CN103421838A - 转基因抗虫水稻的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于水稻基因工程技术领域。具体涉及一种转基因抗鳞翅目害虫水稻的培育方法。利用人工合成的新型杀虫基因cry1C作为目标基因其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。以bar基因作为选择标记基因，采用农杆菌介导的遗传转化法，将目标基因导入水稻优良恢复系明恢63中，获得高抗水稻鳞翅目害虫的新型转基因水稻材料T1C-19。此外，可通过有性杂交和体细胞杂交技术将T19-1的抗虫基因重组到新的水稻种质中去，培育成水稻抗虫新品种(系)。本发明公开了转化载体的构建、水稻遗传转化和转化植物的分子鉴定、插入位点的序列分析以及室内和田间抗虫试验等过程的验证试验。

Description

转基因抗虫水稻的培育方法

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种利用农杆菌介导的遗传转化技术将外源基因导入水稻受体品种从而获得转基因抗虫水稻的方法。 

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性菌，广泛存在于土壤、尘埃、水域、沙漠、植物、昆虫尸体中(贾士荣等，2001)。1901年，日本学者石渡从染病的家蚕体液中首次分离出Bt菌，并证明部分Bt对鳞翅目昆虫有杀虫活性。二十世纪50年代，人们发现Bt菌的杀虫活性与伴胞晶体有关(Hannay1953)，并证实这种伴胞晶体由蛋白质组成(Hannay和Fitz-James1955)。这种蛋白被称作δ内毒素(δ-endotoxins)或杀虫晶体蛋白(insecti cidal crystal protein，ICP)。杀虫晶体蛋白的分子量一般为130-140KD左右，其基因一般位于苏云金芽胞杆菌的质粒上。目前人们已从不同的Bt菌的亚种中分离出对不同昆虫(如鳞翅目、鞘翅目、双翅目、螨类等)和无脊椎动物(如寄生线虫、原生动物等)有特异毒杀作用的杀虫晶体蛋白。 

Bt杀虫晶体蛋白本身不具有生物活性，称为原毒素(protoxin)。当昆虫吞食Cry晶体原毒素后，肠道中的碱性环境和大量的蛋白酶会将晶体蛋白水解成毒性肽。活化的毒性肽的细胞结合区与肠道上皮细胞纹缘受体(BBMV)结合，而毒性区作用于细胞膜，改变肠道细胞膜离子的通透性，产生小孔，破坏渗透平衡，使细胞裂解，最终使昆虫厌食而亡。 

Bt杀虫晶体蛋白一般为碱溶性，即需要在碱性条件下才能溶解，毒蛋白才能活化。由于不同昆虫的消化道的pH环境不一样，所以它直接影响Bt杀虫蛋白的杀虫活性。以Cry1蛋白为例，其作用的鳞翅目昆虫的消化道pH值为pH10-11，在这种碱性条件下，Cry1原毒素的分子间二硫键被破坏，成为分子量为130-140kDa的原毒素(Bietlot et al.，1990；Du et al.，1994)。接着在昆虫消化道的一些蛋白酶的作用下，逐步除去C端的约60kDa和N端的3-5kDa的结构片段，从而成为62-65kDa不被蛋白酶降解的活性毒素(Rajamohan et al.，1998；Schnepf et al.，1998；Frutos et al.，1999)。故原毒素能否激活是产生毒性的首要条件。 

1981年，Schnepf和Whiteley首次将Bt库斯塔克亚种(subsp.Kurstaki)菌株HD-1中的杀虫晶体蛋白基因克隆到了大肠杆菌质粒中。随后，有学者将Bt基因转入烟草(Adang et al.，1987；Barton et al.，1987；Vaeck et al.，1987)、西红柿(Fischhoff et al.，1987)、棉花(Perlak et al.1990)等获得了相应的抗虫转Bt基因植物。 

虫害是水稻(Oryza sativa L.)生产的大敌，造成水稻减产、品质下降。其中，危害水稻最主要的害虫是鳞翅目的二化螟(Chilo suppressalis)、三化螟(Tryporyza incertulas)和稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)。二化螟和三化螟主要危害水稻茎秆，在苗期和分蘖期造成枯心；在孕穗初期侵入，造成枯孕穗；在孕穗末期和抽穗初期侵入，造成白穗(Pathak，1977)。稻纵卷叶螟[Cnaphalocrocis medinalis(walker)]则以幼虫缀丝纵卷水稻叶片成虫苞，幼虫匿居其中取食叶肉，形成白色条斑。长期以来，螟虫主要通过化学农药进行防治，不但增加了水稻生产成本，而且造成了环境污染、农药残留等问题(Pingali and Roger1995)。 

