CN103194544B

CN103194544B - 一种辅助鉴定烟草环斑病毒的试剂及其应用

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Publication number: CN103194544B
Application number: CN201310123680.1A
Authority: CN
Inventors: 粟智平; 封立平; 许红岩; 尹伟力; 耿金培; 李金庆; 杨益娥
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-04-10
Filing date: 2013-04-10
Publication date: 2015-08-05
Anticipated expiration: 2033-04-10
Also published as: CN103194544A

Abstract

本发明的目的是提供一种辅助鉴定烟草环斑病毒的试剂及其应用。本发明提供的试剂包括由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的特异引物。所述试剂还可包括核苷酸序列如序列表的序列4所示的特异探针。烟草环斑病毒是我国重要的检疫性有害生物，本发明中利用三条巢式PCR引物和一条TaqMan探针，建立了半巢式-RT-Realtime PCR检测TRSV的方法。该方法有机地结合了巢式PCR和实时荧光PCR技术；三条引物和一条探针形成的两套PCR体系相互验证，有效提高了结果的准确性；实时荧光PCR技术有效提高了检测的灵敏度。本方法准确、灵敏、简便、快速，检出低限均可达4fg/μl植物总RNA。

Description

一种辅助鉴定烟草环斑病毒的试剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种辅助鉴定烟草环斑病毒的试剂及其应用。

背景技术

烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus，TRSV)，1927年首次在美国弗吉尼亚烟草上发现并报道,现已分布于世界50多个国家。中国现在局部分布，官方控制，是我国进境重要的检疫对象。我国已从荷兰进口的萝卜种子、美国进口的大豆和塞尔维亚进口的葵花种子等进口货物中截获过该病毒。

烟草环斑病毒隶属豇豆花叶病毒科（Comoviridae），是线虫传多面体病毒属（Nepovirus）的代表种。该病毒粒子是球状、等轴、直径约28ｎｍ的二十面体，壳粒由60个外壳蛋白亚基组成。TRSV寄主范围很广，可侵染54科246种植物。自然寄主有豆类、瓜类、薯类、花卉和果树等，发病后导致多种作物的产量下降50%以上。TRSV传播途径多样，可通过种子传播、嫁接、机械接种、媒介传播。汁液接种易传毒。种子传毒，种传寄主多且种传率高，如大豆种传率为40%-100%。苗木是远距离传播的主要途径。自然传播介体为线虫Xiphinema americanum和X.rivesi。土壤中的美洲剑线虫（Xiphinema americanum）的成虫和3龄幼虫单头线虫也能传毒，线虫在24小时内获毒，感染的线虫贮藏在10℃下49周后仍可传毒。烟蓟马（Thrips tabaci）的若虫、螨（Teranychus spp.）、叶蝉（Melanoplusdiffentials,M.mexicanus,M.femurrubrum）、烟草叶甲（Epitrixhirtipennis）和桃蚜（Myzus persicae）也可传毒。

进境粮谷、种子、苗木中植物病毒的检测是我国检验检疫系统的重点，也是难点，尤其是木本植物中病毒的检测，由于它们在植株体内含量低、分布不均，且时有复合侵染等特殊性，传统的方法，极易出现漏检和误检。为了维护我国农业的健康发展、防止烟草环斑病毒随粮谷、种子、苗木等传入中国，开发出快速、灵敏检测该病毒的先进的技术，意义重大。

近年来，国内关于烟草环斑病毒检测技术的研究报道较多，主要采用血清学方法、胶体金免疫层析法或分子生物学方法。如曹成等建立了双重胶体金层析法快速检测烟草环斑病毒的方法（曹成,魏梅生，张永江等，双重胶体金层析法快速检测番茄环斑病毒和烟草环斑病毒RT-PCR扩增子[J]．中国农学通报，2011,27(22):197-201．）；杨翠云等建立了RT-PCR和IC-RT-PCR检测方法(杨翠云，曹洁，于翠，等．烟草环斑病毒RT-PCR和IC-RT-PCR检测方法的研究[J]．上海农业学报，2007，23(1)：83-87．)；易汪雪等建立了单管实时荧光RT-PCR方法。常规的RT-PCR方法检测也有相关的报道(易汪雪，陈舜胜，杨翠云，等．单管实时荧光RT-PCR方法同时检测大豆种子中的菜豆荚斑驳病毒和烟草环斑病毒[J]．植物病理学报，2011，41(1)：85-92．)。

