CN113201584B

CN113201584B - 多重目标核酸的检测方法、试剂盒以及用途

Info

Publication number: CN113201584B
Application number: CN202110641181.6A
Authority: CN
Inventors: 蒋健晖; 楚霞; 唐昊; 唐丽娟
Original assignee: Hunan Rongjian Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hunan Rongjian Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-06-09
Filing date: 2021-06-09
Publication date: 2022-11-04
Anticipated expiration: 2041-06-09
Also published as: CN113201584A

Abstract

本发明提供了一种多重目标核酸的检测方法，所述方法包括以下步骤：(1)根据多重目标核酸制备环介导等温扩增反应所需的混合物；其中所述混合物包括分别针对多重目标核酸设计的引物和探针组，所述引物和探针组中的每组包括2条外引物F3和B3、2条内引物FIP和BIP以及环引物和蝎状引物探针；待检测的核酸；(2)将步骤(1)所述的混合物置于恒定温度下进行扩增反应；(3)检测步骤(2)的反应结果。本发明提供的方法对待检测的目标核酸没有依赖性，针对每种目标核酸，选择合适的扩增区域，进行配套的引物设计即可开展目标核酸的检测分析。

Description

多重目标核酸的检测方法、试剂盒以及用途

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种多重目标核酸的检测方法。

背景技术

近几年来，一系列基因检测方法层出不穷，同时经典的方法也在不断地被改进，由于环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术的发展，大大促进了基因检测研究的发展和应用。环介导等温扩增技术是由Notomi等建立的一种新的核酸特异性扩增技术，具有特异性强、灵敏高、操作简单、产物易检测等优点。该技术已被广泛用于分子诊断领域。LAMP针对靶序列的6个特异部位设计4条核心引物，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，从而使靶序列高效扩增。4条核心引物之中2条为内引物，即FIP(Forward inner primer，FIP)和BIP(Backward inner primer，BIP)。FIP包含Flc和F2(F2c区域的互补序列)，即5’-Flc-F2；BIP包含B1c(B1区域的互补序列)和B2，即5’-Blc-B2。其余两条核心引物为外引物为F3和B3。另外的两条环引物(Loopprimes，LF和LB)被增加到反应体系中加速LAMP反应。环介导等温扩增反应只需要把基因模板、引物、链置换型DNA聚合酶、dNTP等共同置于一定温度下(60-65℃)、经一个步骤即可完成。反应扩增效率极高，可在15-60min内实现10⁹-10¹⁰倍的扩增，加之其有较高的灵敏度与专一性，非常适合应用于各种核酸检测。

LAMP扩增之后，其产物的检测可以通过琼脂糖电泳后染色观察。较为简便的方法是直接在产物中加入SYBR Green I染色，呈现绿色为阳性反应，橙红色为阴性反应。也可以通过扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度进行判断，液体浑浊，离心或有白色沉淀的为阳性反应，无此现象的则为阴性反应。现在更为简单的方法是在反应混合物中加入可视染料，阳性反应管的颜色从浅灰色变为绿色，阴性反应管则保持原来的浅灰色。然而，这些方法都只能检测LAMP反应是否进行，不能识别针对特定靶序列的特异性扩增，导致LAMP在检测目的序列时，其结果的判定缺乏特异性。因此，传统LAMP检测很难实现对多重目的片段的同时检测，这极大限制了LAMP的广泛应用。

鉴于上述问题，一些研究致力于发展多重LAMP检测技术。实现多重LAMP检测最常见的方法是在靶序列中寻找限制性内切酶酶切位点，将LAMP产物运用限制性内切酶消化，通过电泳消化后的LAMP产物，根据不同的电泳条带大小与相应的靶序列对应。然而，该方法需要两步完成，限制性内切酶酶切片段大小各异的LAMP产物时，耗时较长且酶切不完全，导致一条靶序列常常对应了几条电泳条带，使得多重LAMP的结果难判断。另一种实现多重LAMP检测的新技术是将LAMP扩增反应和焦磷酸测序结合。然而，该方法与限制性内切酶介导的多重LAMP检测技术一样，都需要两步完成，首先是LAMP扩增，然后通过焦磷酸测序对应到相应的靶序列。该方法操作繁琐，需要特定的试剂盒对LAMP产物进行纯化，测序过程需要特殊人员，以及普通实验室无法负担的测序仪和测序试剂。这些劣势限制了该方法的推广使用。

