KR20110089557A

KR20110089557A - 혈우병 ａ를 야기하는 신규한 ｆⅷ 유전자 돌연변이체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20110089557A
Application number: KR1020100009008A
Authority: KR
Inventors: 김혜선; 황성호; 김민정; 임정아
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2010-02-01
Filing date: 2010-02-01
Publication date: 2011-08-09
Also published as: KR101228224B1

Abstract

본 발명은 혈우병 A의 진단에 이용가능한 8개의 FⅧ 유전자 돌연변이체, 상기 FⅧ 유전자의 돌연변이체를 검출하는 방법, 상기 FⅧ 유전자의 돌연변이체를 이용하여 혈우병 A를 진단하는 방법, 상기 FⅧ 유전자의 돌연변이체의 존재 여부를 확인하는 제제를 포함하는 혈우병 A 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 혈우병 A 진단용 키트에 관한 것이다.

Description

혈우병 Ａ를 야기하는 신규한 ＦⅧ 유전자 돌연변이체 및 이의 용도{Novel FⅧ gene mutants inducing haemophilia A and uses thereof}

본 발명은 혈우병 A를 야기하는 신규한 FⅧ 유전자 돌연변이체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 혈우병 A의 진단에 이용가능한 8개의 FⅧ 유전자 돌연변이체, 상기 FⅧ 유전자의 돌연변이체를 검출하는 방법, 상기 FⅧ 유전자의 돌연변이체를 이용하여 혈우병 A를 진단하는 방법, 상기 FⅧ 유전자의 돌연변이체의 존재 여부를 확인하는 제제를 포함하는 혈우병 A 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 혈우병 A 진단용 키트에 관한 것이다.

혈우병 A는 X-성염색체에 연관된 유전성 출혈질환으로, 8번 혈액응고인자의 결핍이나 기능이상으로 인해 발생한다. 이 질환은 FⅧ 유전자(F8)의 역위, 점돌연변이, 염기결손, 염기삽입 등의 돌연변이에 의해 야기되는 것으로 알려져 있다. FⅧ 유전자는 26개의 엑손으로 구성되었으며 크기가 180 kbp 이상으로 X-염색체의 0.1%의 비율을 차지한다. FⅧ 유전자의 산물은 효소 활성을 가지고 있지 않은 혈액응고 과정에 조효소로 작용한다. 좀더 정확히 말하면 FⅧ 의 결핍은 10번 혈액응고인자 (FX)의 기능을 억제하게 되어 혈액응고 과정이 방해받게 되고 최종적으로 섬유소(fibrin) 형성이 비효율적으로 일어난다. 이러한 비효율적인 섬유소의 형성은 계속적인 출혈의 근본적인 생화학적 장애를 야기하게 되어 혈우병 환자는 지혈시간이 지연되게 된다.

이 FⅧ 유전자는 전구체를 포함하여 2351개 아미노산 잔기를 암호화한다. FⅧ 단백질의 N-말단에 19개의 신호 펩티드를 가지고 있고, 단백질 성숙과정에서 당화(glycosylation)가 일어나는 2332개의 아미노산으로 구성된 250kDa의 단백질이 만들어진다.

8번 혈액응고인자 (FⅧ)는 N-말단(N-terminus)에서부터 이름을 붙여진 A1-A2-B-A3-C1-C2로 구성된 다중 도메인(multi-domain)을 가진 단백질이다. 간세포에서 합성된 FⅧ는 혈관으로 분비되고, 혈관 내피 세포에서 합성되어 분비되는 폰 빌레브란드 인자(von Willebrand factor, vWF)와 쉽게 결합된다. 게다가, FⅧ는 소포체(endoplasmic reticulum)에서 N-연결(linked) 당화(glycosylation)와 골지체에서 설페이트화(sulfation)를 포함한 다양한 전사 후 번역과정에 의해서 변화된다. 또한 FⅧ은 중쇄(A1-A2)와 경쇄(A3-C1-C2)를 연결하는 B-도메인은 분해된다. FⅧ은 중쇄와 경쇄에 칼슘과 구리와 같은 금속이온들이 연결되어 있는 이형이합체(heterodimeric) 단백질이다. 그래서, 다양한 FⅧ 유전자의 돌연변이는 유전자의 활성이나 안정성뿐만 아니라 단백질 구조에 중요한 영향을 줄 수 있다.

북아메리카에서는 5000명의 남성 중에서 약 한 명의 HA 환자가 발견된다. 그러나, 한국인 사이에서의 발생은 관련 환자들의 등록 자료와 차이점이 있다. 한국 혈우재단의 2007년도 연간 자료에 따르면 48백만명의 한국 인구 중 약 2,000명의 혈우병 환자들이 있는 것으로 조사되었다. 이것은 10,000명의 남성 중에서 1명 꼴로 발생한다는 것과 일치한다. 이와 같은 차이점은 고유의 인종차이에 의한 것으로 보인다. 하지만, 이와 같은 결과는 한국인 혈우병 환자가 잘 발견되지 않는다는 증거가 될 수 있다. 그렇기 때문에 더 정확하고 적절한 진단 방법이 필요하다.

또한, 900개 이상의 돌연변이가 현재 HAMSTeRs 데이타베이스에 기록되어 있음에도 불구하고, 한국인을 포함한 아시안 혈우병 관련 돌연변이 종류의 자료들은 부족한 시점이다. 이번 연구에서 우리는 서로 아무런 연관성이 없는 38명의 남성 환자들을 실험군으로 하여 한국인 혈우병 환자에서 일어나는 FⅧ 유전자의 돌연변이의 종류들의 특성을 알아보았다. 중합효소연쇄반응(PCR), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex-PCR), 그리고 직접적인 시퀀싱(sequencing) 기술을 통해서 37명의 환자들로부터 32개의 돌연변이를 알아냈다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 혈우병 A를 야기하는 FⅧ 유전자의 염기 서열 분석을 통한 돌연변이 검출을 실시한 결과, 혈우병 A의 진단에 유용한 8개의 새로운 FⅧ 유전자 돌연변이체를 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 혈우병 A의 진단에 이용가능한 8개의 신규한 FⅧ 유전자 돌연변이체를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 FⅧ 유전자의 돌연변이체를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 FⅧ 유전자의 돌연변이체를 이용하여 혈우병 A를 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 FⅧ 유전자의 돌연변이체의 존재 여부를 확인하는 제제를 포함하는 혈우병 A 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 혈우병 A 진단용 키트를 제공한다.