ELISA技术操作步骤繁琐、检测周期长、灵敏度低、易出现假阳性。PCR凝胶电泳技术较ELISA在多个方面有所提高，但易于造成污染。未见采用半巢式-实时荧光PCR检测TRSV的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种辅助鉴定烟草环斑病毒的试剂及其应用。

本发明提供的辅助鉴定烟草环斑病毒的试剂，包括特异引物；所述特异引物由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成。

所述试剂可由所述特异引物和特异探针组成；所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列4所示。所述特异探针可为TaqMan探针。

所述试剂可用于制备辅助鉴定烟草环斑病毒的试剂盒。

本发明还保护一种辅助鉴定烟草环斑病毒的试剂盒，包括所述试剂。

所述试剂可用于辅助鉴定烟草环斑病毒。

本发明还保护一种辅助鉴定烟草环斑病毒的方法，包括如下步骤：以待测病毒的cDNA为模板，用特异引物对甲进行PCR，得到PCR产物甲；以待测病毒的cDNA为模板，用特异引物对乙进行PCR，得到PCR产物乙；如果PCR产物甲为309bp且PCR产物乙为245bp，待测病毒为候选的烟草环斑病毒；所述特异引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对；所述特异引物对乙为序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对。

本发明还保护另一种辅助鉴定烟草环斑病毒的方法，包括如下步骤：以待测病毒的cDNA为模板，用特异引物对甲和特异探针进行实时荧光PCR，得到扩增曲线甲；以待测病毒的cDNA为模板，用特异引物对乙和所述特异探针进行实时荧光PCR，得到扩增曲线乙；根据扩增曲线甲和扩增曲线乙判断待测病毒是否为候选的烟草环斑病毒；所述特异引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对；所述特异引物对乙为序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对；所述特异探针为TaqMan探针，核苷酸序列如序列表的序列4所示。如果所述扩增曲线甲和所述扩增曲线乙均为阳性，待测病毒为候选的烟草环斑病毒。

所述待测病毒具体可为烟草环斑病毒、南方菜豆花叶病毒、菜豆荚斑驳病毒、花生矮化病毒、番茄环斑病毒或番茄斑萎病毒。

本发明还保护一种检测待测样本中是否含有烟草环斑病毒的方法，包括如下步骤：

（1）提取待测样本的总RNA，反转录为cDNA；

（2）以所述cDNA为模板，用特异引物对甲和特异探针进行实时荧光PCR，得到扩增曲线甲；以所述cDNA为模板，用特异引物对乙和所述特异探针进行实时荧光PCR，得到扩增曲线乙；根据扩增曲线甲和扩增曲线乙判断待测样本中是否含有烟草环斑病毒；所述特异引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对；所述特异引物对乙为序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对；所述特异探针为TaqMan探针，核苷酸序列如序列表的序列4所示。如果所述扩增曲线甲和所述扩增曲线乙均为阳性，待测样本含有烟草环斑病毒。

所述TaqMan探针5’末端具体可连接有荧光报告染料FAM，3’末端具体可连接有荧光淬灭染料TAMRA。

不同的方法，灵敏度和准确性差异较大，如ELISA与PCR凝胶电泳方法灵敏度相差100倍以上，PCR凝胶电泳与实时荧光PCR技术灵敏度相差也在100倍以上。即使同样采用实时荧光PCR技术，由于引物的扩增效率不一样，灵敏度差异也可达到1000倍以上。在实际检测鉴定工作中，为了提高结果的准确性，经常需要对一个结果进行两个以上的确认试验，不同方法检测灵敏度不一样，很难保证两个试验的结果完全一样，这就为结果的判断增加了难度，特别是在检测目标含量极少的情况下，这种难度就会进一步加大。若两套方法检测灵敏度一样或非常接近，这个难题就迎刃而解。

