CN103820551A - 快速检测抗精恶唑禾草灵菵草的Ile-1781-Leu突变的分子检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于LAMP技术快速鉴定含有Ile-1781-Leu突变的抗精恶唑禾草灵的菵草基因型的分子检测方法，可用于含有该种突变的菵草的早期预警和流行监测。该检测方法共分3个主要步骤，(1)分别提取待测样品的基因组DNA；(2)设计特异性引物，进行LAMP恒温扩增；(3)在上述LAMP扩增产物中加入荧光染料SYBR Green I，观察其颜色变化；也可在3.0％琼脂糖凝胶电泳上分离，观察扩增结果。根据结果鉴定是否为具有Ile-1781-Leu突变的菵草种群；如果LAMP扩增产物显示黄色，这时电泳图谱应为梯状条带，判定为带有Ile-1781-Leu突变的菵草种群；如果扩增产物为橙色，这时电泳图谱无条带扩增，判定为不带有Ile-1781-Leu突变的菵草种群。本发明实现了恒温扩增，不需要昂贵的仪器设备、繁琐的电泳过程，使检测时间和成本大大降低。与普通PCR相比，本发明还具有灵敏度高、特异性强、检测准确性高等特点。

Description

快速检测抗精恶唑禾草灵菵草的Ile-1781-Leu突变的分子检测方法

技术领域

本发明是基于环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)对抗精恶唑禾草灵菵草的Ile-1781-Leu突变进行快速检测的分子检测方法，属于农业科学技术领域。

背景技术

环介导恒温扩增反应(LAMP)是2000年由日本学者Notomi等发明的一种新颖的恒温核酸体外扩增技术，该方法利用一套(4种)特异性引物，以识别靶基因的六个特定区域。该技术原理是：在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65C范围60min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。SYBR Green I是一种荧光染料，根据反应液中成分的变化而呈现出不同的颜色，阴性(没有扩增出产物)时为橙色，阳性(有产物扩增)时为黄色。LAMP方法的优势是在恒温条件下进行，不需要循环仪等昂贵的仪器；扩增反应极快，一般在1小时内完成；扩增产生的产物量大，通过肉眼即可判定结果，不需要繁琐的电泳过程；灵敏度高、特异性强；操作简便、快捷，极适于抗性杂草突变情况的快速诊断及检测。

菵草(Beckmannia syzigachne Steud.)是一年生或越年生禾本科草本植物，广布于世界各地；在我国东北、华北、西北、华东、西南等各省区的水边湿地也有广泛分布；菵草具有一个冬前出草高峰和一个春后出草次峰，小麦产量均随着菵草密度的增加而显著下降。20世纪90年代初，我国长江中下游地区的稻茬油菜田和小麦田中，菵草的发生量呈现上升趋势，从原来的次要杂草逐渐上升为麦田的主要杂草，给小麦生产带来了新的危害。

AOPP类除草剂在抗性风险分级中属于高风险级别，一般连续使用6-10年，杂草就会对其产生抗性。精噁唑禾草灵(骠马)属于AOPP类除草剂，是防治麦田禾本科杂草的主导药剂，自20世纪80年代上市以来，在小麦田大面积推广应用。在生产上发现长期单一使用精噁唑禾草灵，其用量逐年增加，药效降低，杂草对精噁唑禾草灵逐渐产生抗性。许多农民反映，在田间推荐剂量下，精噁唑禾草对菵草的防除效果不理想；张锁荣等经田间调查发现连续使用精噁唑禾草灵8年的菵草对精噁唑禾草灵产生了抗药性。经王金信等研究发现，在江苏省丹阳地区已经发现带有Ile-1781-Leu突变的抗精恶唑禾草灵的菵草种群。为了能够更好地控制田间抗性菵草种群的蔓延以及指导田间农民的正确用药，以LAMP为基础的分子生物学技术能快速检测抗精恶唑禾草灵菵草的Ile-1781-Leu突变情况，该方法具有简单、快速、成本低，灵敏性高等特点，从而大大提高了检测效率。然而，经检索目前国内外尚未对抗精恶唑禾草灵菵草的Ile-1781-Leu突变的LAMP快速分子检测有相关报道。