본 발명은 이제껏 보고되지 않은 8개의 새로운 FⅧ 유전자 돌연변이체를 발견하였는데, 이는 혈우병 A의 진단과 보인자(carrier)의 검출에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

도 1은 8번 혈액응고인자의 인트론 22 와 인트론 1의 역위 분석을 나타낸다. 인트론 22(A)와 인트론 1(B)에서의 역위를 검출하기 위해, 장거리 중합효소연쇄반응(long distance-PCR)을 수행한 것이다. (A) 인트론 22번의 역위를 조사한 실험 결과이다. 레인 1과 4는 A+B 프라이머의 결과(10 kb의 산물)를 보여주며, 이는 야생형과 돌연변이(역위)형 모두에서 증폭된다. 레인 2와 5는 역위를 검출하기 위한 B+P 프라이머의 산물(11 kb, 레인 5에 별표)을 보여주며, 이 산물은 돌연변이(역위)형에서만 검출된다. 레인 3과 6은 P+Q 프리이머를 통해 12kb의 중합효소연쇄반응 산물이 만들어지는 것을 보여주고 있으며, 야생형에서만 관찰된다. 레인 M은 크기 표지자(size marker)이다. (B) 인트론 1의 역위를 조사하기 위해, int1h-1 와 int1h -2 영역에 대한 프라이머인 9cR+9F+2F 프라이머의 조합(레인 1, 3 및 5)과 2F+2R+9F 프라이머 조합(레인 2, 4 및 6)을 이용하였다. 레인 1과 2는 야생형 중합효소연쇄반응 산물을 보여주고 있으며, 레인 3과 4는 혈우병환자 중 인트론 1의 역위가 발생하지 않은 결과를 나타낸다. 레인 1과 3은 2.0 kb 산물과 레인 2와 4는 1.2 kb 산물을 보여주고 있다. 하지만, 레인 5와 6은 1.4 kb와 1.8 kb의 중합효소연쇄반응 산물을 나타내므로 인트론 1의 역위가 발생한 환자임을 알 수 있다. 레인 M1과 M2로 표시된 부분은 각각 1 kb 표지자와 100 bp 표지자를 나타낸다.
도 2는 다중 중합효소연쇄반응을 통한 전체 엑손 결손 검출법을 나타낸다. FⅧ의 엑손 결손을 검사하기 위해, 대조군으로 건강한 남성(A와 C)의 혈액과 혈우병 환자(B와 D)의 말초혈액에서 DNA를 분리하였다. 각각의 분리된 DNA를 다중 중합효소연쇄반응(A, B)과 단일 중합효소연쇄반응(C, D)을 통해 증폭하였다. 다중 중합효소연쇄반응(A, B)과 단일 중합효소연쇄반응(C, D)에는 각각 8개의 프라이머 세트와 35개의 개별 프라이머를 사용하였다. 각 레인 위에 표시된 숫자는 프라이머 세트(A, B)와 프라이머(C와 D) 번호이다. B와 D에서 화살표로 표시된 부분이 엑손이 결손된 부분이다. 레인 M은 100 bp 크기 표지자이다.
도 3은 한국인 혈우병 환자에서 나타나는 FⅧ 돌연변이를 정리한 것이다. 염기 서열 분석법과 역위조사를 이용해 FⅧ 돌연변이를 조사하여, 37명의 환자 중 32명의 환자의 돌연변이를 확인하였다. 돌연변이의 종류와 비율은 다음과 같다. 15명의 인트론 22 역위 (39.5%), 1명의 인트론 1 역위 (2.6%), 1명의 전체 엑손 결손 (2.6%), 6명의 미스센스 돌연변이 (15.8%), 5명의 염기결손 (13.2%), 3명의 넌센스 돌연변이 (7.9%) 그리고 2명의 염기삽입 (5.3%) 돌연변이가 조사되었다. 5명(13.2%)의 환자는 돌연변이를 확인하지 못했다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

서열번호 1의 염기서열로 이루어진 천연 FⅧ 유전자 중에서,

5953번 위치의 염기 C가 결손(deletion)되는 결손 돌연변이체;

207번 및 208번 위치의 염기 GT가 결손되는 결손 돌연변이체;

5860번 내지 5865번 위치의 염기 GCTCAG가 결손되는 결손 돌연변이체;

5471번 위치의 염기 A가 결손되는 결손 돌연변이체;

5825번 위치의 염기 G가 A로 치환되는 미스센스 돌연변이체;

6406번 위치의 염기 G가 A로 치환되는 미스센스 돌연변이체;

4076번 위치의 염기 G가 A로 치환되는 넌센스 돌연변이체; 및

6283번 위치 및 6284번 위치 사이에 염기 A가 삽입되는 삽입 돌연변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 FⅧ 유전자의 돌연변이체를 제공한다.

상기 천연 FⅧ 유전자의 서열번호 1의 염기서열은 번역개시코돈인 ATG에서 A를 +1로 하여 표시한 것이다.

본 발명의 FⅧ 유전자의 돌연변이체 중, 5953번 위치의 염기 C가 결손(deletion)되는 결손 돌연변이체는 엑손 18의 A3 도메인에 결손이 생긴 것으로, 상기 결손에 의해 성숙 단백질(mature protein)의 1966번 위치의 아미노산이 아르기닌에서 글루탐산으로 치환된 경우이다 (c.5953delC, p.Arg1966Glu).

207번 및 208번 위치의 염기 GT가 결손되는 결손 돌연변이체는 엑손 02의 A1 도메인에 결손이 생긴 것으로, 상기 결손에 의해 성숙 단백질의 51번 위치의 아미노산이 페닐알라닌에서 류신으로 치환된 경우이다 (c.207_208delGT, p.Phe51Leu).

5860번 내지 5865번 위치의 염기 GCTCAG가 결손되는 결손 돌연변이체는 엑손 18의 A3 도메인에 결손이 생긴 것으로, 상기 결손에 의해 성숙 단백질의 상기 위치에 해당하는 아미노산 2개가 결손된 경우이다 (c.5860_5865delGCTCAG).

5471번 위치의 염기 A가 결손되는 결손 돌연변이체는 엑손 16의 A3 도메인에 결손이 생긴 것으로, 상기 결손에 의해 성숙 단백질의 1805번 위치의 아미노산이 아르기닌에서 트레오닌으로 치환된 경우이다 (c.5471delA, p.Arg1805Thr).

5825번 위치의 염기 G가 A로 치환되는 미스센스 돌연변이체는 엑손 18의 A3 도메인의 5825번 위치의 염기 G가 A로 치환된 것으로, 상기 치환에 의해 성숙 단백질의 1923번 위치의 아미노산이 글리신에서 아스파르트산으로 치환된 경우이다 (c.5825G>A, p.Gly1923Asp).

