CN113881637A - 一种人诱导多能干细胞及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人诱导多能干细胞株SXMUi002‑A‑1，所述人诱导多能干细胞株SXMUi002‑A‑1保藏于国家典型培养物保藏中心，保藏编号为CGMCC No：22359。该iPSC通过从携带F9c.223C＞T(p.R75X)无义突变的B型血友病患者尿液中提取尿液细胞重编程得到，经进一步研究发现，其不仅在细胞形态、基因表达、增殖及分化潜能方面类似于胚胎干细胞，并且具有向三个胚层分化的潜能。本发明制备得到的人诱导多能干细胞株SXMUi002‑A‑1对血友病无义突变的分子机制研究，血友病的检测、药物筛选、基因治疗等临床应用研究具有重要价值，提供了重要资源。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种人诱导多能干细胞及其制备方法和应用。
背景技术
血友病是一种X染色体连锁隐性遗传性出血性疾病，共同的特征是活性凝血活酶生成障碍，凝血时间延长，终身具有轻微创伤后出血倾向，重症患者没有明显外伤也可发生“自发性”出血。F8基因缺陷导致血友病A(hemophiliaA，HA)，F9基因缺陷导致血友病B(hemophiliaB，HB)，在男性人群中，发病率分别为1/5,000及1/25,000[杨仁池.血友病诊断与治疗中国专家共识(2017年版)[J].中华血液学杂志,2017,38(05):364-370.]。FactorIX Gene(F9)Variant Database(http://www.factorix.org/)显示3713个个案报告中有1094种F9变体，其中无义突变有87种，约占8％。
血友病现有的治疗手段仍以凝血因子制品输注的替代治疗为主，对家庭和社会造成极大负担[Chinese MAH T,ThrombosisAnd Hemostasis Group C S O H.Chineseguidelines on the treatment of hemophilia(version 2020)[J].Zhōnghuá xuèyèxuézázhì,2020,41(4):265-271.]。此外，长期输注凝血因子导致抑制物的产生使得替代治疗疗效降低甚至无效，研究显示无义突变是凝血因子抑制物产生的高危因素[Gouw S C,vanden Berg H M,Oldenburg J,et al.F8 gene mutation type and inhibitordevelopment in patients with severe hemophilia A:systematic review and meta-analysis[J].Blood,2012,119(12):2922-2934.]。
故针对无义突变所致的血友病，探索新的廉价的个性化治疗方法并揭示其分子机制具有重要的意义。由于血友病是单基因遗传病,因此对于血友病,基因治疗应该是最理想的方式，也是根治的唯一办法。采用动物模型可以研究各种疾病的病理改变和疾病机制，但动物本身与人类之间存在的生物学差异使得很多疾病状态无法很好地用动物模型来模拟。2006年日本京都大学Yamanaka研究小组利用OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC四种因子首次将小鼠成纤维细胞诱导为多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，简称“iPS细胞”[YY,T S,M S Y.Derivation offunctional mature neutrophils from humanembryonic stem cells.[J].Blood:The Journal of the American Society ofHematology,2009,113(26).]。iPS细胞不仅在细胞形态、表面抗原、基因表达、增殖及分化潜能方面类似于胚胎干细胞，并且具有向三个胚层分化的潜能。中国科学家于2008年11月利用iPS细胞培育出小鼠—“小小”[Zhao XY,Li W,Lv Z,et al.iPS cells produceviable mice through tetraploid complementation[J].Nature,2009,461(7260):86-90.]，证明了iPS细胞确实具有多能性。利用患者的尿液细胞(urine cells,UC)重编程可以得到iPS，这些无饲养层，无血清，无整合以及临床级的iPSC可以为疾病建模、移植或毒性和作用评估提供无限的细胞来源。此外，iPSC是基因操纵以更好地了解疾病的潜在机制的理想靶标。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于提供一种人诱导多能干细胞。
包括如下技术方案：
一种人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1，其保藏于国家典型培养物保藏中心，保藏编号为CGMCC No：22359。
本发明的目的之一还在于提供一种药物组合物。
包括如下技术方案：
一种药物组合物，其有效成分包含上述人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1、人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1的培养物、人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1的提取物中的任意至少一种。
