CN113993375B - B型血友病大鼠模型 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及B型血友病大鼠及其制备方法，更详细地，涉及F9因子被敲减(knock‑down)或敲除(knock‑out)的B型血友病大鼠(rat)及其制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及B型血友病大鼠及其制备方法，更详细地，涉及敲减(knock-down)或敲除(knock-out)F9因子的B型血友病大鼠(rat)及其制备方法。
背景技术
B型血友病或克雷司马斯病为凝血因子IX缺乏所导致的遗传性X-相关劣性出血性疾病。B型血友病不仅具有在受伤部位持续出血的问题，而且还具有诱发在关节或肌肉中发生自然出血而诱发如血友病性关节病的并发症的问题。在此情况下，需要研发根治性且有效的新疗法，有必要为药物的功效及稳定性评价而研发更好的动物模型。
作为现有的B型血友病动物模型，小鼠(mice)具有在关节或肌肉等不几乎发生组织中的自然出血(pontaneous bleeding)现象的问题(参照Yen C.T.,Fan M.-N.,Yang Y.-L.,Chou S.-C.,Yu I.-S.,Lin S.-W.Thromb.J.2016；14:22.)。这种B型血友病小鼠不适合用于药物研发及生产。由此，针对B型血友病的动物模型，提出了与在基因上与人类更加类似且更好地示出B型血友病的疾病症状的动物模型有关的必要性，并且，在生物医学领域中，能够以较低的费用利用能够准确地研究B型血友病的动物模型的要求正在增加。
由此，本发明提供F9因子缺乏的大鼠作为B型血友病模型。这种大鼠动物模型可表现出B型血友病的疾病症状，更具体地，可充分表现出自然出血现象，这将为之后的治疗剂研发中心提供重要的工具。
发明内容
技术问题
本申请提供B型血友病大鼠及其制备方法。
并且，本申请提供包含为了制备B型血友病大鼠而可人工操作F9基因的基因操作技术的组合物。
本申请提供利用上述B型血友病大鼠的各种用途。
技术方案
为了解决如上所述的问题，本说明书提供B型血友病大鼠作为B型血友病模型用动物。
本申请中公开的一实施方式涉及在基因组中发生人工修饰的B型血友病大鼠。
在上述基因组中发生人工修饰的B型血友病大鼠包含F9基因中的一部分或全部被人工操作和/或修饰的F9基因。
在一实例中，上述人工操作的F9基因在外显子(exon)、内含子(intron)、调控区(regulatory region)、5'末端或其相邻位点、3'末端或其相邻位点或剪接位点(splicingsite)等包含人工修饰。
上述F9基因核酸序列修饰包含一种以上的核苷酸的附加、缺失或被基因组取代，但并不限定于此。
上述F9基因核酸序列修饰可包含F9基因中的核酸序列的一种以上的核苷酸的插入、F9基因中的核酸序列的一种以上的核苷酸的缺失、F9基因中的核酸序列的一种以上的核苷酸的取代、F9基因中的核酸序列或其部分的敲减等。
上述基因组中的人工修饰可诱发F9因子的突变。即，B型血友病大鼠可包含人工修饰的F9因子。
上述人工修饰的F9因子包含一种以上的氨基酸序列的变更和/或取代。
例如，上述氨基酸可变更为具有相似性质的氨基酸。或者，上述氨基酸可变更为具有不同性质的氨基酸。
上述氨基酸的变更和/或取代可调节蛋白质表达量。
或者，上述氨基酸的变更和/或取代可影响蛋白质的结构、功能。
因此，通过上述F9因子的人工修饰，上述B型血友病大鼠包含并不表达或表达量减少的F9因子，或者包含上述B型血友病大鼠包含功能降低或丧失的F9因子。
本申请中公开的一实施方式涉及包含人工修饰的F9因子和/或编码其的基因的细胞。
上述细胞可以为转化干细胞、胚胎细胞或体细胞。
上述转化细胞包含人工修饰的F9基因。
作为一实施例，上述转化细胞可包含在F9基因中的一个以上的区域发生核苷酸的附加、缺失或取代的基因。
作为另一实施例，可以为敲减和/或敲除上述F9基因的细胞。
上述转化细胞可包含靶向F9因子的基因操作技术，即，人工核酸酶、反义核糖核酸(RNA)、显性负性突变体F9(dominant negative mutant F9)或核酶等。
例如，上述转化细胞包含CRISPR-Cas系统、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)或兆核酸酶，或者包含编码其的核酸。
或者，例如，上述转化细胞包含小干扰(小干扰核糖核酸(siRN A))、短发夹核糖核酸(shRNA)或微小核糖核酸(microRNA)，或者包含编码其的核酸。
或者，例如，上述转化细胞包含靶向F9因子的显性负性突变体F9或对于编码F9因子的核酸的核酶(ribozyme)，或者包含编码其的核酸。
上述基因操作技术以各种形态包含在细胞中。例如，可以为包含编码基因操作技术的核酸的载体形态。
上述转化细胞可以为没有F9因子或表达量减少的细胞。
上述转化细胞可以为F9因子的功能丧失或降低的细胞。
上述转化细胞可以为缺乏F9因子的细胞。
上述转化细胞可形成细胞集落。上述细胞集落可以为利用单个细胞培养的单个细胞。
本申请的一实施方式涉及包含人工修饰的F9因子的大鼠。
即，涉及F9基因被敲减或敲除而将F9因子的表达或功能下调(downregulation)或完全丧失的大鼠。以下，可与“人工修饰的大鼠”混合使用。
上述人工修饰的大鼠可能出现出血症状(持续性出血、自然出血)。
上述人工修饰的大鼠可能出现自然出血和/或外出血(external bleeding)。
在任意实例中，上述人工修饰的大鼠包括组织中的自然出血。
包括由上述组织中的自然出血引起的炎症和/或由上述组织中的自然出血引起的肿胀。
例如，上述组织可以为关节、肌肉及眼。
在本说明书中，提供用于对F9基因进行人工操作的F9基因操作技术。
引起上述F9基因中的人工修饰的基因操作技术为选自利用人工核酸酶的技术、利用反义核糖核酸的技术及利用突变基因或蛋白等技术中的一种以上，但基因操作技术并不局限于此。
本申请中公开的上述F9基因操作技术可以为选自由作为人工核酸酶的CRISRP-Cas系统、锌指核酸酶、转录激活样效应因子核酸酶及兆核酸酶(mega-nuclease)组成的组中的一种以上。
上述人工核酸酶可与F9基因的全部或一部分核酸序列形成互补键。
上述人工核酸酶可通过去除整个F9基因或将F9基因中的一部分核酸序列缺失(deletion)、取代(substitution)，或通过插入外源核苷酸来对F9基因进行人工修饰。
上述人工核酸酶可与F9基因中的外显子区域、内含子区域、调节区域、剪接位点、5'末端部分或其相邻区域、3'末端部分或其相邻区域的一部分核酸序列互补结合，由此可对F9基因进行人工修饰。
本申请中公开的上述F9基因操作技术涉及与F9基因互补结合的反义核糖核酸技术。
利用上述反义核糖核酸的基因操作技术可以为小干扰核糖核酸(以下，称为“小干扰核糖核酸”)、短发夹核糖核酸(以下，称为“短发夹核糖核酸”)及微小核糖核酸(以下，称为“miRNA”)中的一种以上。
上述反义核糖核酸可与F9基因的一部分核酸序列形成互补键，可调节F9基因蛋白表达。
例如，可与F9基因中的外显子区域、内含子区域、调节区域、剪接位点、5'末端部分或其相邻区域、3'末端部分或其相邻区域的一部分核酸序列形成互补键。
或者，在本申请中，可提供用于调节F9因子功能及表达的显性负性突变体(dominant negative mutant)、核酶、胞内抗体(intracellular antibody)、肽(peptide)或小分子(small molecule)。
在本说明书中，提供用于制备B型血友病大鼠模型的F9基因操作用组合物，其特征在于，包含：向导核糖核酸或编码其的脱氧核糖核酸(DNA)；以及编辑蛋白或编码其的脱氧核糖核酸，此时，上述向导核糖核酸包含选自由SEQ ID NO:21至SEQ ID NO:26组成的组中的序列，上述向导核糖核酸将F9基因序列的全部或一部分作为靶序列，上述编辑蛋白包含源自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9蛋白，上述向导核糖核酸和上述编辑蛋白可形成向导核糖核酸-编辑蛋白复合物来引起上述F9基因中的人工修饰。
如一实例，上述向导核糖核酸和上述编辑蛋白能够以形成复合物的核糖核蛋白(RNP，ribonucleoprotein)形态存在。
如一实例，编码上述向导核糖核酸的脱氧核糖核酸及编码上述编辑蛋白的脱氧核糖核酸能够以载体形态存在。
在本说明书中，提供包含选自由SEQ ID NO:21至SEQ ID NO:26组成的组中的序列的向导核糖核酸。
本说明书提供B型血友病大鼠模型制备用组合物。
本申请中公开的内容的一实施方式涉及用于操作或修饰F9基因的组合物。
用于操作或修饰上述F9基因的组合物可包含上述人工核酸酶或编码其的核酸。例如，人工核酸酶可以为转录激活样效应因子核酸酶、锌指核酸酶、兆核酸酶或CRISPR-酶(enzyme)系统中的一种以上。
如一例，上述F9基因操作用组合物可包含能够与F9基因中的一部分核酸序列形成互补键的向导核糖核酸及Cas9酶或其复合物。
如另一例，F9基因操作用组合物可包含能够与F9基因中的一部分核酸序列形成互补键的反义核糖核酸，如小干扰核糖核酸或短发夹核糖核酸等。
如另一例，F9基因操作用组合物可包含显性负性突变体F9因子或核酶等。
上述组合物可包含为混合物形式的以下中的一种以上：一种或多种向导核糖核酸及Cas9酶或其复合物；一种或多种反义核糖核酸；或显性负性突变体F9因子。
上述组合物能够以表达盒形态提供。
上述F9基因操作技术以病毒载体、非病毒载体或非载体形态包含在组合物中。
如一例，上述组合物包含核糖核蛋白形态的F9基因操作技术。
如另一例，上述组合物包含重组表达载体，上述重组表达载体包含F9基因操作技术。
在本说明书中，提供制备B型血友病大鼠的方法。
在本申请的一实施方式中，包括向大鼠细胞中递送(delivery)基因操作技术来对上述F9基因进行人工修饰的步骤。
此时，上述F9基因操作技术可利用裸核酸载体(naked nucleic acid vector)、非病毒性载体(non-viral vector)或病毒性载体(viral vector)来递送。
在一实例中，为了制备上述人工修饰的大鼠，可包括利用大鼠细胞中的非病毒载体引入F9基因操作技术的步骤。
例如，当上述F9基因操作技术为向导核糖核酸及Cas9时，上述向导核糖核酸-Cas9复合物可通过显微注射(microinjection)法递送至细胞中。即，能够以核糖核蛋白(RNP，ribonucleoprotein)的形态递送。上述向导核糖核酸-Cas9复合物是指通过向导核糖核酸与CRISPR酶的相互作用形成的复合物。
用于人工修饰上述F9基因的转化为重组表达载体的源自大鼠的细胞可根据本领域公知的方法增殖并培养。
在本申请的另一实施方式中，可包括筛选包含F9靶基因操作技术的转化细胞的步骤。
此时，上述转化细胞可利用抗生素抗性基因(antibiotic resistance gene)、抗原-抗体反应、荧光蛋白(fluroscent protein)及表面标记基因(surface marker gene)中的一种以上来从细胞集落筛选转化细胞。
本说明书中公开的一实施方式涉及利用移植胚胎细胞的方法的F9基因操作大鼠生产方法。
上述方法可包括：步骤(a)，将从大鼠的组织分离出的胚胎细胞暴露在人工核酸酶(兆核酸酶、锌指核酸酶、转录激活样效应因子核酸酶和/或CRISPR-酶系统)；步骤(b)，将胚胎移植到代孕鼠身体中；步骤(c)，上述人工核酸酶与胚胎中的F9基因位点特异性结合来引起细胞染色体变化，由此形成人工修饰的F9基因；以及步骤(d)，代孕鼠妊娠包含人工修饰的F9基因的大鼠。
可参照本领域公知的现有的胚胎移植方法理解与各个步骤有关的常规技术内容。