6406번 위치의 염기 G가 A로 치환되는 미스센스 돌연변이체는 엑손 22의 C1 도메인의 6406번 위치의 염기 G가 A로 치환된 것으로, 상기 치환에 의해 성숙 단백질의 2117번 위치의 아미노산이 글리신에서 아르기닌으로 치환된 경우이다 (c.6406G>A, pGly2117Arg).

4076번 위치의 염기 G가 A로 치환되는 넌센스 돌연변이체는 엑손 14의 B 도메인의 4076번 위치의 염기 G가 A로 치환된 것으로, 상기 치환에 의해 성숙 단백질의 1340번 위치의 아미노산이 트립토판에서 종결코돈으로 치환된 경우이다 (c.4076G>A, p.Trp1340X).

6283번 위치 및 6284번 위치 사이에 염기 A가 삽입되는 삽입 돌연변이체는 엑손 22의 C1 도메인의 6283번 위치 및 6284번 위치 사이에 염기 A가 삽입된 것으로, 상기 치환에 의해 성숙 단백질의 2076번 위치의 아미노산이 류신에서 타이로신으로 치환된 경우이다 (c.6283_6284InsA, p.Leu2076Tyr).

결손(deletion) 돌연변이는 하나 이상의 염기가 제거되게 되는 경우로, 선천성 부신과형성증(congenital adrenal hyperplasia)이 대표적이다.

미스센스(missense) 돌연변이는 DNA 사슬 위의 어떤 부위에 하나의 염기 치환이 일어나서 mRNA의 유전암호가 변해 본래의 것과는 다른 아미노산이 지정이 되어 단백질에 영향을 주게 되는 유전자 돌연변이를 말하며, 겸상 적혈구 빈혈(sickle-cell anemia), 대동맥판상부 협착증(supravalvular aortic stenosis, SVAS) 등이 대표적인 미스센스 돌연변이로 알려져 있다.

넌센스 돌연변이는 하나의 염기 치환으로 본래의 어느 한 아미노산을 암호화하는 코돈이 아미노산을 암호화하지 않는 종결코돈(넌센스 코돈)으로 변화되어 단백질의 합성이 그 코돈이 있는 곳에서 중단되는 유전자 돌연변이를 말하며, 레트 증후군(Rett syndrome)이 대표적인 넌센스 돌연변이로 알려져 있다.

염기삽입(insertion) 돌연변이는 하나 이상의 염기가 기존의 염기들 사이로 끼어들어 변화가 일어나는 유전자 돌연변이를 말하며, 대표적인 염기삽입 돌연변이는 마르판 증후군(Marfan syndrome)과 고셔병(Gaucher disease)이 있다.

본 발명의 신규한 8개의 FⅧ 유전자의 돌연변이체는 혈우병 A의 진단에 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한,

혈우병 A 의심 환자로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하여 본 발명의 돌연변이체 부위의 유전자를 증폭하는 단계; 및

상기 증폭된 유전자를 동정하는 단계를 포함하는 본 발명의 FⅧ 유전자의 돌연변이체를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 FⅧ 유전자의 돌연변이체를 검출하는 방법은 혈우병 A 의심 환자로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 혈우병 A 의심 환자로부터 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Quick Gene mini-80 핵산 분리 시스템(Fujifilm, Japan)을 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 본 발명의 돌연변이체 부위의 유전자를 증폭할 수 있다. 증폭 반응에 이용되는 프라이머 세트는 FⅧ 유전자의 돌연변이체 위치를 알고 있으므로, 적당한 크기의 증폭 산물이 생성될 수 있도록 당업자의 면에서 용이하게 디자인할 수 있다. 유전자를 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. 상기 증폭된 유전자를 동정하는 방법은 시퀀싱 등을 통해 수행할 수 있다.

본 발명은 또한,

혈우병 A 의심 환자로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하여 본 발명의 돌연변이체 부위의 유전자를 증폭하는 단계;

상기 증폭된 유전자를 동정하는 단계; 및

상기 동정된 유전자를 본 발명의 FⅧ 유전자의 돌연변이체와 비교하는 단계를 포함하는 혈우병 A를 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 혈우병 A를 진단하는 방법에서, 혈우병 A 의심 환자로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계, 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하여 본 발명의 돌연변이체 부위의 유전자를 증폭하는 단계 및 상기 증폭된 유전자를 동정하는 단계는 전술한 바와 같다. 마지막 단계는 상기 동정된 유전자를 본 발명의 FⅧ 유전자의 돌연변이체와 비교하는 단계이다. 즉, 동정된 유전자의 염기서열과 본 발명의 FⅧ 유전자의 돌연변이체의 염기서열을 비교하여, 상기 동정된 유전자의 염기서열이 본 발명의 FⅧ 유전자의 돌연변이체의 염기서열 중의 하나에 해당한다면, 혈우병 A 의심 환자는 혈우병 A 환자로 진단할 수 있는 것이다.

본 발명은 또한, 본 발명의 FⅧ 유전자의 돌연변이체의 존재 여부를 확인하는 제제를 포함하는 혈우병 A 진단용 조성물을 제공한다. 상기 FⅧ 유전자의 돌연변이체의 존재 여부를 확인하는 제제는 상기 돌연변이체에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명의 FⅧ 유전자의 돌연변이체의 염기 서열이 밝혀져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 돌연변이체의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 이들 돌연변이체의 특정 영역에 특이적으로 결합하는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명에서, 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에서는 FⅧ 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 혈우병 A를 진단할 수 있다. 예를 들면, 센스 프라이머의 경우에 결손, 치환 또는 삽입이 일어난 돌연변이체에 해당하는 프라이머를 디자인하고, 안티센스 프라이머는 돌연변이가 일어나지 않는 위치에 해당하는 프라이머를 디자인하여 PCR하면, 본 발명의 FⅧ 유전자의 돌연변이체인 경우에는 PCR에 의해 증폭 산물이 생성될 것이나, 본 발명의 FⅧ 유전자의 돌연변이체가 아닌 경우에는 증폭 산물이 생성되지 않을 것이다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명에서, 용어 "프로브"란 DNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 DNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 FⅧ 유전자와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 혈우병 A를 진단할 수 있다. 예를 들면, 결손, 치환 또는 삽입이 일어난 돌연변이체에 해당하는 프로브를 합성하고, 혈우병 A의 의심 환자의 게놈 DNA와 상기 프로브를 혼성화하면, 본 발명의 FⅧ 유전자의 돌연변이체인 경우에는 혼성화가 일어날 것이나, 본 발명의 FⅧ 유전자의 돌연변이체가 아닌 경우에는 혼성화가 일어나지 않을 것이다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 혈우병 A 진단용 조성물을 포함하는 혈우병 A 진단용 키트를 제공한다. 상기 키트에는 전술한 프라이머, 프로브뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