本发明的目的之一还在于提供一种人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1的制备方法。
包括如下技术方案：
收集携带F9突变基因的体细胞，并进行细胞培养；
将含有重编程因子的质粒导入培养后的体细胞，采用重编程培养基培养，筛选重编程成功细胞，获得人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1。
本发明的细胞株SXMUi002-A-1，已于2021年7月7日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No：22359。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
本发明的发明人通过从携带F9 c.223C＞T(p.R75X)无义突变的B型血友病患者尿液中提取尿液细胞，并将该体细胞成功重编程，得到细胞株SXMUi002-A-1，该细胞株经进一步研究发现，其不仅在细胞形态、基因表达、增殖及分化潜能方面类似于胚胎干细胞，并且具有向三个胚层分化的潜能。经综合鉴定为人诱导多能干细胞，并对其进行生物保藏(保藏编号为CGMCC No：22359)。本发明制备得到的人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1对血友病无义突变的分子机制研究，血友病的检测、药物筛选、基因治疗等临床应用研究具有重要价值，提供了重要资源。
附图说明
图1为实施例1中质粒pCEP4-M2L图谱。
图2为实施例1中质粒PEP4-EO2S-ET2K图谱。
图3为实施例1中制备的人诱导多能干细胞SXMUi001-A-1细胞系的特性描述，其中，A为尿液细胞的诱导重编程过程(1-16天，D1～D16)，D0为尿液细胞电转当天电转前状态，从D1、D7到D16，可见干细胞样克隆形成；P0为挑取的iPS克隆，P6为第6代iPS，比例尺，100μm；B为人诱导多能干细胞SXMUi001-A-1的碱性磷酸酶实验检测结果；C为人诱导多能干细胞SXMUi001-A-1的染色体核型分析结果；D为人诱导多能干细胞SXMUi001-A-1的Sanger测序结果；E为对人诱导多能干细胞SXMUi001-A-1的免疫荧光染色检测结果，比例尺，100μm；F为人诱导多能干细胞SXMUi001-A-1、hES(人胚胎干细胞)和UC细胞的多能性基因NANOG、OCT4、SOX2的qPCR分析检测结果。
具体实施方式
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
在整个说明书和权利要求书中，以下术语具有与本文明确相关的含义，除非上下文另有明确规定。在本发明中使用的短语“在一个实施方案中”不一定指代相同的实施方案，尽管其可能是。此外，在本发明中使用的短语“在另一实施方案中”不一定指代不同的实施方案，尽管其可能是。因此，如下所述，可以容易地组合本发明的各个实施方案，而不脱离本发明的范围或精神。
此外，如本发明所使用的，术语“或”是包含性的“或”符号，并且等同于术语“和/或”，除非上下文另有明确规定。术语“基于”不是排他性的，并且允许基于未描述的其他因素，除非上下文另有明确规定。此外，在整个说明书中，“一个”、“一种”和“所述/该”的含义包括复数指示物。“在......中”中的含义包括“在......中”和“在......上”。
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
本发明涉及缩略语和术语定义如下：
“诱导性多能干细胞”(Inducedpluripotent stem cells，iPSCs)是指通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程的多能性干细胞。分化的细胞在特定条件下被逆转后，恢复到全能性状态，或者形成胚胎干细胞系，或者进一步发育成新个体的过程即为细胞重编程(Cell reprogramming)。分化是基因选择性表达的结果，并没有改变遗传物质，而重编程在某种意义上就是分化的一个逆转。与经典的胚胎干细胞技术和体细胞核移植技术不同，iPSCs技术不使用胚胎细胞或卵细胞，因此没有伦理学问题。
“电穿孔”也叫电转染，是通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而吸收周围介质中的外源分子。这种技术可以将核苷酸、DNA与RNA、蛋白、糖类、染料及病毒颗粒等导入原核和真核细胞内。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
本发明的一些实施例提供了一种人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1，已于2021年7月7日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No：22359。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
在其中一些实施例中，上述人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1分类命名为：人诱导多能干细胞。
