CN101899513B

CN101899513B - 鉴别转基因抗虫棉南农6号的pcr检测方法及其应用

Info

Publication number: CN101899513B
Application number: CN 201010233893
Authority: CN
Inventors: 谢家建; 孙爻; 苏长青; 彭于发
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-07-19
Filing date: 2010-07-19
Publication date: 2013-04-10
Anticipated expiration: 2030-07-19
Also published as: CN101899513A

Abstract

本发明“转基因抗虫棉南农6号的PCR检测方法及其应用”，涉及生物技术领域。本发明转基因抗虫棉南农6号的PCR检测方法，其特征在于PCR正向引物依据SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的1-449位碱基序列设计，反向引物依据SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的450-2247位碱基序列设计。能利用普通的PCR仪器、试剂快速准确鉴别出转基因抗虫棉南农6号，以及以转基因抗虫棉南农6号为亲本的棉花品系。

Description

鉴别转基因抗虫棉南农6号的PCR检测方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种鉴别转基因抗虫棉南农6号的PCR方法及其应用。

背景技术

我国是转基因作物的主要种植国家之一，2009年转基因作物种植总面积位居全球第六位。目前我国已经批准商业化种植的转基因作物包括转基因抗虫棉花、抗木瓜环斑病毒的转基因番木瓜等。其中，转Bt基因抗虫棉是我国种植面积最大的转基因作物，2009年种植面积达370万公顷，占我国棉花种植总面积的近70％。

南农6号是南京农业大学棉花研究所选育的转基因抗虫杂交棉组合。2005年通过国家农作物品种审定委员会审定并定名(审定编号：国审棉2005016)，并申请国家植物新品种保护(公告号为CNA002866E)。截止2008年，转基因棉南农6号获得了湖南、河南、江苏、江西、浙江等5省的农业转基因生物生产应用安全证书，示范、推广315万亩(张天真，高产、雄性不育化制种的转Bt基因抗虫杂交棉“南农6号”的示范推广，《中国科技成果》2008年12期)。目前在我国已经批准了多个转基因棉花品种的商业化种植，开发快速、特异的检测方法来鉴别不同的转基因品种，对知识产权保护和转基因安全的监管都显得十分必要和紧迫。

目前，PCR技术是转基因作物检测中应用最为广泛的技术。在应用这种技术进行转基因作物定性检测时，根据其扩增的靶标区域和特异性将其分为四类：一、筛选检测，以转基因通用的外源启动子和终止子为靶标区域；二、基因特异性检测，以特异的外源目的基因为靶标区域；三、构建特异性检测，以转基因元件之间的特异构建为靶标区域；四、转化体特异性检测，以转化体特异性片段(外源插入片段与受体基因组连接区域)为靶标区域。这四类检测方法对转基因作物的检测特异性是逐渐增加的，转化体特异性检测是目前对转基因品系检测特异性最高的检测方法，也是目前转基因检测中最常用的身份检测方法，这种检测方法甚至能够区分同一转化载体产生的不同转化植株品系。

目前我国批准种植的棉花品种中，仅MON531和GK12的转化体特异性序列和转化体特异性检测方法已经有报道，而转基因棉南农6号的转化体特异性序列和转化体特异性检测方法尚未见报道。

发明内容

针对上述领域中的空白，提供了转基因抗虫棉南农6号的转化体特异性PCR检测方法，该PCR方法利用普通的PCR仪器、试剂快速准确鉴别出转基因抗虫棉南农6号，以及以南农6号为亲本的棉花品系。

一种鉴别转基因抗虫棉南农6号的PCR检测方法，其特征在于PCR正向引物依据SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的1-449位碱基序列设计，反向引物依据SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的450-2247位碱基序列设计，扩增靶标为正反向引物序列在SEQ ID NO.1所示核苷酸序列上的识别位置之间的核苷酸序列。

所述正向引物为NN6-F1：5‘-AACTGTAATGACTCCGCGCA-3’，

所述反向引物为NN6-R1：5‘-GACGGGCAACACTAATTAAGAC-3’，扩增区域位于SEQID NO1的274-514位，扩增产物大小为241bp。