在本说明书中公开的一实施方式涉及F9基因已通过人工修饰敲除的B型血友病模型用转化大鼠的制备方法及由其制备的B型血友病模型用大鼠，所述方法包括：将引入重组载体的核供体细胞的核移植到去核卵母细胞；以及生下大鼠后代。
在任意具体例中，利用通过人工修饰敲除上述F9基因的转化细胞株通过本发明的体细胞核移植方法(SCNT，somatic cell nuclear transfer)生产B型血友病大鼠。
上述B型血友病大鼠生产方法可包括：步骤(a)，培养从大鼠的组织分离出的体细胞或干细胞，由此制备核供体细胞；步骤(b)，向上述核供体细胞引入靶向F9基因中的一部分或全部的人工操作核酸酶；步骤(c)，从大鼠的卵母细胞去除核来制备去核卵母细胞；步骤(d)，向上述步骤(c)的去核卵母细胞显微注射步骤(b)的核供体细胞并融合；步骤(e)，激活在上述步骤(d)中融合的卵母细胞；以及步骤(f)，向代孕鼠的输卵管中移植上述激活的卵母细胞。
可参照在本领域公知的现有的利用体细胞核移植技术的克隆动物的制备方法等理解与各个步骤有关的常规技术内容。
在本说明书中，提供包含F9基因中的人工修饰的B型血友病大鼠模型制备方法，其包括：使大鼠细胞与上述用于制备B型血友病大鼠模型的F9基因操作用组合物相接触来在上述细胞的F9基因中产生人工修饰；以及向大鼠引入上述细胞来制备B型血友病大鼠模型。
如一实例，上述接触可通过选自电穿孔法(electroporation)、脂质体、质粒、病毒载体、纳米颗粒(nanoparticles)及蛋白转导域(PTD，Protein translocation domain)融合蛋白方法中的一种以上的方法执行。
在一实例中，提供利用CRISPR/Cas9系统的转化大鼠制备方法。
上述利用CRISPR/Cas9系统的转化大鼠制备方法可包括：步骤(a)，向胚胎细胞内引入靶向大鼠中的F9基因的一部分核酸序列或全部的CRISPR-酶系统；步骤(b)，将胚胎移植到代孕鼠身体中；步骤(c)，上述CRISPR-酶系统与胚胎中的F9基因位点特异性结合来引起细胞染色体变化，由此形成人工修饰的F9基因；以及步骤(d)，代孕鼠人参包含人工修饰的F9基因的大鼠。
在本说明书中，可利用以往没有的新型B型血友病大鼠来提供用于筛选B型血友病治疗用药物的动物模型。更具体地，可提供用于筛选B型血友病自然出血预防或治疗用药物的动物模型。
在一实例中，与B型血友病有关的药物筛选方法可包括：步骤(a)，向B型血友病大鼠模型给药用于减轻、预防或治疗B型血友病的候选物质；以及步骤(b)，给药候选物质后，将该候选物质与未给药候选物质的对照组比较并分析。
优选地，候选物质为选自由肽、蛋白质、非肽化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取液、植物提取液及动物组织提取液等组成的组中的一种以上，但并不限定于此。
上述化合物可以为新型化合物或已公知的化合物。此时，上述化合物可形成盐。
发明的效果
根据本说明书中公开的技术，产生如下的效果。
根据本说明书中公开的技术，可提供B型血友病大鼠。具体地，可提供人工修饰F9因子的B型血友病大鼠。
本说明书中提供的B型血友病大鼠与人类基因相似，不仅可用于研究确切的病因机制，还可作为最适合药物筛选的动物模型用于探索对于B型血友病的治疗物质、研发诊断法等，因此，可非常有用地用作B型血友病动物模型。
附图说明
图1为比较分析F9(+/+)大鼠和F9(-/-)大鼠的图表，(a)部分示出比较分析F9(+/+)大鼠和F9(-/-)大鼠的活化部分凝血活酶时间(aPTT)的图表，(b)部分示出比较分析F9(+/+)大鼠和F9(-/-)大鼠的凝血酶时间的图表，(c)示出比较分析F9(+/+)大鼠和F9(-/-)大鼠的血小板数的图表。
图2为比较F9(+/+)大鼠与F9(-/-)大鼠的出血量之差，即，在相同时间切尾(tailcutting)后的10分钟的出血量的照片。
图3为为了确认F9大鼠的疼痛部位的形态，仅剜出F9大鼠的有疼痛的部位来执行苏木精-伊红染色(H&E染色)并观察的结果的照片。
图4为示出在敲除F9基因的大鼠中表现出的自然出血现象的照片。
图5为示出在敲除F9基因的大鼠的脚掌表现出的症状的照片。
图6为示出在敲除F9基因的大鼠的眼中表现出的症状的照片。
图7为示出在敲除F9基因的大鼠的年轻活鼠中表现出的症状的照片。
图8为为了观察F9(+/+)大鼠和F9(-/-)大鼠的大腿肌的组织学变化而执行苏木精-伊红染色并观察的结果的照片。
具体实施方式
除非另行定义，在本说明书中使用的所有技术术语及科学术语的含义与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。与在本说明书中记载的相似或相同的方法及物质可用于本发明的执行或试验中，但在以下公开适合的方法及物质。在本说明书中提及的所有出版物、专利申请、专利及其他参照文献的全部内容通过引用结合在本申请中。此外，物质、方法及实施例仅为例示性的，而不是限制性的。
术语的定义
转化、转化细胞及转化动物
“转化(Transformation，基因修饰(genetic modification))”是指人工修饰细胞中的动物基因组(animal genome)所包含的多核苷酸(polynucleotide)。上述修饰包括将细胞中的动物基因组所包含的多核苷酸的一部分去除、取代一部分以及相动物基因组插入核苷酸(nucleotide)或多核苷酸。
本申请的术语“转化”包括将可在细胞中表达的蛋白质或核糖核酸追加、变更或去除。
“转化细胞”是指包含细胞中的动物基因组的转化的部分的细胞。
“转化动物”是指包含至少一种转化细胞的动物。动物F0可包含第一转化细胞。上述动物F0可生产后代F1。上述F1及F1以下的后代所包含的一种以上的细胞可包含动物基因组，上述动物基因组包含与上述第一转化细胞中的动物基因组的转化的部分具有相同的碱基序列的部分。本申请的“转化动物”包括上述F0、F1及F1以下的后代。
疾病模型动物
“疾病模型动物”是指具有与人的疾病非常类似的形态的疾病的动物。在研究人的疾病的过程中，疾病模型动物的意义在于人与动物的生理或遗传相似性。在研究疾病的过程中，生物医学疾病模型动物提供对于疾病的各种原因和发病过程及诊断的研究用材料，通过研究疾病模型动物来找出与疾病相关的基因，并可理解基因之间的相互作用，可通过研发的新药候选物质的实际功效及毒性检查获取判断商业化可行性的基础资料。
动物或实验动物
“动物”或“实验动物”是指人乐之外的任意哺乳动物、啮齿动物。上述动物包括胚胎、胎儿、新生儿及成体的所有年龄的动物。在本说明书中使用的动物可从如商业来源获得。这种动物包括实验用动物或其他动物、兔、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠及豚鼠)、牛、羊、猪、羊、马、狗、猫、鸟(例如，鸡、火鸡、鸭、鹅)、灵长类动物(例如，黑猩猩、猴、猕猴)，但并不限定于此。最优选的动物为大鼠。
人工核酸酶(Engineered nuclease)
“人工核酸酶”为可通过与任意基因结合来切断特定核酸位点，如特定脱氧核糖核酸位点来损伤或破坏的人工核酸酶和/或包含其的系统的统称术语。还表示为“靶向(内切)核酸酶(target-specific(endo)nuclease)”或“基因剪刀”。上述人工核酸酶为序列特异性内切核酸酶。除非另有具体说明，否则“序列特异性内切核酸酶”或“序列特异性核酸酶”是指在特定核苷酸序列中，识别多核苷酸，如靶基因并结合，由此催化上述多核苷酸中的单股或双股破损的蛋白质。可特异性识别特定序列来切割核酸，因此，非常有用于基因编辑(Genome editing)技术。例如，具有包含锌指核酸酶(ZFN，zinc finger protein)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN，transcription activator-like effector protein)、CRISPR/Cas系统的核糖核酸引导的内切酶(核糖核酸引导的核酸内切酶，RNA-guidedendonuclease)等。
CRISPR-酶系统
“CRISPR-酶系统”是指包含与细胞中的动物基因组上的靶位点或外切-多核苷酸的靶位点(target site)相互作用来切割靶位点的一部分的蛋白质的复合物。
CRISPR-酶系统可包含引导核酸及CRISPR酶。
敲除(knock-out)
“敲除”是指导致靶基因的功能降低的对基因序列的修饰，优选地，由此无法检测到靶基因的表达或靶基因的表达无意义。在本发明中，F9基因的敲除是指F9基因的功能实质上降低而无法检测到表达或表达仅以无意义的水平存在。敲除转化体可以为具有杂合敲除的F9基因的或纯合敲除的F9基因的转化动物。例如敲除还包括将相应动物暴露在增强靶基因修饰的物质、引入在靶基因部位增强重组的酶、或者能够定向靶基因修饰的条件性敲除等用于出生后靶基因修饰的方法。
靶基因
除非另有具体说明，否则“靶基因”是指编码细胞中的多肽的核酸。除非另有具体说明，否则“靶序列”是指靶基因的一部分，例如，靶基因的一种以上的外显子序列、靶基因的内含子序列或调节序列、或者靶基因的外显子与内含子序列、内含子与调节序列、外显子与调节序列，或者外显子、内含子与调节序列的组合。
培养
“培养”为在适当人工调节的环境条件下培养生物体或生物体的一部分(器官、组织、细胞等)，在此情况下，作为外在条件重要的是温度、湿度、光、气相的组成(二氧化碳或氧的分压)等，此外，对于所培养的生物体具有最重要的直接影响的是培养基(培养箱)，其是生物体的直接环境的同时还是生存或增殖所需的各种营养成分的供应场所。
体外培养
“体外培养”为不同于细胞等在体内生长的状态的方法，是指在实验室的培养箱(incubator)中以与体内的环境相似的条件培养的一系列实验室过程。
细胞、宿主细胞或修饰的细胞
“细胞”、“宿主细胞”、“修饰的细胞”等是指特定对象细胞以及这些细胞的后代或潜在后代。可根据突变或环境影响在后代中产生特定修饰，因此，这些后代实际上与亲代细胞不同，但依然包含在本说明书中使用的术语和范围内。
修饰的或操作的
适用于核酸的术语“修饰的”或“操作的”在本说明书中互换使用，是指向构成基因的核苷酸序列施加人工修饰。上述修饰可包含一个以上的核苷酸的缺失、取代、插入或倒位等。修饰的或操作的核苷酸序列可表现出核酸或其表达生成物的表达和/或功能活性的变化，例如增加、促进、减少或丧失等。
核供体细胞
“核供体细胞”是指向作为核受体的受体卵母细胞递送核的细胞或细胞核。优选地，“卵母细胞”是指已到达第二次减数分裂中期的成熟卵母细胞。在本说明书中，可使用大鼠的体细胞或干细胞作为上述核供体细胞。
体细胞(somatic cell)
“体细胞”为构成多细胞生物的细胞中除生殖细胞之外的细胞，其包括以特定目的分化而不会变成其他细胞的分化细胞和具有分化成具有某些类型不同功能的细胞的能力的细胞。
干细胞(stem cell)
“干细胞”是指可发育成任何组织的细胞。具有两个基本特征，即，首先，通过反复分裂而产生自身的自我更新(self-renewal)，以及可分化成根据环境具有特定功能的细胞的多潜能性。
核移植(nuclear transfer)
“核移植”是指从卵母细胞(oocyte)去除核(nucleus)后，向上述卵母细胞引入从其他细胞获取的供体核(donor nucleus)的技术。更具体地，“核移植”包含通过如下的步骤获取包含与包含供体核的另一动物细胞相同的基因信息的动物的技术：从动物的卵母细胞去除核后，引入从其他动物细胞获取的供体核的步骤；引入了供体核的卵母细胞的重编程(reprogramming)步骤；分化经重编程的卵母细胞的步骤；以及将分化的卵母细胞移植至代孕鼠的步骤。
体细胞核移植(SCNT，somatic cell nuclear transfe；)
