JP2011229456A - 血友病aモデルブタの作出 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(a)第VIII因子遺伝子のエキソン16を標的としたターゲティングベクターを作製する工程;(b)胎児線維芽細胞に、工程(a)で作製したターゲティングベクターを導入し、相同組換えにより生じた遺伝子組換え細胞を選抜する工程;(c)採取した豚の体内成熟卵子から除核する工程;(d)工程(c)で除核された卵子に、工程(c)で選抜された遺伝子組換え細胞の細胞核を注入する工程;(e)工程(d)で細胞核が注入された卵子に活性化処理を施し、活性化処理後の核移植胚を雌豚の卵管又は子宮に移植する工程;を備えた血友病Aモデルブタの作出方法。
【選択図】なし
Description
(a)第VIII因子遺伝子のエキソン16を標的としたターゲティングベクターを作製する工程;
(b)胎児線維芽細胞に、工程(a)で作製したターゲティングベクターを導入し、相同組換えにより生じた遺伝子組換え細胞を選抜する工程;
(c)採取した豚の体内成熟卵子から除核する工程;
(d)工程(c)で除核された卵子に、工程(c)で選抜された遺伝子組換え細胞の細胞核を注入する工程;
(e)工程(d)で細胞核が注入された卵子に活性化処理を施し、活性化処理後の核移植胚を雌豚の卵管又は子宮に移植する工程;
や、(4)X染色体上の第VIII因子遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現される第VIII因子を発現する機能が失われた第VIII因子ノックアウトブタに被検物質を投与し、該モデルブタにおける血液凝固機能の程度を評価することを特徴とする血友病の予防・治療剤のスクリーニング方法に関する。
1.FVIII遺伝子ターゲティングベクターの作製(ベクター名:F8−GTV)
胎齢65日目の雄ブタ胎仔線維芽細胞からDNAzol(Invitrogen社製)を用いてブタゲノムDNAを分離し、このゲノムDNAからFVIII遺伝子のエキソン16を標的とするベクターを構築した。Sus scrofa coagulation factor VIII cDNA sequence(Accession number;NM_214167)をもとにプライマーを作製し(表1)、エキソン14からエキソン21までと、エキソン16からエキソン22までをExpand Long Template PCR System(Roche Diagnostics社製)を用いたPCRにて増幅させ、pCR2.1-TOPO Cloning Kit(Invitrogen社製)またはpCRBluntII-TOPO Cloning Kit(Invitrogen社製)を用いてクローニング後、ABI PRISM Genetic Analyzer(Applied Biosystems社製)によるDNA塩基配列決定と、エキソン部位とcDNA配列とを照合した。さらにイントロン14部位におけるXhoI認識配列を付加したプライマー(表1)とエキソン21プライマーのPCRによりクローニングしたイントロン14−エキソン21をエキソン16内にあるXhoIで処理したイントロン14−エキソン16の5’−アームを、エキソン16プライマーとイントロン21部位におけるXbaI認識配列を付加したプライマー(表1)によりエキソン16−イントロン21の3’−アームをクローニングし、pBS-HSVTK-PGKNeo(京都大学ウイルス研究所 生田宏一教授からの供与)のXhoIとXbaI部位へ組み込み、エキソン16の中にPGK−Neoを挿入させ、5’−アーム上流に自殺遺伝子であるHSV−TKを配したFVIII遺伝子ターゲティングベクターを作製した。エレクトロポレーションに用いるため、NotI(TOYOBO社製)の消化により線状化し、フェノール/クロロフォルムによる精製後、HBS(HEPEs Buffered Saline)で25nMの濃度に希釈した。
5’−アームあるいは3’−アームをクローニングしたプラスミドを任意の制限酵素にて37℃、2時間処理後、アガロース電気泳動とエチジウムブロマイド染色にて消化バンドを確認し、DNA塩基配列決定した配列の制限酵素認識部位を照合させ、制限酵素地図を作成した。
