 및 글루타민 중 어느 하나의 아미노산으로 변경될 수 있다.
또 다른 예를 들어, 상기 F9 폴리펩타이드 내 소수성 아미노산은 산성 아미노산인 글루탐산 또는 아스파르트산 중 어느 하나의 아미노산으로 변경될 수 있다.
또 다른 예를 들어, 상기 F9 폴리펩타이드 내 소수성 아미노산은 염기성 아미노산인 아르기닌 및 히스티딘 중 어느 하나의 아미노산으로 변경될 수 있다.
또 다른 예를 들어, 상기 F9 폴리펩타이드 내 극성 아미노산은 소수성 아미노산인 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 중 어느 하나 이상의 아미노산으로 변경될 수 있다.
또 다른 예를 들어, 상기 F9 폴리펩타이드 내 산성 아미노산은 염기성 아미노산인 아르기닌 또는 히스티딘으로 변경될 수 있다.
또 다른 예를 들어, 상기 F9 폴리펩타이드 내 염기성 아미노산은 산성 아미노산인 글루탐산 또는 아스파르트산으로 변경될 수 있다.
요컨대, 상기 아미노산의 변경 및/또는 치환으로 인해, 단백질 발현량이 조절될 수 있다.
또는, 상기 아미노산의 변경 및/또는 치환은 단백질의 구조, 기능에 영향을 줄 수 있다.
따라서 일 구현예로, 상기 F9 인자의 인위적 변형에 의해 상기 혈우병B 랫드는 발현을 아예 하지 않거나, 발현이 억제되거나, 및/또는 발현량이 감소된 F9 인자를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예로, 상기 혈우병B 랫드는 기능이 저하되거나 상실된 F9 인자를 포함할 수 있다.
혈우병 B 질환 랫드 모델의 특징 2 - 출혈 증상이 발생함
상기 인위적 변형이 일어난 랫드는 출혈증상(지속적 출혈, 자연출혈)이 나타날 수 있다. 일 구현예로, 상기 인위적 변형이 일어난 랫드는 자연 출혈(spontaneous bleeding) 및/또는 외출혈(external bleeding)이 일어날 수 있다. 임의의 구현예에서, 상기 인위적 변형이 일어난 랫드는 조직 내 자연 출혈(spontaneous bleeding)을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 인위적 변형이 일어난 랫드는,
상기 조직 내 자연 출혈에 의한 염증; 및/또는
상기 조직 내 자연 출혈에 의한 붓기를 포함하며,
예를 들어, 상기 조직은 관절, 근육 및 눈일 수 있다.
특히, 상기 인위적 변형이 일어난 랫드는 생쥐(mice)에는 나타나지 않는 자연 출혈(spontaneous bleeding)이 나타날 수 있다.
혈우병 B 질환 랫드 모델의 장점 1 - 랫드 자체의 장점
랫드(rat)는 인간과 유전적 유사성이 높으며, 생쥐의 동물 모델로서 장점을 모두 보유하고 있다. 예를 들어, 랫드(rat)는 영양이나 대사생리적 측면에서 다른 종류의 동물보다 사람과 유사성이 높고 근육과 장기 등의 중량비가 사람과 비슷하며, 내분비, 생식 등의 측면에서 성주기의 판정이 마우스보다 편리하고 보다 규칙적이며, 월경주기 면에서도 사람과 유사성이 높다. 또한, 상기 랫드는 마우스와 비교하여 성장기는 짧고, 번식 능력은 거의 비슷하면서, 몸집은 더 크기 때문에 외과적 수술조작이 보다 용이하다. 또한, 상기 랫드는 시료 채취 시 더 많은 양을 채취할 수 있으며, 포유류에 나타나는 질병에 대한 증상이 마우스와 비교하여 인간과 더 유사하게 나타나, 신뢰성 있는 질병 동물 모델이다.
혈우병 B 질환 랫드 모델의 장점 2 - 혈우병 B 질환 모델로서의 장점
각종 출혈 증상(예를 들어, 자연 출혈 증상)은 혈우병 B 질환의 대표적인 증상 중 하나이다. 특히 무릎 관절 등에 자연 출혈이 발생하는 경우, 관절염 등이 발생하는 문제가 있어 치료제 개발 수요가 급증하고 있다. 치료제 개발 과정에는 해당 질환에 대한 적절한 동물 모델을 사용하는 것이 필수적이다. 하지만, 종래 일반적으로 사용되었던 혈우병 B 질환 동물 모델인 생쥐(mice) 모델은, 상기 각종 출혈 증상이 나타나지 않아 효과적인 동물 모델이 될 수 없었다. 또한, 개와 같은 포유류 동물 종은 인간과 더 유사한 모델 동물을 제조할 수 있다는 장점은 있지만, 번식이 용이하지 않고, 실험 비용이 너무 많이 소요되기 때문에 동물 모델로서 사용하기 어렵다는 문제점이 있었다. 본 명세서에서 제공하는 상기 혈우병 B 질환 랫드 모델은 1) 혈우병 B 질환의 대표적인 증상인 각종 출혈 증상(예를 들어, 자연 출혈)이 발생한다는 점이 특징으로서, 혈우병 B 질환에 대한 동물 모델로서 적합하고, 2) 번식이 용이하고, 비용이 적게 드는 등, 상기한 랫드 자체의 장점 덕에 효율적인 동물 모델로 사용될 수 있다는 장점이 있다. 따라서, 상기 혈우병 B 질환 랫드(rat) 모델은 기존 마우스 모델의 한계를 극복한 동물 모델로서, 치료제 개발 및 생산에 있어서 적합할 뿐만 아니라 독성 및 안정성 평가에 좋은 동물 모델이다.
랫드 종류 - 예시
랫드(rat)는 쥐가(muridae), 시궁쥐속(Rattus)에 속하며, 생쥐속(Mus)에 해당하는 생쥐와는 구별된다. 이러한 랫드는 윈스타쥐(wistar rat), 롱에반스쥐(long-Evans rat), 스프라구 돌리쥐(Sprague Dawley rat), 저커쥐(Zucker rat), 바이오브리딩 쥐(Biobreeding rat), 브래틀보로 쥐(brattleboro rat), 헤어리스쥐(Hairless rat)등이 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 랫드는 당업자가 적절히 선택되어 사용할 수 있는, 공지된 임의의 종류를 사용할 수 있다.
인위적으로 변형된 F9 유전자를 포함하는 세포
인위적으로 변형된 F9 유전자를 포함하는 세포 - 개괄
본 출원에서 개시하는 일 태양은 인위적으로 변형된 F9 인자 및/또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 세포에 관한 것이다. 상기 세포는 상기 혈우병 B 질환 랫드 모델을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 상기 세포는 목적에 따라 상기 혈우병 B 질환 랫드 모델과는 별도로, 독립적으로 사용될 수 있다.
대상 세포 - 예시
상기 세포는 형질 전환된 줄기세포, 배아세포 또는 체세포일 수 있다.
임의의 구체예에서, 예를 들면 상기 세포는 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아 생식세포, 태아 유래 세포, 태좌세포 및 배아세포 등이 있다. 또한 다양한 기원 조직으로부터 유래된 성체 줄기세포, 예를 들어, 지방, 자궁, 골수, 근육, 태반, 제대혈 또는 피부(상피) 등의 조직 유래 줄기세포를 사용할 수 있다. 비-인간 숙주 배아는 일반적으로 2-세포 단계, 4-세포 단계, 4-세포 단계, 8-세포 단계, 16-세포 단계, 32-세포 단계, 64-세포 단계, 상실배 또는 배반포를 포함하는 배아일 수 있다.