水稻是东南亚人民的主食作物，故发展转Bt水稻对于亚洲国家具有特殊意义。第一，水稻的种植面 积大，全球每年种植水稻面积超过了1.45亿公顷，而亚洲的种植面积占总种植面积的90％以上，故发展转Bt水稻利益巨大。第二，水稻的主要害虫，如二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等均为鳞翅目昆虫，在Bt蛋白的有效毒杀范围内。第三，通过大规模的筛选，目前尚未在水稻中找到有效控制虫害的抗性基因资源。因此，通过转基因培育抗虫水稻是解决上述问题的最有效途径。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种培育转基因抗虫水稻的方法，其中基因转化的受体为水稻品种明恢63，所使用的目的基因为杀虫基因cry1C(其核苷酸序列见中国发明专利ZL02139081.9文献和本说明书的序列表SEQ ID NO：1)。 

采用农杆菌介导的籼稻遗传转化法(参见专利号为ZL200410013344.2文献)，将杀虫基因cry1C导入受体水稻品种明恢63中。通过PCR分析对T₀代转基因植株进行阳性检测，Southern杂交确定不同转基因家系的拷贝数，以酶联免疫吸附法检测杀虫晶体蛋白的含量，室内离体茎杆接虫结合田间自然发虫鉴定确定不同转基因家系的抗虫性。同时在田间调查转基因植株的株高、分蘖数、产量等农艺性状，最终获得外源基因单拷贝插入，高抗水稻鳞翅目害虫且农艺性状与原品种没有显著差异的转基因水稻新材料。通过反向PCR确定外源基因插到受体品种明恢63中的侧翼序列。该转基因抗虫材料可通过有性杂交和体细胞杂交技术重组到新的水稻种质中去，进而培育获得抗虫水稻衍生新品种(系)。 

本发明还公开了转化载体的构建，水稻遗传转化和转化植物的分子鉴定，插入位点的序列分析，室内和田间抗虫试验以及农艺性状调查等过程。 

本发明的具体步骤是： 

一种培育提高水稻对螟虫抗性的转基因植物的方法，利用序列表SEQ ID NO：1所示的抗虫基因cry1C，构建获得如图2所示的植物表达载体pBar13-Cry1C，通过农杆菌介导的籼稻遗传转化方法，将所述的表达载体pBar13-Cry1C导入到水稻受体中，使其在转基因水稻中表达cry1C基因，通过在室内和田间检测转基因水稻对水稻螟虫的抗性，最终获得高抗螟虫的转基因水稻植株； 

其中：图2所示的植物表达载体pBar13-Cry1C含有序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。 

其中的植物表达载体pBar13-Cry1C含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和图2所示结构，该载体通过如下步骤构建而成： 

先用Xho I酶切图1所示pCAMBIA1300质粒载体，然后用T4DNA聚合酶抹成平末端，连入bar基因形成中间载体pBar13，用HindIII+BamH I双酶切pBar13后，连入玉米Ubiquitin启动子，再用BamHI+Sac I双酶切保存有cry1C基因的pUC18质粒后，连入SEQ IDNO：1所示的cry1C基因后，形成图2所示的新型植物表达载体pBar13-Cry1C。 

本发明利用上述方法获得的一个复合转基因结构，该转基因水稻植株T1c-19基因组的特定位点上携带了一种能稳定遗传的复合转基因结构，该特定位点位于水稻基因组第11染色体，所述的复合转基因结构由以下所示的序列沿5’到3’方向顺序连接而成： 

(i)SEQ ID NO：3所示的插入位点5’端侧翼序列； 

(ii)SEQ ID NO：4所示的插入的外源基因序列；和 

(iii)SEQ IDNO：5所示的插入位点3’端侧翼序列。 

所述衍生水稻材料基因组第12染色体特定位点携带有由(i)SEQ ID NO：3所示的序列，(ii)SEQ ID NO：4所示的插入的外源基因序列，和(iii)SEQ ID NO：5所示的序列连接而成的复合转基因结构。 

本发明得到一种侧翼序列，其在转基因水稻T1C-19的外源基因中插入位置的5’端，该片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。 

本发明得到另一种侧翼序列，其在转基因水稻T1C-19的外源基因中插入位置的3’端，所述的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。 

本发明提供了一种转基因抗虫水稻T1C-19的侧翼序列分析的反向PCR检测方法，反向PCR反应中进行第一轮扩增的两条引物序列分别为 

P1：5’-TTTCGCTCATGTGTTGAGCATA-3’； 

P2：5’TGGAATTGTGAGCGGATAACA3’。 

本发明提供了一种转基因抗虫水稻T1C-19的侧翼序列分析的反向PCR检测方法，反向PCR反应中进行第一轮扩增的两条引物序列分别为 

P3：5’-CCAGTACTAAAATCCAGATCCCC-3’； 

P4：5’TCACACAGGAAACAGCTATGACC3’。 

具体地，本发明是这样实现的： 

先以pCAMBIA1300质粒为基础载体，构建具有选择标记bar基因的载体pBar13，再将人工合成的cry1C基因插入其多克隆位点，形成相应的植物表达载体pBar13-Cry1C。将水稻品种明恢63的成熟种子消毒后诱导胚性愈伤组织。将含有表达载体pBar13Cry1C的农杆菌菌株与胚性愈伤组织进行共培养后，在含有除草剂Basta的筛选培养基上进行抗性愈伤组织的筛选，将筛选出来的抗性愈伤组织在分化培养基上进行分化，当分化的小植株长到2cm左右时，切掉原生根，放到生根培养基上进行生根，当新根生长到2cm左右时，炼苗后移栽到温室。这些再生小苗即为T₀代转基因苗。 