ランドレース♀×大ヨークシャー♂で交配後、妊娠65もしくは72日目の胎児を採取した。採取した胎児は、ハサミで筋肉組織を採取し、細切した。細切した胎児組織1g当たり10mlの0.25%トリプシン−0.04%EDTA−2Na液に懸濁し、一晩冷蔵した(4℃)。遠心処理(1500rpm、5min)により上清を除去した後、37℃に保温したウォーターバスにて20−30分間処理した。保温処理後、胎児組織1g当たり10mlのDMEM+10%FCSを加えてピペッティングし、セルストイレーナーにて濾過した。濾過液を遠心後、上清を除去し、沈殿物に10mlのDMEM+10%FCSを添加して再懸濁した。細胞数を計測し、適当量になるようDMEM+10%FCSにて調整した後、75cm2細胞培養用フラスコに播いた。その播いた細胞は、37℃で5%CO2でコンフルエントになるまで培養し、以下のエレクトロポレーションによる遺伝子導入に用いた。
分離および増殖した胎児線維芽細胞は、0.25%トリプシン−0.04%EDTA−2Na液で剥離させ、DMEM+10%FCSにて懸濁した。細胞懸濁液を遠心処理(1500rpm、5min)した後、上清を除去し、冷HBSに再懸濁した。再懸濁液は、再度遠心処理を行って上清を除去した。細胞数が2.5×107細胞/mlになるようにHBSにて調整した。キュベットに細胞溶液0.4ml(1.0×107細胞/ml)と100μlの調整済みDNA液(25nMの直線化したターゲッティングベクターを添加、図1.)を加えた後、良く混和した。遺伝子導入には、電気穿孔法装置を300V、950μF、抵抗∞の条件のパルスにて行った。パルス付加後、10分間室温にて静置した。静置した細胞は、DMEM+10%FCSに懸濁後、3枚の10cmシャーレに分けて培養した。パルス後48時間目に800μg/mlのネオマイシン(G418)および2μMガンシクロビア(Denosine;Mitsubishi Tanabe Pharma社製)を培養液に添加し、耐性細胞株を7−12日間選択培養した。薬剤選択後、PBSで洗浄し、0.25%トリプシン−EDTA(Invitrogen社製)をしみ込ませたペーパーディスク(ADVANTEC社製)を細胞コロニーに乗せ、37℃で3分インキュベーションした後、培地を入れておいた24ウェル-プレート(Corning社製)へ1枚/ウェルとなるように継代した。培養5−6日目にフルコンフルエントになった各コロニーは1/6ずつ24ウェル−プレートの3ウェルに継代し、1/2の細胞についてゲノムDNAを抽出し、相同組換えにより生じた遺伝子組換え体についてスクリーニングした。同様に継代した3ウェルについてもフルコンフルエントにした後に細胞継代とゲノムDNAを抽出し、確認のPCRスクリーニングをした。PCRスクリーニングで陽性の結果が出たコロニーは、そのまま培養を継続し、核移植に供した。
PCRスクリーニングはエキソン14とエキソン18に設置したプライマー(表2)を用いたPCRによりFVIII遺伝子組み換え体コロニーを特定し、Neoに設置したプライマー(表2)とのPCRにより確認した。また、Neo遺伝子の挿入を確かめるため、エキソン14―18のPCRで得られたバンドをNeo遺伝子に存在するStuIの消化により確認した。FVIII遺伝子組換え体コロニーはG0期へ以降するまで増殖させ、核移植に使用した。核移植・胚移植由来の雄ブタ胎仔ゲノムについても同様のPCRにより解析した。細胞は、200g/mlのプロテナーゼKが含む50μlの超純水に再懸濁し、55℃で3時間保温した後、95℃10分間加熱してプロテナーゼを失活させた。PCR分析は、Roche社製Expand Long Template PCR Systemを用いた。25μl量の反応液中に消化した50μlのサンプルから鋳型として1μl(30〜500ng/μl)を用いた。PCRサイクルのパラメーターは、最初に94℃を2分間、次に94℃を10秒、68℃を6分の1サイクルを10サイクル、94℃を15秒、68℃を6分の1サイクルにおいて68℃については、1サイクル毎に20秒間増加させ25サイクル後、68℃を7分間処理した。プライマーはF8エキソン14F(5’−CATCAGAGGGACATAAGCCTTCCTAC−3’)およびF8エキソン18R(5’−GCCAGGGAGTGTATCCATCACATAG−3’)を用いた。このプライマーは、8kbの変異アレル特異的な産物を設定した。精製したDNAに対するPCRは、鋳型として100ngの精製DNAを使用した点を除いて同様に実施した。