연구 대상 및 DNA 추출

말초혈액 시료는 한국혈우재단의원(서울, 광주)과 아주대학교병원 혈전지혈센타에서 얻었다. 연구대상은 38명의 한국인 혈우병A 환자와 한 명의 건강한 남성을 대상으로 하였다. 모든 환자는 prolonged activated partial thromboplastin time(aPTT)으로 확인하였고 FⅧ의 활성도가 1% 미만인 환자들을 대상으로 하였다. 모든 환자는 충분한 상담을 하였고, AMC IRB-06-216 (아주대학교 의료원의 Institutional Review Board) 동의서를 작성하였다. 유전체 DNA는 Quick Gene mini-80 핵산 분리 시스템(Fujifilm, Japan)을 이용하여 말초혈액에서 추출하였다.

장거리( Long distance) 중합효소연쇄반응을 이용한 역위 진단

22번 인트론의 역위를 알아보기 위해, Liu 등(1998, Blood 92, 1458-1459)에 의해 개발된 P, Q, A 그리고 B 프라이머를 이용한 방법을 변형하여 장거리 중합효소연쇄반응을 수행하였다. PCR 혼합물 (25 ul)은 dNTP를 10 mM, 각 프라이머를 10 μM, 주형 DNA를 200ng, 밴드 닥터(band doctor, Slogent, Korea)를 5×, 그리고 EF Taq(Slogent, Korea) 1U을 넣어 준비하였다. 프라이머는 A+B, B+P, 그리고 P+Q를 사용하였으며, Polakova 등(2003, General physiology and biophysics 22, 243-253)에 소개된 subcycling PCR 방법을 이용하여 중합효소연쇄반응을 진행하였다. 구체적으로 중합효소연쇄반응 사이클(cycle)은 95℃에서 30초간 10 사이클, 그 다음 60℃에서 2분간 4 사이클 그리고 65℃에서 2분간 진행하였다. 나머지 20 사이클은 각 어닐링(annealing)/연장(extension) 단계에서 매 사이클마다 3초씩 추가하여 진행하였다.

1번 인트론의 역위를 알아보기 위해, 9F, 9cF, 2F, 그리고 2R 프라이머를 Bagnall 등(2002, Blood 99, 168-174)에 의해 소개된 방법을 이용해 준비하였다. 중합효소연쇄반응 증폭은 주형 DNA 200ng, dNTP 10mM, 10× EF-taq 완충액, 그리고 프라이머 10 μM을 넣어 총 반응 부피가 20 ㎕가 되도록 준비하여 시행하였다. 9F+9cF+2F 그리고 9F+2F+2R 프라이머를 이용해 장거리 중합효소연쇄반응을 두 번 시행하였으며, 중합효소연쇄반응의 각 단계는 94℃에서 30초간 30 사이클, 30초간 65℃ 그리고 2분간 72℃로 하였다.

다중( multiplex ) PCR 을 통한 전체 엑손 결손 분석

엑손 결손분석은 역위가 일어나지 않은 환자를 대상으로 다중 PCR을 통해 수행하였다. 표 1에서 볼 수 있듯이, 총 35개의 엑손 특이적 프라이머들은 26개의 엑손의 3'- 그리고 5'-비번역 영역(UTR)을 포함하여 증폭할 수 있도록 제작하였다. 다중 PCR을 위해 35개의 프라이머를 각 PCR 산물의 크기가 겹쳐지지 않도록 8개의 그룹으로 나누어 만들었다. 다중 PCR은 각 프라이머들이 10μM의 농도가 되도록 첨가하였고 100 ng의 DNA를 넣고 2× i-star PCR 프리믹스 키트(iNtRON Biotechnology, Korea)를 이용하여 수행하였다. DNA 증폭은 94℃에서 10초, 55℃에서 20초 그리고 72℃에서 20초씩 30회 반복하였다.

