CN102424842B

CN102424842B - 沙门氏菌的lamp检测方法及其专用引物与试剂盒

Info

Publication number: CN102424842B
Application number: CN2011104332623A
Authority: CN
Inventors: 刘威; 黄留玉; 袁静; 邹大阳; 尹志涛; 尚伟; 李云梅; 郭晶
Original assignee: Institute of Disease Control and Prevention of PLA
Current assignee: Institute of Disease Control and Prevention of PLA
Priority date: 2011-12-21
Filing date: 2011-12-21
Publication date: 2013-08-07
Anticipated expiration: 2031-12-21
Also published as: CN102424842A

Abstract

本发明公开了沙门氏菌的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒。所述专用引物是根据如序列表中序列1所示的沙门氏菌的特异性保守靶序列invA基因设计的，用以定性检测待测样品中的沙门氏菌。本发明可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到沙门氏菌，不需要复杂仪器，为沙门氏菌的检测提供了新的技术平台，可用于畜牧业生产单位、基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测沙门氏菌，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。

Description

沙门氏菌的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域中细菌的分子生物学检测方法，特别是涉及沙门氏菌的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒。

背景技术

在各种畜产品中，细菌性食物中毒最为常见，而由沙门氏菌引起的食物中毒病例在食物中毒中居于前列。动物性产品中含有多种丰富的营养成分，非常适宜沙门氏菌的生长繁殖，人们一旦摄入了含有大量沙门氏菌的动物性产品，就会引起细菌性感染，进而在毒素的作用下发生食物中毒。沙门氏菌不仅危害人类健康，还会给畜牧业带来巨大的经济损失。由沙门氏菌引起的疾病主要分为两大类：一类是伤寒和副伤寒，另一类是急性肠胃炎。鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌等污染动物性产品是引起人类沙门氏菌食物中毒的主要致病菌。沙门氏菌污染主要来源于患病的人和动物及其带菌者，主要由其粪便、尿、乳汁以及流产胎儿、胎衣和羊水排出的病菌污染水源、土壤和饲料等，其中饲料和水源的污染是导致沙门氏菌传染的主要原因。畜禽感染沙门氏菌可引起相应的传染病，如猪霍乱、鸡白痢等。一般情况下，畜禽肠道带菌率比较高，当动物因患病、衰弱、营养不良、疲劳以致抵抗力降低时，肠道中的沙门氏菌即可经肠系膜淋巴结和组织进入血液引起全身感染，甚至死亡。例如，猪霍乱沙门氏菌可引起仔猪副伤寒，急性病例出现败血症变化，死亡率相当高。慢性病例产生坏死性肠炎，影响猪的生长发育。鸡白痢沙门氏菌，主要侵害雏鸡，引起败血症，可造成大批死亡。在成年母鸡则主要引起卵巢炎，可在卵黄内带菌而传给幼雏。沙门氏菌引起的食物中毒一般在5-10月份最易发生。人食用沙门氏菌污染的食物后，一般8-24h后发病，潜伏期最短2h，长者可达72h。沙门氏菌食物中毒主要有三种表现类型，即胃肠炎型、伤寒型和败血症型，以胃肠炎型最为常见。

环介导的等温核酸扩增技术(LAMP)是由T.Notomi(Notomi T，Okayama H，MasubuchiH，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res2000；28(12)：63.)发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、快速、高特异地扩增靶序列。近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。Masaki Imai等人(Imai M，Ninomiya A，Minekawa H，et al.Rapid diagnosis of H5N 1avian influenza virus infection bynewly developed influenza H5 hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermalamplification method.J Virol Methods.2007；141(2)：173-80.)利用LAMP建立了禽流感病毒的实验室确诊体系；Nobuyuki Hayashi等人(Hayashi N，Arai R，Tada S，Taguchi H，Ogawa Y.Detection and identification of Brettanomyces/Dekkera sp.yeasts with aloop-mediated isothermal amplification method.Food Microbiol.2007；24(7-8)：778-85.)针对四种香酒酵母的ITS序列设计了LAMP特异性引物，建立了高效的LAMP检测体系。LAMP还可以检测其它与人类相关的病毒，如病毒性出血性败血病(VHS)、巨细胞病毒(CMV)、埃博拉病毒(EBOV)、慢性伯基特淋巴瘤病毒(EBV)、虹彩病毒、人类疮疹病毒8型、造血组织坏死病毒(工HHNV)、番茄斑萎病毒和番茄黄化曲叶病毒等。但是迄今为止，市场上还未见用于检测沙门氏菌的LAMP专用引物与试剂盒问世。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性和灵敏度较高的用于检测沙门氏菌的LAMP检测专用引物。

