CN103194539A

CN103194539A - 一种利用ssr分子标记鉴定苎麻品种的方法

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Publication number: CN103194539A
Application number: CN2013101205470A
Authority: CN
Inventors: 陈建华; 栾明宝; 王晓飞; 许英; 孙志民; 邹自征
Original assignee: Institute of Bast Fiber Crops of CAAS
Current assignee: Institute of Bast Fiber Crops of CAAS
Priority date: 2013-04-09
Filing date: 2013-04-09
Publication date: 2013-07-10
Anticipated expiration: 2033-04-09
Also published as: CN103194539B

Abstract

本发明公开了一种利用SSR分子标记鉴定苎麻品种的方法，首先提取苎麻种质资源的DNA，然后通过EST-SSR引物进行PCR扩增，根据扩增带型构建苎麻的分子身份证，以区分和鉴定苎麻品种。本发明方法具有以下优势：首先，分子身份证编码原则方面，直接规定了第N个标记引物的扩增结果对应分子身份证的第N位，省略对标记名称的表述；同时，由于每个标记的引物扩增的带型不超过9，因此保证了分子身份证每1位上也只有1位数，书写非常简洁。其次，EST-SSR引物形成和实验操作过程简单，易操作，扩增带型清晰稳定，重复性好。该方法为准确鉴别苎麻种质资源，尤其是同物异名和同名异物现象奠定了基础，也为新品种保护奠定了基础。

Description

一种利用SSR分子标记鉴定苎麻品种的方法

技术领域

本发明属于植物品种的分子生物学鉴定方法技术领域，具体涉及一种利用SSR分子标记鉴定苎麻品种的方法。

背景技术

苎麻(Boehmeria nivea L.Gaud)，又叫“中国草”，起源于中国，为荨麻科苎麻属的多年生宿根性草本植物，是中国特色的天然纺织原料^[1]。除传统的纤维价值外，苎麻的药用价值、饲料用途、水土保持、工业原料、生物能源等多功能用途已开始受到关注^[2-5]。迄今为止，我国是收集、保存苎麻属种质资源最多的国家，仅国家种质长沙苎麻圃就拥有2000多份材料，其中的栽培资源已广泛为育种和生产所利用^[6]。

在收集种质资源的过程中发现，苎麻存在同物异名和同名异物现象。而且，随着选育品种的增加，面对如此多的新种质，进行品种鉴定不仅对苗木繁育具有重要意义，也是保护这些品种知识产权的需要。传统上苎麻一般采用形态性状进行种质鉴定。采用田间调查品种性状的方法，时间长，费用高；且苎麻为宿根性多年生植物，生命周期长，种质资源间的形态差异性状少，利用传统的形态学性状鉴定方法区分种质较为困难。随着DNA分子标记的不断发展和完善，从分子水平上对种质的遗传特异性快速、准确、经济、不受环境条件影响的鉴定成为可能。

我们课题组2010年利用ISSR分子标记技术构建了42份苎麻种质的分子身份证^[7]以区分和鉴定品种。但是ISSR标记扩增结果相对不稳定，重复性差。SSR（simple sequence repeats）分析技术具有染色体上分布均匀、多态性丰富、共显性、分辨率高和易于检测等优点^[8]，自开发以来就成为最为有效构建许多作物指纹图谱的工具^[9]。高运来等^[10]利用43对SSR引物对黑龙江省6个积温带的83个大豆品种构建了分子身份证。王黎明等^[11]利用41对SSR引物构建了142份甜高粱的分子身份证。陈昌文等^[12]利用8对SSR引物构建了176份桃种质资源的分子身份证。

目前，尚未有利用SSR分子标记构建苎麻分子身份证的方法。

发明内容

本发明目的旨在创立一种利用SSR分子标记鉴定苎麻品种的方法。

一种利用SSR分子标记鉴定苎麻品种的方法，包括以下步骤：

（1）提取各样品苎麻种质DNA；

（2）利用设计的8对苎麻EST-SSR引物，扩增苎麻的基因组DNA；

（3）记录每个样品每对引物的DNA扩增带型；

（4）根据DNA扩增带型区分鉴定苎麻品种；

所述的8对苎麻EST-SSR引物序列如下：

ibfc50：F:AACAATCCAGGAGTGGCAATC

R:ACAAGCGAAGATCGTCTCATC；

ibfc40F:TGTATAGAACTGAGTAAATGATTG

R:CAACTTTCTTAAACCACTTTCG；

Ibfc27F:AGCCAGGTTCCAGAAGTCC

R:CATAATCACAAAGTCTCGGTTCC；

Ibfc11F:GCGGAGGCTTAATTTGCTTTG

R:ACTCAATACATACACGGCACTAG；

ibfc65F:ACGAACCACAACACAGAGAG

R:ACGAGGGAACACCAGAGAG；

ibfc62F:GAAACTATTTCCACCAACAAAG

R:ACACACATTCCTACACACC；

ibfc53F:GGCTCAAGTTTGCTCATAGATTC

R:CGGCTTCGCTTTAGGATTTG；

ibfc20F:AGTGCGGAGATAACTGTTC

R:GGCTACTTTATTCTAAACCAAAC。

PCR反应体系:20μL，

体系组成	终浓度
		Mg²⁺	2.0mmol/L
Taq Buffer	1×
		dNTP Mix	200μmol/L
Taq Enzyme	1U
		Primers	0.25μmol/L
DNA	90ng