다중 중합효소연쇄반응에 사용된 프라이머 세트

세트	프라이머	엑손	크기 (bp)	정방향 프라이머 (서열번호)	역방향 프라이머 (서열번호)
세트 1	1	20	228	TTTGAGAAGCTGAATTTTGTGC(2)	GAAGCATGGAGATGGATTCATTA(3)
	2	22	287	TCAGGAGGTAGCACATACAT(4)	GTCCAATATCTGAAATCTGC(5)
	3	11	362	CCCTTGCAACAACAACATGA(6)	TTTCTTCAGGTTATAAGGGGACA(7)
	4	08	484	CACCATGCTTCCCATATAGC(8)	ATGGCTTCAGGATTTGTTGG(9)
	5	14B	599	GATCCATCACCTGGAGCA AT(10)	GGGCCATCAATGTGAGTCTT(11)
세트 2	6	26E	230	CCCCAAAGGTGATATGGTTTT(12)	TCAGTGTTCACATTTTTATTTCCA(13)
	7	02	290	CATTACTTCCAGCTGCTTTTTG(14)	TTTGGCAGCTGCACTTTTTA(15)
	8	18	362	TGGTGGAGTGGAGAGAAAGAA(16)	AGCATGGAGCTTGTCTGCTT(17)
	9	26A	557	CTGTGCTTTGCAGTGACCAT(18)	TTCTACAACAGAGGAAGTGGTGA(19)
세트 3	10	19	248	AACCAATGTATCTCATGCTCATTTT(20)	GGAAGAAAGCTGTAAAGAAGTAGGC(21)
	11	23	294	TTGACAGAAATTGCTTTTTACTCTG(22)	TCCCCCAGTCTCAGGATAACT(23)
	12	13	364	CATGACAATCACAATCCAAAATA(24)	CATGTGAGCTAGTGGGCAAA(25)
	13	14A	567	CTGGGAATGGGAGAGAACCT(26)	ATGTCCCCACTGTGATGGAG(27)
세트 4	14	21	261	CCACAGCTTAGATTAACCCTCA(28)	TGAGCTTGCAAGAGGAATAAGTAA(29)
	15	25	300	TGGGAATTTCTGGGAGTAAATG(30)	AAGCTCTAGGAGAGGTGGTATTTTT(31)
	16	01	480	TAGCAGCCTCCCTTTTGCTA(32)	CTAACCCGATGTCTGCACCT(33)
	17	26B	596	GGAGAAACCTGCATGAAAGC(34)	TTGGCCATCACAAATTTCAA(35)
세트 5	18	10	250	TTCTTGTTGATCCTAGTCGTTTT(36)	GCTGGA GAA AGG ACC AAC ATA(37)
	19	12	298	TGCTAGCTCCTACCTGACAACA(38)	CATTCATTATCTGGA CATCACTTTG(39)
	20	04	372	CATGTTTCTTTGAGTGTACAGTGG(40)	TTCAGG TGA AGG AAC ACA AATG(41)
	21	14E	570	GGATGACACCTCAACCCAGT(42)	CCTTCCACGAGATCCAGA TG(43)
세트 6	23	24	250	ACTGAGGCTGAAGCATGTCC(44)	CCCAACCACTGCTCTGAGTC(45)
	24	03	299	GCATGCTTCTCCACTGTGAC(46)	GCCACCATTACAAAGCACAC(47)
	25	17	397	AGGTTGGACTGGCATAAAAA(48)	CCCTGGATCAAGTCTCATTTG(49)
	26	26C	580	TGCAAATGTGCATTTTTCTGA(50)	CCTCCAGCCCCCTTTACTAT(51)
	27	14C	695	AGCTCATGGACCTGCTTTGT(52)	CATTCTCTTGGATTAATGTTTCCT(53)
세트 7	28	06	258	GCGGTCATTCATGAGACACA(54)	CCGAGCTGTTTGTGAACTGA(55)
	29	15	299	TGAGGCATTTCTACCCACTTG(56)	CCAAAAGTGGGAATACATTATAGTCA(57)
	30	07	400	TGTCCTAGCAAGTGTTTTCCATT(58)	AATGTCCCCTTCAGCAACAC(59)
	31	26D	580	CCACCCCCATAAGATTGTGA(60)	CTGAAGAAACCAGCAGGAAAA(61)
	22	14F	686	TCCCTACGGAAACTAGCAATG(62)	TCACAAGAGCAGAGCAAAGG(63)
세트 8	32	05	259	TCTCCTCCTAGTGACAATTTCC(64)	CCATCTCCTTCATTCCTGA(65)
	33	09	300	TTTGAGCCTACCTAGAATTTTTCTTC(66)	GGTATTTTAGAAACTCAAAACTCTCC(67)
	34	16	468	CAGCATCCATCTTCTGTACCA(68)	AAAGCTTCTTATTGCACGTAGG(69)
	35	14D	595	TCCAAGCAGCAGAAACCTATT(70)	AGTAATGGCCCCTTTCTCCT(71)

염기 서열 분석을 통한 돌연변이 검출

FⅧ 유전자 염기 서열분석은 35개의 합성된 프라이머를 이용하여 3'-비번역 영역과 5-'비번역 영역 그리고 모든 26개의 엑손을 대상으로 ABI 3730XL DNA 분석기(Applied Biosystem, USA)에 대한 BigDye 터미네이터 V3.1 사이클 시퀀싱 키트를 이용하여 수행하였다. 염기서열 변이는 각 엑손 영역의 다중 정렬에 대한 ClustalW를 이용하여 분석하였다. 정상 FⅧ 유전자(등록번호: NM_000132.3)를 대조유전자로 사용하였다. 최종적으로, 돌연변이 데이터는 DNASTAR seqman 프로그램을 이용하여 확인하였고, HAMSTeRS 데이타베이스(http://europium.csc.mrc.ac.uk)와 비교하였다.

실시예 1: 장거리 중합효소연쇄반응을 이용한 인트론 22번과 1번의 역위 분석

현재 HAMSTeRS 데이타베이스에는 900 종류 이상의 FⅧ의 돌연변이가 등록되어있다. 이 중에, 가장 흔하게 나타나는 것이 인트론 22번의 역위이다. 인트론 22번의 역위는 중증 혈우병 환자의 40~50%에서 발견되기 때문에 FⅧ의 돌연변이의 호발 부위로 주목을 받고 있다. 따라서 우리는 먼저 환자 집단의 인트론 22번의 역위에 집중했다. 인트론 22번의 역위는 int22h -2와 함께 있는 int22h - 1(유전자내)와 int22h -3(유전자외) 사이에서의 유전자 상동 재조합을 통해 발생한다. 인트론 22번의 역위를 살펴보기 위하여 Liu 등의 방법에 따라 프라이머 P, Q, A, B를 합성하였다. 프라이머 P와 Q는 int22h -1에 결합하는데 반해, 프라이머 A와 B는 int22h -2와 int22h -3에 결합한다. 도 1A에서 볼 수 있는 것과 같이, 레인 1과 4는 A와 B 혼합 프라이머에 의한 역위형과 야생형의 증폭된 결과(10kb)이다. 레인 2와 5에서 P와 B 혼합 프라이머를 사용하였을 때 야생형에서는 결과가 없지만 역위 환자에서는 11kb의 결과가 나오는 것을 볼 수 있다(레인 5에 별표). 또한, 레인 3과 6에서는 P와 Q 혼합 프라이머 사용 시, 야생형에서는 12kb에서 결과가 나타나지만 역위 환자에서는 결과가 나오지 않았음을 확인할 수 있다. 동일한 방법을 사용하여, FⅧ의 int22 역위가 있는 환자 15명을 확인할 수 있었다.

다음으로 인트론 22번 역위가 없는 환자 중에서 인트론 1번의 역위를 조사하였다. 인트론 22번의 역위와 비슷하게, 인트론 1번의 역위는 프로모터 부위의int1h-1(유전자내)와 int1h -2(유전자외)의 유전자 상동 재조합에 의하여 발생한다. FⅧ 유전자의 인트론 1번이 결손된 경우 펩타이드를 암호화하는 첫번째 엑손의 결손되고 그에 따라서 C6 .1A 유전자의 번역이 멈추기 때문에, 이 경우 유전자가 발현될 것이라고 예상되지 않았다. 인트론 1번의 역위를 찾아내기 위해, int1h -1과 int1h-2의 증폭 결과를 비교하였다. 도 1B는 건강한 남성(레인 1과 2)과 결손형 돌연변이가 나중에 발견된 인트론 1-음성인 혈우병 환자(레인 3과 4), 인트론 1번 역위환자(레인 5와 6)의 중합효소 연쇄반응(PCR)의 결과를 나타낸다. 혼합 프라이머 9cR+9F+2F (레인 1, 3 및 5)와 2F+2R+9F (레인 2, 4 및 6)은 각각 int1h - 1와 int1h-2의 증폭을 위해 사용되었다. 야생형에서 프라이머 9cR+9F+2F의 결과는 2.0kb 일 것이고, 반면 프라이머 2F+2R+9F의 결과는 1.2kb일 것이라 예상하였다. 도 1B에 보이는 대로, 야생형(레인 1, 2)과 인트론 1-음성 혈우병 환자(레인 3, 4)에서는 int1h - 1와 int1h -2이 예상한 것과 같이 2.0kb 와 1.2kb의 결과를 생성하였다. 그러나, 인트론 1번 역위 환자(AMC-HA14)에서는 1.4kb(레인 5), 1.8kb(레인 6) 크기의 결과가 생성되었다. 이는 한국인 혈우병 환자에서는 인트론 1번 역위 환자가 보고된 적이 없기 때문인 것으로, 이것은 첫번째로 나타난 사례이다.