“体细胞核移植”是指包含上述供体核的细胞为体细胞的情况的核移植。上述“体细胞核移植”包含如下的技术，即，在包含上述供体核的动物细胞为体细胞的情况下，经过之前提及的步骤，由此获取包含与上述体细胞相同的遗传信息的动物。
可通过将基因操作用物质递送至包含上述供体核的细胞来制备转化动物。例如，可通过将基因操作用物质显微注射(somatic cell microinjection)至体细胞后，通过体细胞核移植制备转化动物。
培养基或培养基组合物
“培养基”或“培养基组合物”是指用于体内或体外细胞生长或增殖等的混合物。该混合物包含糖、氨基酸、各种营养物质、血清、生长因子、无机质等细胞生长及增殖等所必须的元素。
治疗
“治疗”是指用于获取有益或所期望的临床结果的方法。为了本说明书的目的，有益或所期望的临床结果非限制性的包含症状的缓解、疾病范围的减少、疾病状态的稳定化(即，未恶化)、疾病进展的延迟或进展速度的降低、疾病状态的改善或暂时缓解及减轻、疾病是否可检测或疾病是不可检测到的。“治疗”是指治疗性治疗及预防或预防性措施等。上述治疗不仅包含可已被预防的疾病的治疗，还包含已发生疾病所需的治疗。优选地，与不治疗相比，“缓解(palliating)”疾病是指疾病状态的范围和/或不期望的临床症状减少和/或进展的时间进程(time course)延迟或延长。
约
“约”是指对于参照量、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度以30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2或1％左右变化的量、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。
背景知识-血友病及F9因子
血友病
“B型血友病”或克雷司马斯病为F9因子(凝血因子IX，FIX)缺乏所导致的遗传性X-现骨干劣性出血性疾病。B型血友病为与F9因子的量或功能的缺乏相关的疾病。
此时，血友病症状，即，出血的形态具有中枢神经系统外伤或出血(包括腰椎穿刺、硬膜外麻醉等)、腹膜后间隙出血、麻醉拔牙、严重消化道出血、上呼吸道及呼吸道出血、关节腔出血及肌肉出血、浅表血肿、口腔内出血、根尖下出血、鼻出血、轻度血尿、月经过多等。上述关节腔出血是指在膝、肘、踝、肩、髋(髋关节)、腕等的出血。
“自然出血”还称为自发性出血或自然内出血(spontaneous inter nalbleeding)，是指在在日常生活中在没有外伤、特殊因素或预兆的情况下突然发生的出血，B型血友病经常表现出关节和/或肌内自发性出血症状。上述自然内出血可在关节、肌肉、胃肠道、脑、肾脏、鼻及眼中的一个以上区域出现。这种自发性出血诱发并发症，由反复关节出血导致的关节变形、炎症出现为血友病引起的代表症状中的一种。由此，开发用于预防或治疗自发性出血的治疗剂作为B型血友病治疗剂也是非常重要的。
“外出血(external bleeding)”是指肉眼可见的身体外部的出血。即，是指割伤、拔牙、手术部位不能止血等外伤引起的出血。
F9因子
“因子(Factor)9(以下，称为“F9”)”为一种凝血因子，是血栓形成必须的蛋白质。此时，F9因子是指具有凝血因子IX的代表特性特性的任何形态的因子IX分子。F9因子为在内源性凝血途径起到必须作用的血浆中的单链糖蛋白，在内源性凝血途径中，作为F9因子的激活形态的因子IXa(FIXa)与因子VIIIa、磷脂及钙离子相互作用来形成将因子X转换为因子Xa的“酶”复合物。上述F9因子由谷氨酸(Gla)结构域、两个表皮生长因子(EGF)结构域(表皮生长因子-1及表皮生长因子-2)、AP区域及丝氨酸蛋白酶结构域组成。
与野生型F9因子不同，“发生突变的F9因子”可以为由于天然发生或人工修饰(artificially modified or artificially engineered)而具有降低或丧失的蛋白功能的F9因子。
“野生型”是指自然中最普遍的基因或任意指定为正常的等位基因。例如，可以为不表示特定疾病的正常状态的基因形态。
术语“人工修饰的(artificially modified or artificially engineere d)”是指实施人工修饰的状态，而不是以在自然状态下发生的状态存在。例如，实施人工修饰的状态可以为在野生型基因人工引起突变的修饰。以下，非天然的人工修饰的F9基因可与术语“人工F9基因”混合使用。
上述F9因子可以为由如NCBI Accession No.NM_031540表达的F9基因，但并不局限于此。
背景知识-基因的人工操作或修饰手段
基因的人工操作或修饰手段-概述
用于人工操作基因的手段有利用人工核酸酶的技术、利用反义核糖核酸的技术及利用突变基因或蛋白质的技术等。
“人工操作的核酸酶(programmable nuclease)”包含可识别所目的的基因体上的特定位置并切割的所有形态的核酸酶。上述人工核酸酶可在包括原核细胞、和/或人类细胞在内的动植物细胞(例如，正细胞)的基因体中识别特定碱基序列来引起双链断裂(DSB，doubl e strand break)。上述双链断裂可通过切割脱氧核糖核酸的双链来生成平端(blunt end)或粘性末端(cohesive end)。双链断裂可在细胞中通过同源重组(homologousrecombination)或非同源重组(NHEJ，non-homologous end-joining)机制有效修复，在此过程中，人工核酸酶为可引起一种以上的核苷酸的取代、插入及删除等的酶。
例如，引起基因中的人工修饰的人工核酸酶可以为源自作为识别基因体中的特定靶序列的结构域的植物病原性基因的转录激活子样效应因子(transcription activator-like effector)结构域与切割结构域融合的转录激活样效应因子核酸酶(TALEN，transcription activator-like effector nuclease)、锌指核酸酶(zinc-fingernuclease)、兆核酸酶(meganuclease)、CRISPR-酶蛋白或Cpf1蛋白等。
上述人工核酸酶可与基因的整个或一部分的核酸序列形成互补键。
上述人工核酸酶可去除整个基因，或者使F9基因中的一部分核酸序列缺失、取代或从外部插入核苷酸，由此可人工修饰基因。
上述人工核酸酶可与基因中的外显子区域、内含子区域、调节区域、剪接位点、5'末端部分或其相邻区域、3'末端部分或其相邻区域的一部分核酸序列互补结合，由此可人工修饰F9基因。
人工操作的对象
上述“人工操作”的对象可以为靶核酸、基因、染色体或蛋白质。
如一例，上述人工核酸酶可通过操作或修饰基因中的靶序列来调节所表达的蛋白质而量、活性或功能，或者可表达修饰的蛋白质。
例如，上述人工核酸酶可通过操作或修饰基因中的靶序列来抑制、控制、减少、促进或增加蛋白质表达量。
例如，上述人工核酸酶可通过操作或修饰基因中的靶序列来抑制、控制、减少、促进或增加蛋白质表达活性。
例如，上述人工核酸酶可通过操作或修饰基因中的靶序列来去除、降低或提高蛋白质的功能。
上述基因操作技术中的一种以上可在基因的转录和翻译阶段起作用。
例如，上述基因操作技术中的一种以上可通过操作或修饰转录调节的靶序列来促进或控制转录。
例如，上述基因操作技术中的一种以上可通过操作或修饰调节蛋白质表达的靶序列来调节蛋白质表达。
CRISPR-酶系统(引导核酸及编辑蛋白)
作为人工操作基因的手段，可使用CRISPR-酶系统。
上述CRISPR-酶系统由引导核酸和/或编辑蛋白构成。
术语“引导核酸”是指识别靶核酸、基因或染色体且与编辑蛋白相互作用的核苷酸序列。此时，上述引导核酸可与靶核酸、基因或染色体内的一部分核苷酸形成互补键。
上述引导核酸可以为靶脱氧核糖核酸特异性向导核糖核酸、编码上述向导核糖核酸的脱氧核糖核酸或脱氧核糖核酸/核糖核酸混合的形态。
上述引导核酸可以为向导核糖核酸。
“向导核糖核酸”可以为在体外(in vitro)转录的，尤其，可以为从寡核苷酸双链或质粒模板转录的，但并不局限于此。
上述向导核糖核酸的设计及构成是普通技术人员公知的，在韩国公开专利10-2018-00187457详细说明，其全部内容通过引用结合在本申请中。
“编辑蛋白”是指与核酸直接结合或不能直接结合但可相互作用的肽、多肽或蛋白质。对于上述编辑蛋白，在概念上还称为“人工操作的核酸酶”或核糖核酸引导的核酸内切酶(RGEN，RNA-Guided Endonuclease)。
在一具体例中，上述编辑蛋白可以为CRISPR酶。
“CRISPR酶”为CRISPR-酶系统的主要蛋白质组分，是指通过与向导核糖核酸混合或形成复合物来识别靶序列并可切割脱氧核糖核酸的核酸酶。
CRISPR酶是普通技术人员公知的，参照韩国公开专利10-2018-00187457。
在本说明书中使用的上述CRISPR酶除了天然蛋白质之外，还包含所有的与向导核糖核酸合作来作用为激活的内切核酸酶(endonuclea se)或切口酶(nickase)的变异体。在激活的内切核酸酶或切口酶的情况下，可导致靶脱氧核糖核酸切割，可导致基因编辑。并且，在未激活的变异体的情况下，可利用其来进行转录调节或分离所目的的脱氧核糖核酸。
上述分离的Cas蛋白还可以为容易向细胞内引入的形态。作为其例，Cas蛋白可与细胞穿透肽或蛋白转导域(protein transduction domain)相连接。上述蛋白转导域可以为源自精氨酸聚合体或源自人类免疫缺陷病毒(HIV)的反式激活(TAT)蛋白，但并不局限于此。除上述所记述的例之外，在本技术领域公知个只能怪细胞穿透肽或蛋白转导域，因此，普通技术人员可不局限于上述力，并可将各种例适用于本说明书。
锌指核酸酶(zinc-finger nuclease)
“锌指脱氧核糖核酸结合蛋白”(或结合域)为通过锌离子的配位，通过其结构稳定的结合域内的氨基酸序列区域的一种以上的锌指以序列-特异性方式与脱氧核糖核酸结合的蛋白质或更大的蛋白质内的结构域。术语“锌指脱氧核糖核酸结合蛋白”主要由锌指蛋白或锌指蛋白引起。
上述锌指核酸酶包含以与靶基因及切割结构域或切割半结构域的靶部位结合的方式操作的锌指蛋白。上述锌指核酸酶可以为包含锌指脱氧核糖核酸结合域及脱氧核糖核酸切割结构域的人工限制酶。其中，锌指脱氧核糖核酸结合域可以是以所选择的序列相接合的方式操作的。例如，Beerli et al.(2002)Nature Biotechnol.20:135-141；Pabo etal.(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalan et al,(2001)Nature Biotechnol.19:656-660；Segal et al.(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Choo et al.(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416可作为参考资料包含在本说明书。与天然发生的锌指蛋白相比，操作的锌指结合域可具有新型结合特异性。操作方法包括合理设计及各种类型的选择，但并不局限于此。合理设计的一种为包含如三重(或四重)核苷酸序列及个别锌指氨基酸序列的数据库的利用，此时，各个三重或四重核苷酸序列与锌指的一种以上的序列相关联，上述锌指与特定三重或四重序列结合。
在上述锌指核酸酶中，选择靶基因及靶序列、编码融合蛋白或其的多核苷酸的设计及构成是普通技术人员公知的，作为参考资料，在美国专利申请公开2005/0064474及2006/0188987的全文中详细说明，上述公开专利的全部内容通过引用结合在本申请中。并且，如这种参考文献及本领域的其他文献中所公开，锌指结构域和/或多指锌指蛋白可通过包含任意的适当连接序列，如包含5个以上的氨基酸长度的连接的连接序列一同连接。6个以上的氨基酸长度的连接序列的例参照美国授权专利6479626、6903185、7153949。在此说明的蛋白质可包含蛋白质的各个锌指之间的适当的连接的任意组合。
