TWI600766B - 用於偵測一目標核苷酸序列中之一特定區域的一突變及／或多形性的套組 - Google Patents

用於偵測一目標核苷酸序列中之一特定區域的一突變及／或多形性的套組 Download PDF

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Description

用於偵測一目標核苷酸序列中之一特定區域的一突變 及/或多形性的套組
本發明係關於一種用於偵測一目標核苷酸序列中之一特定區域的一突變及/或多形性的套組，且特別關於一種套組，其用於偵測CYP2C9*2基因之rs1799853、CYP2C9*3基因之rs1057910、CYP4F2基因之rs2108622、VKORC1-1639基因之rs9923231或VKORC1 1173基因之rs9934438的單核苷酸多形性，其中此套組適用於一聚合酶鏈鎖反應，特別是一恆溫環形增幅法(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)。
目前已知CYP2C9(細胞色素(cytochrome)P450，家族(family)2，次家族(subfamily)C，多胜肽9)基因(CYP2C9*2(rs1799853)、CYP2C9*3(rs1057910)、CYP4F2(細胞色素(cytochrome)P450，家族4，次家族F，多胜肽2)基因(rs2108622)與VKORC1(維他命K環氧化物還原酵素複合物(vitamin K epoxide reductase complex)，次單元1)基因(VKORC1-1639(rs9923231)、VKORC1 1173(rs9934438))顯著地影響對於藥物華法令(warfarin)的維持劑量(maintenance dose)(Clinical Chemistry 55：4,804-812(2009)；Blood.2008 Apr 15；111(8)：4106-12.Epub 2008 Feb 4.；Ann Clin Lab Sci.2011 Summer；41(3)：229-35)。在開此藥方之前，可就病患之基因型來預先篩選病患適合之維持劑量，藉由較快的個人化測定，而將血栓性栓塞事件 (thromboembolic episode)最小化。然而，若進行基因型鑑定以測定裝載劑量(loading dose)，可能會延遲治療幾小時至一天，因此需要更簡單與迅速之基因型鑑定方法。
恆溫環形增幅法(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)為聚合酶鏈鎖反應的一種特殊型式，為日本榮研公司(Eiken Genome Site)在2000年所研發出之新技術。此方法在60-65℃的恆溫環境下，使用四條引子，於1小時內即可完成DNA或RNA的增幅反應。而由於恆溫環形增幅法具有所需的反應時間短、僅需簡單之加熱設備而不需專門儀器等優點，且靈敏度與專一性又相較於傳統之聚合酶鏈鎖反應高出許多，又可以直接以肉眼辨識反應結果，因此非常適合應用於各種核酸檢測，例如基因型鑑定。
第1A與1B圖圖解說明了恆溫環形增幅法的基本原理，而此方法的詳細原理與操作說明，可參見美國專利號US 7,175,985 B1與由日本榮研公司網站所提供之動畫說明(http：/loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/anim.html)。
