CN101974618B

CN101974618B - 转cry1C基因水稻品系T1c-19的转化体特异性PCR检测方法

Info

Publication number: CN101974618B
Application number: CN 201010238746
Authority: CN
Inventors: 谢家建; 彭于发
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-07-26
Filing date: 2010-07-26
Publication date: 2013-05-22
Anticipated expiration: 2030-07-26
Also published as: CN101974618A

Abstract

本发明涉及“转crylC基因水稻品系T1c-19的转化体特异性PCR检测方法”属于生物技术领域。本发明提供了转crylC基因水稻品系T1c-19的转化体特异性序列SEQ ID NO1以及依赖其建立的转化体特异性PCR方法即正向引物依据SEQ ID NO1中1-840位序列设计，反向引物依据SEQ ID NO1的841-1276位序列设计。该PCR方法可作为一种鉴定转基因水稻品系T1c-19，以及以这个品种为亲本的转基因水稻品系的有效手段。本发明为特异性鉴定转crylC基因水稻品系T1c-19提供了便利，该方法的优点在于快速、灵敏度高、特异性好、所需实验条件不高，因此有非常高的实用价值。

Description

转cry1C基因水稻品系T1c-19的转化体特异性PCR检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种鉴别转crylC基因水稻品系T1c-19的转化体特异性PCR方法及其依赖的转化体特异性序列。

背景技术

水稻作为世界上超过一半人口的主食，是最重要的粮食作物之一。在过去的半个多世纪里，水稻育种取得了巨大的成功。水稻的单位产量实现了翻番，部分地方甚至提高至3倍，这为保障世界粮食安全作出了巨大的贡献。但近十几年来水稻的产量停滞不前，这一方面是由于在育种技术上没有新的突破以及遗传多样性在栽培品种中的逐步变窄，另一方面也是因为频繁发生的病虫害以及旱灾等自然灾害使得水稻生产损失惨重。然而，世界人口的持续增长以及社会经济的快速发展导致对粮食的需求不断增加。

针对这些问题，我国学者围绕水稻抗病虫、抗旱、营养高效利用、优质、高产等五大重要性状，利用转基因技术这种新兴的育种手段对水稻品种进行全面改良以实现农业的可持续发展。目前我国已经有多个转基因水稻品系进行了生产性实验，申请生产应用生物安全证书。其中，华中农业大学研发的转crylAb/crylAc基因水稻华恢1号和Bt汕优63的生产应用生物安全证书于2009年8月获得了批准(http://www.stee.agri.gov.cn/biosafety/spxx/P020091127591594596689.pdf，审批编号：农基安证字(2009)第072号和第73号)，成为我国首批允许商业化种植的转基因水稻。

使用新的Bt基因水稻是延缓昆虫抗性产生，提高Bt水稻使用寿命的一种重要策略。Tang等人培育了转人工合成的crylC基因的水稻品系T1c-19(Wei Tang，et al.Development ofinsect-resistant transgenic indica rice with a synthetic cryl C* gene.Mol Breeding.2006，18：1-10)，其田间实验表现出了对螟虫的高度抗性，为发展Bt水稻提供了新的种质资源材料。2006年，该品系获准在湖北省进行环境释放(转CrylC基因抗虫水稻T1c-19在湖北省的环境释放安全审批书.农基安审字(2006)第006号)，2009年获准在湖北省进行生产性实验(转crylC基因抗虫水稻T1c-19在湖北省的生产性试验安全审批书.农基安审字(2009)第006号)(http://new.croplab.org/web/detailjsp？i_＝554)。转crylC基因抗虫水稻T1c-19在通过生产性试验获得生产应用安全证书后，将可能成为我国又一个即将在生产上商业化种植的转基因水稻。

进行转基因成分检测是对转基因植物进行有效监督管理，保障其健康发展的重要技术基础。PCR技术是转基因成分检测中应用最为广泛的技术。在应用这种技术进行转基因作物定性检测时，根据其扩增的靶标区域和特异性将其分为四类：一、筛选检测，以转基因通用的外源启动子和终止子为靶标区域；二、基因特异性检测，以特异的外源目的基因为靶标区域；三、构建特异性检测，以转基因元件之间的特异构建为靶标区域；四、转化体特异性检测，以转化体特异性片段为靶标区域。这四类检测方法对转基因作物的品系检测特异性是逐渐增加的。这四类检测方法对转基因作物的检测特异性是逐渐增加的，转化体特异性检测是目前对转基因品系检测特异性最高的检测方法，也是目前转基因检测中最常用的身份检测方法，这种检测方法甚至能够区分同一转化载体产生的不同转化植株品系。

目前已经有部分专利和文献报道了我国部分转基因水稻品系的转化体特异性片段序列，例如：谢家建等人于2007年和2008年分别利用TAIL-PCR、genome walking和LD-PCR等方法获得了转基因水稻克螟稻、Bt汕优63、科丰6号和科丰8号的转化体特异性片段序列，并建立了转化体特异性的检测方法。然而，在对现有的专利和文献的分析中发现，还没有任何关于转crylC基因水稻品系T1c-19的转化体特异性片段序列和转化体特异性检测方法的文章和专利报道。