如上述锌指核酸酶的核酸酶包含作为核酸酶激活部分的切割结构域和/或切割半结构域。
如一例，上述切割结构域可以为源自与锌指脱氧核糖核酸结合域不同的核酸酶的切割结构域，即，异源切割结构域。
并且，如另一例，上述切割半结构域可以为为了切割活性需要进行二聚化的源自任意核酸酶或其一部分的融合蛋白。在融合蛋白包含切割半结构域的情况下，通常，切割时需要两个融合蛋白。或者，可利用包含两个切割半结构域的单一蛋白质。
两个切割半结构域可源自相同的内切核酸酶(或其功能片段)，或者各个切割半结构域可源自不同的内切核酸酶(或其功能片段)。并且，在两个融合蛋白的靶部位，通过两个融合蛋白和其各个靶部位的结合，切割半结构域在空间上相向来设置，由此，优选地，需以切割半结构域可通过如二聚化形成功能性切割结构域的关系配置。
转录激活样效应因子核酸酶系统
“转录激活样效应因子核酸酶”是指可识别及切割脱氧核糖核酸的靶区域的核酸酶。上述转录激活样效应因子核酸酶为包含转录激活样效应因子(TALE)结构域及核苷酸切割结构域的融合蛋白。在本说明书中，可与“转录激活样效应因子核酸酶”及“转录激活样效应因子核酸酶”混合使用。转录激活样效应因子以黄单胞菌属(Xanthomonas)细菌感染各种植物种时，通过它们的类型分泌系统分泌的蛋白质而周知。上述蛋白质可与宿主植物中的启动子序列结合来集合帮助细菌感染的植物基因的表达。上述蛋白质通过由34个以下的各种各种数的氨基酸重复组成的中心重复结构域识别植物脱氧核糖核酸序列。
“转录激活样效应因子结构域”或“转录激活样效应因子”为包含一种以上的转录激活样效应因子重复结构域/单位的多肽。该重复结构域与转录激活样效应因子和其同源靶脱氧核糖核酸序列的结合相关。单一“重复单元(还称为“重复部”)”通常为33-35氨基酸颤度，与天然产生的转录激活样效应因子蛋白内的其他转录激活样效应因子重复序列示出至少一部分的序列同源性。上述转录激活样效应因子结构域为通过一种以上的转录激活样效应因子重复模块以序列-特异性方式与核苷酸结合的蛋白结构域。
上述转录激活样效应因子脱氧核糖核酸结合域包含至少一种转录激活样效应因子重复模块，更具体地，包含1种至30种的转录激活样效应因子重复模块，但并不限定于此。在本说明书中，可与“转录激活样效应因子脱氧核糖核酸结合域”、“转录激活样效应因子结构域”或“转录激活样效应因子结构域”混合使用。
上述转录激活样效应因子脱氧核糖核酸结合域可包含转录激活样效应因子重复模块的一半。与上述转录激活样效应因子相关地，国际公开专利WO/2012/093833号或美国公开专利2013-0217131号中公开的全部内容通过引用结合在本说明书中。
兆核酸酶
上述兆核酸酶并不局限于此，可以为天然发生兆核酸酶，它们识别15个～40个碱基对切割位点，这通常分为四个家族：LAGLIDADG家族、GIY-YIG家族、His-Cyst盒家族及HNH家族。例示性兆核酸酶包含I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-SceI、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII及I-TevIII。
上述人工操作的兆核酸酶为进行遗传操作以具有新型结合特异性的兆核酸酶。源自兆核酸酶的天然发生或人工操作的脱氧核糖核酸结合域与源自异源核酸酶(例，FokI)的切割结构域连接来修饰基因中的一种以上的基因，由此可敲减或敲除。
利用核糖核酸干扰(RNAi)
利用“反义核糖核酸”的基因操作技术利用核糖核酸干扰(RNA interference，RNAsilencing)，可在小核糖核酸(small RNA，sRNAs)妨碍或降低信使核糖核酸(mRNA)的情况下破坏而使蛋白质合成信息无法在中间传递。可利用反义核糖核酸控制遗传信息的表达。
例如，可利用反义核糖核酸技术来弱化或破坏基因的表达。
在任意实例中，利用上述反义核糖核酸的基因操作技术可以为小干扰核糖核酸(以下，称为“siRNA”)、短发夹核糖核酸(以下，称为“shRNA”)及微小核糖核酸(以下，称为“miRNA”)中的一种以上。
上述反义核糖核酸可与基因的一部分核酸序列形成互补键，可调节基因蛋白的表达。
例如，可与基因中的外显子区域、内含子区域、调节区域、剪接位点、5'末端部分或其相邻区域、3'末端部分或其相邻区域的一部分核酸序列形成互补键。
此外
此外，为了操作上述基因所表达的因子，而不是直接操作基因，可使用显性负性突变体、核酶、胞内抗体、肽或小分子。
如一例，在细胞内表达上述显性负性突变体，由此可表达不能正常发挥功能的因子。
或者，如另一例，可利用肽或小分子等诱导目标因子无法在细胞内发挥正常功能。
背景知识-基因操作用物质的递送
基因操作用物质的递送–概述
以下，对如上所述的基因地人工操作手段，即，将基因操作用物质递送至基因操作的对象(例如，细胞等)的方法进行详细说明。
基因操作用物质的递送1-载体
基因操作用物质可利用裸核酸载体、非病毒性载体或病毒性载体来递送。
上述载体可以为病毒或非病毒载体(例如，质粒)。
术语“载体”可向细胞递送基因序列。通常，“载体构建体”、“表达载体”及“基因递送载体”是指可指示关注基因的表达且可向靶细胞递送基因序列的任意核酸构建体。
上述载体为引入至细胞内来人工修饰基因的手段，质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体等公知的表达载体，普通技术人员可根据利用脱氧核糖核酸重组技术的任意公知方法制备载体。
“基因递送载体”是指可指示关注基因的表达且向靶细胞递送基因序列的任意核酸构建体。
因此，上述术语不仅包含克隆载体及表达载体，还包含载体的整合。
上述载体可以为重组表达载体。例如，可以为包含基因操作用物质的载体。
用于人工修饰上述基因的重组表达载体可包含启动子(promoter)。上述启动子可利用本技术领域的启动子。
“启动子”为作为调节转录起始及速度的核苷酸序列区域的调节序列。这些启动子可包含与核糖核酸聚合酶及其他调节蛋白质等的转录因子结合来启动核苷酸序列的特异性转录的基因元件。术语“有效配置的”、“有效结合的”、“被调节”及“被转录调节”是指对调节序列的转录起始及表达的核酸序列而言，启动子在正确的作用位置上和/或以正确的取向配置。
例如，上述启动子可以为靶区域中的内源启动子或外源启动子。上述启动子可以为被核糖核酸聚合酶II或核糖核酸聚合酶III识别的启动子。上述启动子可以为组成型启动子、诱导型启动子、对象特异性启动子、病毒启动子或非病毒启动子。
上述启动子可根据控制区域(即，向导核糖核酸、CRISPR酶)利用合适的启动子。例如，用于向导核糖核酸的启动子可以为H1、EF-1a、转运核糖核酸(tRNA)或U6启动子。例如，用于编辑蛋白的启动子可以为CMV、EF-1a、EFS、MSCV、PGK或CAG启动子。
用于人工修饰上述基因的重组表达载体可包含报告(reporter)基因，上述报告基因可包含报告系统。
并且，用于人工修饰上述基因的重组表达载体可包含选择标记，上述选择标记包含如卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因的抗生素抗性基因、如绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白的荧光蛋白等，但并不局限于此。
并且，用于人工修饰上述基因的重组表达载体还可包含用于分离纯化或确认蛋白质的标签序列。作为标签序列的例，有绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST，Glutathione S-transferase)标签、透明质酸(HA)、多聚组氨酸标签(His-tag)、Myc标签(Myc-tag)、T7-标签(T7-tag)等，但本发明的标签序列并不局限于上述例。
并且，用于人工修饰上述基因的重组表达载体包含上述之外的复制起点、增强子、任意必须核糖体结合位点、科扎克共有(kozak consensus)序列、聚腺苷酸化位点、剪接供体及受体位点、转录终止位点、5'侧翼非转录序列、内含肽和/或2A序列等。
基因操作用物质的递送2-病毒递送
上述基因操作技术可利用病毒递送至细胞内。
上述病毒递送(viral delivery)可利用基于核糖核酸的病毒性载体(RNA-basedviral vector)。上述基于核糖核酸的病毒性载体可包含致癌逆转录病毒载体(Oncoretroviral vector)、慢病毒载体(Lentiviral vector)及人类泡沫病毒载体(Humanfoamy viral vector)，但并不局限于此。
上述病毒递送可利用基于脱氧核糖核酸的病毒性载体(DNA-based viralvector)。上述基于脱氧核糖核酸的病毒性载体可包含腺病毒(A denovirus)、腺相关病毒(Adeno-associated virus)、EB病毒(Epste in-Barr virus)、单纯疱疹病毒(Herpessimplex virus)及痘病毒(Po xvirus)，但并不局限于此。
在病毒递送的情况下，具有大尺寸(large size)基因的递送效率佳的优点。
上述基因操作用物质可利用一种以上的载体来递送至对象内。
例如，在上述基因操作用物质为向导核糖核酸及编辑蛋白的情况下，上述编辑蛋白和向导核糖核酸可在互不相同的载体编码来递送。
当上述基因操作用物质利用两种以上的载体来递送至基因组内时，可利用相同种类或不同种类的载体来递送。
例如，向导核酸可利用质粒搬运，同时，编辑蛋白可利用病毒载体递送。
基因操作用物质的递送3-非病毒递送
上述基因操作用物质可利用非病毒递送至细胞内。
上述非病毒递送(non-viral delivery)可利用裸核酸载体。上述裸核酸载体可以为环形核酸载体(circular nucleic acid vector)或线性核酸载体(linear nucleicacid vector)，但并不局限于此。
上述非病毒递送可利用非病毒性载体。上述非病毒性载体可包含人工染色体(artificial chromosome)、脂质体(liposome)、聚合物(polymer)、脂质-聚合物杂化物(lipid-polymer hybrid)、无机纳米粒子(inorganic nanoparticle)及有机纳米粒子(organic nanoparticle)，但并不局限于此。
上述非病毒递送可包含显微注射、基因枪(gene gun)、电穿孔、声穿孔(sonoporation)、光穿孔(photoporation)、磁转染(magneto fection)及水穿孔(hydroporation)，但并不局限于此。
“显微注射”是指将物质注射到生物体的器官、组织、细胞或细胞内的细胞器。上述物质可包含化学物质(chemical compound)、多核苷酸或多肽(polypeptide)。
上述显微注射可包括生殖细胞显微注射(gamete microinjection)、胚胎显微注射(embryo microinjection)及体细胞显微注射等。
上述胚胎显微注射是指向胚胎显微注射包含多核苷酸的物质，包括向胚胎(embryo)显微注射包含多核苷酸的物质后经过分化步骤等来获取转化动物的技术。
上述体细胞显微注射是指向体细胞显微注射包含多核苷酸的物质。向上述体细胞显微注射后，可通过核移植方法获取转化动物。
例如，在上述基因操作用物质为向导核糖核酸及编辑蛋白的情况下，上述向导核糖核酸-编辑蛋白复合物可通过显微注射法递送至细胞内。即，能够以核糖核蛋白的形态递送。上述向导核糖核酸-编辑蛋白复合物是指通过向导核糖核酸和CRISPR酶的相互作用形成的复合物。