由第1圖可知，恆溫環形增幅法在一目標基因100中選出了六個區域，分別為F1、F2、F3、B1c、B2c與B3c，而第1A與1B圖中顯示於另一股中之F1c、F2c、F3c、B1、B2與B3區域則分別與上述F1、F2、F3、B1c、B2c與B3c區域互補。於此方法中，所選出之F1與B1c區域的至少一個必須包含所欲偵測之突變點或單核苷酸多形性位點(SNP位點)，而所採用之酵素為BstDNA聚合酶，其可於恆溫進 行增幅反應，並且在增幅時可把目標或模板DNA的雙股結構打開。又於此方法中，採用四條引子，分別為經特殊設計之順向內引子(forward inner primer,FIP)101、順向外引子(forward outer primer)103、逆向內引子(backward inner primer,BIP)105與逆向外引子(backward outer primer)107，其中順向內引子101之序列為由一第一片段(所預期之F1區域之序列的互補股，即所預期之F1c區域的序列)(例如，若預期目標基因之F1區域為野生型之序列，則此第一片段之序列為野生型F1區域的互補股，相對地，若預期目標基因之F1區域為突變型之序列，則此第一片段之序列為突變型F1區域的互補股)與一第二片段(F2區域之序列)所組成，順向外引子103之序列為F3區域之序列，而逆向內引子105之序列為由為由一第三片段(所預期之B1c區域之序列，即所預期之B1區域之序列的互補股)(例如，若預期目標基因之B1c區域為野生型之序列，則此第三片段之序列為野生型B1c區域之序列，相對地，若預期目標基因之B1c區域為突變型之序列，則此第三片段之序列為突變型B1c區域之序列)與一第四片段(B2c區域之序列的互補股，即B2區域之序列)所組成，逆向外引子107之序列為B3c區域之序列的互補股(即B3區域之序列)。
在恆溫環形增幅法進行中，順向內引子101之第二片段(F2區域之序列)會黏附於上述目標基因之另一股的F2c區域而進行互補股合成反應，而合成出具有第一片段(所 預期之F1區域之序列的互補股，即所預期之F1c區域的序列)、第二片段(F2區域之序列)、F1、B1c、B2c與B3c區域之序列的一第一股，又順向外引子103會將此股移開，另合成出具有F3、F2、F1、B1c、B2c與B3c區域之序列的一第二股。接著，逆向內引子(backward inner primer,BIP)105之第四片段(B2區域之序列)黏附於上述第一股之B2c區域，並以此第一股為模板而合成出具有所預期之B1c、B2、B1、F1c、F2c與所預期之F1區域之序列的一第三股。之後，逆向外引子107會將此第三股移開，另合成出具有B3、B2、B1、F1c、F2c與所預期之F1區域之序列的一第四股。而上述第三股之所預期之B1c與B1之間會產生自身黏附，且同樣地，所預期之F1與F1c之間也會會產生自身黏附，因此使第三股成為兩端皆形成有莖環(loop)的一股。然後順向內引子與逆向內引子依序依照此股及/或其互補股合成產物為模板持續進行互補股合成反應，而形成一具有複數個莖環之雙股產物(再次參見第1圖)。
又第2A圖顯示，在進行恆溫環形增幅法期間，當所預期之F1區域的序列和所預期之B1c區域的序列分別與目標基因之F1區域與B1c區域相同時所產生的結果。當所預期之F1區域的序列和所預期之B1c區域的序列分別與目標基因之F1區域與B1c區域相同時，則由於所合成出之前方段落所述之具有所預期之B1c、B2、B1、F1c、F2c與所預期之F1區域之序列的第三股可形成兩端皆形成有莖環的一 股，因此可持續進行互補股合成反應。而相對地，第2B圖顯示，在進行恆溫環形增幅法期間，當所預期之F1區域的序列和所預期之B1c區域的序列分別與目標基因之F1區域與B1c區域不相同所產生的結果。當所預期之F1區域的序列和所預期之B1c區域的序列分別與目標基因之F1區域與B1c區域不同時，則由於合成出之具有所預期之B1c、B2、B1、F1c、F2c與所預期之F1區域之序列的第三股，而其所預期之B1c與B1區域之間以及所預期之F1與F1c區域之間無法分別自身黏附而形成兩端皆形成有莖環的一股，因此無法持續進行互補股合成反應。
故，由上述可知，藉由使用適合之引子(適用於野生型或突變型)，恆溫環形增幅法可用於偵測一目標基因之一特定區域的突變及/或多形性。然而，對於CYP2C9*2基因之rs1799853、CYP2C9*3基因之rs1057910、CYP4F2基因之rs2108622、VKORC1-1639基因之rs9923231與VKORC1 1173基因之rs9934438而言，藉由使用由日本榮研公司提供之網頁版設計軟體PrimerExplorer V4(http：/primerexplorer.jp/e/)所設計出之引子來行恆溫環形增幅法所獲得之結果，並無法得知待測樣本之上述五種基因之單核苷酸多形性分別為何。