体系中余量为水。

PCR扩增程序：95℃预变性5min，94℃变性1min，根据引物的退火温度复性50sec，72℃延伸1min，29次循环后72℃延伸10min；

引物ibfc50、ibfc40、ibfc27、ibfc11、ibfc65、ibfc62、ibfc53、ibfc20的退火温度分别为：50°C、52°C、56°C、51°C、60°C、54°C、56°C、54°C。

步骤（4）是对每个样品不同的DNA扩增带型赋值，构建苎麻SSR分子标记身份证，以区分苎麻品种。

首先将每个样品分别加入1个引物对扩增，即每对引物扩增出来的带型均不超过9种，然后将每对引物扩增出来的所有带型种类均从1开始按序编号，扩增的条带模糊不清，无法正确辨别带型以0表示，最后将每个样品的每对引物的带型编号依次组合在一起，形成8位的分子身份证。

上述方法根据所述的8对引物可以区分108个苎麻品种。

本发明方法中，相对于我们实验室以前利用ISSR分子标记技术构建的苎麻分子身份证具有以下优势。首先，分子身份证编码原则方面，直接规定了第N个标记引物的扩增结果对应分子身份证的第N位，因此省略对标记名称的表述；同时，由于每个标记的引物扩增的带型总数不超过9，从1开始按序编号，扩增的条带模糊不清，无法正确辨别带型以0表示，因此保证了分子身份证每1位上也只有1位数，相比以前的苎麻分子身份证，书写非常简洁。其次，筛选的EST-SSR引物好，实验操作过程简单，易操作，扩增带型清晰稳定，重复性好。苎麻SSR分子标记身份证方法的确立，为准确鉴别苎麻种质资源，尤其是同物异名和同名异物现象奠定了基础，也为新品种保护奠定了基础。

附图说明

图1为引物ibfc50在1-46种质中的扩增图；

其中前5个泳道分别代表5个带型，第7个泳道为第6个带型，第15个泳道为第7个带型，第18个泳道为第8个带型，第26个泳道为第9个带型；

图2为引物ibfc65扩增的6种带型示意图。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1

1材料与方法

1.1材料

108份苎麻种质资源。原产地来自于中国、日本、印度尼西亚、缅甸4个国家。其中国外种质资源5份，国内种质资源103份。国内种质资源包括部分主栽地区的地方品种和全国各苎麻育种单位育成的品种（品系）。以上材料均种植于国家长沙苎麻种质圃。

1.2方法

1.2.1基因组DNA的提取

在国家种质长沙苎麻圃取108份苎麻种质(表1)植株的新发出的嫩芽，利用天根试剂盒提取DNA。提取后的DNA通过电泳检测浓度后，计算样品DNA浓度，并稀释到所需浓度。

1.2.2引物设计与合成

利用SSRhunter结合人工搜索寻找含有SSR的苎麻EST序列，搜索的标准为：单核苷酸的重复次数≥16，二核苷酸的重复次数≥6，三核苷酸的重复次数≥4，四核苷酸的重复次数≥3，五核苷酸的重复次数≥3。六核苷酸的重复次数≥2。为进一步利用苎麻EST建立SSR标记，在剔除SSR旁邻序列小于20bp的EST后，对余下的EST-SSR用软件Primer5设计苎麻SSR引物。设计好的SSR引物在南京金斯特公司合成。

1.2.3SSR-PCR分析

PCR反应体系:20μL反应体系组成见表2

表2PCR反应体系组成

体系组成	终浓度
		Mg²⁺	2.0mmol/L
Taq Buffer	1×
		dNTP Mix	200μmol/L each
Taq Enzyme	1U
		Primers	0.25μmol/L each
DNA	90ng

PCR扩增程序：95℃预变性5min，94℃变性1min，50-60℃之间（依引物的退火温度而定）复性50sec，72℃延伸1min，29次循环后72℃延伸10min。PCR扩增在PTC-200扩增仪上进行（MJ Research.Inc.）。