现有技术的局限性
在以往，作为B型血友病动物模型，大多将生存周期和繁殖周期短且容易管理、费用较低廉的小鼠(mice)用作疾病模型用动物。另外，利用上述小鼠的动物模型无法发现血友病引起的一部分症状，因此持续研究研发与血友病患者疾病诱发机制及症状相似的动物模型。
尤其，作为现有的B型血友病动物模型，小鼠无法示出B型血友病的代表症状之一的关节、肌肉等组织内自发性出血，因此不不适合用作研发及生产B型血友病等的疾病动物模型。并且，如狗的哺乳动物种与啮齿动物相比，用作动物模型时在繁殖及费用方面受限。
由此，对于更适合用作与人类遗传相似性、繁殖、费用及疾病动物模型的动物模型生产的必要性迅速增加，目前为止，未研发利用大鼠的B型血友病动物模型。
B型血友病大鼠模型
B型血友病大鼠模型-概述
本说明书提供B型血友病大鼠作为B型血友病模型用动物。上述B型血友病大鼠的特征在于，1)包含人工修饰的F9基因，2)由此，具有人工修饰的F9因子，3)可示出出血症状(例如，持续性出血和/或自然出血)。由此，上述B型血友病大鼠具有可成为对于B型血友病的适当动物模型的优点。
B型血友病大鼠模型的特征1-包含人工修饰的F9基因
本申请中公开的一实施方式涉及已发生基因组中的人工修饰的B型血友病大鼠。已发生上述基因组中的人工修饰的B型血友病大鼠包含将F9基因中的一部分或全部人工操作和/或修饰的F9基因。
如一实例，上述B型血友病大鼠模型的F9因子的表达或功能被下调或完全丧失。具体地，F9基因可被敲减或敲除，但并不局限于此。
以下，“包含人工修饰的F9因子或编码其的核酸的大鼠”可与“人工修饰的大鼠”混合使用。以下，对“人工修饰的F9基因”进行详细说明。
人工修饰的F9基因1-F9基因的修饰方式
在一实例中，上述人工修饰的F9基因在外显子、内含子、调控区、5'末端或其相邻位点、3'末端或其相邻位点或者剪接位点等包含人工修饰。
如一例，上述人工修饰的F9基因可在第一外显子区域或第二外显子区域中的一区域包含一种以上的人工修饰。
如另一例，上述人工修饰的F9基因可在调节区域(增强子、启动子、3'UTR和/或多腺苷酸化信号的非编码序列)中的一区域包含一种以上的人工修饰。
如另一例，上述人工修饰的F9基因可在5'末端或其相邻位点、或者3'末端或其相邻位点中的一区域包含一种以上的人工修饰。
如另一例，上述人工修饰的F9基因可在剪接位点的一区域包含一种以上的人工修饰。
上述F9基因的修饰的一区域(“靶部位”)可以为上述基因中的约1bp、约2bp、约3bp、约4bp、约5bp、约6bp、约7bp、约8bp、约9bp、约10bp、约11bp、约12bp、约13bp、约14bp、约15bp、约16bp、约17bp、约18bp、约19bp、约20bp、约21bp、约22bp、约23bp、约24bp、约25bp、约26bp、约27bp、约28bp、约29bp、约30bp、约40bp或约50bp的连续的碱基序列位点。上述F9基因的靶位点可以为上述基因中的具有选自上一句的两个数值范围内的长度的连续的碱基序列位点。上述F9基因的靶位点可以为上述基因中的具有选自上一句的一个数值以上的长度的连续的碱基序列位点。
上述F9基因核酸序列修饰包含一种以上的核苷酸的附加、缺失或被基因组取代，但并不限定于此。
可包含F9基因中的核酸序列的一种以上的核苷酸的插入、F9基因中的核酸序列的一种以上的核苷酸的缺失、F9基因中的核酸序列的一种以上的核苷酸的取代、F9基因中的核酸序列或该部分的敲除、F9基因中的核酸序列或该部分的敲减等。
例如，上述F9基因的修饰可通过以下中的一种以上来诱导：1)F9基因的全部缺失或一部分缺失，例如，F9基因的1bp以上的核苷酸，例如，1个至50个、1个至30个、1个至27个、1个至25个、1个至23个、1个至20个、1个至15个、1个至10个、1个至5个、1个至3个或1个核苷酸的缺失；2)F9基因的1bp以上的核苷酸，例如，1个至30个、1个至27个、1个至25个、1个至23个、1个至20个、1个至15个、1个至10个、1个至5个、1个至3个或1个核苷酸的取代；以及3)将来自外源基因的一个以上的核苷酸，例如，1个至30个、1个至27个、1个至25个、1个至23个、1个至20个、1个至15个、1个至10个、1个至5个、1个至3个或1个核苷酸(各自独立地，选自A、T、C及G中)插入至任意位置。
变更上述外显子(Exon)或内含子(introno)内的一种以上的核酸序列的结果，可将上述F9基因的转录量减少或丧失、上述F9因子表达的减少或丧失或者上述F9因子的功能和/或活性降低甚至失活。
变更上述调控区、剪接位点、5'末端或其相邻位点、3'末端内的一种以上的核酸序列的结果，可将上述F9基因的转录量减少或丧失、上述F9因子表达的减少或丧失或者F9因子的功能和/或活性降低甚至失活。
如另一实例，在基因组中发生上述人工修饰的B型血友病大鼠中，F9基因可被完全去除。即，可包含通过人工操作或修饰去除整个F9基因的修饰。
如一实例，在上述F9基因中，两末端的一部分核酸序列和/或两末端的相邻位点可同时切割或依次切割和/或同时去除或依次去除。如另一实例，上述F9基因可全部去除。
人工修饰的F9基因2-人工修饰的F9因子
上述基因组中的人工修饰可诱发F9因子的突变。即，B型血友病大鼠可包含人工修饰的F9因子。
在一实例中，上述人工修饰的F9因子可以为变更一种以上的氨基酸序列的F9因子。
上述F9因子中的一种以上的氨基酸可变更为具有相似性质的氨基酸。
例如，上述F9多肽中的疏水性氨基酸可变更为其他疏水性氨基酸。疏水性氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸或精氨酸或组氨酸中的一种。
如另一例，上述F9多肽中的酸性氨基酸可变更为其他酸性氨基酸。酸性氨基酸为谷氨酸或天冬氨酸中的一种。
如另一例，上述F9多肽中的极性氨基酸可变更为其他极性氨基酸。极性氨基酸为丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺中的一种。
上述F9因子中的一种以上的氨基酸可变更为具有不同性质的氨基酸。
例如，上述F9多肽中的疏水性氨基酸可变更为作为极性氨基酸的丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺及谷氨酰胺中的一种氨基酸。
如另一例，上述F9多肽中的疏水性氨基酸可变更为作为酸性氨基酸的谷氨酸或天冬氨酸中的一种氨基酸。
如另一例，上述F9多肽中的疏水性氨基酸可变更为作为碱性氨基酸的精氨酸及组氨酸中的一种氨基酸。
如另一例，上述F9多肽中的极性氨基酸可变更为作为疏水性氨基酸的甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸及色氨酸中的一种以上的氨基酸。
如另一例，上述F9多肽中的酸性氨基酸可变更为作为碱性氨基酸的精氨酸或组氨酸。
如另一例，上述F9多肽中的碱性氨基酸可变更为作为酸性氨基酸的谷氨酸或天冬氨酸。
例如，可通过上述氨基酸的变更和/或取代调节蛋白质表达量。
或者，上述氨基酸的变更和/或取代可影响蛋白质的结构、功能。
因此，如一实例，通过上述F9因子的人工修饰，上述B型血友病大鼠可包含完全不表达或表达被抑制和/或表达量减少的F9因子。如另一实例，上述B型血友病大鼠可包含功能减低或丧失的F9因子。
B型血友病大鼠模型的特征2-发生出血症状
上述人工修饰的大鼠可示出出血症状(持续性出血、自然出血)。如一实例，上述人工修饰的大鼠可诱发自然出血和/或外出血。在任一实例中，上述人工修饰的大鼠包含组织中的自然出血。
在另一实例中，上述人工修饰的大鼠包含由上述组织中的自然出血引起的炎症；和/或由上述组织中的自然出血引起的肿胀，例如，上述组织可以为关节、肌肉及眼。
尤其，上述人工修饰的大鼠可示出在小鼠中不示出的自然出血。
B型血友病大鼠模型的优点1-大鼠本身的优点
大鼠与人类具有遗传相似性，具有作为小鼠的动物模型的所有优点。例如，在营养和代谢生理方面，大鼠与其他种类的动物相比于人类更相似，肌肉和器官等的重量比与人相似，在内分泌、生殖等的方面性周期的判断便于小鼠且更加有规律，在月经周期方面也与人相似。并且，与小鼠相比，上述大鼠的生长期短、繁殖能力几乎相似，体型更大，因此，更加容易进行外科手术操作。并且，当摘取试样时，上述大鼠可摘取更多的量，与小鼠相比，在哺乳动物中示出的疾病的症状与人类更加相似，因此为具有可靠性的疾病动物模型。
B型血友病大鼠模型的优点2-作为B型血友病模型的优点
各种出血症状(例如，自然出血症状)为B型血友病的代表症状之一。尤其，当在膝关节等发生自然出血时，具有发生关节炎等的问题，因此治疗剂研发需求急速增加。在研发治疗剂的过程中，必须使用对于相应疾病适当的动物模型。但是，作为以往通常使用的B型血友病动物模型的小鼠模型不示出上述各种出血症状，因此无法成为有效的动物模型。并且，如狗的哺乳动物具有可制备与人类更相似的模型动物的优点，但不易繁殖，实验费用多，因此具有难以用作动物模型的问题。本说明书中提供的上述B型血友病大鼠模型具有如下的优点：1)具有发生B型血友病的代表性症状的各种出血症状(例如，自然出血)的特征，适合用作B型血友病的动物模型；2)由于容易繁殖、费用少等上述大鼠本身的优点，可用作有效的动物模型。因此，上述B型血友病大鼠模型为克服现有的小鼠模型的局限的动物模型，不仅适合用于研发及生产治疗剂，还是对于毒性及稳定性的评价也佳的动物模型。
大鼠种类-例示
大鼠属于鼠科(muridae)、大鼠属(Rattus)，区别于小鼠属(Mus)的小鼠。这种大鼠有威斯塔鼠(wistar rat)、长埃文斯鼠(long-Evans rat)、斯普拉-道来氏大鼠(SpragueDawley rat)、zucker大鼠(Zucker rat)、BB大鼠(Biobreeding rat)、brattleboro rat、无毛鼠(Hairless rat)等。
本说明书公开的大鼠可使用普通技术人员适当选择来使用的公知的任意种类。
包含人工修饰的F9基因的细胞
包含人工修饰的F9基因的细胞-概述
本申请中公开的一实施方式涉及包含人工修饰的F9因子和/或编码其的基因的细胞。上述细胞可用于制备上述B型血友病大鼠模型。上述细胞可根据目的独立于上述B型血友病大鼠模型来单独使用。
对象细胞-例示
上述细胞可以为转化的干细胞、胚胎细胞或体细胞。
在任意具体例中，例如，上述细胞有卵丘细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、角质细胞、造血细胞、黑色素细胞、软骨细胞、巨噬细胞、单核细胞、肌肉细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、源自胚胎的细胞、胎盘细胞及胚胎细胞等。并且，可使用源自各种来源组织的成体干细胞，如脂肪、子宫、骨髓、肌肉、胎盘、脐带血或皮肤(上皮)等的源自组织的干细胞。非人宿主胚胎通常可以为包含2-细胞阶段、4-细胞阶段、4-细胞阶段、8-细胞阶段、16-细胞阶段、32-细胞阶段、64-细胞阶段、桑椹胚或胚泡的胚胎。
在另一任意具体例中，上述细胞可以为肝(hepatocyte)细胞。
上述胚胎细胞、体细胞或干细胞可通过如下的方法获取：使用本领域公知的常规方法，制备外科用标本或活检用标本。
转化细胞
“转化细胞”可以为细胞内基因组中包含转化的部分的体细胞或胚胎细胞。以下，转化的体细胞或胚胎细胞可与术语“转化细胞”混合使用。上述转化细胞包含从包含转化的部分的第一细胞分裂而获取的第二细胞。此时，分裂而获取的第二细胞包含具有与第一细胞的转化的部分相同的碱基序列的部分。
上述转化细胞包含人工修饰的F9基因。人工修饰的F9基因如上所述。