所述PCR检测方法在鉴别南农6号以及以南农6号为亲本的棉花品种上的应用。

本发明的发明人通过Genome walking方法扩增获得了南农6号的转化体特异性序列，如SEQ ID NO.1所示，所谓转化体特异性序列指南农6号这个转基因品系所唯一拥有的序列，这种唯一性由外源转化载序列以及外源转化载体在宿主基因组的特定插入位置决定。在转基因过程中，外源基因可能插入到宿主基因组的很多个位置，外源基因插入位置不同将得到不同的转基因品系，即得到不同的转化体特异性。本发明获得的转化体特异性序列的5’端1～449bp为外源转化载体序列，3’端450-2247bp位置为宿主棉花的基因组序列。基于转化体特异性片段与转基因品系的一一对应性，通过在该特异性序列上设计引物，正向引物设计在1～449bp位置，反向引物设计在3’端450～2247bp位置，采用这对正反向引物对待测品系的基因组进行PCR扩增，是一种检测未知棉花品系是否是南农6号及其子代的有效手段。在检测中，由于设计的正反向引物的正确靶标序列就是其设计所依据的转化体特异性序列，即SEQ ID NO.1，即事先已经非常清楚引物在靶标序列上的识别位置和靶标序列片段长度，因此能够预先计算出扩增产物应该为多长，当某个待测品系的基因组扩增产物出现相应长度的扩增片段时，说明该品系就是南农6号或者以南农6号为亲本的棉花品种。

本发明的核心贡献在于获得并向公众提供了南农6号的转化体特异性序列，基于其与转基因品系的一一对应性，提供了其在检测南农6号上的应用，即根据其设计特异性引物来鉴别待测品系是否是南农6号或其子代，根据一段已知序列采用引物常规设计规则来设计扩增该段序列的引物，对于本领域普通技术人员来说是普遍掌握的常规技能，本发明的检测方法不限于采用哪一对特异性引物，不同的人根据SEQ ID NO.1及本发明的检测方法中提供的引物设计思路可能会设计出不同的引物对，但都是基于本发明提供了转化体特异性序列SEQ ID NO.1所示的序列这个前提，因此都在本发明的保护范围内。发明人同时也提供了采用一对自己设计的特异性引物NN6-F1/NN6-R1进行检测的方法。

由于转基因抗虫棉南农6号是我国目前广泛种植的转基因抗虫棉品系之一，因此本发明为特异性鉴定转基因抗虫棉南农6号提供了便利，该方法的优点在于快速、灵敏度高、特异性好、所需实验条件不高，因此有非常高的实用价值。

附图说明

图1转基因抗虫棉南农6号转化体特异性序列的Genome Walking扩增

M：DNA Marker DL2000；1-4：DL1-DL4的Walking产物

图2转基因棉南农6号转化体特异性PCR检测结果

M：DNA Marker DL2000；1：空白对照，2：南农6号，3-12：10个市场棉花样品

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等的分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照仪器或者试剂制造厂商所建议的条件。

实施例1转基因抗虫棉南农6号转化体特异性序列的克隆

1实验材料

1.1植物材料

转基因抗虫棉：南农6号(生厂商：江苏神农大丰种业科技有限公司)，是现有品种，记载在《现代农业科技(上半月刊)》2005年08期的“南农6号栽培技术要点”一文中，本实验室也有保存，自申请日起二十年内，可向公众发放用于验证试验。

1.2酶与试剂

分子生物学试剂，如dNTPs、Taq DNA聚合酶、DL2000Marker等购自大连宝生物工程有限公司。

其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

1.3实验仪器

PCR扩增仪：Mastercycle gradient(Eppendorfco.)

核酸电泳仪：DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)

DNA测序仪(Applied Biosystem377型全自动荧光序列分析仪)

DNA电泳分析系统：Kodak EDAS 290(Kodak co.)

其它仪器包括：离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等。

2实验方法和过程

2.1棉花基因组DNA提取与检测

2.1.1棉花基因组DNA提取

取子叶期的幼嫩棉花叶片做为DNA提取的材料，依照柱式植物DNAout试剂盒(天泽基因公司)的操作手册，进行棉花材料总DNA的提取。

2.1.4DNA检测

取5μl提取的DNA溶液，以0.8％的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来初步判断提取DNA的质量。采用紫外分光光度计测定所提取的DNA的浓度和纯度。

2.2Genome walking分离转基因抗虫棉南农6号的转化体特异性序列

Genome walking也是一种扩增已知序列旁侧未知区域序列的方法，主要步骤为基因组DNA酶切、与接头连接、两次巢式PCR扩增等。本实施例采用Genome walking的方法获得了转基因抗虫棉南农6号的转化体特异性序列。具体步骤参照Genome Walker^TM Universal Kit(Takara大连公司)试剂盒说明，本实施例进行了部分改进，主要操作步骤如下。

2.2.1基因组DNA酶切

分别用DraI、StuI、Pvu II和EcoR V酶切南农6号基因组DNA，标记为DL1～DL4。酶切体系为：基因组DNA(0.1μg/μL)，25μL；10×酶切Buffer，10μL；内切酶(10U/μL)，8μL；ddH₂O，57μL；总体积100μL。37℃温浴2h，取出离心管，低速离心5～10s，继续温浴16～18h。各取5μL进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否完全。

2.2.2纯化酶切产物

按回收试剂盒说明书纯化酶切产物。

2.2.3连接反应

连接反应体系：纯化的酶切产物，4μL；接头(25μM)，1.9μL；10×连接Buffer，1.6μL；T4DNA连接酶(6U/μL)，0.5μL；ddH₂O，8μL；总体积16μL。