在T₀代苗生长期间，通过PCR检测的方法去掉假阳性转基因植株，并对阳性的T₀植株进行收种。在T₁代，转基因植株分家系进行种植，通过田间观察，挑选抗虫性好且农艺性状无明显变异的转基因家系，并进行Southern杂交分析，确定其外源基因插入的拷贝数。随后，将挑选出来的单拷贝家系分单株进行收种。收获的种子在含有Basta的培养基上进行发芽试验，筛选出纯合的转基因单株。通过进一步的室内和田间抗虫试验、Cry1C蛋白的含量测定、农艺性状调查等检测，获得具有商业化潜力的转基因水稻家系。最后对挑选出来的具有商业化潜力的转基因水稻家系进行T-DNA插入位点侧翼序列的分析。 

本发明的优点在于： 

(1)本发明将抗虫基因cry1C导入受体品种的基因组中，外源基因能在后代中稳定遗传并保持相应的抗虫特性，不用或少用农药，保护环境。 

(2)本发明中的抗虫转基因材料可以通过杂交、回交的方式，将外源基因及抗虫特性传递给其它水稻品种，培育转基因抗虫新品种或新品系。 

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是cry1C基因的全长DNA序列。 

序列表SEQ ID NO：2是表达载体pBar13+Cry1C的全长DNA序列。 

序列表SEQ ID NO：3是转基因植株T1C-19插入位点相邻的5’基因组DNA序列。 

序列表SEQ ID NO：4是T1C-19的插入到水稻基因组中的外源基因DNA序列。 

序列表SEQ ID NO：5是转基因植株T1C-19插入位点相邻的3’基因组DNA序列。 

序列表SEQ ID NO：6扩增cry1C基因的左引物。 

序列表SEQ ID NO：7扩增cry1C基因的右引物。 

序列表SEQ ID NO：8扩增bar基因的左引物。 

序列表SEQ ID NO：9扩增bar基因的右引物。 

序列表SEQ ID NO：10反式PCR进行侧翼序列分析的第一轮扩增的左引物。 

序列表SEQ ID NO：11反式PCR进行侧翼序列分析的第一轮扩增的右引物。 

序列表SEQ ID NO：12反式PCR进行侧翼序列分析的第二轮扩增的左引物。 

序列表SEQ ID NO：13反式PCR进行侧翼序列分析的第二轮扩增的右引物。 

序列表SEQ ID NO：145’端侧翼序列特征性PCR检测的左引物。 

序列表SEQ ID NO：153’端侧翼序列特征性PCR检测的右引物。 

序列表SEQ ID NO：165’端侧翼序列特征性PCR检测的左引物。 

序列表SEQ ID NO：173’端侧翼序列特征性PCR检测的右引物。 

图1：pCAMBIA1300质粒图，本专利申请中是利用其骨架构建的转化载体。 

图2：转化载体pBar13-1C的T-DNA区示意图。该载体是在pCAMBIA1300(图1)衍生而来，即将外源基因cry1C插入到克隆位点并以bar基因替代了hpt基因作为选择标记基因。 

图3：pBar-Cry1C载体的转化过程。图中(a)：胚性愈伤诱导；(b)：胚性愈伤继代；(c)：抗性愈伤筛选(图中黄白色的愈伤即为抗性愈伤，黑褐色为非转化愈伤)；(d)：抗性愈伤再生小苗；(e)：再生植株生根；(f)：再生植株在温室内炼苗。 

图4：转cry1C基因植株的PCR扩增结果。泳道表示：M：2kb DNA ladder，control：非转基因对照。P：质粒。 

图5：转基因T₀植株的Southern杂交结果。泳道表示：M：DNA Marker，NT：非转基因对照 

图6：PCR扩增检测转基因T1C-19株系T₁代分离比。泳道表示：M：DNA marker，所扩增的37个样品中，有28个为阳性(有扩增产物)，9个为阴性(没扩增产物)，其阳性/阴性＝28∶9＝3∶1，符合孟德尔单基因遗传方式。 

图7：转基因T₁植株的种子进行发芽试验，挑选纯合单株。(a)对照明恢63：种子只萌动，不能发芽；(b)纯合子：几乎所有的种子均能发芽成苗；(c)杂合子：约3/4的种子能发芽成苗，1/4的种子能萌动，不能发芽；(d)阴性：和对照一样，所有的种子只萌动，不能发芽成苗。 