또 다른 임의의 구체예에서 상기 세포는 간(hepatocyte)세포일 수 있다.
상기 배아세포, 체세포 또는 줄기세포는 당업계에 공지되어 있는 통상적인 방법을 사용하여 외과용 표본 또는 생체검사용 표본을 제조하는 방법으로부터 수득될 수 있다.
형질 전환 세포
'형질 전환 세포'는 세포 내 게놈 중 형질 전환된 부분을 포함하고 있는 체세포 또는 배아세포일 수 있다. 이하에서 형질 전환된 체세포 또는 배아세포는 형질 전환 세포라는 용어와 혼용되어 사용될 수 있다. 상기 형질 전환 세포는 형질 전환된 부분을 포함하고 있는 제1세포로부터 분열되어 얻은 제2세포를 포함한다. 이때, 분열되어 얻어진 제2 세포는 제1 세포의 형질 전환된 부분과 동일한 염기서열을 가지는 부분을 포함한다.
상기 형질 전환 세포는 인위적으로 변형된 F9 유전자를 포함한다. 인위적으로 변형된 F9 유전자는 전술한 바와 같다.
일 실시예로, 상기 형질 전환 세포는 F9 유전자 내 하나 이상의 일 영역에 뉴클레오타이드의 부가, 결실 또는 치환이 일어난 유전자를 포함할 수 있다.
다른 실시예로, 상기 F9 유전자가 넉다운(knock-down) 및/또는 넉아웃(knock-out)된 세포 일 수 있다.
상기 형질 전환 세포는 F9 인자가 아예 없거나 또는 발현량이 감소된 세포일 수 있다.
상기 형질 전환 세포는 F9 인자의 기능이 상실되거나 또는 저하된 세포일 수 있다.
상기 형질 전환 세포는 F9 인자가 결핍된 세포일 수 있다.
유전자 조작용 물질 포함
상기 형질 전환 세포는 F9인자를 타겟 하는 유전자 조작용 물질 즉, 인위적 뉴클레아제, 안티센스 RNA, dominant negative mutant F9, 또는 리보자임 등을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 형질 전환 세포는 CRISPR-Cas system, ZFN, TALEN 또는 메가 뉴클레아제를 포함하거나, 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함한다.
또는 예를 들어, 상기 형질 전환 세포는 small interfering RNA(siRNA), short hairpin RNA(shRNA) 또는 microRNA를 포함하거나, 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함한다.
또는 예를 들어, 상기 형질 전환 세포는 F9 인자를 타겟 하는 dominant negative mutant F9, 또는 F9 인자를 암호화하는 핵산에 대한 리보자임(ribozyme)을 포함하거나 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함한다.
상기 유전자 조작용 물질은 세포 내 다양한 형태로 포함된다 예를 들어, 유전자 조작용 물질을 암호화하는 핵산을 포함하고 있는 벡터의 형태일 수 있다.
세포 콜로니 형성 가능
상기 형질전환 세포는 세포 콜로니를 형성할 수 있다. 상기 세포 콜로니는 단일 세포로부터 배양된 단일 세포일 수 있다.
이때, 상기 세포 콜로니는 F9인자가 모두 넉다운 또는 넉아웃된 세포로만 형성된 콜로니일 수 있다.
또는 세포 콜로니는 넉다운 또는 넉아웃되지 않은 정상 F9 인자를 포함하는 세포를 포함하는 키메릭(chimeric) 세포 콜로니일 수 있다.
혈우병 B 질환 모델 랫드(rat) 제조를 위한 F9 유전자 조작용 조성물
혈우병 B 질환 모델 랫드(rat) 제조를 위한 F9 유전자 조작용 조성물 - 개괄
본 명세서는 F9 유전자 조작용 조성물을 제공하고자 한다. 본 출원에 의해 개시되는 내용의 일 태양은 F9 유전자를 인위적으로 조작 또는 변형하기 위한 조성물에 관한 것이다.
혈우병 B 질환 랫드 모델 제조용 조성물 - 예시
상기 F9 유전자를 조작 또는 변형하기 위한 조성물은 상기 인위적 뉴클레아제 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인위적 뉴클레아제는 TALEN, ZFN, 메가 뉴클레아제 또는 CRISPR-enzyme 시스템 중 어느 1이상일 수 있다.
상기 F9 유전자 조작용 조성물은 F9 유전자 내 일부 핵산서열과 상보적 결합을 형성할 수 있는 안티센스 RNA 예를 들어, siRNA 또는 shRNA등을 포함할 수 있다.
상기 F9 인자 또는 이를 암호화하는 유전자를 조작 또는 변형하기 위한 조성물은 dominant negative mutant F9 인자 또는 ribozyme 등을 포함할 수 있다.
또는, 본 출원에 의해 개시되는 내용의 다른 구현예에서 상기 조성물은 F9 단백질 기능을 억제하거나 또는 저하시키는 dominant negative mutant, intracellular antibody, peptide 및 small molecule 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다
상기 조성물은 하나 이상의 가이드 RNA 및 Cas9 효소 또는 이의 복합체, 안티센스 RNA 및 dominant negative mutant F9 인자 중 어느 하나 이상을 혼합하여 포함할 수 있다.
상기 조성물은 발현 카세트 형태로 제공될 수 있다.
CRISPR-Cas system 포함 조성물 1 - 개괄
본 출원에 의해 개시되는 내용의 일 구현예는 F9 유전자 조작용 조성물로서, CRISPR-Cas system을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 출원에 의해 개시되는 일 구체예에서, 상기 조성물은
가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 DNA; 및
에디터 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA를 포함할 수 있고,
상기 에디터 단백질은 CRISPR 효소이며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
일 구현예에서, 상기 CRISPR 효소는 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 가이드 RNA는 F9 유전자 내 표적 서열과 상동성이 있거나, 상보적인 결합을 형성할 수 있다.
상기 가이드RNA-에디터 단백질 복합체가 F9 유전자 또는 핵산 서열에 결합하면, 상기 가이드RNA-에디터 단백질 복합체의 에디터 단백질에 의해 F9 유전자 또는 핵산 서열은 절단 또는 변형될 수 있다.
CRISPR-Cas system 포함 조성물 2 - 가이드 RNA의 표적 서열
상기 CRISPR Cas system을 포함하는 조성물은 가이드 RNA를 포함한다. 상기 가이드 RNA는 표적 서열과 상동성이 있거나, 상기 표적 서열과 상보적인 결합을 할 수 있는 서열을 포함한다. 이하 표적 서열에 대해 자세히 설명한다.
“표적 서열”은 표적 유전자 또는 핵산 내에 존재하는 뉴클레오타이드 서열로, 구체적으로는 표적 유전자 또는 핵산 내에 표적 영역의 일부 뉴클레오타이드 서열이며, 이때 “표적 영역”은 표적 유전자 또는 핵산 내에 가이드핵산-에디터단백질에 의해 변형될 수 있는 부위이다.
이하에서, 표적 서열이라 함은 두 가지의 뉴클레오타이드 서열 정보 모두를 의미하는 용어로 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적 유전자의 경우, 표적 서열은 표적 유전자 DNA의 transcribed strand의 서열 정보를 의미하는 것일 수도 있고, 또는 non-transcribed strand의 뉴클레오타이드 서열 정보를 의미하는 것일 수도 있다.
일 실시예로, 상기 표적 유전자는 F9 유전자일 수 있다.