1.2.4PCR扩增产物检测

扩增产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用张军^[13]的方法进行银染。记录带型。

1.2.5分子身份证的构建

用筛选出多态性好的SSR引物，对各种质资源的苎麻基因组总DNA样品进行PCR扩增。

对每个引物不同带型进行赋值。

采用东北农业大学开发的资源特征分析软件IAnalysis1.0(登记号为2007SR11870)建立品种分子ID。

2结果与分析

2.1苎麻EST-SSR引物的特点

从NCBI下载的320条EST序列中，共有70条含有SSR序列，其中6条含有2条以上的SSR序列。苎麻的EST-SSR种类丰富，单核苷酸至六核苷酸重复都能能检出。但各类型的EST-SSR出现的频率大不相同。共设计了76对SSR引物，所设计的苎麻EST-SSR引物的优势重复单元为三核苷酸、单核苷酸和二核苷酸．其中三核苷酸基元所占的比例最高，为46.1%；单碱基基元所占比例次之，为19.7%；双碱基基元所占比例达到15.8%。四碱基、五碱基和六碱基所占的比例较低，为3.9%-7.9%之间。

2.2苎麻EST-SSR引物的遗传多样性

利用76对EST-SSR引物，对62份苎麻种质DNA进行扩增，结果表明，70对引物进行了有效扩增，50对引物具有多态性，27对引物扩增出了清晰条带。利用popgene32软件，考察了27对引物的遗传多样性(表3)。结果表明，27对SSR引物中，每对引物扩增的位点数在2-5之间，其中19对引物扩增出2个位点，7对引物扩增出3个位点，1对引物扩增出5个位点。27对引物的观察杂合度（H_O）在0.16到0.93之间，期望杂合度在0.21到0.66之间。14对引物偏离Hardy–Weinberg(P<0.05)。

2.3分子身份证的构建

分别记录27对引物108份苎麻种质的PCR扩增带型。每对引物扩增带型分别记为1,2，….n。然后把数据输入EXCEL表格中。首先删除扩增模糊不清比例超过4%的引物，共有6对引物被删除，分别是ibfc35、ibfc10、ibfc28、ibfc16、ibfc69、ibfc56。其次删除与其他引物相似系数超过0.8的的引物，共有2对引物被删除，分别是ibfc19和ibfc24。然后根据引物的特异性指数进行分子身份证构建。如采用2个以上标记组合的特异等位基因来区分苎麻种质资源，当2个标记不能完全区分所有种质时，则通过增加标记数的方法来区分，直到把所有种质区分开为止。即第k个标记的带型结果n对应分子身份证的第k位。例如在本发明中利用k=8对引物（ibfc20、ibfc53、ibfc65、ibfc40、ibfc50、ibfc11、ibfc27、ibfc62引物序列）可以把108份苎麻种质资源区分开。构建了具有8位的苎麻分子身份证（表4）。如：瓦窑苎麻的ID为43311132，分子身份证的第一位4，表示引物ibfc20（k_i）扩增出该引物的第四种(n_j)带型。分子身份证的第三位3，表示引物ibfc65扩增出该引物的第三种带型。

表4108份苎麻种质资源的分子身份证

0表示扩增的条带模糊不清，无法正确辨别带型。

3讨论

3.1本发明的分子身份证编码原则书写简洁

王静毅等^[14]对香蕉构建的指纹图谱也可认为是一种分子身份证，作者采用字母加数字的方法表示分子身份证的位数和SSR引物扩增的不同等位基因，例如，将第1个标记的引物扩增的第11个等位基因命名为A11，这造成了分子身份证的字符串编码位数过多。以前本申请人课题组利用ISSR标记构建苎麻分子身份证，采用的是01表示法，位数达到16位。而在本发明中，直接规定了第N个标记引物的扩增结果对应分子身份证的第N位，因此省略对标记名称的表述；同时，由于每个标记的引物扩增的带型不超过9，因此保证了分子身份证每1位上也只有1位数，相比以前的苎麻分子身份证，书写非常简洁。

表3.8对SSR引物的特征

3.2SSR分子标记构建苎麻分子身份证的优势

我们前期利用了ISSR分子标记技术构建了42份苎麻的分子身份证。但是发现，利用ISSR技术扩增的条带较多，重复性较差，容易导致人为误差。SSR分子标记技术，由于标记方法本身的特性，其在不同品种间每个特定大小的等位基因序列一致，扩增的条带相对较少，因此重复性高；同时SSR不需要对模板酶切，操作简单。这些特点使其应用于分子身份证的构建成为可能。根据大麦谱系对亲本及其后代品种中SSR的分析，SSR在不同世代间遗传稳定^[15]。同一品种不同个体SSR的稳定性在水稻中得到证实^[16]。因此，相对ISSR等分子标记技术，利用SSR分子标记技术构建分子身份证具有准确可靠的优势。

参考文献

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Claims

1.一种利用SSR分子标记鉴定苎麻品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：