图8：转cry1C基因植株的Bt蛋白含量测定。■：转基因株系，分蘖期；

转基因株系，拔节期；□：F₁杂种。 

图9：在室内人工接虫条件下，转基因植株对一龄三化螟的抗性表现。A：对照明恢63，茎杆内表面可见大量的虫粪及活力强、虫体大的三化螟幼虫；B：转基因植株T1C-19，茎杆基本保持原样，未见任何螟虫危害状，表面可见死虫。 

图10：在自然条件下，转基因植株对稻纵卷叶螟的反应。图中，A：非转基因明恢63对照，肉眼见植株叶片大量被损害。B：转基因植株T1C-19不见一片叶被危害，表现高度的抗性。 

具体实施方式

实施例1：表达载体的构建 

先用Xho I限制性内切酶消化pCAMBIA1300质粒(the Center for the Application of Molecular Biology in International Agriculture，Australia惠赠)，回收大片段，并用核酸酶切成平末端。与 此同时，用SmaI酶消化pTW-a质粒，回收小片段(bar基因)。将所回收的大片段和小片段进行连接后，转化大肠杆菌，挑选含bar基因的阳性克隆子，将获得的载体命名为中间载体pBar13。 

然后用HindIII/BamHI双酶切将Ubi启动子从pUBC质粒上切下来(Ubi启动子的作用方向为SacI位点→BamHI位点)，插入pBar13载体的多克隆位点上，形成pBar-Ubi中间载体。与此同时，用BamHI/Sac I将cry1C完整地切下来(基因表达方向为BamHI位点→SacI位点)，插入到中间载体pBar-Ubi的Bam HI位点上，形成cry1C基因植物表达载体pBar13-Cry1C(其序列见SEQ ID NO：1所示，图2)，随后，导入到农杆菌菌株EHA105中制成转化工程菌，在-70℃冰箱冷冻保存待用。 

实施例2：农杆菌介导的遗传转化 

农杆菌介导的遗传转化方法参照华中农业大学作物遗传改良围家重点实验室发表的“农杆菌介导的遗传转化操作手册”所示的方法及林拥军教授发表的文章(Lin和Zhang2005)。转化受体为水稻品种“明恢63”(福建省农业科学院惠赠)的成熟种子所诱导产生的胚性愈伤组织。 

成熟种子在黑暗中诱导7天后，胚和胚乳之间长出淡黄色的胚性愈伤，培养40天后，分离胚性愈伤在继代培养基增殖。然后，将含有转化载体pBar13-Cry1C的工程菌浸染胚性愈伤，在28℃下共培养3天后在选择培养基(25mg/L Basta)上培养，大约25天后，可以看到抗性愈伤从褐化愈伤的表面长出。抗性愈伤在黑暗条件下预分化7天后转入分化培养基，出现绿色小芽。分化的幼苗在生根培养基上培养5天左右，就长出白色小根，15天后形成大量的根系。切除原生根后，再放到生根培养基上重新生根，形成大量根系的小苗具有独立生长能力，移栽到温室能成活并正常生长(图3)。 

转化实验中，有5400块愈伤组织与pBar13-Cry1C载体进行了共培养，最终成苗120株，转化效率为2.8％，分化效率为80.7％(表1)。 

表1  农杆菌介导的遗传转化结果 

本发明的遗传转化的主要步骤、培养基及其配制的方法如下所述： 

(1)试剂和溶液缩写 

本发明中培养基配制过程中所涉及到得的主要试剂的名称及缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N₆max(N₆大量元素成分溶液)；N₆mix(N₆微量元素成分溶液)；MSmax(MS大量元素成分溶液)；MSmix(MS微量元素成分溶液) 

(2)主要溶液配方 

1)铁盐(Fe_2-EDTA)贮存液(按照100X浓缩液配制)： 

将3.73克乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·2H₂O）和2.78克FeSO4·7H₂O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000ml，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。 

2)维生素贮存液(按照100X浓缩液配制)： 

加蒸馏水定容至1000ml，4℃保存备用。 

3)MS培养基大量元素母液(按照10X浓缩液配制)： 

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000ml。 

4)MS培养基微量元素母液(按照100X浓缩液配制)： 

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000ml。 

5)2，4-D贮存液(1mg/ml)的配制： 

称取2，4-D100mg，用1ml1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，于室温下保存。 

6)6-BA贮存液(1mg/ml)的配制： 

称取6-BA100mg，用1ml1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。 

7)萘乙酸(NAA)贮存液(1mg/ml)的配制： 

称取NAA100mg，用1ml1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。 

8)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1mg/ml)的配制： 

称取IAA100mg，用1ml1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。 

9)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)的配制： 

称取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。 

10)AS贮存液的配制： 

称取AS0.392g，加入DMSO10ml溶解，分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。 

11)1N氢氧化钾贮存液配制： 

称取氢氧化钾5.6g，用蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。 

(3)农杆菌介导的遗传转化步骤 

1)胚性愈伤诱导 

a.将成熟的明恢水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒15分钟； 

b.用灭菌水洗种子4-5次； 

c.将种子放在诱导培养基上； 

d.将接种后的培养基置于黑暗处培养6周，温度25±1℃。 

2)愈伤继代 

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养4周，温度25±1℃。 

3)预培养 

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养3周，温度25±1℃。 

4)农杆菌培养 

a.在带有对应抗性选择的LA培养基(LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002，北京)上预培养农杆菌EHA105(澳大利亚CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株)两天，温度28℃； 