임의의 구현예에서
상기 F9 유전자 내 표적 서열은 F9 유전자 내 엑손 영역에 위치하는 연속하는 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
이때, 상기 표적 서열은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열, 35 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
또는 상기 표적 서열은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드 서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드 서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드 서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
상기 F9 유전자 내 표적 서열은 F9 유전자 내 프로모터 영역에 위치한 연속하는 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
이때, 상기 표적 서열은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열, 35 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또는 상기 표적 서열은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
상기 F9 유전자 내 표적 서열은 F9 유전자 내 인트론 영역에 위치한 연속하는 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
이때, 상기 표적 서열은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열, 35 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또는 상기 표적 서열은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
상기 F9 유전자 내 표적서열은 F9 유전자 내 인핸서(enhancer) 영역에 위치한 연속하는 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
이때, 상기 표적 서열은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열, 35 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또는 상기 표적 서열은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
상기 F9 유전자 내 표적서열은 F9 유전자 내 프로모터, 인핸서, 3'UTR, 폴리아데닐(polyA) 또는 이의 혼합 부분에 위치한 연속하는 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
이때, 상기 표적 서열은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
또는 상기 표적 서열은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드 서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드 서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드 서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
상기 F9 유전자 내 표적서열은 F9 유전자 내 엑손, 인트론 또는 이의 혼합 부분에 위치한 연속하는 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
이때, 상기 표적 서열은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
또는 상기 표적 서열은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드 서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드 서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드 서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
상기 F9 유전자 내 표적서열은 F9 유전자 내 돌연변이 부분(예를 들면, 야생형 유전자와 다른 부분)을 포함하거나 또는 근접한 연속하는 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
상기 “돌연변이(mutation)”은 유전자가 가지는 DNA의 염기서열에 변화가 일어난 것으로, 유전자가 가지는 DNA의 염기서열 내에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 삭제(deletion), 삽입(insertion) 또는 치환(substitution)되어 변형된 것을 모두 포함한다. 이떄, 유전자 내 돌연변이가 일어난 서열을 “돌연변이 서열(mutation sequence)”로 지칭한다. 또한, 돌연변이는 유전자 내 돌연변이로 인해 유전자가 암호화하는 단백질의 일부 아미노산이 삭제(deletion), 삽입(insertion) 또는 치환(substitution)되어 변형된 것을 모두 포함한다.
이때, 상기 하나 이상의 돌연변이는 자연발생적으로 유발된 돌연변이일 수 있다.
이때, 상기 하나 이상의 돌연변이는 대상 단백질 발현에 영향을 미치지 않는 동의 돌연변이(synonymous mutation)일 수 있다.
예를 들어, 상기 대상이 단일 핵산염기 다형현상 의존 유전자일 경우, 하나 이상의 돌연변이는 특정 질병(암, 당뇨병, 고혈압 등)에 대한 약물 반응성, 부작용, 또는 약물에 대한 내성에 영향을 주지 않는 돌연변이일 수 있다.
이때, 상기 표적 서열은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
또는 상기 표적 서열은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드 서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드 서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드 서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
바람직하게, 본 명세서에 의해 개시되는 표적서열은 F9 유전자 내 엑손영역 또는 엑손, 인트론 또는 이의 혼합부분에 위치하는 연속하는 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
이때, 상기 표적 서열은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
또는 상기 표적 서열은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드 서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드 서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드 서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
상기 F9 유전자 내 표적서열은 F9 유전자의 핵산서열 내의 PAM(proto-spacer-adjacent Motif) 서열의 5'말단 및/또는 3'말단에 인접한 연속하는 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
이때, 상기 PAM 서열은 예를 들어, 하기의 서열 중 1 이상일 수 있다(5'에서 3'방향으로 기재함).
NG(N은 A, T, C 또는 G임);
NGG(N은 A, T, C 또는 G임);
NNNNRYAC(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, R은 A또는 G이고, Y는 C또는 T임);
NNAGAAW(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, W는 A 또는 T임);
NNNNGATT(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G임);
NNGRR(T)(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, R은 A 또는 G임); 및
TTN(N은 A, T, C 또는 G임).
일 실시예로, 상기 PAM 서열은 NGG(N은 A, T, C 또는 G임)일 수 있다.
일 실시예로, 상기 표적 서열은 서열번호 1번 내지 6번으로 이뤄진 군에서 선택된 하나 이상의 서열일 수 있다. 일 실시예로, 상기 가이드 RNA는 상기 서열번호 1번 내지 6번으로 이뤄진 군에서 선택된 하나 이상의 표적 서열과 상동성이 있거나, 이와 상보적으로 결합할 수 있는 서열을 포함할 수 있다.
CRISPR-Cas system 포함 조성물 3 - 가이드RNA 전체 서열
상기 가이드 RNA는 전술한 표적 서열과 상동성을 가지는 서열 또는 이와 상보적인 결합을 할 수 있는 서열뿐 아니라 Cas9 단백질과 복합체를 이룰 수 있는 서열 부분을 더 포함한다. 상기 서열은 부분은 Cas9 단백질의 유래에 따라 달라질 수 있다. 일 실시예로, 상기 CRISPR-Cas system이 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질을 에디터 단백질로 포함하는 경우, 상기 가이드 RNA는 표적 서열 및 5'-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3'(서열번호 27)로 표현되는 서열 부분을 포함할 수 있다. 일 실시예로, 상기 CRISPR-Cas system이 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질을 에디터 단백질로 포함하는 경우, 상기 가이드 RNA는 표적 서열 및 5'-GUUUUAGUCCCUGAAAAGGGACUAAAAUAAAGAGUUUGCGGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU-3'(서열번호 28)로 표현되는 서열 부분을 포함할 수 있다. 일 실시예로, 상기 가이드 RNA는 서열번호 21 내지 26으로 이뤄진 군에서 선택된 서열을 포함할 수 있다.
CRISPR-Cas system 포함 조성물 4 - 에디터 단백질
상기 CRISPR-Cas system을 포함하는 조성물은 에디터 단백질을 포함한다. 에디터 단백질의 기능에 대해서는 전술하였다. 일 구현예로, 상기 에디터 단백질은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스아우레우스 (Streptococcus aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이세리아 메닝기디티스 (Neisseria meningitidis)유래의 Cas9 단백질, 및 Cpf1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 바람직한 구현예로, 상기 에디터 단백질은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질일 수 있다.
CRISPR-Cas system 포함 조성물 6 - 가이드 핵산-에디터단백질 복합체
가이드 핵산 및 에디터 단백질에 관한 설명은 전술한 바와 같다.
상기 F9 유전자와 상보적 결합을 형성하는 가이드 핵산과 에디터단백질은 가이드핵산-에디터단백질 복합체를 형성할 수 있다.
상기 가이드핵산-에디터단백질 복합체는 세포 밖에서 형성될 수 있다.
상기 가이드핵산-에디터단백질 복합체는 세포 내의 세포질에서 형성될 수 있다.
상기 가이드핵산-에디터단백질 복합체는 세포 내의 핵 안에서 형성될 수 있다.
상기 가이드핵산-에디터단백질 복합체체에서, 에디터 단백질은 F9 유전자 또는 핵산 서열 내에 존재하는 PAM을 인식할 수 있다.
상기 가이드핵산-에디터단백질 복합체에서 가이드 핵산은 F9 유전자 또는 핵산 서열에 상보적인 결합을 할 수 있다.
상기 가이드핵산-에디터단백질 복합체가 F9 유전자 또는 핵산 서열에 결합하면, 상기 가이드핵산 - 에디터 단백질 복합체의 에디터 단백질에 의해 F9 유전자 또는 핵산 서열은 절단 또는 변형될 수 있다.