因此，目前亟需一種新穎的套組，其可用來快速正確偵測出CYP2C9*2基因之rs1799853、CYP2C9*3基因之rs1057910、CYP4F2基因之rs2108622、VKORC1-1639基因之rs9923231或VKORC1 1173基因之rs9934438的單核 苷酸多形性。
本發明提供一種用於偵測一目標核苷酸序列中之一特定區域的一突變及/或多形性的套組，包括：至少一第一引子，係由一第一片段與一第二片段所組成，該第一片段之3’端連接該第二片段之5’端，其中該第一片段係為一第一序列之互補股，且具有約10-30個核苷酸，而該第一序列係位於序列辨識號：3之第375個位置至第406個位置之間，且必須包含第401個位置，又該第二片段係為一第二序列，且具有約10-30個核苷酸，而該第二序列係位於序列辨識號：3之第320個位置至第348個位置之間；一第二引子，其中該第二引子係為一第三序列，且具有約10-30個核苷酸，而該第三序列係位於序列辨識號：3之第298個位置至第328個位置之間；至少一第三引子，係由一第三片段與一第四片段所組成，該第三片段之3’端連接該第四片段之5’端，其中該第三片段係為一第四序列，且具有約10-30個核苷酸，而該第四序列係位於序列辨識號：3之第396個位置至第428個位置之間，且必須包含第401個位置，又該第四片段係為一第五序列之互補股，且具有約10-30個核苷酸，而該第五序列係位於序列辨識號：3之第451個位置至第479個位置之間；以及一第四引子，其中該第四引子係為一第六序列之互補股，且具有約10-30個核苷酸，而該第六序列係位於序列辨識號：3之第482個位置至第514個位置之間；其中該套組係用於偵測來自 一個體之樣本中之一目標基因中之一特定區域的一突變及/或多形性，該目標基因為CYP2C9(序列辨識號：1)，而該特定區域為CYP2C9*2(rs1799853)，而該突變或及/或多形性之發生位置位於序列辨識號：1之第8633個位置，又其中該套組係使用於一聚合酶鏈鎖反應中，當該特定區域之核苷酸序列包含一所預測之核苷酸序列時，於該聚合酶鏈鎖反應中產生一互補股合成產物，該互補股合成產物從5’端至3’端包括第四序列、第五序列之互補股、第四序列之互補股、第一序列之互補股、第二序列之互補股與第一序列，其中於互補股合成產物中，第四序列與第四序列之互補股之間發生自身黏附，第一序列與第一序列之互補股之間發生自身黏附，或者該互補股合成產物從5’端至3’端包括第四序列之互補股、第五序列、第四序列、第一序列、第二序列與第一序列之互補股，其中於互補股合成產物中，第四序列之互補股與第四序列之間發生自身黏附，第一序列之互補股與第一序列之間發生自身黏附，而使該互補股合成產物形成兩端皆形成有莖環的一股進而持續進行互補股合成反應，而當該特定區域之核苷酸序列並非一預測之序列時，聚合酶鏈鎖反應中之互補股合成反應會被抑制。
本發明也提供一種用於偵測一目標核苷酸序列中之一特定區域的一突變及/或多形性的套組，包括：至少一第一引子，係由一第一片段與一第二片段所組成，該第一片段之3’端連接該第二片段之5’端，其中該第一片段係為一第 一序列之互補股，且具有約10-30個核苷酸，而該第一序列係位於序列辨識號：25之第376個位置至第406個位置之間，且必須包含第401個位置，又該第二片段係為一第二序列，且具有約10-30個核苷酸，而該第二序列係位於序列辨識號：25之第332個位置至第359個位置之間；一第二引子，其中該第二引子係為一第三序列，且具有約10-30個核苷酸，而該第三序列係位於序列辨識號：25之第301個位置至第328個位置之間；至少一第三引子，係由一第三片段與一第四片段所組成，該第三片段之3’端連接該第四片段之5’端，其中該第三片段係為一第四序列，且具有約10