ランドレース(L)およびランドレース、大ヨークシャー(W)、デュロック(D)の三元交雑種(LWD)の生後160〜194日齢の春期発動前の雌ブタを用いた。供試ブタにeCG(ピーメックス、三共)を1500IU投与し、その72時間後にhCG(プペローゲン、三共)を500IU投与した。hCG投与48時間後に屠殺し、卵巣、卵管、子宮の結合組織を摘出した。また、性成熟に達した雌豚からの採卵は、予め発情時に雄希釈精液を用いて人工授精を行い、妊娠21−50日後に流産処置し行った。核移植予定5日前にPGF2α類縁体クロプロステロール約0.2mg(プラネート:2ml量、武田製薬社製)を臀部筋肉内に投与した。その24時間後に、同様にPGF2α類縁体クロプロステロールを注射し、同時にeCG(ピーメックス、三共製薬社製)を臀部筋肉内に1500IU投与した。PGF2α+eCG投与72時間後にhCG(プペローゲン、三共製薬社製)を500IU投与した。hCG投与46時間後に屠殺し、卵巣、卵管、子宮の結合組織を摘出した。
摘出した卵巣、卵管、子宮の結合組織を直ちに実験室に持ち帰り、灌流液(PBS:Ca2+、Mg2+不含、(TAKARA社製)+0.1%ウシ血清アルブミン:BSA(Sigma社製、Cat.No.A−4503)+100mlあたり1ml添加抗生物質:Antibiotic,Antimycotic(Sigma社製、A−7292)で卵管を灌流し、卵子を採取した。得られた卵子は0.1%ヒアルロニダーゼを含む、灌流液を用いて卵丘細胞を裸化し、卵細胞質の均一な卵子を選抜した後、ヒアルロニダーゼを含まない灌流液中で洗浄した。その後、PZM−3液(Biol Reprod. 66:112-119. 2002)を用いてインキュベーター(38.5℃、5%CO2、5%O2、90%N2)内で供試するまで体外培養を行った。
屠場にて食肉用として屠殺された春機発動前の未経産雌ブタより卵巣を採取し、PBS(−)液にて35℃保温下で研究室に持ち帰った。持ち帰った卵巣は直ちに、37℃に保温したPBS(−)にて洗浄し、卵巣結合組織を除去した後、採卵作業を行った。直径3−6mmの卵胞を選び、16G注射針付き10mlシリンジで吸引した。吸引した卵胞液は、50mlディスポチューブに回収し、5分以上室温放置後、上清を除去した。卵子が含まれる沈殿物に対し、TALP−Hepes液を加えて懸濁後、沈殿物がチューブの底に溜まったのを確認し、沈殿物を吸引しないよう、パスツールピペットにて上清を除去した。この洗浄操作を2−3回繰り返した。卵丘細胞が3層以上密に付着した卵丘細胞卵子複合体(COC)とCOCに壁側顆粒層細胞が付着した壁側顆粒層細胞−卵丘細胞卵子複合体(GCOC)を選別・採卵をした。
採取したCOCおよびGCOCは、約15〜20個/穴で改変NCSU37を100μl分注し、100μl流動パラフィンオイルカバーした6穴ディッシュを用いて成熟培養した。改変NCSU−37は、10%ブタ卵胞液、0.6mMシステイン、50μM βメルカプトエタノール、1mMジブチリルcAMP、10IU/ml PMSG(ピーメックス;1000IU三共製薬社製)、10IU/ml hCG(プペローゲン;1500IU、三共製薬社製)を添加して作製した。20〜22時間まで培養後、ホルモン及びジブチリルcAMP無添加改変NCSU37に移して供試時まで培養した。成熟培養は39℃、気相条件は、CO25%、O25%、N290%の条件で実施した。成熟培養時間は、42−44時間で行い、成熟卵子(第一極体放出卵子)のみを試験に使用した。
除核操作前に、屠殺採卵した未受精卵子を、サイトカラシンB(Sigma社製:Cat.No.C−6762)が5μg/ml濃度含むPZM3液に移し、15分間以上処理した。除核操作も同濃度のサイトカラシンBが含まれるPZM3液で作製したドロップ内(10cmプラスチックシャーレの中心付近に50μlでドロップを作製し、ミネラルオイル20mlで被った)で行った。卵子は、第一極体が、12時から3時方向の位置になるようにホールディングピペットで保定した。ピエゾマイクロマニピュレーター(プライムテック株式会社製)に取り付けた除核用ピペット(外径25〜30μm、先端を30〜45度の角度で研磨)により、第一極体ごと細胞質を1/4〜1/3量程吸引した。除核用ピペットの操作性が悪くなった場合は、20%PVP液(Sigma社製:Cat.No.PVP−360)ドロップにて、吸引・排出を繰り返し、洗浄を行った。除核操作終了後、直ちにサイトカラシンBが含まれないPZM3液に移し、洗浄を行う。洗浄には、PZM3液が3ml入った35mmディッシュ(Falcon社製、1008)で2回以上、丁寧に洗浄し、サイトカラシンBを除去した。その後、注入操作まで、PZM3液ドロップ(35mmディッシュ:Falcon社製、3001に100μlのドロップを作製し、4mlミネラルオイルで被った)に移し、インキュベーター内で培養した。