此外，现存的多重LAMP检测技术都无法实现快速检测，完成多重LAMP检测耗时大于2.5小时。由于LAMP反应的灵敏度极高，实行LAMP产物的开盖操作对以后的LAMP实验存在极大的污染。

综上，现有技术中的LAMP不论在单一扩增还是多重扩增的检测上都存在着难以克服的技术问题基于此，当前对能同时检测多重目标核酸的环介导等温扩增方法存在需求。

发明内容

因此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种单管检测多重目标核酸的环介导恒温扩增方法。本发明的技术方案中，通过在反应引物中设计蝎状引物探针，实现了同时检测多重目标核酸的目的。本发明的目的为基于LAMP检测技术提供了一种高灵敏性、检测简便、省时的方法，可以广泛应用于细菌类病原微生物的检测，病毒类病原微生物的检测，真菌类微生物的检测，现场病原寄生虫的检测，转基因产品成分检测等。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

一方面，本发明提供了一种多重目标核酸的检测方法，所述方法包括以下步骤：

(1)根据多重目标核酸制备环介导等温扩增反应所需的混合物；

其中所述混合物包括分别针对多重目标核酸设计的引物和探针组，所述引物和探针组中的每组包括2条外引物F3和B3、2条内引物FIP和BIP、环引物和蝎状引物探针；待检测的核酸；

(2)将步骤(1)所述的混合物置于恒定温度下进行扩增反应；

(3)检测步骤(2)的反应结果。

根据本发明所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述蝎状引物探针的上游区域包含发夹结构，下游区域包含与环引物特异性互补的片段，所述互补的片段长度优选与环引物长度相同；并且，所述蝎状引物探针的5’端碱基上标记荧光基团，与其互补配对的对应碱基上标记淬灭基团；

优选地，所述引物和探针组中的每组的蝎状引物探针所标记的荧光基团不同；

优选地，所述蝎状引物探针的径区包含7～8个碱基，环区包含7～8个碱基；

优选地，所述荧光基团为FAM、TAMRA和/或Cy5，淬灭基团为BHQ1和/或BHQ2。

根据不同的目标序列，设计不同的环引物，以及不同的蝎状引物探针，标记不同的荧光基团，即可实现多重目标核酸的检测。其中，针对不同的目标的蝎状引物探针的荧光基团和淬灭基团必须不同。

根据本发明所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述反应混合物还包含dNTP和聚合酶，优选为Bst 2.0WarmStart^TM聚合酶；当所述待检测核酸包含RNA时，所述混合物还包含逆转录酶，优选为AMV逆转录酶；

优选地，所述反应混合物进一步包含一种或多种选自下组的成分：Mg²⁺、K⁺、NH₄ ⁺、H⁺、Cl-、SO₄ ²-、Tris-HCl和细胞表面活性剂；

更优选地，所述反应混合物包含Tris-HCl、KCl、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄、

X-100。

在一个优选的实施例中，用于检测包含三种目标核酸的待检测核酸的方法包括：

三种目标核酸分别对应的外引物F3、B3，内引物FIP、BIP，环引物LF，蝎状引物探针SP，10×Thermopol缓冲溶液(200mM Tris-HCl，100mM(NH₄)₂SO₄，100mM KCl，20mM MgSO₄，1％

X-100，pH 8.8)，三种目标核酸，MgSO₄，dNTP，AMV逆转录酶，Bst 2.0WarmStart^TM聚合酶。

根据本发明所述的方法，其中，在步骤(2)中，所述反应的温度为60-65℃，优选为63-64℃。

根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(3)中，所示检测使用实时定量PCR仪，在一个优选的实施方案中各位伯乐实时定量PCR仪C1000 Thermal Cycler。