CRISPR-Cas system 포함 조성물 5 - CRISPR-Cas system의 형태
상기 CRISPR-Cas 시스템은 바이러스 벡터, 비바이러스 벡터 또는 비-벡터형태로 조성물에 포함될 수 있다.
일 실시예에서 상기 CRISPR-Cas system은 가이드 RNA 및 CRISPR 효소가 복합체(complex)를 형성하는 RNP(ribonucleoprotein) 형태로 존재할 수 있다.
다른 실시예에서, 상기 CRISPR-Cas 시스템은 핵산의 형태로 벡터에 포함될 수 있다.
상기 벡터는 바이러스 벡터 또는 비-바이러스벡터일 수 있다.
상기 CRISPR-Cas 시스템은 한 개의 벡터에 포함될 수 있다.
상기 CRISPR-Cas 시스템은 두 개 이상의 벡터에 포함될 수 있다. 이때 상기 두 개의 벡터는 동일한 종류의 벡터일 수도 있고, 상이한 종류의 벡터일 수도 있다.
인위적으로 변형된 F9 유전자를 포함하는 랫드 세포 제조 방법
인위적으로 변형된 F9 유전자를 포함하는 랫드 세포 제조 방법 - 개괄
본 출원의 일 태양은 F9 유전자 내 인위적 변형을 포함하는 랫드(rat) 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 일 실시예로, 상기 제조 방법은 F9 유전자 조작용 조성물을 랫드 세포에 접촉시키는 것을 포함한다. 더 나아가, 상기 제조 방법은 형질 전환된 세포를 배양하는 것; 및/또는 상기 형질 전환된 세포를 선별하는 것을 추가적으로 포함할 수 있다.
F9 유전자 조작용 조성물을 접촉시키는 것
상기 제조 방법은 랫드(rat) 세포의 F9 유전자를 인위적으로 변형시키는 것을 중요한 구성 요소로 포함한다. 이때, 전술한 F9 유전자 조작용 조성물을 이용할 수 있다. 일 구현예로, 상기 제조 방법은 상기 랫드 세포에 F9 유전자 조작용 조성물을 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 랫드 세포는 체세포, 배아세포, 또는 배아줄기세포일 수 있다. 일 구현예로, 상기 접촉시키는 것은 전기천공법(electroporation), 리포좀, 플라스미드, 바이러스 벡터, 나노파티클(nanoparticles) 및 PTD(Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 중 선택되는 1이상의 방법으로 수행될 수 있다. 일 구현예로, 상기 접촉시키는 것은 생체 외(in vitro)에서 수행될 수 있다.
형질 전환된 세포의 배양
상기 유전자 조작 기술을 이용해 형질 전환된 세포는 콜로니를 형성할 수 있다. 형질 전환된 세포를 포함하는 세포 콜로니는 전술한 바와 같다.
상기 F9 유전자를 인위적으로 변형시키기 위한 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 랫드 유래 세포는 당업계에 공지된 방법에 따라 증식 및 배양될 수 있다.
적절한 배지는 동물 세포 및 특히, 설치류 동물 세포의 배양을 위해 개발되거나, 또는 동물 세포 성장에 필요한 적절한 성분, 예컨대 동화성 탄소, 질소 및/또는 미량 영양소와 함께 실험실 내에서 제조될 수 있는 임의의 이용 가능한 배지를 사용할 수 있다.
상기 배지는 동물 세포 성장에 적절한 임의의 기본 배지, 비제한적인 예로서, 일반적으로 배양에 이용되는 기본 배지로는 MEM(Minimal Essential Medium), DMEM(Dulbecco modified Eagle Medium), RPMI(Roswell Park Memorial Institute Medium), K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium)이 있으며, 이 외에도 당해 업계에서 이용되는 배지라면 제한 없이 사용할 수 있다. 바람직하게는, α-MEM 배지(GIBCO), K-SFM 배지, DMEM배지(Welgene), MCDB 131배지(Welgene), IMEM배지(GIBCO), DMEM/F12 배지, PCM 배지, M199/F12(mixture)(GIBCO), 및 MSC 확장배지(Chemicon)로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
이러한 기본 배지에, 탄소, 질소 및 미량 영양소의 동화성 공급원, 비제한적인 예로서, 혈청 공급원, 성장 인자, 아미노산, 항생제, 비타민, 한원제, 및/또는 당 공급원이 첨가될 수 있다.
당업계에서 통상의 지식을 가진 자가 적합한 배지를 선택 또는 조합하여 공지의 방법으로 적절히 배양할 수 있음은 자명할 것이다. 또한 이 분야의 통상의 지식에 기초하여 적합한 배양 환경, 시간, 온도 등의 조건을 조절하면서 배양할 수 있음은 자명하다.
형질전환 세포의 선별
본 출원의 다른 태양은 F9 타겟 유전자 조작 기술을 포함하는 형질전환 세포를 선별하는 단계를 포함할 수 있다.
이때, 상기 형질 전환 세포는 항생제 저항성 유전자(antibiotic resistance gene), 항원-항체반응, 형광 단백질(fluroscent protein) 및 표면 마커 유전자(surface marker gene) 중 어느 하나 이상을 이용하여 형질 전환 세포를 콜로니로부터 선별할 수 있다.
예를 들어, F9 타겟 유전자 조작 기술, 즉 예를 들어 가이드RNA 및 Cas9 단백질을 포함하는 세포는 형광 신호(fluorescence signal)를 측정할 수 있다. 따라서 상기 유전자 조작 기술을 포함하지 않는 세포와 구별할 수 있다.
혈우병 B 질환 랫드 모델 제조 방법
혈우병 B 질환 랫드 모델 제조 방법 - 개괄
본 명세서에서는 혈우병B 질환 랫드 모델을 제조하는 방법을 제공하고자 한다. 일 실시예로, 상기 제조방법은 CRISPR/Cas system을 이용한 F9 유전자 조작 랫드 제조방법일 수 있다. 또 다른 실시예로, 상기 제조방법은 배아 세포 이식을 이용한 F9 유전자 조작 랫드 제조방법일 수 있다. 또 다른 실시예로, 상기 제조방법은 핵 공여 세포를 이용한 F9 유전자 조작 랫드 제조방법일 수 있다.
배아 세포 이식을 이용한 F9 유전자 조작 랫드 제조방법
본 명세서에서 개시하는 일 태양은 배아 세포를 이식하는 방법을 이용한 F9 유전자 조작 랫드 생산방법에 관한 것이다.
상기 방법은
(a) 랫드의 조직으로부터 분리한 배아 세포를 상기 F9 유전자 조작용 조성물과 접촉시키는 것;
(b) 대리모 내 배아들을 이식하는 것; 및
(d) 대리모는 인위적으로 변형된 F9 유전자를 포함하는 랫드를 임신하는 것,
을 포함할 수 있다.
각 단계에 관한 통상적인 기술 내용은 당업계에 공지되어 있는 종래 배아 이식 방법을 참조하여 이해할 수 있을 것이다.
또한, 상기 F9 유전자 조작용 조성물과 접촉시키는 것은 당업계에 공지되어있는 통상의 방법을 이용할 수 있다.
예를 들어, 상기 F9 유전자 조작용 조성물을 세포 외(in vitro)에서 가이드 RNA 및 Cas9 복합체를 형성하여 전기천공법(electroporation) 또는 미세주입법(microinjection)등의 공지의 방법을 이용하여 배아 세포와 접촉시킬 수 있다.
다른 예로, 상기 F9 유전자 조작용 조성물은 하나 이상의 벡터를 이용하여 세포 내 도입될 수 있고 세포 내에서 복합체를 형성하여 F9 유전자의 표적 서열에 결합할 수 있다.