在其中一些实施例中，上述人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1具有一种或多种以下性质：多潜能性；多能性；形成畸胎瘤的能力；正常的二倍体核型；具有无限增殖的能力；比人类胚胎干细胞短的端粒；在大气氧气条件(例如大于5％的氧气至大约21％的氧气)下增殖而具有未分化的表型的能力；集落增殖。
在其中一些实施例中，上述人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1由F9基因发生.c223C＞T无义突变的B型血友病患者的体细胞中导入重编程因子，细胞重编程形成。
在其中一些实施例中，上述体细胞包括但不限于尿液、血液、脂肪组织、羊水、胎盘绒毛膜、羊膜、脐带血、各种部位的骨膜细胞或皮肤成纤维细胞。
在其中一些实施例中，上述体细胞为尿液细胞，避免了从皮肤取样的疼痛及对病人的伤害。
在其中一些实施例中，上述重编程因子包括OCT4、SOX2、KLF4、MYC。
本发明的一些实施例提供了一种药物组合物，其有效成分包含上述人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1、人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1的培养物、人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1的提取物中的任意至少一种。
在其中一些实施例中，上述药物组合物中有效成分包含人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1的培养物，进一步地包括：人诱导多能干细胞的纯化群体；从人诱导多能干细胞分化的细胞(如纯化的分化细胞的群体)。这些分化的干细胞包括但不限于：胰腺β细胞、神经干细胞、皮层神经元、多巴胺能神经元、少突胶质细胞(o l i godendrocyte)或少突胶质细胞祖细胞、肝细胞、肝干细胞、心肌细胞或肾上皮细胞。
在其中一些实施例中，上述药物组合物中有效成分包含人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1的提取物，进一步地包括但不限于：核酸、氨基酸、小分子化合物、抗体、多肽、细胞器等；其中细胞器一般认为是散布在细胞质内具有一定形态和功能的微结构或微器官，如线粒体、内质网、溶酶体、液泡、核糖体、中心体、外泌体等。
本发明的一些实施例提供了上述人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1和/或上述药物组合物在构建血友病细胞模型中的应用。
本发明的一些实施例提供了上述人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1和/或上述药物组合物在制备和/或筛选血友病治疗药物中的应用。
在其中一些实施例中，上述人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1具有低免疫原性。因此，其可成为一种新型的、具有低免疫排斥反应的移植供体的来源，应用于血友病移植治疗。
在其中一些实施例中，上述血友病为一种遗传性凝血功能障碍的出血性疾病，其包括：血友病A(血友病甲)，即因子Ⅷ促凝成分(Ⅷ：C)缺乏症，也称AGH缺乏症；血友病B(血友病乙)，即因子Ⅸ缺乏症，又称PTC缺乏症、凝血活酶成分缺乏症；血友病C(血友病丙)，即因子Ⅺ(FⅪ)缺乏症，又称PTA缺乏症、凝血活酶前质缺乏症。
在其中一些实施例中，优选为血友病B。
本发明的一些实施例提供了上述人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1和/或上述药物组合物在制备检测、分类或预测、治疗监测、预后或其它评价血友病的试剂中的应用。
本发明的一些实施例提供了上述人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1的制备方法。
包括如下技术方案：
收集携带F9突变基因的体细胞，并进行细胞培养；
将含有重编程因子OCT4、SOX2、KLF4、MYC的质粒导入培养后的体细胞，采用重编程培养基培养，筛选重编程成功细胞，获得人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1。
在其中一些实施例中，上述携带F9突变基因的体细胞为F9基因发生.c223C＞T无义突变的尿液细胞。
在其中一些实施例中，上述导入方式为通过核转仪将质粒PEP4-EO2S-ET2K和pCEP4-M2L进行电穿孔转染导入。
在其中一些实施例中，上述导入方式为将含有重编程因子OCT4、SOX2、KLF4、MYC的质粒PEP4-EO2S-ET2K 6μg和pCEP4-M2L 4μg，通过电转仪LONZA Nucleofecto 2b Device，选择程序：T-020，进行电穿孔转染导入1×106个人类尿液细胞中。
实施例1
发明人前期筛查了山西地区血友病患者基因突变类型，其中，在山西医科大学第二医院的某一B型血友病患者中检测到F9基因突变c.223C＞T，经确认(http://www.factorix.org/)该突变为无义突变。
一、人诱导多能干细胞的制备
收集尿液细胞：