PCR解析によりFVIII遺伝子がノックアウトされていると判定した雄胎児の線維芽細胞を核移植ドナー細胞として用いた。培養液にはDMEM+10% FCSを用い、植え継ぎ回数は0〜5回の細胞を用いた。核移植予定日に合わせて、植え継ぎを行った後、コンフルエント状態から培養液の交換を行わず、3〜14日間放置し、細胞周期をG1/G0期に同調した。核移植に用いる約1時間前にドナー体細胞の準備を行った。細胞処理は、培養容器の培養液を除去した後に、PBS(−)にて3回以上洗浄を行い、0.25%トリプシン+0.04%EDTA-2Na液にて細胞剥離処理を行った。剥離した細胞に10%FCS添加DMEMを加えて懸濁した後、遠心処理(1,500rpm、5min、室温)を行った。遠心処理後、上清を除去し、PZM3液を適量加えて懸濁し、核移植に用いるまで室温で放置した。体細胞核注入操作時に、適当な細胞数を注入操作用チャンバーのドロップに添加して使用した。
注入用チャンバー(10cmシャーレにPZM3液50μlでドロップを作製し、ミネラルオイル20mlで被った)のドロップに適量のドナー細胞を添加し、除核済み卵子50〜100個を入れて操作した。注入操作には、ピエゾマイクロマニュピレーターに体細胞核注入用ピペット(外径7−10μm、鈍端)を用いた。注入用ピペットをピエゾマイクロマニュピレーターに取り付ける前に、ピペット後端より5mmの位置にフロリナートを3−5mm幅になるように、充填して使用した。そのピペットをピエゾに取り付けて使用する時は、先端より培養液、フロリナート、空気、ミネラルオイルの順で満たされている状態にして操作した。注入操作を行う前に、必ず20%PVP液ドロップ内で注入用ピペットを洗浄(ピペッティングやPVPドロップへのピペット先端の出し入れ)した。浮遊している体細胞を吸引し、数回ピペッティングを行い、細胞膜を壊し、ホールディングピペットにて保定した除核済み卵子細胞質内へ注入した。体細胞核を注入した卵子は、活性化処理時間までインキュベーターで培養を行った(1〜3時間)。
体細胞核を注入した卵子の活性化処理は直流パルス刺激(SSH−2、島津製作所製)を、1.5kV/cm 100μsec×1回の条件にて行った。チャンバーには2mm幅のステンレスワイヤー電極を用い、電気刺激用の電解質溶液には0.05mM CaCl2、0.1mM MgSO4ならびに0.02%BSAを含む0.28Mマンニトール溶液を用いた。
活性化処理卵子は5μg/mlサイトカラシンB(Sigma社製:Cat.No.C−6762)を含むPZM3液で2時間培養し、第2極体の放出を抑制させる処理を行った。
活性化後2倍体処理をした卵子は、PZM3液にて体外培養を行い、活性化処理後2日目に分割胚のみ胚移植に用いた。
仮腹の同期化は妊娠豚を人工流産処置することで行った。また、仮腹の発情は、採卵豚のものより、1日遅れるように発情同期化処置を行った。供試予定の雌ブタは、発情時に、雄豚希釈精液を用いて人工授精を行い妊娠させた。妊娠後21−50日目の妊娠豚を用いた。核移植予定6日前にPGF2α類縁体クロプロステロール約0.2mg(プラネート、武田製薬社製:2ml量)を臀部に注射した。その24時間後に、同様にPGF2α類縁体クロプロステロールを注射し、同時にeCG(ピーメックス、三共製薬社製)を1000IU投与した。PGF2α+eCG投与72時間後にhCG(プペローゲン、三共製薬社製)を500IU投与した。hCG投与、約68時間目に仮腹へケタラール投与後、ハロセン麻酔下で外科的に胚移植手術を行った。胚移植はPPカテーテル(フジヒラ社製)を卵管へ挿入して行った。
同定したPCR陽性コロニーは、非相同組換え細胞が、様々な割合で含まれている可能性があり、体細胞核移植技術を用いた効率的な相同組換え動物の作出の妨げとなりうることが予想された。そこで、単一な相同組換え細胞のみの集団を得るため、妊娠した雌ブタの32日目もしくは39日目に胎児を採取した。採取した胎児は、3.と同様に細胞を分離すると同時にゲノムDNAを採取し、相同組み換え個体であるか5.と同様の条件でPCR解析した。PCR解析にて陽性であった胎児細胞を用いて再核移植を実施し、胚移植によりFVIIIノックアウトクローン個体の作出に供した。