핵 공여 세포를 이용한 F9 유전자 조작 랫드 제조방법
본 명세서에서 개시하는 일 태양은 재조합 벡터가 도입된 핵 공여 세포의 핵을 탈핵된 난자에 이식하여 산자를 생산함으로써, F9 유전자가 인위적으로 넉아웃 된 혈우병B 질환 모델용 형질전환 랫드의 제조방법 및 이에 의해 제조된 혈우병 B질환 모델용 랫드에 관한 것이다.
임의의 구체예에서, 상기 F9 유전자를 인위적으로 넉아웃 시킨 형질전환 세포주를 이용하여 체세포 핵 이식 방법(somatic cell nuclear transfer, SCNT)으로, 혈우병B 질환 랫드를 생산한다.
상기 혈우병B 질환 랫드 생산방법은
(a) 랫드의 조직으로부터 분리한 체세포 또는 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는, 핵 공여 세포를 제조하는 것;
(b) 상기 F9 유전자 조작용 조성물을 상기 핵 공여 세포에 접촉시키는 것;
(c) 랫드의 난자로부터 핵을 제거하여 탈핵 난자를 제조하는 것;
(d) 상기 (c) 단계의 탈핵 난자에 (b) 단계의 핵 공여 세포를 미세주입하고 융합시키는 것;
(e) 상기 (d) 단계에서 융합된 난자를 활성화시키는 것; 및
(f) 상기 활성화된 난자를 대리모의 난관에 이식하는 것,
을 포함할 수 있다.
각 단계에 관한 통상적인 기술 내용은 당업계에 공지되어 있는 종래 체세포 핵 이식 기술을 이용한 복제 동물의 제조 방법 등을 참조하여 이해할 수 있을 것이다.
혈우병 B 질환 연구용 및/또는 치료용 동물 모델
본 명세서에서는 기존에 없는 신규한 혈우병B 질환 랫드(rat)를 이용하여, 혈우병B 질환 연구용 및/또는 치료용 동물 모델을 제공하고자 한다.
상기 혈우병B 질환 랫드는 혈우병B 질환에 대한 원인 및/또는 기전 규명, 질병에 대한 증상, 치료 물질 탐색 등에 이용될 수 있다.
상기 혈우병B 동물 모델 랫드는 인간의 혈우병B 환자와 유사한 병리 기작을 나타내는바, 인간 혈우병B 치료 연구를 위한 동물 모델로서 매우 유용하다.
본 출원의 일 구현예로, 기존에 없는 신규한 혈우병B 질환 랫드(rat)를 이용하여, 혈우병B 치료용 약물 스크리닝용 동물 모델을 제공할 수 있다. 또는 보다 구체적으로, 혈우병 B 자연 출혈 예방 또는 치료용 약물 스크리닝용 동물 모델을 제공할 수 있다.
본 출원의 랫드 모델은 상기 F9 유전자를 인위적 변형하여 F9단백질 발현을 감소 또는 상실시키거나, 및/또는 F9단백질 기능 저하 또는 상실시킴으로써, 무릎관절, 근육, 눈 등에 자연출혈이 발생할 수 있고, 자연출혈로 인해 관절, 근육, 눈 등이 붓거나 염증이 생긴다.
그러므로 상기 혈우병B 질환 모델은 혈우병B 치료제, 즉 약물 스크리닝을 하기 위한 동물 모델로서 매우 유용하다. 즉, 상기 혈우병B 질환 모델은 혈우병B 유발 여부를 확인할 수 있음은 물론, 현재 개발 진행중인 치료제를 투여하여 혈우병B 질병 기전의 규명, 치료 물질 탐색, 진단법 개발등 다양한 활용이 가능할 것이다.
일 구현예에서, 혈우병B에 대한 약물 스크리닝 방법은
(a) 혈우병b 질환 모델 랫드에 혈우병B 경감, 예방 또는 치료를 위한 후보물질을 투여하는 것;
(b) 후보물질 투여 후, 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교 및 분석하는 단계
를 포함할 수 있다.
후보 물질은 펩타이드, 단백질, 비펩타이드성 화합물, 합성화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액 및 동물 조직추출액 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느이상인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 화합물은 신규 화합물이거나 또는 이미 공지된 화합물일 수 있다. 이때, 상기 화합물은 염을 형성하고 있을 수 있다.
상기(b) 단계에서 혈우병B 질환 랫드에 후보물질의 투여는 주사(injection), 수혈(transfusion), 삽입(implantation) 또는 이식(transplantation)과 같은, 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 투여 경로는 피하(subcutaneously), 피내(intradermaliy), 종양내(intratumorally), 절내(intranodally), 골수내(intramedullary), 근육내(intramuscularly), 정맥내(intravenous), 림프액내(intralymphatic), 복막 내(intraperitoneally) 등에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 적절한 투여량, 투여 방법 또는 후보 물질의 특성에 따라 랫드 내 후보물질이 투여될 수 있다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명할 것이다.
1. gRNA 디자인
CRISPR RGEN Tools((http://www.rgenome.net; Park et al, Bioinformatics 31:4014-4016, 2015)을 이용하여, rat F9 유전자(ENSRNOG00000003430.7)의 Exon1과 Exon2에 해당되는 6개의 “NGG”PAM을 고려한 guide RNA를 디자인하였다. 디자인된 guide RNA는 Rat 유전체상에서 On-target 부위를 제외하고 1 base 또는 2 base mismatch가 없는 것을 고려하였다.
Rat F9 유전자 KO용 guide RNA의 target DNA 서열
sgRNA target 서열번호
Rat_F9_Exon1_gRNA1_target DNA GCCATCATGGCAGACGCTCC SEQ ID NO. 1
Rat_F9_Exon1_gRNA2_target DNA TGCTGAGTAGATAGCCCAGA SEQ ID NO. 2
Rat_F9_Exon2_gRNA3_target DNA TGGACGGGTAAGAATTTTGG SEQ ID NO. 3
Rat_F9_Exon2_gRNA4_target DNA CTTTGGACGGGTAAGAATTT SEQ ID NO. 4
Rat_F9_Exon2_gRNA5_target DNA TGAGTTATATCTCTTTGGAC SEQ ID NO. 5
Rat_F9_Exon2_gRNA6_target DNA CGTCCAAAGAGATATAACTC SEQ ID NO. 6
이들 6개의 guide RNA에 의해 생기는 indel을 embryo pool에서 확인하기 위해 사용된 deep-squencing primer는 다음과 같다.
guide RNA에 대한 on-target editing을 확인하기 위한 deep-sequencing primers
primer name sequence 서열번호
Rat-F9_exon1_F CTTTCCTGACAGCAGCACAA SEQ ID NO. 7
Rat-F9_exon1_R ATGCACCGCAAACACTGTAA SEQ ID NO. 8
Rat-F9_exon2_F AGGGAATGACGATCACCTTG SEQ ID NO. 9
Rat-F9_exon2_R TTGACGTTTTCCATCTTTTGC SEQ ID NO. 10
Rat_F9_exon1_2nd_F ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCCATTCAGCTTGTACTTTGG SEQ ID NO. 11
Rat_F9_exon1_2nd_R GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGACATGCTGCCTGCTACAAT SEQ ID NO. 12
Rat_F9_exon2_2nd_F ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCCAAAGAGAAATTAGCTATGGAA SEQ ID NO. 13
Rat_F9_exon2_2nd_R GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCGTGCTTCTTCAAAACTGC SEQ ID NO. 14
F: forward primer, R: reverse primer2. gRNA의 구축 및 합성
RNP에 의한 전달 시스템을 위해 sgRNA는 Phusion 매개 중합에 의해 생성된 두 개의 부분적 (Forward: GAAATTAATACGACTCACTATAGCGTCCAAAGAGATATAACTCAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
Reverse primer: AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC) 올리고뉴클레오타이드의 어닐링에 의한 주형의 생성 후 T7 RNA 중합효소에 의해 전사시켰다. 전사된 sgRNA는 분광분석(spectrometry)을 이용해 정제 및 정량 하였다.