인트론 1번의 역위는 중증의 혈우병을 야기하며, 환자의 말초혈액 림프구에서 발견된 엑손 2-26번 재조합 RNA가 상대적으로 안정하다는 보고가 있다(Brinke et al, 1996, Human molecular genetics 5, 1945-1951). 이러한 결과들은 인트론 1번 역위에 의한 저해 항체의 분화 가능성을 나타낸다. 그러나 이번 연구의 인트론 1번 역위 환자(AMC-HA14)는 예상하였던 항체를 분화하지 않았다(데이타 미제시). 이러한 발견은 인트론 1번의 역위와 억제적 항체(inhibitor)의 관계에 대한 이해가 완전하지 않음을 말한다.

실시예 2: 다중 PCR 을 통한 전체 엑손의 결손 분석

여태까지 보고된 바로는 전체 엑손의 결손이 시퀀스 분석을 통해 검출할 수 없었기 때문에, 전체 엑손의 결손 검사를 위해 돌연변이 조사(profiling)가 필요하다. 게다가 FⅧ 유전자가 많은 엑손을 가지고 있기 때문에, 일반적으로 사용되는 단일 중합효소연쇄반응(singleplex-PCR)은 실시하기 어렵다. 따라서, 시퀀스 분석을 하기 전에, 역위-음성 환자와 건강한 남성에게 프라이머 8쌍(표 1)을 사용하여 다중 중합효소연쇄반응을 수행했다. 반면에 단일 중합효소연쇄반응으로 엑손의 결손을 찾아낼 때, 각 환자마다 35번의 반응이 필요한데 반해, 다중 중합효소연쇄반응으로는 4~5개의 프라이머로 단지 8번의 반응만으로도 충분했다. 도 2A는 8쌍의 프라이머로 35개의 증폭 결과를 나타내는 건강한 남자의 양성 대조군을 말한다. 그러나, 환자(도 2B)의 경우 화살표로 표시된 것처럼 레인 1, 5, 7 및 8에서 결과가 나오지 않았다. 크기를 비교해볼 때, 엑손 8, 엑손 10, 엑손 7, 엑손 9 부분이다. 다중 중합효소연쇄반응에 의한 결과를 확실하게 하기 위해, 모든 35개의 프라이머를 통해 단일 중합효소연쇄반응을 시행하였다. 건강한 남성에서 모든 프라이머는 그에 상응하는 증폭 결과를 나타냈으나(도 2C), 환자에서는 엑손 10, 엑손 8, 엑손 7 및 엑손 9에 상응하는 레인 4, 18, 30 및 33(화살표로 표시됨)에서 증폭되지 않은 결과가 나타났다. 결과적으로, 엑손 7 내지 엑손 10 까지의 전체 결손을 가지는 한 환자(AMC-HA45)를 찾아냈다. 이 결손은 HAMSTeRS 데이타베이스에 등록되어 있으며, 중증의 표현형과 관련되어 있다. 전체 엑손의 결손은 2.6%로 나타났고 이것은 Bagnall 등의 결과와 유사하다(도 3).

실시예 3: 염기 서열 분석을 통한 돌연변이 검출

마지막으로, 직접적인 시퀀싱 기술을 통해 남아있는 환자들의 FⅧ 유전자의 변동성을 분석하였다. 표 2에 나타난 바와 같이, 질병-유발 돌연변이를 일으키는 16개 시퀀스의 변동성을 확인하였다. 이것들은 6개의 미스센스(missense), 3개의 넌센스(nonsense), 2개의 삽입(insertion) 및 5개의 결손 돌연변이를 포함한다. 이러한 돌연변이의 분포는 다음과 같다: A1 도메인 2개, A2 도메인 2개, A3 도메인 4개, B 도메인 3개, C1 도메인 3개, C2 도메인 2개. 이러한 결과들은 이번 연구에서 FⅧ에 돌연변이 호발 부위가 없음을 의미한다. 이 중 8개의 돌연변이 종류는 HAMSTeRS 데이타베이스에 보고되어 있지만, 이번 연구에서 나타난 8개의 돌연변이는 완전히 새롭게 발견된 것이다. 이러한 새로운 돌연변이는 AMC-HA15(c.5953delC, p.Arg1966Glu), AMC-HA20(c.207_208delGT, p.Phe51Leu), AMC-HA24(c.5860_5865delGCTCAG) 및 AMC-HA50(c.5471delA, p.Arg1805Thr)에서의 4개의 결손, AMC-HA21(c.5825G>A, p.Gly1923Asp), AMC-HA41(c.6406G>A, pGly2117Arg)에서의 2개의 미스센스돌연변이, AMC-HA25(c.4076G>A, p.Trp1340X)에서의 1개의 넌센스돌연변이, AMC-HA35(c.6283_6284InsA, p.Leu2076Tyr)에서의 1개의 염기삽입 돌연변이를 포함한다.

*: 뉴클레오티드의 번호는 개시 코돈(ATG)을 +1로 하여 "A"로 표시하였다. 또한, c.5953delC에서 c.은 coding region을 나타낸다.