实时荧光PCR（Realtime-PCR）检测技术是国际最近十余年发展起来的高新检测技术，该技术将PCR扩增与荧光检测系统有机结合起来。与目前已报道的其它检测技术相比，该技术具有巨大的优越性，主要体现在：（a）能实时观察PCR过程中待检测样品模板DNA（或cDNA）扩增情况，无需进行电泳、染色和紫外检测，大大简化了操作程序并缩短检测时间；（b）采用荧光信号放大功能，大大提高了灵敏度；（c）特异性引物与特异荧光探针双保险结构有效提高了检测的准确性；（d）全封闭的操作系统，减少了PCR产物对实验室环境的染污和样品间的交叉染污，有效降低和避免了假阳性结果。实时荧光PCR技术，是目前生物检测领域中最准确、最灵敏的技术，其优越性使之在植物检疫中具有广阔的应用范围和前景。

烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus，TRSV)是我国重要的检疫性有害生物。本研究根据TRSV基因组中外壳蛋白基因（CP）序列保守区，分别设计两套引物和TaqMAN探针，本研究中共设计三条引物（两条上游引物和一条下游引物）和一条Taqman探针，建立了半巢式-RT-Realtime PCR检测TRSV的方法。

与现有技术比较，本发明的优点如下：(1)上述实时荧光PCR技术的优点在本发明得以全部体现，如准确、灵敏、简便、快速和能有效减少污染等；(2)设计上非常巧妙地将巢式PCR的原理运用到实时荧光PCR技术中，并与实时荧光PCR技术有机结合；(3)在实时荧光PCR技术的基础上仅增加一条引物，就形成两套独立的实时荧光PCR反应系统；(4)两套引物探针相互验证，进一步有效提高了结果的准确性；(5)两套引物探针的扩增效率一致，因此对于同一个样品的两次验证实验，结果的能保证基本一致，从而降低了结果判断的难度，在实际检测工作、科研和解决重大的国际贸易争端中具有极强的可操作性；(6)两套引物探针的扩增效率极高，检出低限均可达4fg/μl植物总RNA。

附图说明

图1为特异性测定中试剂甲的实时荧光PCR结果；纵轴为△Rn,横轴为循环数；A为TRSV，B为BPMV，C为SBMV，D为PSV，E为ToRSV，F为TSWV，G为CK1，H为CK2。

图2为特异性测定中试剂乙的实时荧光PCR结果；纵轴为△Rn,横轴为循环数；A为TRSV，B为BPMV，C为SBMV，D为PSV，E为ToRSV，F为TSWV，G为CK1，H为CK2。

图3为灵敏度测定中试剂甲的实时荧光PCR结果；纵轴为△Rn,横轴为循环数；A、B、C、D、E、F、G、H、I、J所对应的RNA浓度依次为4ng/μl、400pg/μl、40pg/μl、4pg/μl、400fg/μl、40fg/μl、4fg/μl、0.4fg/μl、0.04fg/μl、0.004fg/μl，K对应DEPC水。

图4为灵敏度测定中试剂乙的实时荧光PCR结果纵轴为△Rn,横轴为循环数；A、B、C、D、E、F、G、H、I、J所对应的RNA浓度依次为4ng/μl、400pg/μl、40pg/μl、4pg/μl、400fg/μl、40fg/μl、4fg/μl、0.4fg/μl、0.04fg/μl、0.004fg/μl，K对应DEPC水。

图5为试剂甲和试剂乙的扩增效率对比图；纵轴为△Rn,横轴为循环数；A为试剂甲，B为试剂乙。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实时荧光PCR基因扩增仪为ABI PRISM7000（美国ABI公司）；核酸蛋白分析仪为BioPhotometer(德国eppendorf公司)；植物总RNA提取试剂盒（商品名E.Z.N.ATM,美国Omega公司产品，货号：R2867-01）购自北京双羸生物公司；反转录试剂盒购自大连宝生物公司（TaKaRa）（货号：DRR037A）、实时荧光PCR试剂盒（定量PCR SuperMix-UDG，货号：C11730-025）购自美国Invitrogen公司。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实时荧光PCR的结果的判定标准为：Ct值＜40，为阳性；Ct值≥40，为阴性。

烟草环斑病毒（TRSV）：ATCC编号PV-97；

菜豆荚斑驳病毒（BPMV）：ATCC编号PV-367；

南方菜豆花叶病毒(SBMV)：ATCC编号PV-300；

花生矮化病毒（PSV）：ATCC编号PV-1059；

番茄环斑病毒（ToRSV）：ATCC编号PV-239；

番茄斑萎病毒（TSWV）：ATCC编号PVAS-484。

ATCC即美国标准菌种收藏所（American Type Culture Collection），http://www.atcc.org/。

实施例1、试剂的制备

一、引物和探针的设计

根据美国NCBI核酸数据库中TRSV基因组中外壳蛋白基因（CP）序列保守区，分别设计两套TaqMAN探针和引物，本研究中共设计三条引物（两条上游引物TRSVF1、TRSVF2和一条下游引物TRSVR）和一条Taqman探针（TRSVP）。