b.将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。 

5)农杆菌侵染 

a.将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内； 

b.调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀0.8-1.0； 

c.将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟； 

d.转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放在共培养基上培养3天，温度19-20℃。 

6)愈伤洗涤和选择培养 

a.灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌； 

b.浸泡在含400毫克/L羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟； 

c.转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干； 

d.转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。 

7)分化 

a.将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天； 

b.转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照(1500-2000Lx)下培养，培养温度26℃。 

8)生根 

剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照(1500-2000Lx)下培养2-3周，培养温度26℃。 

9)移栽 

清洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。 

实施例3：PCR检测转基因阳性植株 

采用小量基因组DNA抽提法提取T₀代转基因叶片DNA进行PCR分析，扩增cry1C*基因的引物分别为F：5’-ttctactggggaggacatcg-3′(SEQ ID NO：6)，R：5’-cggtatctttgggtgattgg-3’(SEQ ID NO：7)，扩增的产物为602bp。 

PCR反应体系：反应总体系为20μl，DNA模板30-50ng，10×buffer2.0μl，2mM dNTP1.5μl，25mM MgCl₂2.0μl，10μM引物(F/R)各0.4μl，Taq酶1U，加灭菌ddH₂O至20μl。 

PCR反应程序：94℃，变性3min；94℃，变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃延伸10min。 

PCR产物检测：扩增产物在0.8％的琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外分析仪观察并照相。 

小量叶片基因组DNA的提取方法：取适量幼嫩叶片，加800μl1.5×CTAB研磨，转入1.5ml离心管中；65℃水浴30min；加入600μl氯仿/异戊醇(体积比24∶1)上下颠倒数次(约15min)，下层液相呈深绿色为止；室温下12000r/min离心10min；取500μl上清于一新1.5ml离心管，加入预冷的95％乙醇1ml，混匀后置-20℃，30min；室温下12000r/min离心10min，去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，自然干燥；加入100μl ddH₂O溶解，备用。 

由抗性愈伤分化出的小苗并非全部为阳性转化子。为此，提取转基因T₀植株的DNA进行了PCR分析。一共检测了108株，其中阳性株103株，阳性率95.4％(图4)。这说明由抗性愈伤经预分化(预分化培养基加10mg/L的Basta)后所生长的小苗绝大多数为阳性。 

实施例4：T₀转基因植株的Southern杂交检测 

酶切、电泳和转膜：CTAB法提取叶片总的DNA，测定浓度后用双蒸水调成400ng/μl待用。杂交时，每个样品取4μg即10μl原液用Dra I酶进行酶切，同时以未转基因植物叶片DNA作对照。酶切完全后在1％的TAE胶上电泳18小时，印迹到尼龙膜，然后以相应的质粒制作的探针进行杂交。其详细过程见Liu et al.(1997)报道的方法。 

探针的制备：提取含cry1C*基因的质粒用BamHI/SacI酶切，回收目标基因片段，采用随机引物法标记为探针。 

杂交：将尼龙膜放入杂交袋中，加入20ml的杂交液，排除气泡后封口，置于65℃的摇床中振荡，预杂交16h。具体的步骤为： 

1.在一个离心管中加入12μl ddH₂O、1μl探针DNA(约100ng)、1μlλDNA(约6ng)和2μl随机引物； 

2.将上述体系在95℃中干浴变性5min后，立即置于冰上冷却5min；3.8000r/min离心1min，加入2.5μl buffer、2.5μl dNTP、和1μl Klenow Fragment酶； 

4.在同位素操作台上加入3μlα-32P-dCTP，37℃中水浴30min； 

5.向上述反应体系中补加500μl杂交液，打开管盖，100℃干浴变性10min； 

6.将变性的探针加到杂交袋中，封口后置于65℃的摇床中杂交。杂交16h后取出尼龙膜，先用1×SSC和0.1％SDS冷洗10min，再用1×SSC和0.1％SDS在65℃中热洗，直至膜信号强度降到 500-1000cpm。将尼龙膜用保鲜膜包好，放入磷屏中显影。 

将PCR阳性的T₀植株在分蘖期提取DNA进行Southern blot分析表明：目标基因已经整合到受体材料的基因组中。但不同转基因植株，插入的转基因拷贝数不一样，有单拷贝插入，也有2-3拷贝插入，有的拷贝数超过5个。其中，转基因T₀植株有9个为单拷贝插入(图5)。在随后的遗传分析、室内和田间抗虫试验时，均挑取单拷贝的株系进行研究。 