**: 아미노산의 번호는 다른 FⅧ 유전자 연구에서 사용한 방법과 같이, 성숙 단백질(mature protein)에 대한 것이다. 또한, p.Arg1966Glu에서 p.은 protein을 나타낸다.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Novel FVIII gene mutants inducing haemophilia A and uses thereof <130> PN10010 <160> 71 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 7056 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(7056) <223> FVIII gene <400> 1 atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60 accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120 ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180 acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240 gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300 gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360 ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420 gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480 aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540 gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600 gggagtctgg 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ctggcaaaat atattagaaa gtgacactga gtttaaaaaa 3180 gtgacacctt tgattcatga cagaatgctt atggacaaaa atgctacagc tttgaggcta 3240 aatcatatgt caaataaaac tacttcatca aaaaacatgg aaatggtcca acagaaaaaa 3300 gagggcccca ttccaccaga tgcacaaaat ccagatatgt cgttctttaa gatgctattc 3360 ttgccagaat cagcaaggtg gatacaaagg actcatggaa agaactctct gaactctggg 3420 caaggcccca gtccaaagca attagtatcc ttaggaccag aaaaatctgt ggaaggtcag 3480 aatttcttgt ctgagaaaaa caaagtggta gtaggaaagg gtgaatttac aaaggacgta 3540 ggactcaaag agatggtttt tccaagcagc agaaacctat ttcttactaa cttggataat 3600 ttacatgaaa ataatacaca caatcaagaa aaaaaaattc aggaagaaat agaaaagaag 3660 gaaacattaa tccaagagaa tgtagttttg cctcagatac atacagtgac tggcactaag 3720 aatttcatga agaacctttt cttactgagc actaggcaaa atgtagaagg ttcatatgac 3780 ggggcatatg ctccagtact tcaagatttt aggtcattaa atgattcaac aaatagaaca 3840 aagaaacaca cagctcattt ctcaaaaaaa ggggaggaag aaaacttgga aggcttggga 3900 aatcaaacca agcaaattgt agagaaatat gcatgcacca caaggatatc tcctaataca 3960 agccagcaga attttgtcac gcaacgtagt aagagagctt tgaaacaatt cagactccca 4020 ctagaagaaa cagaacttga aaaaaggata attgtggatg acacctcaac ccagtggtcc 4080 aaaaacatga aacatttgac cccgagcacc ctcacacaga tagactacaa tgagaaggag 4140 aaaggggcca ttactcagtc tcccttatca gattgcctta cgaggagtca tagcatccct 4200 caagcaaata gatctccatt acccattgca aaggtatcat catttccatc tattagacct 4260 atatatctga ccagggtcct attccaagac aactcttctc atcttccagc agcatcttat 4320 agaaagaaag attctggggt ccaagaaagc agtcatttct tacaaggagc caaaaaaaat 4380 aacctttctt tagccattct aaccttggag atgactggtg atcaaagaga ggttggctcc 4440 ctggggacaa gtgccacaaa ttcagtcaca tacaagaaag ttgagaacac tgttctcccg 4500 aaaccagact tgcccaaaac atctggcaaa gttgaattgc ttccaaaagt tcacatttat 4560 cagaaggacc tattccctac ggaaactagc aatgggtctc ctggccatct ggatctcgtg 4620 gaagggagcc ttcttcaggg aacagaggga gcgattaagt ggaatgaagc aaacagacct 4680 ggaaaagttc cctttctgag agtagcaaca gaaagctctg caaagactcc ctccaagcta 4740 ttggatcctc ttgcttggga taaccactat ggtactcaga taccaaaaga agagtggaaa 4800 tcccaagaga agtcaccaga aaaaacagct tttaagaaaa aggataccat tttgtccctg 4860 aacgcttgtg aaagcaatca tgcaatagca gcaataaatg agggacaaaa taagcccgaa 4920 atagaagtca cctgggcaaa gcaaggtagg actgaaaggc tgtgctctca aaacccacca 4980 gtcttgaaac gccatcaacg ggaaataact cgtactactc ttcagtcaga tcaagaggaa 5040 attgactatg atgataccat atcagttgaa atgaagaagg aagattttga catttatgat 5100 gaggatgaaa atcagagccc ccgcagcttt caaaagaaaa cacgacacta ttttattgct 5160 gcagtggaga ggctctggga ttatgggatg agtagctccc cacatgttct aagaaacagg 5220 gctcagagtg gcagtgtccc tcagttcaag aaagttgttt tccaggaatt tactgatggc 5280 tcctttactc agcccttata ccgtggagaa ctaaatgaac atttgggact cctggggcca 5340 tatataagag cagaagttga agataatatc atggtaactt tcagaaatca ggcctctcgt 5400 ccctattcct tctattctag ccttatttct tatgaggaag atcagaggca aggagcagaa 5460 cctagaaaaa actttgtcaa gcctaatgaa accaaaactt acttttggaa agtgcaacat 5520 catatggcac ccactaaaga tgagtttgac tgcaaagcct gggcttattt ctctgatgtt 5580 gacctggaaa aagatgtgca ctcaggcctg attggacccc ttctggtctg ccacactaac 5640 acactgaacc ctgctcatgg gagacaagtg acagtacagg aatttgctct gtttttcacc 5700 atctttgatg agaccaaaag ctggtacttc actgaaaata tggaaagaaa ctgcagggct 5760 ccctgcaata tccagatgga agatcccact tttaaagaga attatcgctt ccatgcaatc 5820 aatggctaca taatggatac actacctggc ttagtaatgg ctcaggatca aaggattcga 5880 tggtatctgc tcagcatggg cagcaatgaa aacatccatt ctattcattt cagtggacat 5940 gtgttcactg tacgaaaaaa agaggagtat aaaatggcac tgtacaatct ctatccaggt 6000 gtttttgaga cagtggaaat gttaccatcc aaagctggaa tttggcgggt ggaatgcctt 6060 attggcgagc atctacatgc tgggatgagc acactttttc tggtgtacag caataagtgt 6120 cagactcccc tgggaatggc ttctggacac attagagatt ttcagattac agcttcagga 6180 caatatggac agtgggcccc aaagctggcc agacttcatt attccggatc aatcaatgcc 6240 tggagcacca aggagccctt ttcttggatc aaggtggatc tgttggcacc aatgattatt 6300 cacggcatca agacccaggg tgcccgtcag aagttctcca gcctctacat ctctcagttt 6360 atcatcatgt atagtcttga tgggaagaag tggcagactt atcgaggaaa ttccactgga 6420 accttaatgg tcttctttgg caatgtggat tcatctggga taaaacacaa tatttttaac 6480 cctccaatta ttgctcgata catccgtttg cacccaactc attatagcat tcgcagcact 6540 cttcgcatgg agttgatggg ctgtgattta aatagttgca gcatgccatt gggaatggag 6600 agtaaagcaa tatcagatgc acagattact gcttcatcct actttaccaa tatgtttgcc 6660 acctggtctc cttcaaaagc tcgacttcac ctccaaggga ggagtaatgc ctggagacct 6720 caggtgaata atccaaaaga gtggctgcaa gtggacttcc agaagacaat gaaagtcaca 6780 ggagtaacta ctcagggagt aaaatctctg cttaccagca tgtatgtgaa ggagttcctc 6840 atctccagca gtcaagatgg ccatcagtgg actctctttt ttcagaatgg caaagtaaag 6900 gtttttcagg gaaatcaaga ctccttcaca cctgtggtga actctctaga cccaccgtta 6960 ctgactcgct accttcgaat tcacccccag agttgggtgc accagattgc cctgaggatg 7020 gaggttctgg gctgcgaggc acaggacctc tactga 7056 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 2 tttgagaagc tgaattttgt gc 22 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 3 gaagcatgga gatggattca tta 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 4 tcaggaggta gcacatacat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 5 gtccaatatc tgaaatctgc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 6 cccttgcaac aacaacatga 20 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 7 tttcttcagg ttataagggg aca 23 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 8 caccatgctt cccatatagc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 9 atggcttcag gatttgttgg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 10 gatccatcac ctggagcaat 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 11 gggccatcaa tgtgagtctt 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 12 ccccaaaggt gatatggttt t 21 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 13 tcagtgttca catttttatt tcca 24 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 14 cattacttcc agctgctttt tg 22 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 15 tttggcagct gcacttttta 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 16 tggtggagtg gagagaaaga a 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 17 agcatggagc ttgtctgctt 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 18 ctgtgctttg cagtgaccat 20 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 19 ttctacaaca gaggaagtgg tga 23 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 20 aaccaatgta tctcatgctc atttt 25 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 21 ggaagaaagc tgtaaagaag taggc 25 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 22 ttgacagaaa ttgcttttta ctctg 25 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 23 tcccccagtc tcaggataac t 21 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 24 catgacaatc acaatccaaa ata 23 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 25 catgtgagct agtgggcaaa 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 26 ctgggaatgg gagagaacct 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 27 atgtccccac tgtgatggag 20 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 28 ccacagctta gattaaccct ca 22 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 29 tgagcttgca agaggaataa gtaa 24 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 30 tgggaatttc tgggagtaaa tg 22 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 31 aagctctagg agaggtggta ttttt 25 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 32 tagcagcctc ccttttgcta 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 33 ctaacccgat gtctgcacct 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 34 ggagaaacct gcatgaaagc 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 35 ttggccatca caaatttcaa 20 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 36 ttcttgttga tcctagtcgt ttt 23 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 37 gctggagaaa ggaccaacat a 21 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 38 tgctagctcc tacctgacaa ca 22 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 39 cattcattat ctggacatca ctttg 25 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 40 catgtttctt tgagtgtaca gtgg 24 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 41 ttcaggtgaa ggaacacaaa tg 22 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 42 ggatgacacc tcaacccagt 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 43 ccttccacga gatccagatg 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 44 actgaggctg aagcatgtcc 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 45 cccaaccact gctctgagtc 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 46 gcatgcttct ccactgtgac 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 47 gccaccatta caaagcacac 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 48 aggttggact ggcataaaaa 20 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 49 ccctggatca agtctcattt g 21 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 50 tgcaaatgtg catttttctg a 21 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 51 cctccagccc cctttactat 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 52 agctcatgga cctgctttgt 20 <210> 53 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 53 cattctcttg gattaatgtt tcct 24 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 54 gcggtcattc atgagacaca 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 55 ccgagctgtt tgtgaactga 20 <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 56 tgaggcattt ctacccactt g 21 <210> 57 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 57 ccaaaagtgg gaatacatta tagtca 26 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 58 tgtcctagca agtgttttcc att 23 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 59 aatgtcccct tcagcaacac 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 60 ccacccccat aagattgtga 20 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 61 ctgaagaaac cagcaggaaa a 21 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 62 tccctacgga aactagcaat g 21 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 63 tcacaagagc agagcaaagg 20 <210> 64 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 64 tctcctccta gtgacaattt cc 22 <210> 65 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 65 ccatctcctt cattcctga 19 <210> 66 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 66 tttgagccta cctagaattt ttcttc 26 <210> 67 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 67 ggtattttag aaactcaaaa ctctcc 26 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 68 cagcatccat cttctgtacc a 21 <210> 69 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 69 aaagcttctt attgcacgta gg 22 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 70 tccaagcagc agaaacctat t 21 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 71 agtaatggcc cctttctcct 20