如一实例，上述转化细胞可包含在F9基因中的一个以上的区域发生核苷酸的插入、缺失或取代的基因。
如另一实施例，上述F9基因可以为敲减和/或敲除的细胞。
上述转化细胞可以为F9因子完全没有或表达量减少的细胞。
上述转化细胞可以为F9因子的功能丧失或降低的细胞。
上述转化细胞可以为F9因子缺乏的细胞。
包含基因操作用物质
上述转化细胞可包含靶向F9因子的基因操作用物质，即，人工核酸酶、反义核糖核酸、显性负性突变体F9或核酶等。
例如，上述转化细胞包含CRISPR-Cas系统、锌指核酸酶、转录激活样效应因子核酸酶或兆核酸酶，或者包含编码其的核酸。
或者，例如，上述转化细胞包含(siRNA，small interfering RNA)、短发夹核糖核酸或微小核糖核酸，或者包含编码其的核酸。
或者，例如，上述转化细胞包含靶向F9因子的显性负性突变体F9或对于编码F9因子的核酸的核酶，或者包含编码其的核酸。
上述基因操作用物质以各种形态包含在细胞中。例如，可以为包含编码基因操作用物质的核酸的载体的形态。
可形成细胞集落
上述转化细胞可形成细胞集落。上述细胞集落可以为从单个细胞培养的单个细胞。
此时，上述细胞集落可以为仅由F9因子均被敲减或敲除的细胞形成的集落。
或者，细胞集落可以为包含细胞的嵌合(chimeric)细胞集落，上述细胞包含未被敲减或敲除的正常F9因子。
用于制备B型血友病大鼠模型的F9基因操作用组合物
用于制备B型血友病大鼠模型的F9基因操作用组合物-概述
本说明书提供F9基因操作用组合物。本申请公开的内容的一实施方式涉及用于人工操作或修饰F9基因的组合物。
用于制备B型血友病大鼠模型的组合物-例示
用于操作或修饰上述F9基因的组合物可包含上述人工核酸酶或编码其的核酸。例如，人工核酸酶可以为转录激活样效应因子核酸酶、锌指核酸酶、兆核酸酶或CRISPR-酶系统中的一种以上。
上述F9基因操作用组合物可包含可与F9基因中的一部分核酸序列形成互补键的反义核糖核酸，例如，小干扰核糖核酸或短发夹核糖核酸等。
用于操作或修饰上述F9因子或编码其的基因的组合物可包含显性负性突变体F9因子或核酶等。
或者，在本申请中公开的内筒的另一实例中，上述组合物可包含抑制或降低F9蛋白功能的显性负性突变体、胞内抗体、肽及小分子中的一种以上。
上述组合物可混合包含一种以上的向导核糖核酸及Cas9酶或其复合物、反义核糖核酸及显性负性突变体F9因子中的一种以上。
上述组合物能够以表达盒形态提供。
包含CRISPR-Cas系统的组合物1-概述
本申请公开的内容的一实例涉及F9基因操作用组合物，为包含CRISPR-Cas系统的组合物。
在通过本申请公开的一具体例中，上述组合物可包含：向导核糖核酸或编码其的脱氧核糖核酸；以及编辑蛋白或编码其的脱氧核糖核酸，上述编辑蛋白为CRISPR酶，对其的说明与在上文中说明的内容相同。
在一实例中，上述CRISPR酶可以为源自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9蛋白。
在一实例中，上述向导核糖核酸与F9基因中的靶序列具有同源性或形成互补键。
若上述向导核糖核酸-编辑蛋白复合物与F9基因或F9基因的核苷酸序列结合，则可通过上述向导核糖核酸-编辑蛋白复合物的编辑蛋白切割或修饰F9基因或其核苷酸序列。
包含CRISPR-Cas系统的组合物2-向导核糖核酸的靶序列
上述包含CRISPR Cas系统的组合物包含向导核糖核酸。上述向导核糖核酸与靶序列具有同源性，或者包含可与上述靶序列互补的序列。以下，对靶序列进行详细说明。
“靶序列”为存在于靶基因或靶核酸中的核苷酸序列，具体地，为靶基因或靶核酸中的靶区域的一部分核苷酸序列，此时，“靶区域”为可被靶基因或靶核酸中的向导核酸-编辑蛋白修饰的位点。
以下，术语“靶序列”是指两种核苷酸序列信息。例如，在靶基因的情况下，靶序列可意味着靶基因脱氧核糖核酸的转录链(transcribed strand)的序列信息，还可意味着非转录链(non-transcribed strand)的核苷酸序列信息。
如一实例，上述靶基因可以为F9基因。
在任一实例中，上述F9基因中的靶序列可以为位于F9基因中的外显子区域的连续的10个至35个核苷酸的序列。
此时，上述靶序列可以为10个至35个核苷酸的序列、15个至35个核苷酸的序列、20个至35个核苷酸的序列或30个至35个核苷酸的序列。
或者，上述靶序列可以为10个至15个核苷酸的序列、15个至20个核苷酸的序列、20个至25个核苷酸的序列、25个至30个核苷酸的序列或30个至35个核苷酸的序列。
上述F9基因中的靶序列可以为位于F9基因中的启动子区域的连续的10个至35个核苷酸的序列。
此时，上述靶序列可以为10个至35个核苷酸的序列、15个至35个核苷酸的序列、20个至35个核苷酸的序列或30个至35个核苷酸的序列。
或者，上述靶序列可以为10个至15个核苷酸的序列、15个至20个核苷酸的序列、20个至25个核苷酸的序列、25个至30个核苷酸的序列或30个至35个核苷酸的序列。
上述F9基因中的靶序列可以为位于F9基因中的内含子区域的连续的10个至35个核苷酸的序列。
此时，上述靶序列可以为10个至35个核苷酸的序列、15个至35个核苷酸的序列、20个至35个核苷酸的序列或30个至35个核苷酸的序列。
或者，上述靶序列可以为10个至15个核苷酸的序列、15个至20个核苷酸的序列、20个至25个核苷酸的序列、25个至30个甘酸序列或30个至35个核苷酸的序列。
上述F9基因中的靶序列可以为位于F9基因中的增强子(enhancer)区域的连续的10个至35个核苷酸的序列。
此时，上述靶序列可以为10个至35个核苷酸的序列、15个至35个核苷酸的序列、20个至35个核苷酸的序列或30个至35个核苷酸的序列。
或者，上述靶序列可以为10个至15个核苷酸的序列、15个至20个核苷酸的序列、20个至25个核苷酸的序列、25个至30个核苷酸的序列或30个至35个核苷酸的序列。
上述F9基因中的靶序列可以为位于F9基因中的启动子、增强子、3'UTR、聚腺苷酸(polyA)或其混合部分的连续的10个至35个核苷酸的序列。
此时，上述靶序列可以为10个至35个核苷酸的序列、15个至35个核苷酸的序列、20个至35个核苷酸的序列、25个至35个核苷酸的序列或30个至35个核苷酸的序列。
或者，上述靶序列可以为10个至15个核苷酸的序列、15个至20个核苷酸的序列、20个至25个核苷酸的序列、25个至30个核苷酸的序列或30个至35个核苷酸的序列。
上述F9基因中的靶序列可以为位于F9基因中的外显子、内含子或其混合部分的连续的10个至35个核苷酸的序列。
此时，上述靶序列可以为10个至35个核苷酸的序列、15个至35个核苷酸的序列、20个至35个核苷酸的序列、25个至35个核苷酸的序列或30个至35个核苷酸的序列。
或者，上述靶序列可以为10个至15个核苷酸的序列、15个至20个核苷酸的序列、20个至25个核苷酸的序列、25个至30个核苷酸的序列或30个至35个核苷酸的序列。
上述F9基因中的靶序列可以为包含F9基因中的突变部分(例如，与野生型基因不同的部分)或接近F9基因中的突变部分的连续的10个至35个核苷酸的序列。
上述“突变(mutation)”是指在基因所具有的脱氧核糖核酸的碱基序列发生变化，包括在基因所具有的脱氧核糖核酸的碱基序列中的一种以上的核苷酸被删除、插入或取代而修饰的所有。此时，将基因中发生突变的序列称为“突变序列(mutation sequence)”。并且，突变包含由于基因内突变而基因所编码的蛋白质的一部分氨基酸被删除、插入或取代而修饰的所有。
此时，上述一种以上的突变可以为自然诱发的突变。
此时，上述一种以上的突变可以为不影响对象蛋白质表达的同义突变(synonymous mutation)。
例如，在上述对象为单核苷酸多态性依赖基因的情况下，一种以上的突变可以为不影响对于特定疾病(癌症、糖尿病、高血压等)的药物反应性、副作用或对于药物的耐性的突变。
此时，上述靶序列可以为10个至35个核苷酸的序列、15个至35个核苷酸的序列、20个至35个核苷酸的序列、25个至35个核苷酸的序列或30个至35个核苷酸的序列。
或者，上述靶序列可以为10个至15个核苷酸的序列、15个至20个核苷酸的序列、20个至25个核苷酸的序列、25个至30个核苷酸的序列或30个至35个核苷酸的序列。
优选地，本说明书中公开的靶序列可以为位于F9基因中的外显子区域或外显子、内含子或其混合部分的连续的10个至35个核苷酸的序列。
此时，上述靶序列可以为10个至35个核苷酸的序列、15个至35个核苷酸的序列、20个至35个核苷酸的序列、25个至35个核苷酸的序列或30个至35个核苷酸的序列。
或者，上述靶序列可以为10个至15个核苷酸的序列、15个至20个核苷酸的序列、20个至25个核苷酸的序列、25个至30个核苷酸的序列或30个至35个核苷酸的序列。
上述F9基因中的靶序列可以为与F9基因的核酸序列中的原间隔基序(PAM，proto-spacer-adjacent Motif)序列的5'末端和/或3'末端相邻的10个至35个核苷酸的序列。
此时，上述原间隔基序序列可以为如下述序列中的一种以上(以5'到3'方向记载)：NG(N为A、T、C或G)；NGG(N为A、T、C或G)；NNNNRYAC(N各自独立地为A、T、C或G，R为A或G，Y为C或T)；NNAGAAW(N为各自独立地为A、T、C或G，W为A或T)；NNNNGATT(N各自独立地为A、T、C或G)；NNGRR(T)(N各自独立地为A、T、C或G，R为A或G)；以及TTN(N为A、T、C或G)。
如一实例，上述原间隔基序序列可以为NGG(N为A、T、C或G)。
如一实例，上述靶序列可以为选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6组成的组中的一种以上的序列。如一实例，上述向导核糖核酸可包含与选自由上述SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:6组成的组中的一种以上的靶序列具有同源性或可与其互补结合的序列。
包含CRISPR-Cas系统的组合物3-向导核糖核酸全序列
上述向导核糖核酸不仅包含与如上所述的靶序列具有同源性的序列或与其互补结合的序列，还包含与Cas9蛋白形成复合物的序列部分。上述序列部分可根据Cas9蛋白的来源不同。如一实例，在上述CRISP R-Cas系统包含源自酿脓链球菌的Cas9蛋白作为编辑蛋白的情况下，上述向导核糖核酸可包含靶序列及表示为5'-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3'(SEQ ID NO:27)的序列部分。如一实例，在上述CRISPR-Cas系统包含源自空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)的Cas9蛋白作为编辑蛋白的情况下，上述向导核糖核酸可包含靶序列及表示为5'-GUUUUAGUCCCUGAAAAGGGACUAAAAUAAAGAGUUUGCGGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU-3'(SEQID NO:28)的序列部分。如一实例，上述向导核糖核酸可包含选自由SEQ ID NO:21至SEQ IDNO:26组成的组中的序列。
包含CRISPR-Cas系统的组合物4-编辑蛋白
上述包含CRISPR-Cas系统的组合物包含编辑蛋白。编辑蛋白的功能的说明如前所述。如一实例，上述编辑蛋白可以为选自由源自酿脓链球菌的Cas9蛋白、源自空肠弯曲菌的Cas9蛋白、源自嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的Cas9蛋白、源自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的Cas9蛋白、源自脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)的Cas9蛋白及Cpf1蛋白组成的组中的一种以上。如优选实例，上述编辑蛋白可以为源自酿脓链球菌的Cas9蛋白。