根据本发明所述的方法，其中所述多重目标核酸和/或待检测的核酸为RNA和/或DNA。

根据本发明所述的方法，其中所述多重目标核酸和/或待检测的核酸选自两种或多种病毒、细菌、真菌、病源寄生虫的RNA和/或DNA；

优选地，所述多重目标核酸和/或待检测的核酸选自梅毒螺旋菌、虾白斑综合征病毒和/或猪流行性乙型脑炎病毒的RNA和/或DNA；

优选地，所述多重目标核酸和/或待检测的核酸为乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、禽流感病毒、SARS病毒和新型冠状病毒的两种、三种、四种、五种或六种的RNA和/或DNA；

更优选地，所述多重目标核酸和/或待检测的核酸为乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)的RNA和/或DNA；

更优选地，所述多重目标核酸和/或待检测的核酸为禽流感病毒、SARS病毒和新型冠状病毒的RNA。

在一个具体的实施方案中，所述引物和探针组包含如SEQ ID NO:1-18所示的序列中的一条或多条；

优选地，所述引物和探针组包含SEQ ID NO:1-5和16所示的引物和探针组、SEQ IDNO:6-10和17所示的引物和探针组以及SEQ ID NO:11-15和18所示的引物和探针组中的任一组或任两组；

更优选地，所述引物和探针组如SEQ ID NO:1-18所示。

另一方面，本发明还提供了一种检测多重目标核酸的试剂盒，所述试剂盒包含反应混合物，所述反应混合物包括针对多重目标核酸设计的引物和探针组，所述引物和探针组中的每组包括2条外引物F3和B3、2条内引物FIP和BIP、环引物以及蝎状引物探针；

优选地，所述试剂盒还包含：dNTP和聚合酶，优选为Bst 2.0WarmStart^TM聚合酶；

当所述多重目标核酸包含RNA时，所述混合物还包含逆转录酶，优选为AMV逆转录酶；

优选地，所述反应混合物进一步包含一种或多种选自下组的成分：Mg²⁺、K⁺、NH₄ ⁺、H⁺、Cl-、SO₄ ²-、Tris-HCl和细胞表面活性剂；更优选地，所述反应混合物包含Tris-HCl、KCl、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄、

X-100；

优选地，所述蝎状引物探针的上游区域包含发夹结构，下游区域包含与环引物特异性互补的片段，所述互补的片段长度优选与环引物长度相同；并且，所述蝎状引物探针的5’端碱基上标记荧光基团，与其互补配对的对应碱基上标记淬灭基团；

优选地，所述引物和探针组的每组的蝎状引物探针标记的荧光基团不同；

再一方面，本发明提供了一种微生物的检测方法，其包括采用所述方法或试剂盒检测来自待测微生物的核酸；

其中，所述微生物为两种或多种真菌、细菌、寄生虫和/或病毒。

结合说明书附图1，根据本发明所述的恒温扩增方法的反应机制简述如下：

在环介导等温扩增反应中，除了反应所需的2条外引物、2条内引物、1条环引物，再添加一条蝎状引物探针。所述蝎状引物探针的上游区域是一个普通的发夹结构，径区7个碱基，环区8个碱基，在其5’端碱基处标上荧光基团，其互补配对的对应碱基标上淬灭基团，下游区域是与目标的环引物特异性互补，序列长度与环引物相同。