Claims

서열번호 1의 염기서열로 이루어진 천연 FⅧ 유전자 중에서,
5953번 위치의 염기 C가 결손(deletion)되는 결손 돌연변이체;
207번 및 208번 위치의 염기 GT가 결손되는 결손 돌연변이체;
5860번 내지 5865번 위치의 염기 GCTCAG가 결손되는 결손 돌연변이체;
5471번 위치의 염기 A가 결손되는 결손 돌연변이체;
5825번 위치의 염기 G가 A로 치환되는 미스센스 돌연변이체;
6406번 위치의 염기 G가 A로 치환되는 미스센스 돌연변이체;
4076번 위치의 염기 G가 A로 치환되는 넌센스 돌연변이체; 및
6283번 위치 및 6284번 위치 사이에 염기 A가 삽입되는 삽입 돌연변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 FⅧ 유전자의 돌연변이체.
제1항에 있어서, 혈우병 A의 진단에 이용되는 것을 특징으로 하는 FⅧ 유전자의 돌연변이체.
혈우병 A 의심 환자로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하여 제1항의 돌연변이체 부위의 유전자를 증폭하는 단계; 및
상기 증폭된 유전자를 동정하는 단계를 포함하는 제1항의 FⅧ 유전자의 돌연변이체를 검출하는 방법.
혈우병 A 의심 환자로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하여 제1항의 돌연변이체 부위의 유전자를 증폭하는 단계;
상기 증폭된 유전자를 동정하는 단계; 및
상기 동정된 유전자를 제1항의 FⅧ 유전자의 돌연변이체와 비교하는 단계를 포함하는 혈우병 A를 진단하는 방법.
제1항의 FⅧ 유전자의 돌연변이체의 존재 여부를 확인하는 제제를 포함하는 혈우병 A 진단용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 제제는 상기 돌연변이체에 특이적으로 결합하는 프라이머를 포함하는 것인 혈우병 A 진단용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 제제는 상기 돌연변이체에 특이적으로 결합하는 프로브를 포함하는 것인 혈우병 A 진단용 조성물.
제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 혈우병 A 진단용 키트.