本发明所提供的用于对沙门氏菌进行LAMP检测的专用引物，是根据如序列表中序列1所示的沙门氏菌的特异性保守靶序列invA基因设计的，用以定性检测待测样品中的沙门氏菌。

具体来讲，所述用于对沙门氏菌进行LAMP检测的专用引物为以下三组引物对混合的引物组合，第一组引物对：引物1(F3)，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，引物2(B3)，其核苷酸序列如序列表中序列3所示；第二组引物对：引物3(FIP)，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，引物4(BIP)，其核苷酸序列如序列表中序列5所示；第三组引物对：引物5(LF)，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，引物6(LB)，其核苷酸序列如序列表中序列7所示。

所述引物组合中各引物对(FIP和BIP)∶(LF和LB)∶(F3和B3)的摩尔比为40∶20∶5。

本发明的第二个目的是提供一种沙门氏菌的LAMP检测方法。

本发明所提供的沙门氏菌的LAMP检测方法，可包括以下步骤：

1)以待测物的基因组DNA为模板，在上述引物的引导下进行LAMP扩增；

2)反应结束后进行结果判定：在反应液中添加羟基萘酚兰(HNB)，根据反应液的颜色变化判断结果，天蓝色表示待测样品中存在沙门氏菌，紫色表示待测样品中不存在沙门氏菌；或者不添加HNB直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，浊度上升表示待测样品中存在沙门氏菌，浊度无变化表示待测样品中不存在沙门氏菌。

在上述沙门氏菌的LAMP检测方法中，所述步骤1)中的待测物包括纯菌、食品、痰液、尿液和粪便等样品；所述25μl LAMP反应体系可包括：待测物的基因组DNA2μl，20mM Tris·HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％ Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO₄，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase，引物加入量为：40pmol FIP和BIP，20pmol LF和LB，5pmol F3和B3。

所述步骤1)中的LAMP扩增条件可为：置60-65℃恒温40-60min(优选50min)。

所述步骤2)中羟基萘酚兰的添加量可为1.25μl(终反应体系为26.25μl)，浓度为2.4mmol/L。

本发明的第三个目的是提供一种用于对沙门氏菌进行LAMP检测的试剂盒。

本发明所提供的试剂盒，包括上述用于对沙门氏菌进行LAMP检测的引物。

为方便检测，所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为沙门氏菌的DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系(如双蒸水)。

具体的，该沙门氏菌的LAMP检测试剂盒包括：20mM Tris·HCl(pH 8.8)，10mMKCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％ Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO₄，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase，40pmol FIP和BIP，20pmol LF和LB，5pmol F3和B3，羟基萘酚兰指示剂，沙门氏菌的基因组DNA(25μl LAMP反应体系中使用2μl)和双蒸水。

采用以上方案，本发明具有以下优点：

1)高特异性：6条引物对沙门氏菌靶序列的8个特异区域的识别保证了LAMP扩增的高度特异性，即LAMP能从相差仅一个核苷酸的基因标本中找出相应的靶序列进行扩增；

2)高灵敏度：灵敏度比普通PCR方法高10倍；

3)结果鉴定简便：可通过肉眼观察结果(HNB显色)，也可以直接用浊度仪判断结果；

4)操作简单：只要将检测样品(靶核酸)和检测试剂一起放入60-65℃恒温水浴锅中50分钟后就可以判断结果；

5)快速、高效扩增：整个LAMP扩增反应一小时内即可完成，且产率可达到0.5mg/mL。

综上所述，本发明可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到沙门氏菌，不需要复杂仪器，为沙门氏菌的检测提供了新的技术平台，可用于畜牧业生产单位、基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测沙门氏菌，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为本发明沙门氏菌LAMP检测方法特异性的浊度仪检测结果