-30個核苷酸，而該第四序列係位於序列辨識號：25之第396個位置至第425個位置之間，且必須包含第401個位置，又該第四片段係為一第五序列之互補股，且具有約10-30個核苷酸，而該第五序列係位於序列辨識號：25之第448個位置至第478個位置之間；以及一第四引子，其中該第四引子係為一第六序列之互補股，且具有約10-30個核苷酸，而該第六序列係位於序列辨識號：25之第470個位置至第501個位置之間；其中該套組係用於偵測來自一個體之樣本中之一目標基因中之一特定區域的一突變及/或多形性，該目標基因為CYP2C9(序列辨識號：1)，而該特定區域為CYP2C9*3(rs1057910)，而該突變或及/或多形性之發生位置位於序列辨識號：1之第47639個位置，又其中該套組係使用於一聚合酶鏈鎖反應中，當該特定區域之核苷酸序列包含一所預測之核苷酸序列時，於 該聚合酶鏈鎖反應中產生一互補股合成產物，該互補股合成產物從5’端至3’端包括第四序列、第五序列之互補股、第四序列之互補股、第一序列之互補股、第二序列之互補股與第一序列，其中於互補股合成產物中，第四序列與第四序列之互補股之間發生自身黏附，第一序列與第一序列之互補股之間發生自身黏附，或者該互補股合成產物從5’端至3’端包括第四序列之互補股、第五序列、第四序列、第一序列、第二序列與第一序列之互補股，其中於互補股合成產物中，第四序列之互補股與第四序列之間發生自身黏附，第一序列之互補股與第一序列之間發生自身黏附，而使該互補股合成產物形成兩端皆形成有莖環的一股進而持續進行互補股合成反應，而當該特定區域之核苷酸序列並非一預測之序列時，聚合酶鏈鎖反應中之互補股合成反應會被抑制。
本發明另提供一種用於偵測一目標核苷酸序列中之一特定區域的一突變及/或多形性的套組，包括：至少一第一引子，係由一第一片段與一第二片段所組成，該第一片段之3’端連接該第二片段之5’端，其中該第一片段係為一第一序列之互補股，且具有約10-30個核苷酸，而該第一序列係位於序列辨識號：48之第393個位置至第423個位置之間，且必須包含第417個位置，又該第二片段係為一第二序列，且具有約10-30個核苷酸，而該第二序列係位於序列辨識號：48之第352個位置至第381個位置之間；一第二引子，其中該第二引子係為一第三序列，且具有約 10-30個核苷酸，而該第三序列係位於序列辨識號：48之第333個位置至第358個位置之間；至少一第三引子，係由一第三片段與一第四片段所組成，該第三片段之3’端連接該第四片段之5’端，其中該第三片段係為一第四序列，且具有約10-30個核苷酸，而該第四序列係位於序列辨識號：48之第411個位置至第444個位置之間，且必須包含第417個位置，又該第四片段係為一第五序列之互補股，且具有約10-30個核苷酸，而該第五序列係位於序列辨識號：48之第460個位置至第488個位置之間；一第四引子，其中該第四引子係為一第六序列之互補股，且具有約10-30個核苷酸，而該第六序列係位於序列辨識號：48之第492個位置至第519個位置之間；以及其中該套組係用於偵測來自一個體之樣本中之一目標基因中之一特定區域的一突變及/或多形性，該目標基因為CYP4F2(序列辨識號：46)，而該特定區域為rs2108622，而該突變或及/或多形性之發生位置位於序列辨識號：46之第23454個位置，又其中該套組係使用於一聚合酶鏈鎖反應中，當該特定區域之核苷酸序列包含一所預測之核苷酸序列時，於該聚合酶鏈鎖反應中產生一互補股合成產物，該互補股合成產物從5’端至3’端包括第四序列、第五序列之互補股、第四序列之互補股、第一序列之互補股、第二序列之互補股與第一序列，其中於互補股合成產物中，第四序列與第四序列之互補股之間發生自身黏附，第一序列與第一序列之互補股之間發生自身黏附，或者該互補股合成產物從5’端至3’端包括第 四序列之互補股、第五序列、第四序列、第一序列、第二序列與第一序列之互補股，其中於互補股合成產物中，第四序列之互補股與第四序列之間發生自身黏附，第一序列之互補股與第一序列之間發生自身黏附，而使該互補股合成產物形成兩端皆形成有莖環的一股進而持續進行互補股合成反應，而當該特定區域之核苷酸序列並非一預測之序列時，聚合酶鏈鎖反應中之互補股合成反應會被抑制。