经患者同意，从血友病患者尿液样本中分离尿液脱落细胞，对尿液脱落细胞进行增殖培养[Zhou T,Benda C,Dunzinger S,et al.Generation ofhuman inducedpluripotent stem cells from urine samples[J].Nature protocols,2012,7(12):2080-2089.]。
收集中段尿，然后室温下400g离心10分钟分离人类尿液细胞(HUCs)。细胞沉积用DPBS(Gibco)洗涤两次。原代尿液细胞在尿液培养基中培养，该培养基由1：1的DMEM基础培养基混合物(添加10％的胎牛血清(SeraPro)，0.1mM NEAA，1mM L-glutamax，100单位/ml青霉素-100μg/ml链霉素(HyClone))和REGMTM肾上皮细胞生长培养基BulletKitTM(LONZA)组成。在37℃，5％CO2培养箱中培养，3-7天后出现肾上皮细胞贴壁，每2天更换一次培养基。
重编程：
取上述培养后状态良好的HUCs 1×106个，以及含有重编程因子OCT4、SOX2、KLF4、MYC的质粒PEP4-EO2S-ET2K 6μg和pCEP4-M2L 4μg(根据图谱人工合成，其中pCEP4-M2L(Plasmid：#20926)图谱如图1所示，PEP4-EO2S-ET2K(Plasmid：#20927)图谱如图2所示)，用电转试剂Amaxa Basic Nucleofector Kit for primary mammalian Epithelial cells重悬后，转移至电转杯，开启电转仪(LONZA Nucleofecto 2b Device)，选择程序：T-020，将含上述电转杯放入电转仪，启动程序，完成电转。
将完成上述转染的细胞转移至涂有Matrigel(BD,America)的培养板，此时培养基为尿液细胞完全培养基。电转后第二天更换mTeSR1(Stem Cell Technologies)培养基(添加4i(0.5μM A83-01，1μM PD0325901，3μM CHIR99021，0.5μM thiazovivin(Biocare)))在37℃、5％CO2环境下培养，标记为Day 1(D1)，换之后隔天更换诱导培养基，每隔3-4天使用0.5mM EDTA(Sigma)溶液传代。如图3A所示，其为尿液细胞的诱导重编程过程(1-16天，D1～D16)，D0为尿液细胞电转当天电转前状态，从D1、D7到D16，转染后第16天可见干细胞(hESC)样形成，在第18天后人工采集人胚胎干细胞(HESC)菌落，并在mTeSR1培养基中扩增培养，P0为挑出来的iPS克隆，P6为第6代iPS，均呈现典型的hESC形态，将该细胞系命名为F9-hiPSC。于2021年7月7日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No：22359。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。将该细胞系用mTeSR1培养基进行扩增培养，培养得到的细胞经常规细胞收集，用于后续鉴定研究。
二、人诱导多能干细胞的鉴定
(1)碱性磷酸酶表达鉴定：
由于胚胎干细胞中碱性磷酸酶的活性比较高，5-溴-4-氯-3吲哚-磷酸盐(BCIP)能被碱性磷酸酶水解，形成一个中间体，这个中间体能与氯化硝基四氮唑蓝，也称氮蓝四唑(NBT)反应生成白色的中间二聚体和NBT-蓝紫色结晶物。通过染色结果可以相对得知碱性磷酸酶的活性，进而从侧面来证明实验细胞是否具有多能性。
对上述细胞系F9-hiPSC扩增的克隆细胞经碱性磷酸酶染色后，检测结果如图3B所示，胞浆里有深蓝色阳性反应产物。从而初步证明细胞系F9-hiPSC具有多能性。
(2)核型分析：
人诱导多能干细胞在诱导过程中要经历剧烈的变化，有可能使细胞分裂产生问题造成细胞核型的异常。而长时间的体外培养，同样也可能造成细胞核型的异常，因此需要在iPS的细胞传代培养中，定期进行核型检测，以确保细胞的正常。
在第10代进行核型分析，收集上述P10代iPS用于检测，当细胞达到对数期时，将Colcemid加入终浓度为20μg/ml的溶液中2小时。除去上清液，并将沉淀重悬于8ml的0.075MKCl中，并在37℃下孵育20分钟。细胞用新鲜的Carnoy固定剂(甲醇：冰醋酸的比例为3：1)固定。使用Ikaros(MetaStstems，德国)在Olympus BX51显微镜上以450-500谱带分辨率分析了20个中期细胞。
检测结果如图3C所示，在第10代iPS通过G带分析进行了核型分析，显示二倍体46，XY，说明细胞染色体正常，本发明制备得到的细胞系F9-hiPSC较为安全，基因组的稳定性较好。
(3)Sanger测序：
利用TIANamp Genomic DNA Kit(天根)提取细胞系F9-hiPSC的细胞基因组DNA，PCR扩增测序片段。Sanger测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
测序结果如图3D所示，Sanger测序证实了目的位点(F9基因)发生.c223C＞T无义突变。
(4)STR分析：
STR(Short Tandem Repeat，短串联重复序列)基因位点由长度为3～7个碱基对的短串连重复序列组成，这些重复序列广泛存在于人类基因组中，可作为高度多态性标记，被称为细胞的DNA指纹。STR已被广泛应用于亲子鉴定、个体识别、司法鉴定、交通事故鉴定、(造血干细胞)移植治疗后嵌合情况监测等领域。