图2为本发明沙门氏菌LAMP检测方法特异性的HNB染色检测结果

图3为本发明沙门氏菌的LAMP检测方法对沙门氏菌特异性的浊度仪检测结果

图4为本发明沙门氏菌的LAMP检测方法特异性的HNB染色检测结果

图5为本发明沙门氏菌的LAMP检测方法对沙门氏菌灵敏度的浊度仪检测结果

图6为本发明沙门氏菌的LAMP检测方法灵敏度的HNB染色检测结果

图7为沙门氏菌的PCR检测结果

具体实施方式

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、用于对沙门氏菌进行LAMP检测的引物设计

从美国基因数据库检索获得沙门氏菌序列(GenBank号：NC_003197.1)，通过BLAST软件进行同源性分析，获得沙门氏菌的特异性保守靶序列invA基因(序列表中序列1)，再根据该保守靶DNA序列，用软件Primer design V4设计用于对沙门氏菌进行LAMP检测的引物，结果优化得到三组引物对，F3和B3为第一组，FIP和BIP为第二组，LF和LB为第三组，具体引物序列如表1。应用中，三组引物对可以任意比例混合使用，实施例2反应体系中给出了一种具体优化组配作为示例。

表1用于对沙门氏菌进行LAMP检测的引物

引物名称	序列(5’-3’)
		F3	CATCAGCAAGGTAGCAGT(序列表中序列2)
B3	AGCATATGTTTTGTTTCCTGA(序列表中序列3)
		FIP	GCAACACATAGCCAAGCTCC-CAGTATTTCTGGGTAACGCA(序列表中序列4)

BIP	GAACGCGCTTGATGAGCTTT-ATACCGAAATATTCATTGACGT(序列表中序列5)
		LF	CGGAGTTTCTCCCCCTCTT(序列表中序列6)
LB	TGTCTGGCGGTGACGCT(序列表中序列7)

实施例2、本发明沙门氏菌的LAMP检测方法的建立

用实施例1获得的用于对沙门氏菌进行LAMP检测的六条引物对肠炎沙门氏菌(来自中国人民解放军疾病预防控制所传染病控制中心)进行LAMP检测，以获得最佳反应体系及反应条件，具体方法如下：

一、最佳反应体系的确定

在相同反应条件(置63℃恒温50min)下，在反应体系中添加不同浓度的Mg²⁺，以确定最佳反应体系，包括以下步骤：

1)以含沙门氏菌基因组DNA(用Promega的Wizard Genomic DNA purification Kit商品化DNA提取试剂盒提取待测样品中的核酸)为模板，在实施例1获得的六条引物的引导下进行LAMP扩增，其中，25μl LAMP反应体系包括：含沙门氏菌的基因组DNA 2μl，20mM Tris·HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％ Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，分别添加(4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM)MgSO₄，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase(购自NEB公司)，加入的引物量为：40pmol FIP和BIP，20pmol LF和LB，5pmol F3和B3；反应条件为置63℃恒温水浴锅中50min。

2)反应结束后进行结果判定：在反应液中添加1.25μl(终反应体系为26.25μl)2.4mmol/L的羟基萘酚兰(HNB)，根据反应液的颜色变化判断结果(原理：羟基萘酚兰是金属离子指示剂，能指示反应液中Mg²⁺的变化。)，天蓝色表示待测样品中存在沙门氏菌(阳性)，紫色表示待测样品中不存在沙门氏菌(阴性)；或者不添加HNB直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果(原理：LAMP反应的过程中会产生焦磷酸镁，焦磷酸镁是一种白色沉淀，浊度仪可以根据浊度的变化来判断LAMP反应。)，浊度上升表示待测样品中存在沙门氏菌(阳性)，浊度无变化表示待测样品中不存在沙门氏菌(阴性)。

在上述引物组合的引导下，用含有不同浓度MgSO₄的反应体系检测待测样品中的沙门氏菌，结果含有8mM MgSO₄的反应体系的检测效果最好，因此，将本发明最佳的沙门氏菌的LAMP检测体系定为(25μl)：待测物的基因组DNA 2μl，20mMTris·HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO₄，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase，加入的引物量为：40pmol FIP和BIP，20pmol LF和LB，5pmol F3和B3。

二、最佳反应条件的确定

在步骤一确定的相同的反应体系下，在不同反应条件下对含沙门氏菌的基因组DNA进行LAMP检测，以确定最佳反应条件，包括以下步骤：

1)以含沙门氏菌的基因组DNA为模板，在实施例1获得的六条引物的引导下进行LAMP扩增，其中，25μl LAMP反应体系包括：含沙门氏菌的基因组DNA 2μl，20mM Tris·HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO₄，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase，加入的引物量为：40pmol FIP和BIP，20pmol LF和LB，5pmol F3和B3。LAMP的扩增条件为：置60-65℃恒温50-60min。