包含CRISPR-Cas系统的组合物6-引导核酸-编辑蛋白复合物
与引导核酸及编辑蛋白有关的说明如前所述。
与上述F9基因形成互补键的引导核酸和编辑蛋白可形成引导核酸-编辑蛋白复合物。
上述引导核酸-编辑蛋白复合物可在细胞外形成。
上述引导核酸-编辑蛋白复合物可在细胞内的细胞质形成。
上述引导核酸-编辑蛋白复合物可在细胞内的细胞核中形成。
在上述引导核酸-编辑蛋白复合物中，编辑蛋白可识别存在于F9基因或核酸序列中的原间隔基序。
在上述引导核酸-编辑蛋白复合物中，引导核酸可与F9基因或核酸序列互不结合。
若上述引导核酸-编辑蛋白复合物与F9基因或核酸序列结合，则可通过上述引导核酸-编辑蛋白复合物的编辑蛋白切割或修饰F9基因或核酸序列。
包含CRISPR-Cas系统的组合物5-CRISPR-Cas系统的形态
上述CRISPR-Cas系统能够以病毒载体、非病毒载体或非载体形态包含在组合物。
在一实施例中，上述CRISPR-Cas系统能够以向导核糖核酸及CRISPR酶形成复合物(complex)的核糖核蛋白形态存在。
在另一实施例中，上述CRISPR-Cas系统能够以核酸的形态包含在载体。
上述载体可以为病毒载体或非病毒载体。
上述CRISPR-Cas系统可包含在一个载体。
上述CRISPR-Cas系统可包含在两个以上的载体。此时，上述两个载体可以为相同种类的载体，还可以为不同种类的载体。
包含人工修饰的F9基因的大鼠细胞制备方法
包含人工修饰的F9基因的大鼠细胞制备方法-概述
本申请的一实施方式涉及包含F9基因中的人工修饰的大鼠细胞的制备方法。如一实例，上述制备方法还包括将F9基因操作用组合物与大鼠细胞接触的步骤。进而，上述制备方法还可包括：培养转化细胞的步骤；和/或筛选上述转化细胞的步骤。
使F9基因操作用组合物接触的步骤
上述制备方法包括人工修饰大鼠细胞的F9基因的步骤作为重要的构成要素。此时，可利用如上所述的F9基因操作用组合物。如一实例，上述制备方法可包括使F9基因操作用组合物与上述大鼠细胞接触的步骤。如一实例，上述大鼠细胞可以为体细胞、胚胎细胞或胚胎干细胞。如一实例，上述接触可通过选自电穿孔法、脂质体、质粒、病毒载体、纳米颗粒及蛋白转导域融合蛋白方法中的一种以上的方法执行。如一实例，上述接触可在体外(invitro)执行。
培养转化细胞
利用上述基因操作技术转化的细胞可形成集落。包含转化细胞的细胞集落如前所述。
转化为用于人工修饰上述F9基因的的重组表达载体的源自大鼠的细胞可根据本领域公知的方法增殖及培养。
适当的培养基可使用为了动物细胞及尤其，啮齿动物细胞的培养而研发或可与动物细胞生长说所需的适当成分，如同化碳、氮和/或微量营养素一同在实验室内制备的任意可利用的培养基。
上述培养基为适合动物细胞生长的任意的基本培养基，作为非限制性例，通常用于培养的基本培养基有最小必需培养基(MEM，Minimal Essential Medium)、达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM，Dulbecco modified Eagle Medium)、无血清细胞冻存培养基(RPMI，Roswell Park Memorial Institute Medium)、无血清角质形成细胞培养基(K-SFM，Keratinocyte Serum Free Medium)，除此之外，只要是本领域中利用的培养基就可无限制地使用。优选地，可选自由α-最小必需培养基(α-MEM)(GIBCO)、无血清角质形成细胞培养基、达尔伯克改良伊格尔培养基(Welgene)、MCDB 131培养基(Welgene)、IMEM培养基(GIBCO)、达尔伯克改良伊格尔/F12培养基、PCM培养基、M199/F12(混合物(mixture))(GIBCO)及MSC扩增培养基(Chemicon)组成的组中。
可向这种基本培养基添加碳、氮及微量营养素的同化供给源，作为非限制性例，可添加血清供给源、生长因子、氨基酸、抗生素、维生素、冷冻剂和/或糖供给源。
可选择或组合适当的培养基来以公知的方法适当培养，这对本技术领域的普通技术人员而言是显而易见的。并且，可基于本技术领域的常规技术，在调节适当的培养环境、时间、温度等的条件来培养，这是显而易见的。
筛选转化细胞
本申请的另一实施方式可包括筛选包含F9靶基因操作技术的转化细胞的步骤。
此时，上述转化细胞可利用抗生素抗性基因、抗原-抗体反应、荧光蛋白及表面标记基因中的一种以上来从集落筛选转化细胞。
例如，F9靶基因操作技术，即，如包含向导核糖核酸及Cas9蛋白的细胞可测定荧光信号(fluorescence signal)。因此，可区别于未包含上述基因操作技术的细胞。
B型血友病大鼠模型制备方法
B型血友病大鼠模型制备方法-概述
本说明书中提供B型血友病大鼠模型的制备方法。如一实施例，上述制备方法可以为利用CRISPR/Cas系统的F9基因操作大鼠制备方法。如另一实施例，上述制备方法可以为利用胚胎细胞移植的F9基因操作大鼠制备方法。如另一实施例，上述制备方法可以为利用核供体细胞的F9基因操作大鼠制备方法。
利用胚胎细胞移植的F9基因操作大鼠制备方法
本说明书中公开的一实施方式涉及利用移植胚胎细胞的方法的F9基因操作大鼠生产方法。
上述方法可包括：步骤(a)，将从大鼠的组织分离的胚胎细胞与上述F9基因操作用组合物接触；步骤(b)，将胚胎移植到代孕鼠身体中；以及步骤(d)，代孕鼠人参包含人工修饰的F9基因的大鼠。
可参照本领域公知的现有的胚胎移植方法来理解与各个步骤有关的常规技术内容。
并且，与上述F9基因操作用组合物接触的步骤可利用本领域公知的常规方法。
例如，通过电穿孔法或显微注射法等的公知方法使包含在细胞外(in vitro)形成的向导核糖核酸-Cas9复合物的上述F9基因操作用组合物与胚胎细胞接触。
如另一例，上述F9基因操作用组合物可利用一种以上的载体引入至细胞内，还可在细胞内形成复合物来与F9基因的靶序列结合。
利用核供体细胞的F9基因操作大鼠制备方法
本说明书中公开的一实施方式涉及通过如下步骤产生作为B型血友病模型的、F9基因已被敲除的转化大鼠：将来自已引入重组载体的核供体细胞的核移植到去核卵母细胞；生产大鼠后代。该实施方案还涉及通过该方法产生的B型血友病模型用大鼠。
在任意具体例中，利用人工敲除上述F9基因的转化细胞株通过体细胞核移植法生产B型血友病大鼠。
上述B型血友病大鼠生产方法可包括：步骤(a)，培养从大鼠的组织分离的体细胞或干细胞，由此制备核供体细胞；步骤(b)，使上述F9基因操作用组合物与上述核供体细胞接触；步骤(c)，去除大鼠的卵母细胞来制备去核卵母细胞；步骤(d)，向上述步骤(c)的去核卵母细胞显微注射步骤(b)的核供体细胞并使它们融合；步骤(e)，激活在上述步骤(d)中融合的卵母细胞；以及步骤(f)，向代孕鼠的输卵管中移植上述激活的卵母细胞。
可参照在本领域公知的现有的利用体细胞核移植技术的克隆动物的制备方法等理解与各个步骤有关的常规技术内容。
用于研究和/或治疗B型血友病的动物模型
本说明书中提供利用以往没有的新型B型血友病大鼠的用于研究和/或治疗B型血友病的动物模型。
上述B型血友病大鼠可用于弄清B型血友病的原因和/或机制、探索对于疾病的症状、治疗物质等。
上述B型血友病动物大鼠模型示出与人类B型血友病患者相似的病理机制，可有用地用于研究人B型血友病治疗。
如本申请的一实例，可利用以往没有的新型B型血友病大鼠的用于筛选B型血友病治疗用药物的动物模型。或者，更具体地，可提供用于筛选B型血友病自然出血预防或治疗用动物模型。
在本申请的大鼠模型中，可通过人工修饰上述F9基因来使F9蛋白表达减少或丧失，和/或使F9蛋白功能降低或丧失，由此，可在膝关节、肌肉、眼等发生自然出血，由于自然出血在关节、肌肉、眼等发生肿胀或炎症。
因此，上述B型血友病大鼠模型可非常有用地用作用于筛选B型血友病治疗剂，即，药物的动物模型。即，上述B型血友病大鼠模型不仅可确认是否诱发B型血友病，还可通过给药目前正在研发中的治疗剂来弄清B型血友病疾病的机制、探索治疗剂、研发诊断法等。
在一实例中，对于B型血友病的药物诗选方法可包括：步骤(a)，向B型血友病大鼠模型给药用于减轻、预防或治疗B型血友病的候选物质；以及步骤(b)，给药候选物质后，与未给药候选物质的对照组比较并分析。
候选物质优选为选自由肽、蛋白质、非肽化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取液、植物提取液及动物组织提取液等组成的组中的一种以上，但并不限定于此。
上述化合物可以为新型化合物或已公知的化合物。此时，上述化合物可形成盐。
在上述步骤(b)中，当向B型血友病大鼠给药候选物质时，可通过如注射(injection)、输血(transfusion)、插入(implantation)或移植(transplantation)的任意便利的方式执行。给药途径可选自皮下(subcutaneously)、皮内(intradermaliy)、肿瘤内(intratumorally)、结节内(intranodally)、骨髓内(intramedullary)、肌内(intramuscularly)、静脉内(intravenous)、淋巴液内(intralymphatic)、腹膜内(intraperitoneally)等，但并不局限于此，可根据适当的剂量、给药方法或候选物质的特性向大鼠内给药候选物质。
本发明实施方式
这些实施例仅用于更具体地说明本发明，本发明的范围并不局限于这些实施例，这对本发明所属技术领域的普通技术人员而言是显而易见的。
1.g核糖核酸设计
利用CRISPR核糖核酸引导的核酸内切酶工具(http://www.rgenome.net；Park etal,Bioinformatics 31:4014-4016,2015)来设计与大鼠F9基因(ENSRNOG00000003430.7)的外显子1(Exon1)和外显子2(Exon2)相对应的6个考虑“NGG”原间隔基序的向导核糖核酸。所设计的向导核糖核酸使用在大鼠基因体上除目标(On-target)位点之外没有1碱基错配(1base)或2碱基错配(2base mismatch)。
表1
大鼠F9基因敲除用向导核糖核酸的靶脱氧核糖核酸序列
用于在胚胎库(embryo pool)确认通过上述6个向导核糖核酸产生的缺失(indel)的深度测序引物(deep-squencing primer)如下。
表2
用于确认向导核糖核酸的靶向编辑(on-target editing)的深度测序引物
F：正向引物(forward primer)，R：反向引物(reverse primer)
2.向导核糖核酸的构建及合成
为了借助核糖核蛋白的递送系统，小向导核糖核酸通过Phusion介导聚合而生成的两个部分(正向引物：GAAATTAATACGACTCACTATAGCGTCCAAAGAGATATAACTCAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC，反向引物：AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC)寡核苷酸的退火生成模板后，通过T7核糖核酸聚合酶转录。转录的小向导核糖核酸利用分光分析(spectrometry)纯化及定量。
合成的小向导核糖核酸的序列如下。
表3
大鼠F9基因敲除用向导核糖核酸合成序列
表4
大鼠F9基因敲除用向导核糖核酸