합성된 sgRNA의 시퀀스는 다음과 같다.
Rat F9 유전자 KO용 guide RNA 합성 sequence
Name sgRNA 합성 sequence 서열 번호
Rat_F9_Exon1_gRNA1_synthesis seq GAAATTAATACGACTCACTATAGGCCATCATGGCAGACGCTCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC SEQ ID NO. 15
Rat_F9_Exon1_gRNA2_ synthesis seq GAAATTAATACGACTCACTATAGTGCTGAGTAGATAGCCCAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC SEQ ID NO. 16
Rat_F9_Exon2_gRNA3_ synthesis seq GAAATTAATACGACTCACTATAGTGGACGGGTAAGAATTTTGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC SEQ ID NO.17
Rat_F9_Exon2_gRNA4_ synthesis seq GAAATTAATACGACTCACTATAGCTTTGGACGGGTAAGAATTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC SEQ ID NO. 18
Rat_F9_Exon2_gRNA5_ synthesis seq GAAATTAATACGACTCACTATAGTGAGTTATATCTCTTTGGACGTTTTAGAGCTAGAAATAGC SEQ ID NO. 19
Rat_F9_Exon2_gRNA6_ synthesis seq GAAATTAATACGACTCACTATAGCGTCCAAAGAGATATAACTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC SEQ ID NO. 20
Rat F9 유전자 KO용 guide RNA
Name sgRNA 합성 sequence 서열 번호
Rat_F9_Exon1_gRNA1 GCCAUCAUGGCAGACGCUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC SEQ ID NO. 21
Rat_F9_Exon1_gRNA2 UGCUGAGUAGAUAGCCCAGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC SEQ ID NO. 22
Rat_F9_Exon2_gRNA3 UGGACGGGUAAGAAUUUUGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC SEQ ID NO. 23
Rat_F9_Exon2_gRNA4 CUUUGGACGGGUAAGAAUUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC SEQ ID NO. 24
Rat_F9_Exon2_gRNA5 UGAGUUAUAUCUCUUUGGACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC SEQ ID NO. 25
Rat_F9_Exon2_gRNA6 CGUCCAAAGAGAUAUAACTCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC SEQ ID NO. 26
3. F9-/- rat 확립(선별)
표1의 Rat_F9_Exon2_gRNA4를 이용하여 F9 유전자 Exon2영역에 인델(indel)이 형성되었는지 여부를 확인하였다.
F9 유전자 Exon2영역 인델(indel) 확인
Type Sequence
WT ACTTTCAAATTTCAGTTTTTCTTGATCGCGAAAATGCACCAAAATTCTTACCCGTCCAAAGAGATATAACTCAGGGAAACTGGAAGAGTTTGTTCAGGGAAACCTTGAGA
WT-2 ACTTTCAAATTTCAGTTTTTCTTGATCGCGAAAATGCACCAAAATTCTTACCCGTCCAAAGAGATATA--TCAGGGAAACTGGAAGAGTTTGTTCAGGGAAACCTTGAGA
WT ACTTTCAAATTTCAGTTTTTCTTGATCGCGAAAATGCACCAAAATTCTTACCCGTCCAAAGAGATATAACTCAGGGAAACTGGAAGAGTTTGTTCAGGGAAACCTTGAGA
WT-35 ACTTTCAAATTTCAGTTTTTCTTGATCGCGAAAATG----------------------------------------------------CAGGGAAACTGGAAGAGTTTGTTCAGGGAAACCTTGAGA
WT ACTTTCAAATTTCAGTTTTTCTTGATCGCGAAAATGCACCAAAATTCTTACCCGTCCAAAGAGATATAACTCAGGGAAACTGGAAGAGTTTGTTCAGGGAAACCTTGAGA
WT-4 ACTTTCAAATTTCAGTTTTTCTTGATCGCGAAAATGCACCAAAATTCTTACCCGTCCAAAGAGATA----TCAGGGAAACTGGAAGAGTTTGTTCAGGGAAACCTTGAGA
WT ACTTTCAAATTTCAGTTTTTCTTGATCGCGAAAATGCACCAAAATTCTTACCCGTCCAAAGAGATATAACTCAGGGAAACTGGAAGAGTTTGTTCAGGGAAACCTTGAGA
WT+4, T-> A ACTTTCAAATTTCAGTTTTTCTTGATCGCGAAAATGCACCAAAATTCTTACCCGTCCAAAGAGATATAACAACA A TCAGGGAAACTGGAAGAGTTTGTTCAGGGAAACCTTGAGA
WT-4 ACTTTCAAATTTCAGTTTTTCTTGATCGCGAAAATGCACCAAAATTCTTACCCGTCCAAAGAGATA----TCAGGGAAACTGGAAGAGTTTGTTCAGGGAAACCTTGAGA
WT ACTTTCAAATTTCAGTTTTTCTTGATCGCGAAAATGCACCAAAATTCTTACCCGTCCAAAGAGATATAACTCAGGGAAACTGGAAGAGTTTGTTCAGGGAAACCTTGAGA
WT-2 ACTTTCAAATTTCAGTTTTTCTTGATCGCGAAAATGCACCAAAATTCTTACCCGTCCAAAGAGATATA--TCAGGGAAACTGGAAGAGTTTGTTCAGGGAAACCTTGAGA
-: 서열 삭제, 밑줄: 삽입, 볼드체: 치환4. 형질전환 된 F9-/- rat 생산
CRISPR/Cas9을 이용하여 F9 유전자를 넉아웃한 수정란을 대리모에 이식하여 산자를 생산하였다.
이하 좀 더 구체적으로 설명한다.
4-1. 호르몬 투여 및 수정란 채란
수정란은 Day-3, 오전 11시에 채란용 5주령 암컷에게 PMSG-대성미생물(15IU)를 투여하여 황체형성 호르몬을 획일화시켜주었다. Day-1, 오전 11시에 채란용 암컷에 hCG-대성미생물(15IU)를 투여하여 배란일을 획일화시켜준 뒤, WT 수컷과 교배시켰다. 그 다음날(Day-0) 오전 9시에 질전(plug)을 확인한 후, 난소-난관-자궁이 연결된 부분을 잡고 조심스럽게 난관만을 떼어 모아주었다.
채란 30분전 미리 인큐베이터에 M2배지-SIGMA(워싱용 배지)와 mR1ECM-ark-resource(랫드용 배양배지-100 μl 드랍 4개를 만들어 파라핀오일로 덮어줌)를 넣어 준비해둔 뒤, 랫드 마취 들어간 지 30초 내에 M2배지를 꺼내어 현미경울 보며 난관 팽대부를 찢어 수정란을 꺼냈다. 그 뒤, M2 배지-100 μl의 드랍을 4개 만들어 돌아가며 워싱을 해주었으며, mR1ECM 배지-100 μl의 드랍을 4개 만들어 돌아가며 워싱을 해주었다. 워싱을 끝마친 수정란을 재빠르게 미리 만들어 놓은 mR1ECM 배지-100 μl (파라핀 오일로 덮은)인큐베이터로 넣어서 안정기를 주었다.