二、试剂的组成

1、试剂甲的组成

试剂甲由TRSVF1、TRSVR和TRSVP组成（引物和探针由上海生工合成）。

TRSVF1（上游引物）：5’-CTCCTGATGCACATGTTGGGT-3’（序列表的序列1）；

TRSVR（下游引物）：5’-GGGCCTGTTTAGACCTTGACC-3’（序列表的序列3）；

TRSVP（探针）：5’（FAM）-AGACGCAACTGTGACGCTCGCATC-3’（TAMARA）；（核苷酸序列为序列表的序列4，5’端标记报告荧光染料FAM，3’端标记淬灭荧光染料TAMRA）。

TRSVF1和TRSVR的靶序列大小为309bp（见序列表的序列5）。

2、试剂乙的组成

试剂甲由TRSVF2、TRSVR和TRSVP组成（引物和探针由上海生工合成）。

TRSVF2（上游引物）：5’-TCTCAGGTGCATCCTCCCAT-3’（序列表的序列1）；

TRSVF2和TRSVR的靶序列大小为245bp（见序列表的序列6）。

实施例2、试剂的应用

分别取感染六种病毒（TRSV、BPMV、SBMV、PSV、ToRSV和TSWV）的大豆叶片，取健康大豆叶片作为对照，应用实施例1制备的试剂甲和试剂乙分别进行特异性测定、灵敏度测定，并进行试剂甲和试剂乙的扩增效率对比。

一、试剂的特异性测定

1、总RNA提取及质量控制

用植物总RNA提取试剂盒从感染每种病毒的叶片（6种）和健康叶片（CK1）中分别提取总RNA。用核酸蛋白分析仪BioPhotometer测定其OD值，得出其浓度与纯度值，并以此控制核酸质量。

2、反转录合成cDNA

用反转录试剂盒分别将步骤1从7种叶片中提取的总RNA进行反转录，得到cDNA；DEPC水作为总RNA的对照（CK2）。

反应体系（25μL）：5μL PrimerScript^TMBuffer(5×),1.25μLPrimerScript^TM Enzyme Mix I,1.25μL Oligo dT Primer(50μM),1.25μLRandom6mers(100μM),2μL总RNA，加DEPC水至25μL。

反应条件：37℃、15min，85℃、5s。

3、试剂的特异性

用实时荧光PCR试剂盒和实施例1制备的试剂（试剂甲或试剂乙）将步骤2中的cDNA进行实时荧光PCR。

试剂甲的反应体系（25μL）：PCR buffer（2×）12.5μl，ROX0.5μl,TRSVF1（15μM）1μl，TRSVR（15μM）1μl，TRSVP(10μM)1μl，cDNA2.0μl，补充DEPC水至25μl。每个cDNA设置2个重复。

试剂乙的反应体系（25μL）：PCR buffer（2×）12.5μl，ROX0.5μl，TRSVF2（15μM）1μl，TRSVR（15μM）1μl，TRSVP(10μM)1μl，cDNA2.0μl，补充DEPC水至25μl。每个cDNA设置2个重复。

试剂甲和试剂乙的反应体系均在ABI PRISM7000的96孔板中进行；循环条件为：50℃、2min；95℃、2min；95℃、15s，60℃、30s，45个循环。

采用试剂甲的实时荧光PCR结果见图1。采用试剂乙的实时荧光PCR结果见图2。应用试剂甲只有在TRSV中出现扩增曲线（Ct值=20），判为阳性；应用试剂乙只有在TRSV中出现扩增曲线（Ct值=20）。PBMV、SBMV、PSV、ToRSV、TSWV、CK1和CK2均未出现扩增信号，判为阴性。结果表明，试剂甲（或试剂乙）的特异性很好，结果与预计相符。