实施例5：转基因植株的后代遗传分析 

将Southern杂交检测为单拷贝的T₀单株套袋自交收种后种成T₁代株系，每株系种植约90株左右，全生育期不喷施任何杀螟药，让其自然发虫。分蘖开始后，观测植株的卷叶数和枯心数，统计株系内抗虫单株数与感虫单株数。与此同时，采用小样法提取叶片DNA进行PCR扩增，统计PCR阳性和阴性植株，用χ²检测cry1C*基因在后代中的分离规律。 

T₀代转基因植株是杂合子，其相应的T₁代发生分离，因此T₁代是观察转基因后代分离规律的最佳时期。所选9个单拷贝转基因株系经χ²测验发现(图6)，株系1，3，4，5，7，11，16，17，19等7个株系分离比符合3∶1规律(χ² _0.05，1＝3.84)，而且，这几个株系的田间调查结果也表明，PCR阳性单株也表现抗虫性，PCR阴性的植株在田间表现感虫，这说明人工合成的cry1C*能在转基因植株中正常表达，且以显性的方式进行遗传。株系8和14不符合孟德尔分离规律，这种非孟德尔式遗传现象，无论是农杆菌还是基因枪的转化中均有发现。 

表2  T₁代单拷贝转基因株系的遗传分析 

χ² _0.05，1＝3.84，除株系T1C-8和T1C-14外，其余均符合3∶1分离规律。 

实施例6：转基因纯合阳性和阴性株系的筛选 

T₁代自交的种子成熟收获后，每个株系试验20单株，每个单株取50粒种子，去壳后消毒，放在含10mg/L Basta的生根培养基(1/2MS+2％蔗糖+0.3％Phytal gel，pH5.8)上进行发芽试验，7天后检查发芽情况。同时，以未转基因的种子进行同样的处理作对照。理论上，若消毒的种子在不加Basta的条件下具有100％的发芽活力，则在含Basta的1/2MS培养基上，阳性纯合转基因单株的发芽率为100％，杂合转基因单株的发芽率为75％左右，阴性纯合单株的发芽率为0％。因此，如果所接种的50粒种子全部 发芽，则为转基因纯合植株，如果部分发芽，则为杂合植株，如果全部不发芽，则为阴性植株。经χ²测验表明绝大多数单拷贝植株的种子发芽符合孟德尔3∶1分离规律(图7)。 

实施例7：纯合转基因株系的蛋白含量测定 

转基因植株Bt蛋白含量的测定使用美国EnviroLogix公司生产的酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbant Assays，ELISA)试剂盒EnvironLogix kits AP007。样品的制备、酶联免疫反应及O.D.值的测定，均严格按照该试剂盒的使用说明书进行。 

检测的方法如下：先从田间采集新鲜的水稻叶片，放入标记好的1.5ml Eppendorf管，并将其置于冰盒上。材料带回实验室后，称取20mg左右的叶片放入另一干净的Eppendorf管，并加500μl抽提液在研钵中磨成匀浆，之后，将匀浆转移到1.5ml的Eppendorf离心管中静置30min。测量前，将蛋白稀释15倍。测量时，稀释的样品各取100μl加入酶标板孔中，再依次加底物液、显色液及终止液，混匀后放到酶标仪(Multiskan MK3，芬兰，按仪器的说明书操作)下测定各样品O.D.值(测定波长设为450nm)，然后根据标样画出标准曲线。样品的含量则从标准曲线中读出，最后计算每个样品的Bt蛋白含量。 

分别在水稻的分蘖初期及拨节期测定转基因纯合株系叶片的Bt蛋白含量。结果表明：不同转基因株系的Bt蛋白表达量不同，转基因株系中，T1C-19的蛋白表达量最高，为1.42ng/mg鲜叶重(图8)。 

实施例8：转基因植株的室内接虫鉴定 

在拨节期割取转基因水稻的茎杆，并将其切成约5cm长的茎段，放入圆形玻璃养虫瓶(瓶高10cm，直径4cm)。每瓶放入5个茎杆段，用软毛笔将一龄三化螟轻轻地刷到茎段上，每瓶接三化螟约20头，每个材料接3瓶。与此同时，另取试验材料用同样的方法处理后接一龄二化螟12头，每个材料也是3瓶。每个材料重复3次，以未转基因的原品种明恢63茎杆作对照。接虫完毕后，将养虫瓶放入人工气候箱(HP400-GS，武汉)。人工气候箱内设定温度28℃，相对湿度90％，光照3000Lx，每天10小时的光照。5日后，剥开茎杆记录死虫数、活虫数，观察幼虫取食情况，生长状况。 