3.F9-/-大鼠确认(筛选)
利用表1的Rat_F9_Exon2_gRNA4确认是否在F9基因外显子2区域形成缺失。
表5
确认F9基因外显子2区域缺失
-：删除序列，下划线：插入，粗体：取代
4.生产转化的F9-/-大鼠
利用CRISPR/Cas9向代孕鼠移植敲除F9基因的受精卵来生产活后代。
以下，进行更具体地说明。
4-1.激素给药及收集受精卵
对于受精卵，在倒数第3天(Day-3)上午11点，向采卵用5周龄雌性给药PMSG-大星微生物(15IU)来使促黄体激素归一化。在倒数第1天(Day-1)上午11点，向采卵用雌性给药hCG-大星微生物(15IU)来使得排卵日归一化后，与WT雄性交配。在第二天(Day-0)的上午9点确认阴道塞(plug)后，握住卵巢-输卵管-子宫相连的部分后仅小心摘除输卵管。
在采卵30分钟前，事先放入培养箱M2培养基-SIGMA(清洗用培养基)和mR1ECM-ark-resource(大鼠用培养培养基-制备4个100μl的滴剂后利用石蜡油覆盖)并准备后，麻醉大鼠后的30秒内取出M2培养基，通过显微镜撕开输卵管膨胀部分来取出受精卵。之后，在M2培养基，制备4个100μl的滴剂后依次清洗，在mR1ECM培养基，制备4个100μl的滴剂后依次清洗。将技术清洗的受精卵迅速放入事先制备的mR1ECM培养基-100μl的(由石蜡油覆盖)培养箱中并使其稳定。
4-2.转导(Transfection)
在培养箱取出受精卵，在mR1ECM培养基，利用4个100μl的滴剂清洗后，在M2培养基，利用4个100μl的滴剂清洗。之后，为了将小向导核糖核酸：Cas9蛋白/8电穿孔(BEX-Geneeditor1)到受精卵，以0μg∶320μg的比例混合，培养15分钟后使用。在电穿孔过程中，一次共使用40个1细胞，且Pd为30V、Pd on为3.00ms、Pd off为97.0ms、Pd循环为7。
电穿孔受精卵后，在M2培养基，利用100μl的4个滴剂清洗完成电穿孔的受精卵后，在mR1ECM培养基，利用100μl的4个滴剂清洗。事先放入在培养箱内准备的mR1ECM培养基后进行培养。重复(在大鼠用培养培养基，制备100μl的4个滴剂厚利用石蜡油覆盖)来进行。若所有电穿孔结束，则将放入mR1ECM培养基的受精卵培养一天。
4-3.受精卵移植
在倒数第四天(Day-4)上午11点，向7周龄～8周龄雌性注射GnRH-MSD animalHealth(21μg)，来使代孕鼠归一化。在倒数第一天(Day1)确认代孕鼠的阴道塞后，筛选可移植受精卵的代孕鼠，第二天(Day-0)使事先进行输精管切除术雄性与代孕鼠交配。在培养一天的受精卵中仅筛选长到2细胞的受精卵并移植到代孕鼠的输卵管膨胀部。若从妊娠的代孕鼠中生产活后代，则切除耳朵并实施基因型分型(genotyping)来确认动物的特征。
5.F9大鼠靶深度测序(基因型(genotype)分析)
在妊娠的代孕鼠生产活后代后，在断奶时期(3周龄)切除鼠的耳朵并提取基因组脱氧核糖核酸(gDNA来确认动物的特征。在利用靶向部分转导的鼠的耳中，利用Phusionpolymerase taq(New England BioLabs)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增。之后，对于上述聚合酶链式反应扩增物，利用Mi-Seq(lllumina)进行双端(Paird-end)深度测序。利用在线Cas-Analyzer工具(www.rgenome.net)分析深度测序结果。
聚合酶链式反应引物
正向引物：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCGTCCAAAGAGATATAACTCAGG
反向引物：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCGTGCTTCTTCAAAACTGC
6.F9大鼠血液学分析
分析F9的特征后麻醉，10周龄～13周龄(F1代)鼠后在腹主动脉采血。之后，利用SST-BD(血清分离管(serum separated tube))管保存血液，并在常温条件下培养1小时后，利用离心分离机以3000rpm的速度旋转15分钟来分离血清。并委托绿十字医疗基金会实施所分离的血清的血液浓度血清学检查。通过如下的方法进行分析：作为评价参与内源性、外源性系统的凝固因子(F-viii、ix、xi、xii)的功能的筛选检查的PTT，直接测定前凝血酶时间(Prothrombin time)和纤维蛋白原活性的方法向患者的血小板血浆不足施加凝血酶(thrombin)，作为测定将纤维蛋白原(fibrinogen)转化为纤维蛋白(fibrin)并凝固得以提高为止的时间的方法的凝血酶时间(TT，Thrombin time)(参照图2的(b)部分)。在16周龄(F1代)的鼠中，作为存在于外周血液中的类型成分的一种，分析参与止血机制的血小板(platelet)因子。
7.F9大鼠组织学分析
为了观察F9大鼠的大腿肌的组织学变化，执行苏木精(hematoxylin)-伊红(eosin)染色(H&E染色)。通过二甲苯(xylene)去除(deparaffinized)福尔马林固定石蜡包埋(Formalin-fixed paraffin-embedded)组织切片的石蜡后，利用纯乙醇(absolutealcohol)再水化(rehydrated)。用自来水简单清洗后，利用哈里斯苏木精(Harrishematoxylin)将上述组织切片染色5分钟。用自来水将载玻片冲洗5分钟后，在0.2％的氨水中染色30秒钟。用自来水清洗5分钟后，将上述载玻片浸渍在伊红Y(Y eosin)2分30秒钟。之后，上述载玻片在95％的酒精中进行2次脱水，并在二甲苯清洗2次。最后，利用二甲苯基介质(xylene-based medium)安装盖玻片来观察。在图8示出观察其的结果。
8.F9大鼠组织病理学分析
为了通过苏木精-伊红染色(H&E staining)确认疼痛部位的形态，仅切下F9大鼠的疼痛部位，并添加至4％的多聚甲醛(Paraformaldeh yde)来进行固定及清洗步骤。之后，制备石蜡块，并切割(10μm)来将其贴在载玻片。首先，作为再水化步骤，对于沾在石蜡的组织，利用二甲苯溶化石蜡来创造可进行染色的条件。作为染色步骤，利用哈里斯苏木精染色核。利用伊红染色细胞质(cytoplasm)。哈里斯苏木精呈蓝色，伊红呈红色。作为最后步骤，进行脱水(dehydration)来保持染色使其不变。
9.F9大鼠出血分析
利用16周龄(F1代)的对照组、F9+/+、F9-/-进行出血分析(参照图3)。首先，麻醉动物后，将可放入血的15ml的管固定在尾下，来接取出血而流出的血。同时减掉三只鼠的尾巴并利用秒表测时间。同时，通过拍摄视频来确认实时出血量。
产业上的可利用性
本申请提供B型血友病大鼠及其制备方法，作为对于人B型血友病的模型动物，大鼠动物模型可充分示出B型血友病疾病症状，更具体为自然出血症状，这将为未来提供研发治疗剂中重要的工具。
并且，为了制备B型血友病大鼠，本申请提供用于制备B型血友病大鼠模型的F9基因操作组合物，这可用于制备上述B型血友病大鼠。
Claims (16)
1.F9基因操作用组合物在B型血友病大鼠模型的制备中的应用，其特征在于，所述F9基因操作用组合物包含：
向导核糖核酸或编码其的脱氧核糖核酸；以及
编辑蛋白或编码其的脱氧核糖核酸，
其中，所述向导核糖核酸包含由F9基因的靶序列编码的RNA序列以及能够与所述编辑蛋白形成复合物的RNA序列，所述靶序列选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6组成的组，
其中所述编辑蛋白包含源自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9蛋白，
其中所述向导核糖核酸和所述编辑蛋白能够形成向导核糖核酸-编辑蛋白复合物来引起所述F9基因中的人工修饰。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述向导核糖核酸和所述编辑蛋白以其中二者形成复合物的核糖核蛋白形态存在。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，编码所述向导核糖核酸的脱氧核糖核酸及编码所述编辑蛋白的脱氧核糖核酸以载体形态存在。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述载体为病毒载体或非病毒载体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述病毒载体为选自由逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、牛痘病毒、痘病毒及单纯疱疹病毒组成的组中的一种以上。
6.向导核糖核酸在B型血友病大鼠模型的制备中的应用，其特征在于，所述向导核糖核酸包含由F9基因的靶序列编码的RNA序列以及能够与编辑蛋白形成复合物的RNA序列，所述靶序列选自由SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:6组成的组。
7.一种大鼠细胞，其包含F9基因中的人工修饰，其特征在于，
所述F9基因中的人工修饰包含以下中的一个以上修饰：
F9基因全部缺失或一部分缺失；
F9基因全部插入或一部分插入；
F9基因全部插入及缺失或一部分插入及缺失；以及
F9基因中的倒位，
其中所述F9基因的一部分为1bp至100bp核苷酸，
其中所述大鼠细胞通过F9基因中的人工修饰包括以下中的一种以上：
F9因子表达量减少；
F9因子表达抑制；
F9因子功能降低；
F9因子功能丧失；以及
F9因子功能降低或丧失，
所述F9基因中的人工修饰通过所述F9因子中的人工修饰或编码所述F9因子的基因中的人工修饰获得，
其中，所述人工修饰发生在F9基因的第一外显子区域或第二外显子区域，
其中所述大鼠细胞为体细胞。
8.一种大鼠细胞制备方法，所述大鼠细胞包含人工修饰的F9基因，所述方法的特征在于，使大鼠细胞与权利要求1至5中任一项所定义的F9基因操作用组合物相接触的步骤。
9.根据权利要求8所述的大鼠细胞制备方法，其特征在于，所述细胞为体细胞、胚胎细胞或胚胎干细胞。
10.根据权利要求8所述的大鼠细胞制备方法，其特征在于，所述接触通过选自电穿孔法、脂质体、质粒、病毒载体、纳米颗粒及蛋白转导域融合蛋白方法中的一种以上的方法执行。
11.根据权利要求8所述的大鼠细胞制备方法，其特征在于，所述接触在体外执行。
12.一种B型血友病大鼠模型制备方法，所述B型血友病大鼠模型包含F9基因中的人工修饰，所述方法的特征在于，包括：
使大鼠细胞与权利要求1至5中任一项所定义F9基因操作用组合物相接触来引起所述细胞的F9基因中的人工修饰的步骤；以及
向大鼠引入所述细胞来制备B型血友病大鼠模型的步骤。
13.根据权利要求12所述的B型血友病大鼠模型制备方法，其特征在于，所述F9基因中的人工修饰发生在F9基因的第一外显子区域或第二外显子区域。
14.根据权利要求12所述的B型血友病大鼠模型制备方法，其特征在于，所述接触通过选自电穿孔法、脂质体、质粒、病毒载体、纳米颗粒及蛋白转导域融合蛋白方法中的一种以上的方法执行。
15.根据权利要求12所述的B型血友病大鼠模型制备方法，其特征在于，所述B型血友病大鼠表现出组织中的自然出血、由自然出血引起的组织中的炎症以及由自然出血引起的组织中的肿胀中的一种以上的症状。
16.根据权利要求12所述的B型血友病大鼠模型制备方法，其特征在于，所述细胞为体细胞、胚胎细胞及胚胎干细胞中的一种以上。
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