CN105274103A - 一种鉴别汉麻、苎麻、亚麻原麻纤维种类的pcr引物组以及pcr鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物信息技术领域，公开了一种鉴别汉麻、苎麻、亚麻原麻纤维种类的PCR引物组以及PCR鉴别方法。该引物组由SEQ？ID？NO:1-6所示核苷酸序列组成，其中SEQ？ID？NO:1-2所示核苷酸序列为鉴别汉麻的上、下游引物，SEQ？ID？NO:3-4所示核苷酸序列为鉴别苎麻的上、下游引物，SEQ？ID？NO:5-6所示核苷酸序列为鉴别亚麻的上、下游引物。本发明依靠生物技术提供了一套专属性较强的引物，可用来专属鉴别汉麻、苎麻和亚麻，而彼此间互不干扰鉴别，同时所述方法借助PCR技术，具有需要样本量小、检测方便、稳定，可操作性强、结果可靠等优点，可以广泛应用于纺织用麻类原麻纤维检测成分分析中。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种鉴别汉麻、苎麻、亚麻原麻纤维种类的PCR引物组以及PCR鉴别方法。
背景技术
汉麻(CannabinssativalL.)为荨麻目大麻科大麻属一年生草本植物，也称工业大麻，火麻，是重要的韧皮纤维作物。目前栽培面积和产量以中国为多，主要分布在中国云南，安徽，黑龙江等地。我国目前仍然是汉麻纤维的主产国，产量占世界大麻产量的1/3左右，居世界第一位。汉麻纤维以其优良的绿色环保和独特的抗菌舒适性等功能成为了21世纪最具可持续发展潜力的绿色新型纺织服装材料。苎麻(BoehmerianiveaL.Gand)为荨麻目荨麻科苎麻属多年生宿根性草本植物，多产于长江流域。是我国特色的韧皮纤维作物。苎麻一年可收成三次，分别称为头麻，二麻，三麻。每次收成麻的品质都有所不同，头麻，二麻与三麻的纤维粗细程度也各不相同。亚麻(LinumusitatissimumL.)属亚麻科亚麻属，种类较多，分为纤维用，油用，纤油用三类，均为一年生草本植物。亚麻纤维存在于麻茎的韧皮组织中，经脱胶去除胶质可加工成10-20根单纤维组成的工艺纤维。由于吸湿性好，导湿快，直径相对较细，是夏季衣物的主要纤维原料之一。
麻是人类最早用于纺织的材料之一，常用的除了上述提到的苎麻、亚麻、大麻外，还有黄麻、红麻、剑麻、蕉麻等，麻纤维具有天然纤维之王的美誉，是轻纺工业极为重要的优质原料。随着麻类脱胶工艺的不断完善、麻类纤维制品印染后整理技术的突破、高科技纺织手段的应用以及麻类作物综合利用技术的提高，麻类产品的经济价值明显提高，麻纤维织物越来越成为高级时装设计师手中的理想面料。近年来，由于麻纤维具有生态环保，抗霉杀菌等优良特性，因此各种麻纤维纺织产品或含麻纤维纺织产品在市场上日渐增多，而应用于服用纺织产品的麻纤维以苎麻、亚麻、汉麻为主。但是不同的麻纤维价格相差极大，苎麻价格只有3600元/吨～4000元/吨，而汉麻(又称工业大麻)则高达19000元/吨～24000元/吨，不少不法商人为了获取暴利，用价值较低的麻类来冒充价值较高的麻类，为了有力地打击这种商业欺诈行为，必须建立一套能准确鉴别麻类纤维的方法。而这三种纤维微观形态和化学性能相似，特别是麻类经收获剥制干燥后得到原麻，从原麻及脱胶后精干麻外观无法区分麻的种类，造成对这三种麻纤维的鉴别存在困难。因此如何准确定性亚麻、苎麻、大麻已成为纺织品检测成分分析业务中的重要研究课题。目前麻类纤维的鉴别在纤维成分检测实验室主要是经验丰富的检测人员采用显微镜观察各种纤维的微观形态的方式进行鉴别，当鉴定人员经验不足时会产生严重的人为误差。有时为提高分析的准确性往往需要综合显微镜观察、扫描电镜、燃烧法及化学溶解法及红外光谱法等实验的结果综合判断。日本纤维鉴别标准中采用红外光谱鉴别了苎麻和亚麻，韩国纤维鉴定标准中利用麻纤维灼烧残渣形态鉴别了剑麻，韩国标准还利用纤维旋转方向和着色反应鉴别了大麻、亚麻、黄麻，但在实际操作中发现，采用旋转方向和着色反应等来鉴别大麻、亚麻和黄麻时，即使是操作经验十分丰富的检验人员，在没有相关参照物的条件下也相当困难。