反应第一阶段是哑铃状链的形成。双链DNA模板在等温64℃的条件下，首先由内引物FIP的F2区域，特异性识别模板F2c区域，在DNA聚合酶作用下形成一条新的双链DNA，此时外引物F3通过与新合成双链DNA的F3c区域互补配对，置换FIP合成的新链的同时形成自身DNA双链。被置换出的FIP新链5’端具有F1c和F1的互补区域，可自身形成环状结构。同理，另一条内引物BIP此时能与上述环状单链杂交，环状结构被打开合成互补链。在外引物B3的作用下，形成新的双链DNA。反应的第二个阶段为循环扩增阶段。哑铃状结构以自身为模板，在内引物的作用下自我引导合成DNA链。FIP引物F2与F2c杂交，形成新的DNA链，而B1与B1c能互补结合再次形成环状结构，置换出之前的互补链。同理，BIP引物的B2与B2c互补结合，形成新的DNA链，置换出先前合成的DNA链，新链中的F1与F1c互补结合形成环状结构，如此不断的重复扩增，最终的产物是一些具有不同茎长度茎环结构的DNA和带有许多环的类似花椰莱结构的DNA的混合物。

反应中的环引物也是通过茎环结构杂交，启动链置换DNA的合成，其结合区域分别位于F1和F2间以及B1和B2间。环引物的加入，不但对原来内引物的结合没有影响，而且可以结合内引物无法结合的其他环结构并引发链置换DNA合成，因此保证了扩增反应中所有形成的环状单链结构都有相应的引物与之结合，引发DNA合成，从而大大提高LAMP反应速度。在该反应中，新添加的SP探针也是扮演着环引物的作用，与反应过程中生成大量的哑铃式单链结构杂交进行聚合延伸，打开发夹结构，使其荧光恢复，通过伯乐实时定量PCR仪实时监测反应扩增情况。当仪器采集到FAM的荧光信号，表示检测到HBV；当采集到TAMRA的荧光信号，表示检测到HCV；当采集到Cy5的荧光信号，表示检测到HIV，即实现对多重目标核酸进行核酸分析的目的。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明提供的方法不需要复杂可控的温控设备即可完成对核酸的定量分析，实验步骤简单，利用环介导等温扩增的优势缩短反应时间、提高反应效率、重复性高、通用性好、有利于高通量应用，为基因诊断和治疗等研究提供了一种高灵敏性、检测简便性、省时性的核酸分析方法。

2.本发明提供的方法用蝎状引物探针做信号检测，在溶液中发生环介导等温扩增反应，反应过程中生成大量的哑铃式单链结构，蝎状引物探针与其杂交进行聚合延伸，打开发夹结构荧光恢复，通过伯乐实时定量PCR仪实时监测反应扩增情况，实现对多重目标核酸分析的目的。

3.本发明提供的方法对目标核酸序列没有依赖性，针对每种目标核酸，选择合适的扩增区域，进行配套的引物设计即可开展目标核酸的检测分析。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为根据本发明的LAMP检测多重目标核酸的工作原理图；

图2为根据本发明的LAMP检测多重目标核酸的一个具体实施方案中所述的LAMP反应实时荧光曲线；

图3为根据本发明的LAMP检测多重目标核酸的一个具体实施方案中静态荧光光谱图；

图4为根据本发明的LAMP检测多重目标核酸的一个具体实施方案中得到的结果的凝胶电泳图。

图5为根据本发明的LAMP检测多重目标核酸的方法中HBV的灵敏度曲线；

图6为根据本发明的LAMP检测多重目标核酸的方法中HCV的灵敏度曲线；

图7为根据本发明的LAMP检测多重目标核酸的方法中HIV的灵敏度曲线；

图8为根据本发明的LAMP检测多重目标核酸的特异性分析的曲线。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