发明内容

针对上述领域中的空白，提供了转crylC基因水稻品系T1c-19的转化体特异性序列以及鉴别转crylC基因水稻品系T1c-19的转化体特异性PCR方法，该PCR方法能利用普通的PCR仪器、试剂快速准确鉴别出转crylC基因水稻品系T1c-19，以及以T1c-19为亲本的水稻品系。

转crylC基因水稻品系T1c-19转化体特异性序列，如Seq ID No.1所示，其中水稻基因组序列为1-840bp，转化载体序列位于841-1276bp。

转crylC基因水稻品系T1c-19的转化体特异性PCR检测方法，其特征在于：PCR反应中的正向引物依据SEQ ID NO1中1-840位序列设计，反向引物依据SEQ ID NO1的841-1276位序列设计。

根据权利要求1所述的PCR检测方法，

所述正向引物为T1c-19-F1：5‘-ATATTCCCCAATCATGGAGC-3’，

所述反向引物为T1c-19-R1：5‘-GTTTCGCTCATGTGTTGAGC-3’。

扩增区域为扩增SEQ ID NO1的788-1011位，扩增产物大小为224bp。

本发明根据转crylC基因水稻品系T1c-19的T-DNA边界区域(如图1所示)，采用TALL-PCR方法得到转crylC基因水稻品系T1c-19的转化体特异性序列如SEQ ID NO1所示，经分析对比其中1-840bp为水稻基因组序列，841-1276bp为转化载体序列。该特异性序列为转crylC基因水稻品系T1c-19所特有，本领域技术人员根据PCR扩增原理，根据上述两段基因序列来源分别设计引物进行扩增，可专用于该转crylC基因水稻品系T1c-19及以其作为亲本的转基因水稻品系的鉴定。

优选：本发明根据1-840位序列设计正向引物为T1c-19-F1：

5‘-AACTGTAATGACTCCGCGCA-3’，

根据841-1276位序列设计反向引物为T1c-19-R1：

5‘-GACGGGCAACACTAATTAAGAC-3’。

经过实验证明，本发明方法可以用于特异性检测转crylC基因水稻品系T1c-19，扩增区域为扩增SEQ ID NO1的788-1011位，扩增产物大小为224bp。

本发明提供的转crylC基因水稻品系T1c-19的转化体特异性序列以及依赖其建立的转化体特异性PCR方法可作为一种鉴定转基因水稻品系T1c-19，以及以这个品种为亲本的转基因水稻品系的有效手段，由于转crylC基因水稻品系T1c-19在通过生产性试验获得生产应用安全证书后，将可能成为我国又一个即将在生产上商业化种植的转基因水稻品系。因此本发明为特异性鉴定转crylC基因水稻品系T1c-19提供了便利，该方法的优点在于快速、灵敏度高、特异性好、所需实验条件不高，因此有非常高的实用价值。

附图说明

图1转crylC基因水稻品系T1c-19的转化载体T-DNA区构建图谱

图2转crylC基因水稻品系T1c-19的转化体特异性序列TAIL-PCR扩增图谱

M：DNA Marker DL2000，大小依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-8：引物AD2～AD6、AD8、AD9和AD11的TAIL-PCR第三级扩增反应产物

图3转crylC基因水稻品系T1c-19转化体特异性PCR检测结果

M：DNA Marker DL2000；1：空白对照，2-5：4个市场水稻样品，6：转crylC基因水稻品系T1c-19

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook 等的分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照仪器或者试剂制造厂商所建议的条件。

实施例1

转crylC基因水稻品系T1c-19转化体特异性序列的克隆

1实验材料

1.1植物材料

转基因水稻：转crylC基因水稻品系T1c-19(华中农业大学研发)，本实验室有保存，可向公众发放用于实验研究。

1.2酶与试剂

分子生物学试剂，如dNTPs、Taq DNA聚合酶、DL2000Marker购自大连宝生物生物工程有限公司。

其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

1.3实验仪器

PCR扩增仪：Eppendorf Mastercycle gradient(Eppendorf co.)

核酸电泳仪：DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)

DNA测序仪(Applied Biosystem377型全自动荧光序列分析仪)

DNA电泳分析系统：Kodak EDAS 290(Kodak co.)