4-2. 형질도입(Transfection)
인큐베이터에서 수정란을 꺼내어 mR1ECM 배지 100 μl 4개의 드랍에서 워싱하여 준 후 M2배지 100 μl 4개의 드랍에서 워싱을 하였다. 그 뒤, sgRNA: Cas9 protein/8을 수정란에 전기천공(BEX-Gene editor1)하기 위해, 0 μg:320 μg 의 비율로 섞어 15분간 인큐베이션 후 사용하였다. 전기 천공은 총 한번에 40개의 1셀을 사용하며, Pd: 30 V, Pd on: 3.00 ms, Pd off: 97.0 ms, Pd cycle: 7로 하였다.
수정란을 전기천공 한 후, 전기천공을 마친 수정란을 M2배지 100 μl 4개의 드랍에서 워싱 후 mR1ECM배지 100 μl 4개의 드랍에서 워싱하여 준다. 미리 인큐베이터안에 준비 한 mR1ECM 배지에 넣어 준 후 배양한다. (랫드용 배양배지-100 μl 드랍 4개를 만들어 파라핀오일로 덮어준 것) 반복하여 진행한다. 모든 전기천공이 끝나면 mR1ECM 배지에 넣어 준 수정란을 하루 동안 배양한다.
4-3. 수정란 이식
Day-4에 오전 11시에 7~8주령 암컷에게 GnRH-MSD animal Health(21 μg)을 주사하여 대리모를 획일화시켜 주었다. Day1에 대리모의 질전을 확인한 후, 수정란이식이 가능한 대리모를 고른 뒤, Day-0에 미리 정관 수술한 수컷과 대리모를 교배시켰다. 하루 동안 배양한 수정란에서 2-cell로 자란 수정란 만을 골라 대리모의 난관 팽대부에 이식하여 주었다. 임신이 된 대리모에게서 산자가 태어나면 귀를 잘라 genotyping을 실시하여 동물의 형질을 확인한다.
5. F9 랫드 표적 딥시퀀싱 (genotype 분석)
임신이 된 대리모에게서 산자가 태어나 이유 할 시기(3주령)에 쥐의 귀를 잘라 gDNA추출하여 동물의 형질을 확인한다. 온-타겟 부분을 이용하여 형질 도입된 쥐의 귀에서 Phusion polymerase taq(New England BioLabs)을 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 상기 PCR 증폭물로 Mi-Seq(lllumina)을 이용하여 Paird-end 딥 시퀀싱하였다. 딥 시퀀싱 결과는 온라인 Cas-Analyzer tool(www.rgenome.net)을 이용하여 분석하였다.
PCR primer
Forward: ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCGTCCAAAGAGATATAACTCAGG
Reverse: GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCGTGCTTCTTCAAAACTGC
6. F9 랫드 혈액학 분석
F9의 형질 분석한 후 10~13주령(F1 세대) 쥐를 마취한 후 복대동맥에서 채혈하였다. 그 후 SST-BD(serum separated tube) 튜브를 이용하여 혈액을 담이 상온에서 1시간 인큐베이션 한 후 센트리퓨즈를 이용하여 3000 rpm, 15분을 돌려 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청을 녹십자의료재단에 의뢰하여 혈액응고 혈청학 검사를 실시하였다. 내인계, 외인계에 관여하는 응고인자(F-viii, ix, xi, xii)의 기능을 평가하는 스크리닝 검사인 PTT, Prothrombin time 과 섬유소원 활성도를 직접 측정하는 방법으로 환자의 혈소판결핍혈장에 thrombin을 가하여 섬유소원(fibrinogen)이 섬유소(fibrin)로 전환되어 응고가 향상될 때까지의 시간을 측정하는 방법인 TT(Thrombin time)를 분석하였다(도2 (b)참고). 16주령(F1 세대)의 쥐에서는 말초 혈액 내에 존재하는 유형 성분의 한 종류로, 지혈 기전에 관여하는 인자 platelet 분석하였다.
7. F9 랫드 조직학 분석
F9 랫드의 대퇴부 근육의 조직학적 변화를 관찰하기 위해, 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin) 염색(H&E 염색)이 수행되었다. Formalin-fixed paraffin-embedded 조직 섹션이 자일렌(xylene)에 의해 파라핀이 제거(deparaffinized)된 후, 순수 에탄올(absolute alcohol)로 재수화(rehydrated)되었다. 수돗물로 간단히 세척된 후, 상기 조직 섹션은 Harris hematoxylin으로 5분 간 염색되었다. 슬라이드를 5분 간 수돗물로 헹구고, 0.2% 암모니아수에서 30초간 염색되었다. 수돗물로 5분 간 세척된 후, 상기 슬라이드는 Y eosin에 2분 30초 간 침지되었다. 그 후, 상기 슬라이드는 95% 알콜에서 2회 탈수되었고, 자일렌(xylene)에서 2회 세척되었다. 마지막으로, 커버슬립을 크실렌계 미디엄(xylene-based medium)으로 장착하여 관찰하였다. 이를 관찰한 결과가 도8에 도시되어 있다.
8. F9 랫드 조직병리학 분석
H&E staining 통하여 통증부위의 morphology를 확인하여 주기 위해 F9 랫드의 통증이 있던 부위만을 도려내어 4% Paraformaldehyde에 넣어주어 고정 및 워싱 단계를 거쳤다. 그 후 파라핀 블락을 제작하고 컷팅(10 μm)하여 슬라이드에 붙여준다. 먼저 rehydration 단계로서 파라핀에 붙어 있는 조직을 xylene을 이용하여 파라핀은 녹이고 염색을 할 수 있는 조건을 만들어 주었다. staining단계로 Harris heamatoxylin으로 핵을 염색하고 Eosin으로 cytoplasm을 염색하였다. Harris heamatoxylin의 경우 블루색을 띄며, Eosin의 경우 레드를 나타낸다. 마지막 단계로 dehydration하여 염색이 변함없이 유지되게 해준다.
9. F9 랫드 출혈 분석
16주령(F1세대)의 대조군, F9+/+, F9-/-를 이용하여 출혈분석을 하였다(도3참고). 먼저 동물에게 마취를 한 후 피를 받을 수 있는 15ml 튜브를 꼬리가 밑에 고정시켜 출혈되어 나오는 피를 받을 수 있도록 하였다. 동시간에 세 마리의 쥐의 꼬리를 잘라주고 초시계를 이용하여 시간측정을 하였다. 더불어 비디오 촬영을 하여 실시간으로 나타나는 출혈 양을 확인하였다.
본 출원에서는 혈우병B 질환 랫드(rat) 및 이의 제조방법을 제공하고자 하며, 인간 혈우병 B 질환에 대한 모델 동물로서, 랫드(rat) 동물 모델은 혈우병B 질병 증상, 보다 구체적으로 자연 출혈(spontaneous bleeding) 현상을 충분히 보여줄 수 있으며, 이는 향후 치료제 개발에 중요한 도구를 제공할 것이다.
또한, 본 출원에서는 혈우병B 질환 랫드(rat)를 제조하기 위하여, 혈우병 B 질환 랫드 모델 제조용 F9 유전자 조작 조성물을 제공하고자 하며, 이는 상기 혈우병 B 질환 랫드를 제조하는데 사용될 수 있다.