试验结果表明：所筛选的转基因株系中，T1C-3、T1C-4、T1C-5、T1C-7、T1C-11、T1C-17和T1C-19表现对二化螟和三化螟高度抗性，人工接一龄二化螟和三化螟5天后，幼虫的死亡率均为100％，其茎杆没有受到危害，茎杆内外表面见不到虫粪。而非转基因对照明恢63茎杆的外表即可看到大量的虫粪，剥开茎杆，里面也有大量的虫粪，存活幼虫活动性极强，虫体比接虫时明显增大，且已经发育至2龄(图9)。此外，株系T1C-1和T1C-16的抗虫性也较好，三化螟幼虫死亡率为100％，二化螟幼虫死亡率为分别为94.3％和91.5％；株系T1C-8和T1C-14的抗虫性稍差(表3)。 

表3  不同转基因Bt株系的抗虫活性 

实施例9：转基因植株田间抗虫试验及农艺性状考察 

危害水稻的鳞翅目害虫主要为二化螟、三化螟和稻纵卷叶螟。其中，二化螟和三化螟在分蘖期造成枯心，在抽穗以后造成白穗。稻纵卷叶螟则危害叶片，形成白色条斑或卷叶。在分蘖期和抽穗期分别对这些螟害进行了调查，调查指标主要有：稻纵卷叶螟为害率、单株受害叶片数、枯心率和白穗率等(表4)。稻谷成熟后，按单株收获，进行室内考种，考查的农艺性状有株高、穗长、有效穗数、每穗实粒数、结实率、千粒重和单株产量(表5)。 

表4  田间螟害的考查指标及方法 

表5  农艺性状的考查指标及方法 

*：株高在材料成熟后直接在田间测量，其余在室内考种。 

通过田间观察并结合室内抗虫试验，初步获得一批抗性较好的转基因株系11个，分别为T1C-1、T1C-3、T1C-4、T1C-5、T1C-7、T1C-8、T1C-11、T1C-14、T1C-16、T1C-17和T1C-19。2004年，转基因植株已经进入T6代，为了进一步评价这些转基因株系的抗性及农艺性状，对这些株系进行了小区试验。 

田间调查结果表明：对照明恢63所有的分蘖均受害、平均每个分蘖有3.8片叶受害，其枯心率和白穗率分别为17.3％和11.6％，而株系T1C-1、T1C-5、T1C-8、T1C-14、T1C16只有极少量的叶片及分蘖受害；而株系T1C-3、T1C-4、T1C-7、T1C-11、T1C-17和T1C-19没有叶片和分蘖受害。纯合转基因株系T1C-19主要农艺性状与其亲本没有统计意义上的差别(表6)。 

表6  纯合转基因株系T1C-19主要农艺性状的考察 

a：此结果为打药处理的结果。 

转基因纯合株系T1C-19在不同处理下的抗虫性试验表明，无论自然发虫、还是人工接虫，株系T1C-19都表现对螟虫的高度抗性(表7)。 

表7  转基因纯合株系T1C-19在不同处理下的抗虫性(2005，武汉) 

-：接虫后，由于抽穗前所有的原有分蘖均被危害，没有一株能长到抽穗，所以相应的白穗没法调查。 

注：抗虫性的比较采用Duncan法进行多重比较。表中的数据表示为平均数±标准差。*：P＜0.05，到**：P＜0.01 

实施例10：侧翼序列的分析 

转基因插入位点的侧翼序列采用反向PCR技术。反向PCR的原理是将DNA用限制性内切酶消化，然后用连接酶将其自连成环，最后以自连产物为模板，用根据已知序列设计的反向引物进行扩增，得到侧翼的未知序列。 

根据Southern杂交结果选择合适的限制性内切酶。取10μg总DNA，在50μl的反应体系中用30-40U的限制性内切酶消化16h，检测酶切安全后进行纯化。纯化具体步骤： 

1.向酶切反应体系中补加150μl ddH₂O，再加入200μl氯仿/异戊醇(体积比为24∶1)，振荡5min； 

2.12000r/min离心5min，吸取180μl上清液转移至新的离心管中； 

3.加入20μl的3M NaAc和400μl的冰冻无水乙醇，混匀后在-20℃中放置30min； 

4.12000r/min冷冻离心20min，倒掉上清液； 

5.加入500μl75％乙醇洗涤，然后12000r/min离心5min，倒掉上清液； 

6.自然晾干后加入50μl ddH₂O溶解。 

将所有的纯化产物用10U的T4DNA Ligase(购自Promega公司)自连，若电泳检测发现纯化产物浓度较高，可以取部分用于自连。反应体系为100μl，在16℃中连接16h。然后以自连产物为模板，进行反向PCR第一轮扩增，引物为P1和P2；第二轮扩增以第一轮的产物为模板，引物为P3和P4。引物在T-DNA区的位置和序列见表6。 

表8  反向PCR的引物 

第一轮PCR反应体系总体积为40μl，其中包括4μl的10×buffer，3μl的25mM MgCl₂，3μl的2mM dNTP，0.5μl的10uM左右引物，2个单位TaqDNA聚合酶和2μl模板。PCR反应程序为94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，32个循环后72℃延伸5min。第二轮PCR反应体系与第一轮相同，反应程序为94℃预变性5min，94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸5min。 