进一步将汉麻、苎麻、亚麻各种麻纤维通过客观实验检测完全区分开来，则尚未见有文献报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鉴别汉麻、苎麻、亚麻原麻纤维种类的PCR引物组以及PCR鉴别方法，所述引物组在鉴别汉麻、苎麻或亚麻时仅对相应的麻类进行扩增并产生特有DNA条带，不受其他麻类干扰，使得鉴别更加准确、方便和快捷，可结合PCR形成一套系统的鉴别方法。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种鉴别汉麻、苎麻、亚麻原麻纤维种类的PCR引物组，由SEQIDNO:1-6所示核苷酸序列组成，其中SEQIDNO:1-2所示核苷酸序列为鉴别汉麻的上、下游引物，SEQIDNO:3-4所示核苷酸序列为鉴别苎麻的上、下游引物，SEQIDNO:5-6所示核苷酸序列为鉴别亚麻的上、下游引物。
现有鉴别汉麻、苎麻、亚麻原麻纤维种类的方法多采用人工鉴别方法，主观因素和人为经验影响鉴别的准确度，而且无法完全区分汉麻、苎麻、亚麻各种麻纤维，针对现有技术的这一缺陷，本发明从生物技术角度出发，提供了一组专属性的PCR扩增引物组，所述引物组内有专属鉴别汉麻、苎麻和亚麻的三对引物，其仅对各自对应的麻类进行扩增并产生特有DNA条带，不受其他麻类干扰，鉴别更加准确。
基于上述的技术效果，本发明提供了所述PCR引物组在鉴别汉麻、苎麻、亚麻原麻纤维种类中的应用。
与此同时，本发明还提供了一种汉麻、苎麻、亚麻原麻纤维种类的PCR鉴别方法，包括：
步骤1、提取待测的麻类植物纤维样本的DNA；
步骤2、采用SEQIDNO:1-2所示核苷酸序列或SEQIDNO:3-4所示核苷酸序列或SEQIDNO:5-6所示核苷酸序列对样本DNA进行PCR扩增；
步骤3、PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若采用SEQIDNO:1-2所示核苷酸序列扩增的产物为170bp片段的样本即为汉麻纤维，若采用SEQIDNO:3-4所示核苷酸序列扩增的产物为221bp片段的植物纤维为苎麻纤维，若采用SEQIDNO:5-6所示核苷酸序列扩增的产物为270bp片段的植物纤维为亚麻纤维。
其中，步骤1中所述样本的DNA提取可以采用本领域常规的方法，如CTAB法，也可以通过试剂公司购买提取DNA的试剂盒进行提取。
作为优选，步骤2所述PCR扩增体系为：
反应总体积为25μl，其中样本DNA20ng，2×PremixTaq缓冲液12.5μl，5μM上、下游引物各1μl，余量为ddH2O。
作为优选，步骤2所述PCR扩增的程序为：
95℃预变性5min；
95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s，循环27次；
72℃延伸10min，10℃保存。
作为优选，所述琼脂糖凝胶电泳采用胶浓度为2.0％的琼脂糖凝胶。
采用本发明所述引物组中的三对引物分别对汉麻、苎麻和亚麻的DNA进行PCR扩增以及琼脂糖凝胶检测，结果显示，在使用SEQIDNO:1-2所示核苷酸序列扩增汉麻、苎麻和亚麻的DNA时，各自PCR产物电泳仅能检测到汉麻特有的170bp条带，而苎麻、亚麻没有任何条带产生；使用SEQIDNO:3-4所示核苷酸序列扩增汉麻、苎麻和亚麻的DNA时，各自PCR产物电泳仅能检测到苎麻特有的221bp条带，而汉麻麻、亚麻没有任何条带产生；使用SEQIDNO:5-6所示核苷酸序列扩增汉麻、苎麻和亚麻的DNA时，各自PCR产物电泳仅能检测到亚麻特有的270bp条带，而苎麻、汉麻没有任何条带产生。
由以上技术方案可知，本发明依靠生物技术提供了一套专属性较强的引物，可用来专属鉴别汉麻、苎麻和亚麻，而彼此间互不干扰鉴别，同时所述方法借助PCR技术，具有需要样本量小、检测方便、稳定，可操作性强、结果可靠等优点，可以广泛应用于纺织用麻类原麻纤维检测成分分析中。