发明内容

本发明的目的是对于已有的抗精恶唑禾草灵菵草的Ile-1781-Leu突变的鉴定及检测方法中存在费时、费力、成本高、准确性低的缺点，提供一种具有简便、快速、省时省力、灵敏度高的检测方法。根据含有Ile-1781-Leu突变的抗精恶唑禾草灵的菵草基因型，优化反应条件，能对含有该突变的菵草种子及叶片进行检测，可以及时发现该突变情况在田间的存在，从而正确的指导田间用药，及时控制含有该种突变的菵草种群的蔓延，可以减少农民的经济损失，具有很大的实用价值。

本发明所述的快速检测该突变的分子生物学方法，步骤是：

(1)在含有Ile-1781-Leu突变的抗精恶唑禾草灵的菵草的ACCase基因的CT区上设计1对外引物和1对内引物，利用该引物在恒温条件下，进行LAMP扩增；

①1LAMP反应所用的两对引物分别是：

F3：5’-GGACTAGGTGTGGAGTGCT-3’

B3：5’-TGGGAGCTGTACACTTCC-3’

FIP：5’-CCGTCCAGTAACAAATGTAAGTGTAGTGCTGCTATTGCCAGTG-3’

BIP：5’-CCTATCTTGCTCGACTTGGCATGTTCAGGGCAGAAAACC-3’

②LAMP反应体系及其条件：

(1)

反应参数：65℃60min，80℃10min；

(2)在上述LAMP扩增产物中加入荧光染料SYBR Green I，观察其颜色变化；也可在3.0％琼脂糖凝胶电泳上分离，观察扩增结果；

(3)鉴定是否为具有Ile-1781-Leu突变的菵草种群；如果LAMP扩增产物显示黄色，这时电泳图谱应为梯状条带，判定为带有Ile-1781-Leu突变的菵草种群；如果扩增产物为橙色，这时电泳图谱无条带扩增，判定为不带有Ile-1781-Leu突变的菵草种群。

本发明提供的快速检测抗精恶唑禾草灵菵草的Ile-1781-Leu突变的分子生物学方法，具有灵敏度高，特异性强等特点，与现有技术相比，本发明的有益结果是：

1、简便易行：该检测方法通过恒温水浴锅或有稳定热源的设备就能进行实验，通过反应产物颜色变化即可判定结果，省去了昂贵的仪器设备、繁琐的电泳过程；

2、检测高效性：该检测方法所用检测时间仅需1小时左右，而PCR扩增时间较长，这样能大大提高了检测的效率；

3、灵敏度高：以DNA为模板，该方法的检测下限为5×10^-4ng/μL，是常规PCR的1000倍；

4、准确性高：该方法几乎不受反应混合液中存在的大量外源DNA和杂质的影响，不需要从样本中纯化DNA，可直接利用粗提的DNA进行快速检测，大大提高了检测的准确度；

5、特异性强：该方法通过2对引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于PCR引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性大大提高，假阳性出现的概率也随之降低；

6、本发明是国内外首次利用LAMP技术对抗性杂草进行检测，这种方法快速简便，对指导农民正确科学用药，以及降低成本和减少环境污染具有重要的现实意义。

附图说明

图1：含有Ile-1781-Leu突变的抗精恶唑禾草灵菵草LAMP反应颜色变化及电泳谱带图

其中：A.电泳谱带图；B.正常光照下的产物颜色；C.紫外光照下的产物颜色。

M-2000bp Marker；1-未加DNA的清水对照；2-加入不含Ile-1781-Leu突变的敏感DNA基因；3-加入含有Ile-1781-Leu突变的抗性DNA基因。

图2：含有Ile-1781-Leu突变的抗精恶唑禾草灵菵草LAMP灵敏度检测反应颜色变化及电泳谱带图

其中：M-2000bp Marker；1-8-依次为50，5，5×10^-1，5×10^-2，5×10^-3，5×10^-4，5×10^-5，5×10^-6ng/μL，9-为未加DNA的清水对照。