核移植・胚移植により発生した雄ブタ胎仔線維芽細胞から抽出したゲノムDNAを用いてFVIII遺伝子の組換えをサザンブロットにて確認した。5mgのゲノムDNAを制限酵素SacI、StuI、EcoRI、SphI、あるいはXbaIで切断し、アガロース電気泳動後、アルカリトランスファー条件によるサザンブロッティングを実施した。バンドの検出はDIG PCR Labeling Kit(Roche社製)にてエキソン14またはエキソン22のDIGラベルプローブを、エキソンプライマー(表3)を用いたPCRにより作製し、DIG Easy Hyb(Roche社製)にてハイブリダイゼーション、DIG Detection Kit(Roche社製)により検出した。
血液と3.8%クエン酸ナトリウム溶液(Harasawa Pharmaceutical社製)を1/10となるようにブタから採血し、3000rpm、10分の遠心分離により血漿を分離した。活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)をCA500(Sysmex社製) にて測定し、ヒトFVIIIに対する抗体Sheep anti-human FVIII Antibody(Affinity Biologicals Inc.社製)とRabbit Anti-human FVIII(研究室で作製したポリクローナル抗体)、Goat anti-Rabbit IgG-HRP(BioSourse社製)を用いたELISAにより、FVIIIの検出を検討した。ヒト正常血漿(健常者ボランティアによる)においてAPTTのスタンダードを作製し、ヒト血漿FVIII活性を100%としてブタ血漿FVIII活性を算出した。ELISAでは、ブタ血漿とヒト血漿、それらの混和(ブタ/ヒト:1/1〜1/50)をサンプルとし、Benchmark plus(Bio-Rad Laboratories社製)にて吸光度415nmを測定し、ABTS(Kirkegaard&Perry Laboratories社製)の発色によりFVIIIを検出した。
誕生したクローンブタから採取可能な組織(耳、臍帯組織)や血液等からDNAを抽出し、前記5.「PCR解析によるターゲッティングの検出」に準じてPCR解析を行った。
ブタの全ゲノムDNA配列が解読・公開されていないため、現時点で公開されているブタ肝臓からクローニングされたFVIII cDNA配列をヒトFVIII cDNA配列との相同性によりエキソン部位を予測、PCRにより増幅・クローニングすることで遺伝子発現を欠損させるためのターゲッティングベクターを構築し、配列を解読した。cDNA配列とクローニングしたゲノムDNA配列の照合によってエキソン部位が特定された。
また、種々の制限酵素処理によってクローニングしたゲノムDNA領域の制限酵素地図を作製した(図1参照)。
FVIII遺伝子ターゲティングベクターの導入と薬剤選択によって得られた936コロニーのうち増殖可能であった200コロニーをPCRスクリーニングした。遺伝子導入の回数と薬剤耐性コロニー数、増殖コロニー数、FVIII遺伝子組換え型コロニー数を表4に示す。エキソン14−18において、遺伝子組換え型ではエキソン16へのNeoの挿入により遺伝子増幅部位が長くなることを検証したところ、野生型と遺伝子組換え型の両方にバンドが出るコロニー#134が1つ得られた(図2)。コロニー#134におけるNeoの挿入はPCR(エキソン14−Neo、Neo-エキソン22)とエキソン14-18のPCR後のStuIの切断により陽性と確認された(図2)。さらに継代した3ウェルについても同様の結果が得られた(図2)。よって、得られたコロニー#134は野生型細胞とエキソン16にNeoが挿入されたFVIII遺伝子組換え細胞とを含む細胞集団であると考えられた。このコロニー#134を核移植に用いた。
FVIII遺伝子組換え細胞コロニー#134を用いた計5回の核移植・胚移植の結果、1匹のブタ胎仔が得られ、その線維芽細胞を分離・増殖・保存し、そのゲノムDNAの解析を検討した。PCRによる解析はエキソン14−18において遺伝子組換え型のみを示す結果が得られ、エキソン16へのNeoの挿入も陽性であった(図3A)。
また、サザンブロッティングによりFVIII遺伝子の組換えの確認したところ、エキソン14プローブまたはエキソン22プローブを用いた場合において、任意のバンドシフトが認められ(図3B、3C)、目的であるFVIII遺伝子のエキソン16にNeoが挿入されているという結果が得られた。よって、核移植に用いた細胞コロニーはFVIII遺伝子組換え細胞と野生型細胞が混在する細胞集団であったが、核移植後に発生したクローンブタ胎仔はFVIII遺伝子組換えブタ(FVIII−KOブタ)であることが示された。