STR基因座位上的等位基因可通过PCR(聚合酶链式反应)扩增区域内重复序列的拷贝数的不同来区分，在毛细管电泳分离之后可通过荧光检测来识别，随后通过一定的计算方法，即可根据所得的STR分型结果与专业的细胞STR数据库比对从而推算出样品所属的细胞系或可能的交叉污染的细胞系名称。
对上述细胞系F9-hiPSC的细胞进行DNA提取后，委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行STR分析，通过采用DSMZ tools(其中包含来自于ATCC，DSMZ，JCRB，CLASTR和RIKEN数据库的细胞系STR数据)进行细胞系比对，发现细胞库CLASTR中匹配到一株细胞，如下表1-1所示，进一步针对匹配细胞株ETCC001与本细胞系采用表1-2所示分型检测方案进行DNA分型检测，检测结果如表1-3所示。
表1-1
| 客户样本编号 | 公司编号 | 多等位基因 | 匹配细胞系 | 细胞库 | EV值 |
| HIPS-F9 | 20210325-002 | 无 | ETCC001 | CLASTR | 71.43％ |
表1-2
| 方案1 | 方案2 | 方案3 | 方案4 | |
| 1 | AMEL | VWA | D19S433 | D5S818 |
| 2 | D3S1358 | D6S1043 | TH01 | D1S1656 |
| 3 | D13S317 | D2S1338 | D12S391 | D8S1179 |
| 4 | D7S820 | D21S11 | D16S539 | TPOX |
| 5 | D18S51 | FGA | CSF1PO | |
| 6 | PENTAD | PENTAE |
表1-3
其中检测位点包括：D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、VWA、TH01、AMEL、TPOX、CSF1PO、D3S1358、D18S51、PENTAD、D6S1043、D2S1338、D21S11、D19S433、D12S391、FGA、D1S1656、D8S1179、PENTAE共21个，根据检测该株细胞DNA分型在细胞系检索中未找到匹配的细胞系。本次检测在该细胞系中未发现多等位基因(多等位基因指三等位及以上基因现象)。也表明受检细胞系F9-hiPSC未受其他细胞系污染。
(5)免疫荧光染色：
免疫荧光染色在室温下进行，将细胞系F9-hiPSC细胞固定在4％多聚甲醛中15分钟。用0.5％Triton X-100的PBS溶液渗透5分钟后，将细胞用0.5％Triton X-100和10％山羊血清封闭30分钟。接下来，将细胞分别与在10％山羊血清中稀释的一抗(OCT4抗体：BDPharmingen 560307 Oct3/4 Alexa 647 100Tst；SSEA抗体：SSEA4 santa SC-21704；TRA-1-60：BD Pharmingen 560850 Hu TRA-1-60 Ag Alexa 647 TRA-1-60 100Tst；TRA-1-81：BD Pharmingen 560793 Hu TRA-1-81 Alexa 647 TRA-1-81 100Tst)在4℃下孵育过夜，然后分别与在10％山羊血清中稀释的对应二抗在室温下孵育1小时。细胞核用DAPI复染5分钟。使用共焦系统(Zeiss LSM800，德国)获取图像。
免疫荧光染色结果如图3E所示，上述细胞系F9-hiPSC经免疫荧光(IF)染色证实了多能性标记OCT4，SSEA4，TRA-1-60和TRA-1-81均有表达。
(6)实时聚合酶链反应(qPCR)：
收集等量的正常传代培养的上述细胞系F9-hiPSC的细胞、hES(人胚胎干细胞由中国广州的中国科学院广州生物医学与健康研究所赠与)和UC细胞(为上述患者尿液细胞)，通过TRIzol法提取总RNA(分别为HB-hiPS、hES、UC组)，用EZ-pressRNA纯化试剂盒(EZBioscicey)提取各组总RNA。然后将基因组DNA移除，使用
III RT SuperMixfor qPCR(Vazyme)逆转录成cDNA。cDNA在CFX Connect(BioRad)上用2x RealStar GreenPower Mixture(GenStar)进行定量检测多能性基因NANOG、OCT4、SOX2(qPCR，其中内参基因为ACTIN和GAPDH)，具体基因NANOG、OCT4、SOX2的引物序列如下表1-4所示，反应程序为：初始变性95℃10min，40个周期95℃10s和60℃10s和72℃20s。
表1-4
实时聚合酶链反应(qPCR)结果统计如图3F所示，F9-hiPSC内源多能性基因含量较UC水平高，而与人胚胎干细胞(hES)的表达水平相当。
通过上述鉴定分析表明，本发明通过从携带F9 c.223C＞T(p.R75X)无义突变的B型血友病患者尿液中提取尿液细胞，并将该体细胞进行重编程得到的细胞系F9-hiPSC为人诱导多能干细胞，其与胚胎干细胞一样可以在体外诱导分化成不同的细胞和组织，使患者特异的体细胞来源的干细胞治疗(如通过iPS基因编辑纠正血友病等等)成为可能。与传统的干细胞治疗不同，iPSCs移植治疗相应的疾病避免了传统干细胞治疗所存在的道德伦理及免疫排斥等限制。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 山西医科大学
山西大学
<120> 一种人诱导多能干细胞及其制备方法和应用
<150> 2021110049955
<151> 2021-08-30