本發明提供另一種一種用於偵測一目標核苷酸序列中之一特定區域的一突變及/或多形性的套組，包括：至少一第一引子，其係由一第一片段與一第二片段所組成，該第一片段之3’端連接該第二片段之5’端，或其係由一第一片段、一第二片段與一第三片段所組成，該第一片段之3’端連接該第三片段之5’端，該第三片段之3’端連接該第二片段之5’端，該第三片段係由約2-10個胸腺嘧啶所組成，其中該第一片段係為一第一序列之互補股，且具有約10-30個核苷酸，而該第一序列係位於序列辨識號：71之第476個位置至第505個位置之間，且必須包含第501個位置，又該第二片段係為一第二序列，且具有約10-30個核苷酸，而該第二序列係位於序列辨識號：71之第451個位置至第481個位置之間；一第二引子，其中該第二引子係為一第三序列，且具有約10-30個核苷酸，而該第三序列係位於序列辨識號：71之第400個位置至第442個位置之間；至少一第三引子，係由一第三片段與一第四片段所組成，該第三片段之3’端連接該第四片段之5’端，或其 係由一第三片段、一第四片段與一第五片段所組成，該第三片段之3’端連接該第四片段之5’端，該第四片段之3’端連接該第五片段之5’端，該第三片段係由約2-10個胸腺嘧啶所組成，其中該第三片段係為一第四序列，且具有約10-30個核苷酸，而該第四序列係位於序列辨識號：71之第496個位置至第529個位置之間，且必須包含第501個位置，又該第四片段係為一第五序列之互補股，且具有約10-30個核苷酸，而該第五序列係位於序列辨識號：71之第523個位置至第550個位置之間；以及一第四引子，其中該第四引子係為一第六序列之互補股，且具有約10-30個核苷酸，而該第六序列係位於序列辨識號：71之第542個位置至第572個位置之間；其中該套組係用於偵測來自一個體之樣本中之一目標基因中之一特定區域的一突變及/或多形性，該目標基因為VKORC1(序列辨識號：69)，而該特定區域為VKORC1-1639(rs9923231)，而該突變或及/或多形性之發生位置位於序列辨識號：69之第3586個位置，又其中該套組係使用於一聚合酶鏈鎖反應中，當該特定區域之核苷酸序列包含一所預測之核苷酸序列時，於該聚合酶鏈鎖反應中產生一互補股合成產物，該互補股合成產物從5’端至3’端包括第四序列、第五序列之互補股、第四序列之互補股、第一序列之互補股、第二序列之互補股與第一序列，其中於互補股合成產物中，第四序列與第四序列之互補股之間發生自身黏附，第一序列與第一序列之互補股之間發生自身黏附，或者該互補股合成產物從5’ 端至3’端包括第四序列之互補股、第五序列、第四序列、第一序列、第二序列與第一序列之互補股，其中於互補股合成產物中，第四序列之互補股與第四序列之間發生自身黏附，第一序列之互補股與第一序列之間發生自身黏附，而使該互補股合成產物形成兩端皆形成有莖環的一股進而持續進行互補股合成反應，而當該特定區域之核苷酸序列並非一預測之序列時，聚合酶鏈鎖反應中之互補股合成反應會被抑制。
本發明又提供另一種一種用於偵測一目標核苷酸序列中之一特定區域的一突變及/或多形性的套組，包括：至少一第一引子，係由一第一片段與一第二片段所組成，該第一片段之3’端連接該第二片段之5’端，其中該第一片段係為一第一序列之互補股，且具有約10-30個核苷酸，而該第一序列係位於序列辨識號：93之第373個位置至第407個位置之間，且必須包含第401個位置，又該第二片段係為一第二序列，且具有約10-30個核苷酸，而該第二序列係位於序列辨識號：93之第324個位置至第353個位置之間；一第二引子，其中該第二引子係為一第三序列，且具有約10-30個核苷酸，而該第三序列係位於序列辨識號：93之第288個位置至第317個位置之間；至少一第三引子，係由一第三片段與一第四片段所組成，該第三片段之3’端連接該第四片段之5’端，其中該第三片段係為一第四序列，且具有約10-30個核苷酸，而該第四序列係位於序列辨識號：93之第395個位置至第427個位置之間，且必須 