图3：含有Ile-1781-Leu突变的抗精恶唑禾草灵菵草普通PCR灵敏度检测电泳谱带图

其中：M-2000bp Marker；1-8-依次为50，5，5×10^-1，5×10^-2，5×10^-3，5×10^-4，5×10^-5，5×10^-6ng/μL，9-为未加DNA的清水对照。

具体实施方式

实施例1LAMP反应体系优化

为了节省检测成本，保证该检测方法的稳定性和可靠性，实验对反应体系中MgCl₂浓度(2～6mM)，dNTP浓度(0.2～1mM)，F3，B3浓度(0.1～0.8μM)，FIP，BIP浓度(0.4～1.2μM)及甜菜碱浓度(0～1.6M)进行了优化，确定了最佳反应体系为：Bst DNA聚合酶(8U/μL)0.4μL，10×ThermoPol1μL，MgCl2(25mM)1.8μL，dNTP(10mM)0.8μL，FIP(20μM)0.4μL，BIP(20μM)0.4μL，F3(10μM)0.6μL，B3(10μM)0.6μL，甜菜碱(5M)1.6μL，基因组DNA1.0μL，dH2O(灭菌蒸馏水)1.4μL。

实施例2LAMP反应条件优化

为了得到最适的反应温度和时间，保证该检测方法的高效性，实验对反应参数中的反应温度(61-65℃)及时间(20-100min)进行了优化，最终确定最适的反应温度和时间分别65℃和60min。

实施例3LAMP反应灵敏度检测

为了确定LAMP反应的检测下限，本实验中用试剂盒提取纯化的基因组DNA作为模板以10倍梯度稀释。以上述稀释的基因组DNA作为模板，分别进行LAMP及PCR扩增。图2和图3中可以得知，LAMP技术的最低检测下限为5×10^-4ng/μL，而普通PCR检测下限仅为5×10^-1ng/μL。

本发明所建立的检测方法能准确、快速的检测出含Ile-1781-Leu突变的抗精恶唑禾草灵的菵草种群，为科学研究和生产实践提供了一种简便、快速、成本低廉的检测技术，也为该抗性杂草的早期预警及合理用药提供了理论基础和技术指导，对增加生态、社会和经济效益都具有现实而深远的意义。

Claims (2)

1.一种快速检测抗精恶唑禾草灵菵草、日本看麦娘、看麦娘等抗性杂草的Ile-1781-Leu突变的分子检测方法，其特征在于基于环介导恒温扩增技术(LAMP)对该突变进行快速鉴定，该方法共分三步： 

(1)运用引物的特异性进行LAMP恒温扩增，环介导恒温扩增技术(LAMP)反应体系及参数： 

反应体系： 

反应参数：65℃60min，80℃10min； 

(2)在上述LAMP扩增产物中加入荧光染料SYBR Green I，观察其颜色变化；也可在3.0％琼脂糖凝胶电泳上分离，观察扩增结果； 

(3)鉴定是否为具有Ile-1781-Leu突变的菵草种群；如果LAMP扩增产物显示黄色，这时电泳图谱应为梯状条带，判定为带有Ile-1781-Leu突变的菵草种群；如果扩增产物为橙色，这时电泳图谱无条带扩增，判定为不带有Ile-1781-Leu突变的菵草种群。 

2.根据权利要求1所述快速检测抗精恶唑禾草灵菵草、日本看麦娘、看麦娘等抗性杂草的Ile-1781-Leu突变的分子检测方法，其特征在于：步骤(1)所述的用于LAMP反应中的两对引物具有特异性，所述的两对引物分别是： 

(1)外引物对： 

F3：5’-GGACTAGGTGTGGAGTGCT-3’ 

B3：5’-TGGGAGCTGTACACTTCC-3’ 

(2)内引物对： 

FIP：5’-CCGTCCAGTAACAAATGTAAGTGTAGTGCTGCTATTGCCAGTG-3’ 

BIP：5’-CCTATCTTGCTCGACTTGGCATGTTCAGGGCAGAAAACC-3’。 

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