附图说明
图1所示为DNAMarker条带位置凝胶示意图；
图2所述为采用SEQIDNO:1-2所示核苷酸序列扩增汉麻、苎麻和亚麻DNA后扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1-3为汉麻(品种名分别为云麻一号、黑龙江工业大麻、安徽大麻)电泳结果，泳道4-5为苎麻(品种名分别为湘苎二号、湘苎三号)电泳结果，泳道6-9为亚麻(品种名分别为西亚一号、吉亚二号、吉亚四号、吉亚六号)检测结果；
图3所述为采用SEQIDNO:3-4所示核苷酸序列扩增汉麻、苎麻和亚麻DNA后扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道10-12为汉麻(品种名分别为云麻一号、黑龙江工业大麻、安徽大麻)电泳结果，泳道13-14为苎麻(品种名分别为湘苎二号、湘苎三号)电泳结果，泳道15-18为亚麻(品种名分别为西亚一号、吉亚二号、吉亚四号、吉亚六号)检测结果；
图4所述为采用SEQIDNO:5-6所示核苷酸序列扩增汉麻、苎麻和亚麻DNA后扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道19-21为汉麻(品种名分别为云麻一号、黑龙江工业大麻、安徽大麻)电泳结果，泳道22-23为苎麻(品种名分别为湘苎二号、湘苎三号)电泳结果，泳道24-27为亚麻(品种名分别为西亚一号、吉亚二号、吉亚四号、吉亚六号)检测结果。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种鉴别汉麻、苎麻、亚麻原麻纤维种类的PCR引物组以及PCR鉴别方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种鉴别汉麻、苎麻、亚麻原麻纤维种类的PCR引物组以及PCR鉴别方法进行详细说明。
实施例1：本发明所述引物组
汉麻检测上、下游引物：上游引物参见SEQIDNO:1，具体为5ˊ-ATCGAAGAGCAGCAACAAGC-3ˊ，下游引物参见SEQIDNO:2，具体为5ˊ-TGGAGATCTTGTCTTCCAGCTG-3ˊ；
苎麻检测上、下游引物：上游引物参见SEQIDNO:3，具体为5ˊ-TCCAAGCATTTCCCGAACGA-3ˊ，下游引物参见SEQIDNO:4，具体为5ˊ-GCCCGATCTTCCAGCTCTAC-3ˊ；
亚麻检测上、下游引物：上游引物参见SEQIDNO:5，具体为5ˊ-TCATCAACAGCGCATCTGGT-3ˊ，下游引物参见SEQIDNO:6，具体为5ˊ-AGCCTTACAGCCACACACTC-3ˊ。
实施例2：本发明所述PCR鉴别方法
采用市售商用DNA提取试剂盒提取待测的麻类植物纤维样本的DNA；
采用SEQIDNO:1-2所示核苷酸序列或SEQIDNO:3-4所示核苷酸序列或SEQIDNO:5-6所示核苷酸序列对样本DNA进行PCR扩增；
PCR扩增体系为：
反应总体积为25μl，其中样本DNA20ng，2×PremixTaq缓冲液12.5μl，5μM上、下游引物各1μl，余量为ddH2O。
PCR扩增的程序为：
95℃预变性5min；
95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s，循环27次；
72℃延伸10min，10℃保存。
PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(胶浓度2.0％)，若采用SEQIDNO:1-2所示核苷酸序列扩增的产物为170bp片段的样本即为汉麻纤维，若采用SEQIDNO:3-4所示核苷酸序列扩增的产物为221bp片段的植物纤维为苎麻纤维，若采用SEQIDNO:5-6所示核苷酸序列扩增的产物为270bp片段的植物纤维为亚麻纤维。
实施例3：鉴别试验
试验样本为汉麻、苎麻和亚麻，具体品种和采集地见表1。