包含第401個位置，又該第四片段係為一第五序列之互補股，且具有約10-30個核苷酸，而該第五序列係位於序列辨識號：93之第451個位置至第479個位置之間；以及一第四引子，其中該第四引子係為一第六序列之互補股，且具有約10-30個核苷酸，而該第六序列係位於序列辨識號：93之第487個位置至第514個位置之間；其中該套組係用於偵測來自一個體之樣本中之一目標基因中之一特定區域的一突變及/或多形性，該目標基因為VKORC1(序列辨識號：69)，而該特定區域為VKORC1 1173(rs,9934438)，而該突變或及/或多形性之發生位置位於序列辨識號：69之第6399個位置，又其中該套組係使用於一聚合酶鏈鎖反應中，當該特定區域之核苷酸序列包含一所預測之核苷酸序列時，於該聚合酶鏈鎖反應中產生一互補股合成產物，該互補股合成產物從5’端至3’端包括第四序列、第五序列之互補股、第四序列之互補股、第一序列之互補股、第二序列之互補股與第一序列，其中於互補股合成產物中，第四序列與第四序列之互補股之間發生自身黏附，第一序列與第一序列之互補股之間發生自身黏附，或者該互補股合成產物從5’端至3’端包括第四序列之互補股、第五序列、第四序列、第一序列、第二序列與第一序列之互補股，其中於互補股合成產物中，第四序列之互補股與第四序列之間發生自身黏附，第一序列之互補股與第一序列之間發生自身黏附，而使該互補股合成產物形成兩端皆形成有莖環的一股進而持續進行互補股合成反應，而當該特定區域之核 苷酸序列並非一預測之序列時，聚合酶鏈鎖反應中之互補股合成反應會被抑制。
為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作詳細說明如下：
為克服前述藉由使用由日本榮研公司提供之網頁版設計軟體PrimerExplorer V4(http：/primerexplorer.jp/e/)所設計出之引子來行恆溫環形增幅法並無法得知一待測樣本之CYP2C9基因之CYP2C9*2(rs1799853)、CYP2C9基因之CYP2C9*3(rs1057910)、CYP4F2基因之rs2108622、VKORC1基因之VKORC1-1639(rs9923231)與VKORC1基因之VKORC1 1173(rs9934438)等的單核苷酸多形性分別為何之問題，於本發明中提供一新穎之套組，用於偵測一目標核苷酸序列中之一特定區域的一突變及/或多形性。
上述本發明之套組適用於一聚合酶鏈鎖反應，特別是一恆溫環形增幅法(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)，其中藉由使用此套組可快速與正確地獲得偵測結果，且此套組適用於偵測CYP2C9基因之CYP2C9*2(rs1799853)、CYP2C9基因之CYP2C9*3(rs1057910)、CYP4F2基因之rs2108622、VKORC1基因之VKORC1-1639(rs9923231)與VKORC1基因之VKORC1 1173(rs9934438)的單核苷酸多形性。
對於本發明套組中之引子而言，相似於前述日本榮研 公司之引子設計軟體，如同第1A與1B圖所示，引子設計藉由在一目標基因100之所選擇的引子設計範圍內，選擇出六個區域，F1(第一序列)、F2(第二序列)、F3(第三序列)、B1c(第四序列)、B2c(第五序列)與B3c(第六序列)，而顯示於另一股中之F1c、F2c、F3c、B1、B2與B3區域則分別與上述F1、F2、F3、B1c、B2c與B3c區域互補，其中所選擇的引子設計範圍包含一特定區域，其可為欲偵測之突變及/或多形性區域，而所選出之F1與B1c區域的至少一個必須包含所欲偵測之突變點或單核苷酸多形性位點。