作出した細胞由来のクローンブタ胎仔がFVIII遺伝子組換え(FVIII−KO)ブタであることがゲノムDNAの解析により確かめられたため、そのブタ胎仔線維芽細胞をもちいて計7回の核移植・胚移植を実施した。その結果、3頭の仮親が、妊娠し、分娩まで至った。4頭の生存クローンブタが誕生した。胚移植の実施日程と妊娠の有無、出産予定日、分娩頭数(死産)の結果を表5に示す。
FVIII−KO胎仔線維芽細胞の核移植・胚移植により、4頭のFVIII−KOクローンブタが誕生した。しかし、出産直後あるいは2日目までに3頭が死亡した。
死亡したFVIII−KOブタ新生仔の剖検から、体の複数箇所に内出血が認められた(図4A)。母ブタとの接触による内出血と推察された。また、内出血部位を切開したところ、血腫が認められ(図4C)、FVIII−KOブタ自身には死亡前に出血傾向があるものと考えられた。
一方、頭蓋内には出血は認められず、臓器所見も異常がなかった(図4B、4D)。FVIII−KOブタ新生仔のDNAをエキソン14−18 PCRにより解析したところ、2頭ともFVIII−KOのクローンであることが確認された。
野生型ブタの血漿をヒトFVIIIを検出するELISAによって検出したところ、ブタFVIIIは検出されず、ヒト血漿との混和によるELISAにおいてもヒトFVIIIの検出を阻害するような結果は得られなかった(図5A)。また、野生型ブタ血漿のFVIII活性を測定したところ、ブタ血漿はヒト血漿の約3〜3.5倍のFVIII活性を有することが示された(図5B)。
生後2日に出血死したFVIII-KOクローンブタの血液の凝固因子活性(ヒト凝固因子活性換算)を測定したところ、第VIII因子活性は感度以下であり、正常対照となる野生型新生仔ブタの(生後1日)の凝固第VIII因子活性は200%以上であった。FVIIIKOクローンブタの血漿中で低下がみられた第VII因子活性と第XI因子活性は野生型新生仔ブタでも低値であった。FVIII-KOクローンブタでは第VIII因子活性のみが特異的に低下していたことは、得られたクローンブタがFVIII-KOクローンブタであることを確実に示し、出血症状は第VIII因子活性の低下に基づくものであるといえる。
Claims (6)
- X染色体上の第VIII因子遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現される第VIII因子を発現する機能が失われたことを特徴とする血友病Aモデルブタ。
- 請求項1記載の血友病Aモデルブタに由来する臓器、組織又は細胞。
- 以下の工程を備えた血友病Aモデルブタの作出方法。
(a)第VIII因子遺伝子のエキソン16を標的としたターゲティングベクターを作製する工程;
(b)胎児線維芽細胞に、工程(a)で作製したターゲティングベクターを導入し、相同組換えにより生じた遺伝子組換え細胞を選抜する工程;
(c)採取した豚の体内成熟卵子から除核する工程;
(d)工程(c)で除核された卵子に、工程(c)で選抜された遺伝子組換え細胞の細胞核を注入する工程;
(e)工程(d)で細胞核が注入された卵子に活性化処理を施し、活性化処理後の核移植胚を雌豚の卵管又は子宮に移植する工程; - X染色体上の第VIII因子遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現される第VIII因子を発現する機能が失われた第VIII因子ノックアウトブタに被検物質を投与し、該モデルブタにおける血液凝固機能の程度を評価することを特徴とする血友病の予防・治療剤のスクリーニング方法。
- ヒト第VIII因子とブタ第VIII因子とに交差反応性を有する抗第VIII因子抗体。
- ヒト第VIII因子により、X染色体上の第VIII因子遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現される第VIII因子を発現する機能が失われた第VIII因子ノックアウトブタを免疫し、ヒト第VIII因子とブタ第VIII因子とに交差反応性を有する抗第VIII因子抗体を調製することを特徴とする抗第VIII因子抗体の製造方法。
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