表1试验样本
| 样本号 | 品种名称 | 采集地 |
| A(汉麻) | 云麻一号 | 云南省西双版纳 |
| B(汉麻) | 黑龙江工业大麻 | 黑龙江省漠河 |
| C(汉麻) | 安徽大麻 | 安徽省六安 |
| D(苎麻) | 湘苎二号 | 湖南省长沙市 |
| E(苎麻) | 湘苎三号 | 湖南省长沙市 |
| F(亚麻) | 西亚一号 | 宁夏省固原 |
| G(亚麻) | 吉亚二号 | 吉林省长春市 |
| H(亚麻) | 吉亚四号 | 吉林省长春市 |
| I(亚麻) | 吉亚六号 | 吉林省长春市 |
采用SEQIDNO:1-2所示核苷酸序列分别对上述样本DNA进行PCR扩增并进行琼脂糖凝胶检测，方法参照实施例2，DNAMarker条带位置凝胶示意图见图1(下同)，结果见图2；
采用SEQIDNO:3-4所示核苷酸序列分别对上述样本DNA进行PCR扩增并进行琼脂糖凝胶检测，方法参照实施例2，结果见图3；
采用SEQIDNO:5-6所示核苷酸序列分别对上述样本DNA进行PCR扩增并进行琼脂糖凝胶检测，方法参照实施例2，结果见图4；
由图1-图3的电泳图可知，在使用SEQIDNO:1-2所示核苷酸序列扩增汉麻、苎麻和亚麻的DNA时，各自PCR产物电泳仅能检测到汉麻特有的170bp条带，而苎麻、亚麻没有任何条带产生；使用SEQIDNO:3-4所示核苷酸序列扩增汉麻、苎麻和亚麻的DNA时，各自PCR产物电泳仅能检测到苎麻特有的221bp条带，而汉麻麻、亚麻没有任何条带产生；使用SEQIDNO:5-6所示核苷酸序列扩增汉麻、苎麻和亚麻的DNA时，各自PCR产物电泳仅能检测到亚麻特有的270bp条带，而苎麻、汉麻没有任何条带产生。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (6)
1.一种鉴别汉麻、苎麻、亚麻原麻纤维种类的PCR引物组，其特征在于，由SEQIDNO:1-6所示核苷酸序列组成，其中SEQIDNO:1-2所示核苷酸序列为鉴别汉麻的上、下游引物，SEQIDNO:3-4所示核苷酸序列为鉴别苎麻的上、下游引物，SEQIDNO:5-6所示核苷酸序列为鉴别亚麻的上、下游引物。
2.权利要求1所述PCR引物组在鉴别汉麻、苎麻、亚麻原麻纤维种类中的应用。
3.一种汉麻、苎麻、亚麻原麻纤维种类的PCR鉴别方法，其特征在于，包括：
步骤1、提取待测的麻类植物纤维样本的DNA；
步骤2、采用SEQIDNO:1-2所示核苷酸序列或SEQIDNO:3-4所示核苷酸序列或SEQIDNO:5-6所示核苷酸序列对样本DNA进行PCR扩增；
步骤3、PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若采用SEQIDNO:1-2所示核苷酸序列扩增的产物为170bp片段的样本即为汉麻纤维，若采用SEQIDNO:3-4所示核苷酸序列扩增的产物为221bp片段的植物纤维为苎麻纤维，若采用SEQIDNO:5-6所示核苷酸序列扩增的产物为270bp片段的植物纤维为亚麻纤维。
4.根据权利要求3所述鉴别方法，其特征在于，步骤2所述PCR扩增体系为：
反应总体积为25μl，其中样本DNA20ng，2×PremixTaq缓冲液12.5μl，5μM上、下游引物各1μl，余量为ddH2O。
5.根据权利要求3所述鉴别方法，其特征在于，步骤2所述PCR扩增的程序为：
95℃预变性5min；
95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s，循环27次；
72℃延伸10min，10℃保存。
6.根据权利要求3所述鉴别方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶电泳采用胶浓度为2.0％的琼脂糖凝胶。
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