相似地，本發明係根據上述所選擇之六個區域，設計出至少四條引子，分別為順向內引子101、順向外引子103、逆向內引子105與逆向外引子107，其中順向內引子101之序列為由一第一片段(所預期之F1區域之序列的互補股，即所預期之F1c區域的序列)(例如，若預期目標基因之F1區域為野生型之序列，則此第一片段之序列為野生型F1區域的互補股，相對地，若預期目標基因之F1區域為突變型之序列，則此第一片段之序列為突變型F1區域的互補股)與一第二片段(F2區域之序列)所組成，順向外引子103之序列為F3區域之序列，而逆向內引子105之序列為由為由一第三片段(所預期之B1c區域之序列，即所預期之B1區域之序列的互補股)(例如，若預期目標基因之B1c區域為野生型之序列，則此第三片段之序列為野生型B1c區域之序列，相對地，若預期目標基因之B1c區域為突變型之序列，則此第三片段之序列為突變型 B1c區域之序列)與一第四片段(B2c區域之序列的互補股，即B2區域之序列)所組成，逆向外引子107之序列為B3c區域之序列的互補股(即B3區域之序列)。然而，需注意的是，針CYP2C9基因之CYP2C9*2(rs1799853)、CYP2C9基因之CYP2C9*3(rs1057910)、CYP4F2基因之rs2108622、VKORC1基因之VKORC1-1639(rs9923231)與VKORC1基因之VKORC1 1173(rs9934438)的單核苷酸多形性等而言，本發明之套組中之引子的設計根據，F1、F2、F3、B1c、B2c及B3c區域與日本榮研公司之引子設計軟體所建議之六個區域並不相同，而藉由使用本發明之套組，可正確且快速地偵測出上述之單核苷酸多形性的型別。
在以本發明之套組進行所進行之恆溫環形增幅法中，順向內引子101之第二片段(F2區域之序列)會黏附於上述目標基因100之另一股的F2c區域而進行互補股合成反應，而合成出具有第一片段(所預期之F1區域之序列的互補股，即所預期之F1c區域的序列)、第二片段(F2區域之序列)、F1、B1c、B2c與B3c區域之序列的一第一股，又順向外引子103會將此股移開，另合成出具有F3、F2、F1、B1c、B2c與B3c區域之序列的一第二股。接著，逆向內引子105之第四片段(B2區域之序列)黏附於上述第一股之B2c區域，並以此第一股為模板而合成出具有所預期之B1c、B2、B1、F1c、F2c與所預期之F1區域之序列的一第三股。之後，逆向外引子107會將此第三股移開，另合成出具有B3、B2、B1、F1c、F2c與所預期之F1區域之 序列的一第四股。
而當所預期之F1區域的序列和所預期之B1c區域的序列分別與目標基因之F1區域與B1c區域相同時，則由於在所合成出之具有所預期之B1c、B2、B1、F1c、F2c與所預期之F1區域之序列的上述第三股中，其所預期之B1c區域與B1區域之間以及所預期之F1區域與F1c區域之間皆可產生自身黏附，因此可使此第三股成為兩端皆形成有莖環的一股，而可持續進行藉由順向內引子101與逆向內引子105的互補股合成反應(再次參見第2A圖)。而相對地，而當所預期之F1區域的序列和所預期之B1c區域的序列分別與目標基因之F1區域與B1c區域不同時，則由於在所合成出之具有所預期之B1c、B2、B1、F1c、F2c與所預期之F1區域之序列的上述第三股中，其所預期之B1c區域與B1區域之間以及所預期之F1區域與F1c區域之間皆無法產生自身黏附，因此無法使此第三股成為兩端皆形成有莖環的一股，而無法持續進行藉由順向內引子101與逆向內引子105的互補股合成反應(再次參見第2B圖)。
故，根據前述可知，在本發明一第一態樣中，本發明可提供用於偵測一目標核苷酸序列中之一特定區域的一突變及/或多形性的套組，其係用於偵測來自一個體之樣本中之一目標基因中之一特定區域的一突變及/或多形性。上述目標基因可為CYP2C9(序列辨識號：1，而上述特定區域為CYP2C9*2(rs1799853)(序列辨識號：3)，又上述突變或及/或多形性CYP2C9*2(rs1799853(C->T))之發生位置 位於序列辨識號：1之第8633個位置(即，序列辨識號：3之第401個位置)。
上述本發明套組可包括，但不限於，至少一第一引子、一第二引子、至少一第三引子與一第四引子，而用於設計這些引子之前方段落提及之所選擇的引子設計範圍為序列辨識號：3。