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
cccagagcaa gagagg 16
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gtccagacgc aggatg 16
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
cctcacttca ctgcactgta 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
caggttttct ttccctagct 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
cccagcagac ttcacatgt 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
cctcccattt ccctcgtttt 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
aaggtcccgg tcaagaaaca g 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
cttctgcgtc acaccattgc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
gtggacctga cctgccgtct 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
ggaggagtgg gtgtcgctgt 20
Claims (10)
1.一种人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1，其特征在于，所述人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1保藏于国家典型培养物保藏中心，保藏编号为CGMCC No：22359。
2.根据权利要求1所述人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1，其特征在于，所述人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1由F9基因发生.c223C＞T无义突变的B型血友病患者的体细胞中导入重编程因子，细胞重编程形成。
3.根据权利要求2所述人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1，其特征在于，所述体细胞为尿液细胞；所述重编程因子包括OCT4、SOX2、KLF4、MYC。
4.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的有效成分包含权利要求1-3任一项所述人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1、人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1的培养物、人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1的提取物中的任意至少一种。
5.权利要求1-3任一项所述人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1和/或权利要求4所述药物组合物在构建血友病细胞模型中的应用。
6.权利要求1-3任一项所述人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1和/或权利要求4所述药物组合物在制备和/或筛选血友病治疗药物中的应用。
7.权利要求1-3任一项所述人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1和/或权利要求4所述药物组合物在制备检测、分类或预测、治疗监测、预后或其它评价血友病的试剂中的应用。
8.权利要求1-3任一项所述人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
收集携带F9突变基因的体细胞，并进行细胞培养；
将含有重编程因子OCT4、SOX2、KLF4、MYC的质粒导入培养后的体细胞，采用重编程培养基培养，筛选重编程成功细胞，获得人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1。
9.根据权利要求8所述人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1的制备方法，其特征在于，所述携带F9突变基因的体细胞为F9基因发生.c223C＞T无义突变的尿液细胞。
10.根据权利要求8所述人诱导多能干细胞株SXMUi002-A-1的制备方法，其特征在于，所述导入方式为通过核转仪将质粒PEP4-EO2S-ET2K和pCEP4-M2L进行电穿孔转染导入。
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| GR01 | Patent grant | ||
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