扩增产物在0.8％的琼脂糖凝胶中用0.5×TBE电泳检测，切下目标片段，回收后克隆到pGEM-T vector(购自Promega公司)上进行测序。测序的结果在华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室的生物信息学网站http://redb.ncpgr.cn/modules/redbtools/blast.php上比对，确定转基因的整合位置，然后在网站http://rice.plantbiology.msu.edu/analyses_search_blast.shtml上查询该区段的基因注释信息。 

以株系T1C-19的总DNA酶切后的自连产物为模板，进行的第一轮反向PCR得到了两个片段，其中较小的片段约为0.9kb，较大的片段超过1kb，与根据Southern杂交结果所预测的大小相符合。第二轮的反向PCR扩增使大片段的浓度得到富集，测序结果表明该片段为1124bp，其中的467bp来源于T-DNA区。目标片段剩余的567bp通过序列比对定位在水稻基因组的第11号染色体上，处于一段非编码区中。 

对T1C-19的侧翼序列比对分析证明T1c-19的外源基因整合于水稻明恢的11染色体上，并造成17bp的碱基缺失。 

实施例11：T1C-19外源基因插入位点特征性PCR检测 

根据T1C-19外源基因插入位点两端的侧翼序列以及外源基因插入序列，分别设计其外源基因插入位点特征性PCR检测的引物，其中5’端侧翼序列特征性PCR检测的引物为：Rice-F：TCTTGCTCTTGTGTATGTGAACCC(SEQ ID NO：14)和pUbi R：AGAGTTTTAGTTTTCTTAATTTAGAGGCT(SEQ ID NO：15)；3’端侧翼序列特征性PCR检测的引物为：polyA-Tai1-3F：TCTAATTCCTAAAACCAAAATCCAG(SEQ ID NO：16)和T1c-R：AAATGGGGGATGATGATTGTATG(SEQ ID NO：17)。PCR反应体系为：DNA模板50ng，10×PCRbuffer2.0μl，2mM dNTP1.5μl，25mM MgCl₂2.0μl，10μM引物(F/R)各0.4μl，加灭菌ddH₂O至20μl。PCR扩增反应程序为：94℃5min；94℃1min，58℃1min，72℃1.5min，35cycles；72℃5min。扩增产物在0.8％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。 

参考文献 

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16)Vaeck M，Reynaerts A，

Transgenic plants protected from insect attack.Nature，1987，328：3337。 

Claims (8)

1.一种培育转基因高抗螟虫水稻的方法，其特征在于，利用序列表SEQ ID NO：1所示的人工合成的抗虫基因cry1C，构建植物表达载体pBar13-Cry1C，其核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示，通过农杆菌介导的遗传转化方法，将所述的植物表达载体pBar13-Cry1C导入到水稻受体细胞中，使其在转基因水稻细胞中表达cry1C基因，通过在室内和田间检测转基因水稻对水稻螟虫的抗性，最终获得高抗螟虫的转基因水稻纯合植株T1C-19。

2.一种植物表达载体pBar13-cry1C，其特征在于，该载体含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

3.一个水稻复合转基因结构，其特征在于：在权利要求1所述的转基因水稻T1C-19的水稻基因组第11染色体上，所述的复合转基因结构由以下所示的序列沿5’到3’方向顺序连接而成：

(i)SEQ ID NO：3所示的插入位点5’端侧翼序列；

(ii)SEQ ID NO：4所示的插入的外源基因序列；和

(iii)SEQ ID NO：5所示的插入位点3’端侧翼序列。

4.应用权利要求3所述的水稻复合转基因结构的方法，其特征在于培育一种衍生抗虫水稻材料，所述衍生水稻材料基因组第11染色体特定位点携带有权利要求1所述的由(i)SEQ ID NO：3所示的序列，(ii)SEQ ID NO：4所示的插入的外源基因序列，和(iii)SEQID NO.5所示的序列连接而成的复合转基因结构。

5.一种侧翼序列，其特征在于：所述侧翼序列是在转基因水稻T1C-19的外源基因中插入一个片段，所述的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

6.一种侧翼序列，其特征在于：所述侧翼序列是在转基因水稻T1C-19的外源基因中插入一个片段，所述的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

7.一种转基因抗虫水稻5’端侧翼序列的定性PCR检测方法，其特征在于：PCR反应中的引物对的DNA序列如下所示：

Rice-F：TCTTGCTCTTGTGTATGTGAACCC，

pUbi-R：AGAGTTTTAGTTTTCTTAATTTAGAGGCT。

8.一种转基因抗虫水稻3’端侧翼序列的定性PCR检测方法，其特征在于：PCR反应中的引物对的DNA序列如下所示：

polyA-Tail-3F：TCTAATTCCTAAAACCAAAATCCAG，

T1c-R：AAATGGGGGATGATGATTGTATG。

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