实施例1：基于蝎状引物探针做信号检测的环介导等温扩增技术同时检测HBV、 HCV、HIV

(1)引物设计：

针对HBV、HCV、HIV设计环介导等温扩增(LAMP)引物。引物序列见表1：

表1：HBV、HCV、HIV的引物序列表

HBV、HCV、HIV的cDNA序列如下：

HBV目标基因碱基序列SEQ ID NO:19

GGGGGAAAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCACTAGTAAACTGAGCCAGGAGAAACGGACTGAGGCCCACTCCCATAGGAATCTTGCGAAAGCCCAAGATGATGGGATGGGAATACAAGTGCAGTTTCCGTCCGAAGGTTTTGTACAGCAACAAGAGGGAAACATAGAGGTTCCTTGAGCAGGAATCGTGCAGGTCTTGCATGGTCCCGTGCTGGTAGTTGATGTTCCTGGAAGTAGAGGACAAACGGGCAACATACCTTGGTAGTCCAGAAGAACCAACAAGAAGATGAGGCATAGCAGCAGGATGAAGAGGAATATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAGCCAGGACAAATTGGAGGACAAGAGGTTGGTGAGTGATTGGAGGTTGGGGACTGCGAATTTTGGCCAGGACACGTGGGTGCTCCCCCTAGAAAATTGAGAGAAGTCCACCACGAG

HCV目标基因碱基序列SEQ ID NO:20

GTTTAGGATTCGTGCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACCTCCCGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAAGGCCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCTAGCAGTCTCGCGGGGGCACGCCCAAATCTCCAGGCATTGAGCGGGTTGATCCAAGAAAGGACCCGGTCGTCCTGGCAATTCCGGTGTACTCACCGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTCCCGGGAGGGGGGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCATACTAACGCCATGGCTAGACGCTTTCTGCGTGAAGACAGTAGTTCCTCACAGGGGAGTGATTCATGGTGGAGTGTCGCCCCCATCAGGGGGCTGGC

HIV目标基因碱基序列SEQ ID NO:21

ATTTTATTTAATCCCAGGATTATCCATCTTTTATAAATTTCTCCTACTGGGATAGGTGGATTATTTGTCATCCATCCTATTTGTTCCTGAAGGGTACTAGTAGTTCCTGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTCATCTGGCCTGGTGCAATAGGCCCTGCATGCACTGGATGCACTCTATCCCATTCTGCAGCTTCCTCATTGATGGTCTCTTTTAACATTTGCATGGCTGCTTGATGTCCCCCCACTGTGTTTAGCATGGTGTTTAAATCTTGTGGGGTGGCTCCTTCTGATAATGCTGAAAACATGGGTATCACTTCTGGGCTGAAAGCCTTCTCTTCTACTACTTTTACCCATGCATTTAAAGTTCTAGGTGATATGGCCTGATGTACCA

(2)多重LAMP反应

该反应体系的成分为：环介导等温扩增三种目标核酸对应的外引物F3(10μM)、B3(10μM)各1μL，内引物FIP、BIP(80μM)各1μL，环引物LF(20μM)1μL，蝎状引物探针SP(20μM)1μL，10×Thermopol缓冲溶液(200mM Tris-HCl，100mM(NH₄)₂SO₄，100mM KCl，20mM MgSO₄，1％

X-100，pH 8.8)5μL，三种目标核酸各1μL、MgSO₄(10mM)2μL，dNTP(10mM)8μL，AMV逆转录酶2μL，Bst 2.0 WarmStart^TM聚合酶2μL，混合均匀，加灭菌超纯水至50μL。反应温度为64℃，所用仪器为C1000 Thermal Cycler(Bio-Rad，Hercμles，CA，ΜSA)包括一个CFX96原位检测系统。实时监测荧光选择FAM、TAMRA、Cy5通道，每间隔30s读取一次荧光值，具体结果见附图2，空白均没有荧光信号，加了目标分别有HBV、HCV和HIV目标对应的荧光信号。

(3)静态荧光检测

荧光光谱测量在室温下进行，LAMP反应进行40分钟后，在50μL的反应产物中加入50μL水，配成100μL的样品，将此样品置于石英比色皿中，然后用F-7000荧光光谱仪测定，激发波长设为488nm/550nm/630nm，发射波长的范围为503nm～650nm/565nm～700nm/645nm～750nm，激发和发射狭缝宽度均为5nm，具体结果见附图3：图中曲线a是不含三种目标的荧光光谱，曲线b为1pM HBV、HCV和HIV目标存在时测HBV的荧光光谱，曲线c为1pM HBV、HCV和HIV目标存在时测HCV的荧光光谱，曲线d为1pM HBV、HCV和HIV目标存在时测HIV的荧光光谱。由图可知，只有特异性目标存在的时候才能发生特异扩增反应，产生强的荧光信号。