混合反应液，16℃温浴过夜，然后70℃变性5min。每管加入72μL ddH₂O，混匀，-20℃保存备用。

2.2.4PCR反应

Genome Walking共需要两轮PCR反应，其PCR的反应体系见表1。

表1 反应体系(μL)

	第一轮	第二轮
			ddH2O	17.375	36.25
10×Buffer(Mg²⁺Plus)	2.5	5
			dNTP(2.5mM each)	2	4
AP1(10μM)	1	2
			GSP Primer 1(10μM)	1	2
Ex Taq(5U/μL)	0.125	0.25
			Template(20ng/μL)	1	0.5(第一轮反应产物)
Total volume	25	50

两轮PCR扩增的程序见表2。

表2 Genome Walking扩增程序

2.2.5序列测定和分析

PCR扩增产物在0.8％的琼脂糖胶上进行电泳，采用QIAquick Gel Extraction kit回收扩增片段，连接到pGEM-T easy(Promega，Madison，Wis.)，采用ABI PRISM 1300 Genetic Analyzer进行序列测定。采用软件vector NTI10.0(Invitrogen)对测定的序列进行拼接和分析。在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中用BLASTN检索相似的基因组序列。

3实验结果

3.1转基因抗虫棉南农6号转化体特异性序列测定

南农6号的Genome Walking以转化载体序列为基础设计引物NN6-WP1和NN6-WP2(表3)，分别进行第一轮和第二轮PCR扩增，结果在第4泳道获得约2200bp大小的扩增条带(图1)。经序列测定扩增的条带大小为2247bp。

表3 Genome Walking引物

引物	序列
		NN6-WP1	5’-GGAATACCCGGCAATGCAGCAG-3’
NN6-WP2	5’-GCCGACTGGGTTATATCAGACC-3’

3.2转基因抗虫棉南农6号转化体特异性序列分析

将获得的2247bp序列提交NCBI数据库比对分析，其中1-449bp为转化载体序列，450-2247bp为棉花基因组序列。

实施例2.本发明的转化体特异性PCR方法应用于鉴别转基因抗虫棉南农6号

1实验材料

1.1植物材料

转基因抗虫棉：南农6号

10个棉花材料，购自市场。

1.2酶与试剂

分子生物学试剂，如dNTPs、Taq DNA聚合酶、Marker等购自大连宝生物生物工程有限公司。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

1.3实验仪器

PCR扩增仪：Mastercycle gradient(Eppendorf co.)

核酸电泳仪：DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)

DNA电泳分析系统：Kodak EDAS 290(Kodak co.)

2实验方法和过程

2.1棉花基因组DNA提取与检测

见实施例1中2.1棉花基因组DNA提取与检测。

2.2鉴别转基因抗虫棉南农6号的转化体特异性PCR方法

本发明的PCR方法应用于鉴别棉花样品中是否含有转基因抗虫棉品系南农6号。采用引物NN6-F1/NN6-R1组合(序列见表4)，检测购自市场的10个棉花样品，见图2。实验结果表明，转基因抗虫棉南农6号能特异性扩增出预期的241bp的产物，检测的10个市场样品中均未能扩增获得相同大小的片段。

克隆南农6号的扩增片段，按实施例1中“2.2.5序列测定和分析”进行序列分析。序列分析结果表明，扩增片段序列与序列SEQ ID NO1的274-514位完全一致。

检测结果表明本发明提供的PCR方法能很好地鉴别出棉花样品中是否含有转基因抗虫棉南农6号。

PCR反应体系为：0.25μL rTaq(5U/μL)，5μL 10×PCR Buffer(Mg²⁺Plus)，4μL dNTP(各2.5mM)，引物各2μL(10μM)，模板各2μL(20ng/μL)，加灭菌蒸馏水补足体积至50μL。

扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃10min。

表4 鉴别转基因抗虫棉南农6号的转化体特异性PCR引物

引物	序列
		NN6-F1	5’-AACTGTAATGACTCCGCGCA-3’
NN6-R1	5’-GACGGGCAACACTAATTAAGAC-3’

Claims

1.鉴别转基因抗虫棉南农6号的PCR检测方法，其特征在于PCR正向引物依据SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的1-449位碱基序列设计，反向引物依据SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的450-2247位碱基序列设计；

所述正向引物为NN6-F1：5‘-AACTGTAATGACTCCGCGCA-3’，

所述反向引物为NN6-R1：5‘-GACGGGCAACACTAATTAAGAC-3’，

扩增区域位于SEQ ID NO.1的274–514位，扩增产物大小为241bp。

2.权利要求1所述PCR检测方法在鉴别南农6号以及以南农6号为亲本的棉花品种上的应用。