二、试剂的灵敏度测定

1、总RNA提取和各个稀释液的制备

用植物总RNA提取试剂盒从感染TRSV的叶片中提取总RNA，用核酸蛋白分析仪BioPhotometer测定其OD值，得出其浓度和纯度值。浓度值为50ng/μl,纯度值为OD260/280=2.19,OD260/230=2.39。

用DEPC水将提取的总RNA进行10倍梯度稀释，得到各个稀释液。各个稀释液中，RNA浓度分别为4ng/μl、400pg/μl、40pg/μl、4pg/μl、400fg/μl、40fg/μl、4fg/μl、0.4fg/μl、0.04fg/μl、0.004fg/μl。

2、反转录合成cDNA

用反转录试剂盒分别将各个稀释液进行反转录，得到cDNA；DEPC水作为总RNA的对照。

反应体系（25μL）：5μL PrimerScriptTMBuffer(5×)，1.25μLPrimerScript^TM Enzyme Mix I，1.25μL Oligo dT Primer(50μM)，1.25μLRandom6mers(100μM)，2μL稀释液，加DEPC水至25μL。

反应条件：37℃、15min，85℃、5s。

3、试剂的灵敏度

试剂甲的反应体系（25μL）：PCR buffer（2×）12.5μl，ROX0.5μl，TRSVF1（15μM）1μl，TRSVR（15μM）1μl，TRSVP(10μM)1μl，cDNA2.0μl，补充DEPC水至25μl。每个cDNA设置2个重复。

采用试剂甲的实时荧光PCR结果见图3。采用试剂乙的实时荧光PCR结果见图4。应用试剂甲可以判为阳性的最低稀释度为4fg/μl l植物总RNA（Ct值=36）；应用试剂乙可以判为阳性的最低稀释度为4fg/μl植物总RNA（Ct值=37）。结果表明，应用试剂甲（或试剂乙）检测的灵敏度可达10^-7，即4fg/μl植物总RNA。

三、试剂甲和试剂乙的扩增效率对比

1、总RNA提取

用植物总RNA提取试剂盒从感染TRSV的叶片中提取总RNA。用核酸蛋白分析仪BioPhotometer测定其OD值，得出其浓度和纯度值。

2、反转录合成cDNA

用反转录试剂盒将总RNA进行反转录，得到cDNA；DEPC水作为总RNA的对照。

反应体系同步骤一的2。

3、试剂的灵敏度

方法同步骤一的3。

实时荧光PCR结果见图5。采用试剂甲的Ct值=20；采用试剂乙的Ct值=20。结果表明，试剂甲和试剂乙的扩增效率几乎完全一样。

Claims

1.一种辅助鉴定烟草环斑病毒的方法，其中

用于辅助鉴定烟草环斑病毒的试剂是由特异引物和特异探针组成；所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列4所示；所述特异引物由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成；所述特异探针为TaqMan探针；

所述的鉴定方法包括如下步骤：

以待测病毒的cDNA为模板，用特异引物对甲和特异探针进行实时荧光PCR，得到扩增曲线甲；以待测病毒的cDNA为模板，用特异引物对乙和所述特异探针进行实时荧光PCR，得到扩增曲线乙；根据扩增曲线甲和扩增曲线乙判断待测病毒是否为候选的烟草环斑病毒；所述特异引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对；所述特异引物对乙为序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对；所述特异探针为TaqMan探针，核苷酸序列如序列表的序列4所示。

2.权利要求1所述的试剂在制备辅助鉴定烟草环斑病毒的试剂盒中的应用。

3.一种辅助鉴定烟草环斑病毒的试剂盒，包括权利要求1所述的试剂。

4.权利要求1所述的试剂在辅助鉴定烟草环斑病毒中的应用。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述待测病毒为烟草环斑病毒、菜豆荚斑驳病毒、南方菜豆花叶病毒、花生矮化病毒、番茄环斑病毒或番茄斑萎病毒。

6.一种检测待测样本中是否含有烟草环斑病毒的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样本的总RNA，反转录为cDNA；

(2)以所述cDNA为模板，用特异引物对甲和特异探针进行实时荧光PCR，得到扩增曲线甲；以所述cDNA为模板，用特异引物对乙和所述特异探针进行实时荧光PCR，得到扩增曲线乙；根据扩增曲线甲和扩增曲线乙判断待测样本中是否含有烟草环斑病毒；所述特异引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对；所述特异引物对乙为序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对；所述特异探针为TaqMan探针。