(4)凝胶电泳分析

对LAMP反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。制胶和电泳过程均在室温下进行，电泳分析使用1.5％的琼脂糖和0.5×TBE缓冲液(45mM Tris，45mM Boric Acid，10mM EDTA，pH 8.0)，用0.5μg/mL GoldView和0.5μg/mL溴化乙锭进行染色，向上述样品中加入10μL样品混合液，样品混合液在100V电压下电泳90分钟，电泳结束后，用Tanon 4200SF凝胶成像系统观察条带并拍照。通过紫外凝胶成像分析系统进行结果判读，因阳性管经扩增后形成茎环结构和花椰菜样结构的DNA混合物，故LAMP阳性反应管出现阶梯状条带，阴性对照无条带出现。具体结果见附图4：条带M为DNA marker条带；条带1为不加目标HBV的LAMP扩增产物条带；条带2为加目标HBV的LAMP扩增产物条带；条带3为不加目标HCV的LAMP扩增产物条带；条带4为加目标HCV的LAMP扩增产物条带；条带5为不加目标HIV的LAMP扩增产物条带；条带6为加目标HIV的LAMP扩增产物条带。条带7为不加目标HBV、HCV和HIV的LAMP扩增产物条带；条带8为加目标HBV、HCV和HIV的LAMP扩增产物条带，该产物为3种目标的混合产物，其条带的累积带位置可以对应HBV、HCV和HIV的产物。

(5)灵敏度分析

我们通过梯度稀释HBV目标模板的浓度，进行均相溶液中的LAMP实时荧光扩增，HBV的浓度在1.0×10^-17-1.0×10^-10M，得到检出限为0.3×10^-17M，表明所设计引物对HBV进行LAMP检测的高灵敏度，具体结果见附图5。

我们通过梯度稀释HCV目标模板的浓度，进行均相溶液中的LAMP实时荧光扩增，HCV的浓度在1.0×10^-17-1.0×10^-10M，得到检出限为0.6×10^-17M，表明所设计引物对HCV进行LAMP检测的高灵敏度，具体结果见附图6。

我们通过梯度稀释HIV目标模板的浓度，进行均相溶液中的LAMP实时荧光扩增，HIV的浓度在1.0×10^-17-1.0×10^-10M，得到检出限为0.5×10^-17M，表明所设计引物对HIV进行LAMP检测的高灵敏度，具体结果见附图7。

(6)特异性分析

为了考察本方法的特异性，选取梅毒螺旋菌、虾白斑综合征病毒和猪流行性乙型脑炎病毒作为非特异性目标物进行了测试，实时荧光采集结果见附图8。当同时加入目标HBV和梅毒螺旋菌时，只得到HBV的FAM通道荧光信号；当同时加入目标HCV和虾白斑综合征病毒时，只得到HCV的TAMRA通道荧光信号；当同时加入目标HIV和猪流行性乙型脑炎病毒时，只得到HIV的Cy5通道荧光信号。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 湖南大学

<120> 多重目标核酸的检测方法、试剂盒以及用途

<130> DIC20110096

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caaaattcgc agtccccaac 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtagttgat gttcttgga 19

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gataaaacgc cgcagacaca tccccaacct cttgtcctcc aa 42

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cctgctgcta tgcctcatct tcttgacaaa cgggcaacat acctt 45

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_binding

<222> (1)..(1)

<223> 标记荧光集团FAM

<220>

<221> misc_binding

<222> (22)..(22)

<223> 标记淬灭基团BHQ1

<400> 5

agcgcggata tctcaccgcg ctgttggttc ttctggacta cc 42

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggtctgcgg aaccgg 16

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggggcactcg caagca 16

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acgcccaaat ctccaggcat tgcattgcca ggacgaccgg 40