2)结果判定

反应结束后，用与步骤一相同的方法进行结果判定。检测结果表明，本发明最佳的沙门氏菌LAMP扩增条件为：置60-65℃恒温50-60min，优选为55min。

实施例3、本发明沙门氏菌的LAMP检测方法的特异性、灵敏性检测

一、本发明沙门氏菌的LAMP检测方法的特异性检测

分别以肠炎沙门氏菌、甲型副伤寒沙门、副溶血弧菌、宋内志贺氏菌、肠侵袭性大肠杆菌、致病性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌和福氏志贺氏菌(所有菌株均来自中国人民解放军疾病预防控制所传染病控制中心)的基因组DNA为模板，以双蒸水为阴性对照，检测实施例2获得的最佳的沙门氏菌的LAMP检测方法的特异性。

本发明沙门氏菌LAMP检测方法特异性的浊度仪检测结果如图1所示(1阴性对照(双蒸水)；2肠炎沙门氏菌；3甲型副伤寒沙门；4副溶血弧菌；5宋内志贺氏菌；6肠侵袭性大肠杆菌；7致病性大肠杆菌；8肠产毒性大肠杆菌；9鲍曼不动杆菌；10嗜麦芽寡养单胞菌；11福氏志贺氏菌)，本发明沙门氏菌LAMP检测方法特异性的HNB颜色反应检测结果如图2所示(1阴性对照(双蒸水)；2肠炎沙门氏菌；3甲型副伤寒沙门；4副溶血弧菌；5宋内志贺氏菌；6肠侵袭性大肠杆菌；7致病性大肠杆菌；8肠产毒性大肠杆菌；9鲍曼不动杆菌；10嗜麦芽寡养单胞菌；11福氏志贺氏菌)，从图1中可以看出，只有2、3发生了LAMP反应(2、3号试管显示出浅蓝色，表明检测到沙门氏菌)，其余均未发生，而且羟基萘酚兰(HNB)染色方法与浊度仪检测方法的结果一致，表明本发明的沙门氏菌的LAMP检测方法具有较高的特异性，可以特异性地检测到沙门氏菌。

二、本发明沙门氏菌的LAMP检测方法对沙门氏菌的特异性检测

分别以16种沙门氏菌(沙门氏菌10025819551001(SM1)、沙门氏菌10025816251001(SM2)、沙门氏菌10025854361001(SM3)、沙门氏菌10025859981001(SM4)、沙门氏菌10025859211001(SM5)、沙门氏菌10025849671001(SM6)、沙门氏菌10025816741001(SM7)、沙门氏菌10025836541001(SM8)、沙门氏菌10025850221001(SM9)、沙门氏菌10025816581001(SM10)、沙门氏菌10025807331001(SM11)、沙门氏菌10025819301001(SM12)、沙门氏菌10025860041001(SM13)、沙门氏菌10025852381001(SM14)、沙门氏菌10025821361001(SM15)、沙门氏菌10025828541001(SM16))(所有菌株均来自中国人民解放军疾病预防控制所传染病控制中心)的基因组DNA为模板，以双蒸水为阴性对照，检测实施例2获得的最佳的沙门氏菌的LAMP检测方法的特异性。

本发明沙门氏菌的LAMP检测方法对沙门氏菌特异性的浊度仪检测结果如图3所示，羟基萘酚兰(HNB)颜色反应检测结果如图4所示(0号为阴性对照；1号为沙门氏菌10025819551001(SM1)；2号为沙门氏菌10025816251001(SM2)；3号为沙门氏菌10025854361001(SM3)；4号为沙门氏菌10025859981001(SM4)；5号为沙门氏菌10025859211001(SM5)；6号为沙门氏菌10025849671001(SM6)；7号为沙门氏菌10025816741001(SM7)；8号为沙门氏菌10025836541001(SM8)；9号为沙门氏菌10025850221001(SM9)；10号为沙门氏菌10025816581001(SM10)；11号为沙门氏菌10025807331001(SM11)；12号为沙门氏菌10025819301001(SM12)；13号为沙门氏菌10025860041001(SM13)；14号为沙门氏菌10025852381001(SM14)；15号为沙门氏菌10025821361001(SM15)；16号为沙门氏菌10025828541001(SM16))，图3浊度曲线显示所有沙门氏菌菌株均发生了LAMP反应，图4的HNB颜色反应可以看出除0号样品外，1-16号样品均显示浅蓝色，表明检测到沙门氏菌，羟基萘酚兰(HNB)染色方法与浊度仪检测方法的结果一致，说明本发明的沙门氏菌的LAMP检测方法具有较高的特异性，可以特异性地检测到沙门氏菌。