Claims (22)

  1. F9 유전자 내 인위적 변형을 포함하는 혈우병B 질환 모델 랫드(rat)로서,
    상기 F9 유전자 내 인위적 변형은
    F9 유전자 전부 또는 일부 결실(deletion);
    F9 유전자 전부 또는 일부 삽입(insertion);
    F9 유전자 전부 또는 일부 삽입 및 결실; 및
    F9 유전자 내 역위 중 어느 하나 이상의 변형을 포함하고,
    상기 F9 유전자 일부는 1bp 내지 100bp의 뉴클레오타이드이며,
    상기 혈우병B 랫드는 F9 유전자 내 인위적 변형에 의해
    F9 인자 발현량 감소;
    F9 인자 발현 억제;
    F9 인자 기능 저하; 및
    F9 인자 기능 상실
    중 어느 하나 이상을 포함하고,
    상기 혈우병B 질환 랫드(rat)는
    조직 내 자연 출혈(spontaneous bleeding);
    자연 출혈에 의한 조직 내 염증; 및
    자연 출혈에 의한 조직 내 붓기;
    중 어느 하나 이상의 현상을 나타내는, 혈우병B 질환 모델 랫드(rat).
  2. 제1항에 있어서
    상기 인위적 변형은
    F9 유전자 내 엑손 영역(exon region);
    F9 유전자 내 인트론 영역(intron region);
    F9 유전자 내 프로모터 영역(intron region);
    F9 유전자 내 인핸서 영역(intron region);
    F9 유전자 내 5'말단 또는 이의 인접한 영역;
    F9 유전자 내 3'말단 또는 이의 인접한 영역; 및
    F9 유전자 내 스플라이싱 자리(splicing site);
    중 어느 하나 이상의 영역에 형성되는 것을 특징으로 하는
    혈우병B 질환 모델 랫드(rat).
  3. 제1항에 있어서, 상기 F9유전자 내 인위적 변형은 F9 유전자의 엑손 제1영역 또는 엑손 제2영역에 일어난 것을 특징으로 하는, 혈우병B 질환 모델 랫드(rat).
  4. 다음을 포함하는 혈우병 B 질환 모델 랫드(rat) 제조를 위한 F9 유전자 조작용 조성물:
    가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 DNA; 및
    에디터 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA,
    이때, 상기 가이드 RNA는 서열번호 21 내지 26으로 이뤄진 군에서 선택된 서열을 포함하며,
    상기 가이드 RNA는 F9 유전자 서열의 전부 또는 일부를 표적 서열로 하는 것을 특징으로 하고,
    상기 에디터 단백질은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococus pyogenes)에서 유래된 Cas9 단백질을 포함하고,
    상기 가이드 RNA와 상기 에디터 단백질은 가이드 RNA-에디터 단백질 복합체를 형성하여 상기 F9 유전자에 인위적인 변형을 일으킬 수 있는 것을 특징으로 함.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 가이드 RNA와 상기 에디터 단백질이 복합체를 형성한 RNP(ribonucleoprotein) 형태로 존재하는 혈우병 B 질환 모델 랫드(rat) 제조를 위한 F9 유전자 조작용 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 상기 에디터 단백질을 암호화하는 DNA가 벡터 형태로 존재하는 혈우병 B 질환 모델 랫드(rat) 제조를 위한 F9 유전자 조작용 조성물.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 벡터는 바이러스 벡터 또는 비 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는, F9 유전자 조작용 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아바이러스, 폭스바이러스 및 단순포진 바이러스로 구성된 군에서 선택되는 1이상인 것을 특징으로 하는, F9 유전자 조작용 조성물.
  9. 서열번호 21 내지 26으로 이뤄진 군에서 선택된 서열을 포함하는 가이드 RNA.
  10. F9 유전자 내 인위적 변형을 포함하는 랫드(rat)세포로서,
    상기 F9 유전자 내 인위적 변형은
    F9 유전자 전부 또는 일부 결실(deletion);
    F9 유전자 전부 또는 일부 삽입(insertion);
    F9 유전자 전부 또는 일부 삽입 및 결실; 및
    F9 유전자 내 역위 중 어느 하나 이상의 변형을 포함하고,
    상기 F9 유전자 일부는 1bp 내지 100bp의 뉴클레오타이드이며,
    상기 랫드 세포는 F9 유전자 내 인위적 변형에 의해
    상기 F9 인자 또는 이를 암호화하는 유전자 내 인위적 변형에 의해
    F9 인자 발현량 감소;
    F9 인자 발현 억제;
    F9 인자 기능 저하; 및
    F9 인자 기능 상실
    F9 인자 기능이 저하 또는 상실되는 경우
    중 어느 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 랫드(rat) 세포.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 인위적 변형은
    F9 유전자 내 엑손 영역(exon region);
    F9 유전자 내 인트론 영역(intron region);
    F9 유전자 내 프로모터 영역(intron region);
    F9 유전자 내 인핸서 영역(intron region);
    F9 유전자 내 5'말단 또는 이의 인접한 영역;
    F9 유전자 내 3'말단 또는 이의 인접한 영역; 및
    F9 유전자 내 스플라이싱 자리(splicing site);
    중 어느 하나 이상의 영역에 형성되는 것을 특징으로 하는
    랫드(rat) 세포.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 랫드 세포는 체세포, 배아세포 및 배아줄기세포 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 랫드(rat) 세포.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 인위적 변형은 F9 유전자의 엑손 제1영역 또는 엑손 제2영역에 일어난 것을 특징으로 하는 랫드(rat) 세포.
  14. 다음을 포함하는, 인위적으로 변형된 F9 유전자를 포함하는 랫드(rat) 세포 제조 방법:
    랫드(rat) 세포에 청구항 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 혈우병 B 질환 모델 랫드(rat) 제조를 위한 F9 유전자 조작용 조성물을 접촉시키는 것.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 세포는 체세포, 배아세포 또는 배아줄기세포인, 랫드(rat)세포 제조 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 접촉시키는 것은 전기천공법(electroporation), 리포좀, 플라스미드, 바이러스 벡터, 나노파티클(nanoparticles) 및 PTD(Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 중 선택되는 1이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 랫드(rat)세포 제조 방법.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 접촉시키는 것은 생체 외(in vitro)에서 수행되는 것을 특징으로 하는 랫드(rat)세포 제조 방법.
  18. 다음을 포함하는, F9 유전자 내 인위적 변형을 포함하는 혈우병 B 질환 모델 랫드(rat) 제조 방법:
    랫드 세포에 청구항 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 혈우병 B 질환 모델 랫드(rat) 제조를 위한 F9 유전자 조작용 조성물을 접촉시키는 것으로, 이로 인해 상기 세포의 F9 유전자 내 인위적인 변형이 일어나고; 및
    상기 세포를 랫드에 도입하여 혈우병 B 질환 모델 랫드(rat)를 제조하는 것.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 F9유전자 내 인위적 변형은 F9 유전자의 엑손 제2영역에 일어나는 것을 특징으로 하는, 혈우병B 질환 모델 랫드 제작 방법.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 접촉시키는 것은 전기천공법(electroporation), 리포좀, 플라스미드, 바이러스 벡터, 나노파티클(nanoparticles) 및 PTD(Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 중 선택되는 1이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 혈우병B 질환 모델 랫드 제작 방법.
  21. 제18항에 있어서,
    상기 혈우병B 질환 랫드는
    조직 내 자연 출혈(spontaneous bleeding);
    자연 출혈에 의한 조직 내 염증; 및
    자연 출혈에 의한 조직 내 붓기;
    중 어느 하나 이상을 나타내는, 혈우병B 질환 모델 랫드 제작 방법.
  22. 제18항에 있어서,
    상기 세포는 체세포, 배아세포 및 배아줄기세포 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 혈우병B 질환 모델 랫드 제작 방법.
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CN113881637A (zh) * 2021-08-30 2022-01-04 山西医科大学 一种人诱导多能干细胞及其制备方法和应用
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