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccgcgagact gctagccgac cctatcaggc agta 34

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_binding

<222> (1)..(1)

<223> 标记荧光基团TAMRA

<220>

<221> misc_binding

<222> (22)..(22)

<223> 标记淬灭基团BHQ2

<400> 10

agcgcggata tctcaccgcg cttgttgggt cgcgaaaggc c 41

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cctatttgtt cctgaagggt 20

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

attatcagaa ggagccacc 19

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gagtgcatcc agtgcatgca ctgctatgtc acttcccct 39

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccattctgca gcttcctcat tgaacaccat gctaaacaca gt 42

<210> 15

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_binding

<222> (1)..(1)

<223> 标记荧光基团CY5

<220>

<221> misc_binding

<222> (22)..(22)

<223> 标记淬灭基团BHQ2

<400> 15

agcgcggata tctcaccgcg ctatggctgc ttgatgtccc c 41

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

caacgataac caggacaaa 19

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

agcgggttga tccaagaaag gac 23

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

caggccagat gagagaacca 20

<210> 19

<211> 466

<212> DNA

<213> Hepatitis B virus

<400> 19

gggggaaagc cctacgaacc actgaacaaa tggcactagt aaactgagcc aggagaaacg 60

gactgaggcc cactcccata ggaatcttgc gaaagcccaa gatgatggga tgggaataca 120

agtgcagttt ccgtccgaag gttttgtaca gcaacaagag ggaaacatag aggttccttg 180

agcaggaatc gtgcaggtct tgcatggtcc cgtgctggta gttgatgttc ctggaagtag 240

aggacaaacg ggcaacatac cttggtagtc cagaagaacc aacaagaaga tgaggcatag 300

cagcaggatg aagaggaata tgataaaacg ccgcagacac atccagcgat agccaggaca 360

aattggagga caagaggttg gtgagtgatt ggaggttggg gactgcgaat tttggccagg 420

acacgtgggt gctcccccta gaaaattgag agaagtccac cacgag 466

<210> 20

<211> 360

<212> DNA

<213> Hepatitis C virus

<400> 20

gtttaggatt cgtgctcatg gtgcacggtc tacgagacct cccggggcac tcgcaagcac 60

cctatcaggc agtaccacaa ggcctttcgc gacccaacac tactcggcta gcagtctcgc 120

gggggcacgc ccaaatctcc aggcattgag cgggttgatc caagaaagga cccggtcgtc 180

ctggcaattc cggtgtactc accggttccg cagaccacta tggctctccc gggagggggg 240

gtcctggagg ctgcacgaca ctcatactaa cgccatggct agacgctttc tgcgtgaaga 300

cagtagttcc tcacagggga gtgattcatg gtggagtgtc gcccccatca gggggctggc 360

<210> 21

<211> 394

<212> DNA

<213> Human immunodeficiency virus

<400> 21

attttattta atcccaggat tatccatctt ttataaattt ctcctactgg gataggtgga 60

ttatttgtca tccatcctat ttgttcctga agggtactag tagttcctgc tatgtcactt 120

ccccttggtt ctctcatctg gcctggtgca ataggccctg catgcactgg atgcactcta 180

tcccattctg cagcttcctc attgatggtc tcttttaaca tttgcatggc tgcttgatgt 240

ccccccactg tgtttagcat ggtgtttaaa tcttgtgggg tggctccttc tgataatgct 300

gaaaacatgg gtatcacttc tgggctgaaa gccttctctt ctactacttt tacccatgca 360

tttaaagttc taggtgatat ggcctgatgt acca 394

Claims

1.一种用于非诊断目的的多重目标核酸的检测方法，所述方法包括以下步骤：

（1）根据多重目标核酸制备环介导等温扩增反应所需的混合物；

所述蝎状引物探针的上游区域包含发夹结构，下游区域包含与目标核酸特异性互补的片段，所述互补的片段长度与环引物长度相同；并且，所述蝎状引物探针的5’端碱基上标记荧光基团，与其互补配对的对应碱基上标记淬灭基团；