其它仪器包括：离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等。

2实验方法和过程

2.1水稻基因组DNA提取与检测

2.1.1水稻基因组DNA的提取

取苗期水稻叶片做为DNA提取的材料，依照柱式植物DNAout试剂盒(天泽基因公司)的操作手册，进行水稻材料总DNA的提取。

2.1.2水稻基因组DNA检测

取5μl提取的DNA溶液，以0.8％的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来初步判断提取DNA的质量。采用紫外分光光度计测定所提取的DNA的浓度和纯度。

2.2转crylC基因水稻品系T1c-19转化体特异性序列的分离

TAIL-PCR用于扩增已知区域的侧翼序列。根据转crylC基因水稻品系T1c-19的T-DNA边界区域(如图1所示)设计三个巢式特异性PCR引物bar-T1、bar-T2和bar-T3，依次与8 个简并引物AD2～AD6、AD8、AD9和AD11分别组合进行三次PCR扩增，引物序列见表1。PCR反应条件见表2。

表1用于TAIL-PCR扩增的特异性引物和简并引物

primers	sequence
		bar-T1	5’-AAGGCACGCAACGCCTACGAC-3’
bar-T2	5’-TACACCCACCTGCTGAAGTC-3’
		bar-T3	5’-TCAAGAGCGTGGTCGCTGTC-3’
AD2	5’-AGTGNAGAANCAAAGG-3’
		AD3	5’-CATCGNCNGANACGAA-3’
AD4	5’-TG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(G/C)AGA-3’
		AD5	5’-TCGTNCGNACNTAGGA-3’
AD6	5’-NTCGA(G/C)T(A/T)T(G/C)G(A/T)GTT-3’
		AD8	5’-(C/G)TTGNTA(C/G)TNCTNTGC-3’
AD9	5’-(A/T)CAGNTG(A/T)TNGTNCTG-3’
		AD11	5’-CA(A/T)CGICNGAIA(C/G)GGA-3’

表2TAIL-PCR反应程序和条件

2.3序列测定和分析

PCR扩增产物在0.8％的琼脂糖胶上进行电泳，采用QIAquick Gel Extraction kit回收扩增片段，连接到pGEM-T easy(Promega，Madison，Wis.)，采用ABI PRISM 1300Genetic Analyzer进行序列测定。采用vectorNTI10.0(Invitrogen)比较和分析测定的序列与载体序列相似性，在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中用BLASTN检索相似的水稻基因组序列。

3实验结果

3.1转crylC基因水稻品系T1c-19转化体特异性序列测定

转crylC基因水稻品系T1c-19的T-DNA边界TAIL-PCR扩增结果表明，8个AD引物中有3个AD5、AD6和AD8的第三级获得了扩增产物(图2)。回收扩增片段最长的引物AD6的第三级扩增片段，连到载体上，进行序列测定。经序列测定扩增的条带大小为1276bp。

3.2转crylC基因水稻品系T1c-19转化体特异性序列分析

将获得的1276bp序列提交NCBI数据库比对分析，其中1-840bp为水稻基因组序列，841-1276bp为转化载体序列。

实施例2

本发明的转化体特异性PCR方法应用于鉴别转crylC基因水稻品系T1c-19

1实验材料

1.1植物材料

转基因水稻：转crylC基因水稻品系T1c-19

4个水稻材料，购自市场。

1.2酶与试剂

分子生物学试剂，如dNTPs、Taq DNA聚合酶、Marker等购自大连宝生物生物工程有限公司。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

1.3实验仪器

PCR扩增仪：Mastercycle gradient(Eppendorf co.)

核酸电泳仪：DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)

DNA电泳分析系统：Kodak EDAS 290(Kodak co.)

2实验方法和过程

2.1水稻基因组DNA提取与检测

见实施例1中2.1水稻基因组DNA提取与检测。

2.2鉴别转crylC基因水稻品系T1c-19的转化体特异性PCR方法

本发明的PCR方法应用于鉴别水稻样品中是否含有转基因水稻品系T1c-19。采用引物T1c-19-F1/T1c-19-R1组合(序列见表4)，检测购自市场的4个水稻样品，见图3。实验结果表明，转crylC基因水稻品系T1c-19能特异性扩增出224bp的产物，检测的4个市场样品中均未能扩增获得相同大小的片段。

克隆转crylC基因水稻品系T1c-19的扩增片段，按实施例1中“2.3序列测定和分析”进行序列分析。序列分析结果表明，扩增片段序列与序列SEQ ID NO1的788-1011位完全一致。

检测结果表明本发明提供的PCR方法能很好地鉴别出水稻样品中是否含有转crylC基因水稻品系T1c-19。

PCR反应体系为：0.25μL rTaq(5U/μL)，5μL 10×PCR Buffer(Mg²⁺Plus)，4μL dNTP(各2.5mM)，引物各2μL(10μM)，模板各2μL(20ng/μL)，加灭菌蒸馏水补足体积至50μL。

扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃10min。

表4鉴别转crylC基因水稻品系T1c-19的转化体特异性PCR引物

引物	序列
		T1c-19-F1	5’-ATATTCCCCAATCATGGAGC-3’
T1c-19-R1	5’-GTTTCGCTCATGTGTTGAGC-3’

Claims

1.转cry1C基因水稻品系T1c-19的转化体特异性PCR检测方法，其特征在于：PCR反应中采用的正向引物依据SEQ ID NO1中1-840位序列设计，反向引物依据SEQ ID NO1的841-1276位序列设计，所述正向引物为T1c-19-F1：5‘-ATATTCCCCAATCATGGAGC-3’，所述反向引物为T1c-19-R1：5‘-GTTTCGCTCATGTGTTGAGC-3’。