三、本发明沙门氏菌的LAMP检测方法的灵敏度

本实验测试本发明LAMP检测方法与普通PCR方法检测沙门氏菌的灵敏度。方法为：提取沙门氏菌总DNA，然后以10倍梯度(1倍、10倍、10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍)稀释成浓度分别为697ng/μl、69.7ng/μl、6.97ng/μl、697pg/μl、69.7pg/μl、6.97pg/μl、0.697pg/μl、0.06pg/μl，再以经梯度稀释的DNA为模板，分别用本发明的LAMP检测方法与普通PCR方法(引物序列为F3和B3)进行灵敏度检测。

本发明沙门氏菌LAMP检测方法灵敏度的浊度仪检测结果如图5所示(代号1-8模板对应浓度分别为：697ng/μl、69.7ng/μl、6.97ng/μl、697pg/μl、69.7pg/μl、6.97pg/μl、0.697pg/μl、0.06pg/μl)，代号1-6浊度上升表示检测到沙门氏菌，表明本发明引物组合对沙门氏菌的最低检测灵敏度为6.97pg/μl；本发明沙门氏菌LAMP检测方法灵敏度的HNB颜色反应检测结果如图6所示(代号1-8模板对应浓度分别为：697ng/μl、69.7ng/μl、6.97ng/μl、697pg/μl、69.7pg/μl、6.97pg/μl、0.697pg/μl、0.06pg/μl)，其中1-6号试管显示出浅蓝色，检测到沙门氏菌，表明本发明引物组合对沙门氏菌的最低检测灵敏度也为6.97pg/μl；对沙门氏菌的PCR检测结果如图7所示(代号1-8模板对应浓度分别为：697ng/μl、69.7ng/μl、6.97ng/μl、697pg/μl、69.7pg/μl、6.97pg/μl、0.697pg/μl、0.06pg/μl，M为DNA marker D2000，代号1-5样品出现目标条带，表明PCR方法的检测灵敏度为69.7ng/μl。比较可知，本发明沙门氏菌的LAMP检测方法可检测到6.97pg/μl，而普通PCR方法仅能检测到69.7pg/μl，而且羟基萘酚兰(HNB)染色方法及浊度仪检测方法的结果一致，表明本发明沙门氏菌的LAMP检测法比普通PCR检测方法的灵敏度高10倍。

实施例4、制备用于沙门氏菌LAMP检测的试剂盒

将20mM Tris·HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO₄，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase，引物：40pmol FIP和BIP，20pmol LF和LB，5pmol F3和B3，羟基萘酚兰指示剂(用染色法检测时使用)，以及作为阳性对照的沙门氏菌的基因组DNA 2μl，作为阴性对照的不含DNA的LAMP扩增体系(双蒸水)共同包装，再配以产品使用说明书(记载染色法和浊度法两种检测方法)，得到用于沙门氏菌的LAMP检测的试剂盒。

Claims

1.用于对沙门氏菌进行LAMP检测的专用引物，是根据序列表中序列1所示的沙门氏菌的特异性保守靶序列invA基因设计的，用以定性检测待测样品中的沙门氏菌；所述的专用引物为以下三组引物对混合的引物组合，第一组引物对：引物1—F3，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，引物2—B3，其核苷酸序列如序列表中序列3所示；第二组引物对：引物3—FIP，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，引物4—BIP，其核苷酸序列如序列表中序列5所示；第三组引物对：引物5—LF，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，引物6—LB，其核苷酸序列如序列表中序列7所示。

2.根据权利要求1所述的专用引物，其特征在于：所述引物组合中各引物对（FIP和BIP）：（LF和LB）：（F3和B3）的摩尔比为40：20：5。

3.一种沙门氏菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的对沙门氏菌进行LAMP检测的专用引物。

4.根据权利要求3所述的沙门氏菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，还包括作为阳性对照的沙门氏菌的基因组DNA，作为阴性对照的不含DNA的LAMP扩增体系。

5.根据权利要求4所述的沙门氏菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，作为阴性对照的为双蒸水。

6.根据权利要求3或4或5所述的沙门氏菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括：20mM pH8.8的Tris·HCl，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱，8mM MgSO₄，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase，40pmol FIP和BIP，20pmol LF和LB，5pmol F3和B3，羟基萘酚兰指示剂，沙门氏菌的基因组DNA和双蒸水。