所述引物和探针组中的每组的蝎状引物探针所标记的荧光基团不同；

所述蝎状引物探针的径区包含7~8个碱基，环区包含7~8个碱基；

所述多重目标核酸和/或待检测的核酸为乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、以及人类免疫缺陷病毒三种病毒的RNA和/或DNA；

针对乙型肝炎病毒的RNA和/或DNA设计的引物和探针组如SEQ ID NO: 1-5和16所示；针对丙型肝炎病毒的RNA和/或DNA设计的引物和探针组如SEQ ID NO: 6-10和17所示，针对人类免疫缺陷病毒的RNA和/或DNA设计的引物和探针组如SEQ ID NO: 11-15和18所示；

（2）将步骤（1）所述的混合物置于恒定温度下进行扩增反应；

（3）检测步骤（2）的反应结果。

2.如权利要求1所述的方法，其中，在步骤（1）中，所述荧光基团为FAM、TAMRA和/或Cy5，淬灭基团为BHQ1和/或BHQ2。

3.如权利要求1所述的方法，其中，在步骤（1）中，所述反应混合物还包含：dNTP和聚合酶；

当所述待检测的核酸包含RNA时，所述混合物还包含逆转录酶。

4.如权利要求3所述的方法，其中，所述聚合酶为Bst 2.0 WarmStart^TM聚合酶。

5.如权利要求3所述的方法，其中，所述逆转录酶为AMV逆转录酶。

6.如权利要求3所述的方法，所述反应混合物进一步包含一种或多种选自下组的成分：Mg²⁺、K⁺、NH₄ ⁺、H⁺、Cl^-、SO₄ ^2-、Tris-HCl和细胞表面活性剂。

7.如权利要求6所述的方法，所述反应混合物包含Tris-HCl、KCl、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄、Triton® X-100。

8.如权利要求1所述的方法，其中，在步骤（2）中，所述反应的温度为60-65℃。

9.如权利要求8所述的方法，其中，所述反应的温度为63-64℃。

10.如权利要求1所述的方法，其中，在步骤（3）中，所述检测使用实时定量PCR仪。

11.一种检测多重目标核酸的试剂盒，所述试剂盒包含反应混合物，所述反应混合物包括针对多重目标核酸设计的引物和探针组，所述引物和探针组中的每组包括2条外引物F3和B3、2条内引物FIP和BIP、环引物以及蝎状引物探针；

所述引物和探针组的每组的蝎状引物探针标记的荧光基团不同；

所述多重目标核酸为乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、以及人类免疫缺陷病毒三种病毒的RNA和/或DNA；

针对乙型肝炎病毒的RNA和/或DNA设计的引物和探针组如SEQ ID NO: 1-5和16所示，针对丙型肝炎病毒的RNA和/或DNA设计的引物和探针组如SEQ ID NO: 6-10和17所示，针对人类免疫缺陷病毒的RNA和/或DNA设计的引物和探针组如SEQ ID NO: 11-15和18所示。

12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中，所述荧光基团为FAM、TAMRA和/或Cy5，淬灭基团为BHQ1和/或BHQ2。

13.根据权利要求11所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含：dNTP和聚合酶；

14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中，所述聚合酶为Bst 2.0 WarmStart^TM聚合酶。

15.根据权利要求13所述的试剂盒，其中，所述逆转录酶为AMV逆转录酶。

16.根据权利要求11所述的试剂盒，其中，所述反应混合物进一步包含一种或多种选自下组的成分：Mg²⁺、K⁺、NH₄ ⁺、H⁺、Cl^-、SO₄ ^2-、Tris-HCl和细胞表面活性剂。

17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中，所述反应混合物包含Tris-HCl、KCl、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄、Triton® X-100。

18.一种用于非诊断目的的微生物的检测方法，其包括采用如权利要求1至10中任一项所述的方法或如权利要求11至17中任一项所述的试剂盒检测来自待测微生物的核酸。