上述至少一第一引子，係由一第一片段與一第二片段所組成，第一片段之3’端連接第二片段之5’端。第一片段可為一第一序列之互補股，且具有約10-30個核苷酸，而第一序列係位於序列辨識號：3之第375個位置至第406個位置之間，且必須包含第401個位置，又第二片段可為一第二序列，且具有約10-30個核苷酸，而第二序列係位於序列辨識號：3之第320個位置至第348個位置之間。上述第二引子可為一第三序列，且具有約10-30個核苷酸，而第三序列係位於序列辨識號：3之第298個位置至第328個位置之間。
又，上述至少一第三引子，可由一第三片段與一第四片段所組成，第三片段之3’端連接第四片段之5’端。上述第三片段可為一第四序列，且具有約10-30個核苷酸，而第四序列係位於序列辨識號：3之第396個位置至第428個位置之間，且必須包含第401個位置，又第四片段可為一第五序列之互補股，且具有約10-30個核苷酸，而第五序列係位於序列辨識號：3之第451個位置至第479個位置之間。
再者，上述第四引子係為一第六序列之互補股，且具有約10-30個核苷酸，而第六序列係位於序列辨識號：3之第482個位置至第514個位置之間。
上述本發明套組係使用於一聚合酶鏈鎖反應中，聚合酶鏈鎖反應的例子可包括，但不限於恆溫環形增幅法。在一實施例中，本發明之套組適用於恆溫環形增幅法中，而恆溫環形增幅法的溫度可為約55-65℃，較佳為60-65℃。
當上述特定區域之核苷酸序列包含一所預測之核苷酸序列時，於聚合酶鏈鎖反應中產生一互補股合成產物(對應於前方段落所述之第三股，其形成原理可參考前方段落之說明)，此互補股合成產物從5’端至3’端包括第四序列、第五序列之互補股、第四序列之互補股、第一序列之互補股、第二序列之互補股與第一序列，其中於互補股合成產物中，第四序列與第四序列之互補股之間發生自身黏附，第一序列與第一序列之互補股之間發生自身黏附，或者此互補股合成產物從5’端至3’端包括第四序列之互補股、第五序列、第四序列、第一序列、第二序列與第一序列之互補股，其中於互補股合成產物中，第四序列之互補股與第四序列之間發生自身黏附，第一序列之互補股與第一序列之間發生自身黏附，而使互補股合成產物形成兩端皆形成有莖環的一股進而持續進行互補股合成反應。
而相對地，當特定區域之核苷酸序列並非一預測之序列時，聚合酶鏈鎖反應中之互補股合成反應會被抑制，由於無法形成兩端皆形成有莖環的互補股合成產物。
在一實施例中，於上述本發明套組中，至少一第一引子包括序列為序列辨識號：16之引子及/或序列為序列辨識號：17之引子，第二引子為序列辨識號：18、至少一第三引子包括序列為序列辨識號：21之引子及/或序列為序列辨識號：22之引子，而第四引子為序列為序列辨識號23之引子。而於此實施例中，此套組具有偵測出野生型及/或突變型CYP2C9*2(rs1799853(C->T))的能力。
在另一實施例中，於上述本發明套組中，至少一第一引子包括序列為序列辨識號：16之引子，第二引子為序列辨識號：18、至少一第三引子包括序列為序列辨識號：21之引子，而第四引子為序列為序列辨識號23之引子。於此實施例中，此套組具有偵測出野生型CYP2C9*2(rs1799853(C))的能力。
在另一實施例中，於上述本發明套組中，至少一第一引子包括序列為序列辨識號：17之引子，第二引子為序列辨識號：18、至少一第三引子包括序列為序列辨識號：22之引子，而第四引子為序列為序列辨識號23之引子。於此實施例中，此套組具有偵測出突變型CYP2C9*2(rs1799853(T))的能力。
此外，上述本發明之套組還可更包括一DNA聚合酶，其催化包含一股移位之互補股合成與核苷酸基質，但不限於此。上述DNA聚合酶的例子可包括，但不限於BstDNA聚合酶。在一實施例中，上述核苷酸基質可為一經過修飾之核苷酸基質，例如經連接一酵素或染劑，但不限於此。
又，在一聚合酶鏈鎖反應，特別是一恆溫環形增幅法中，上述第一引子與第二引子之使用量比例在約1：1至1：10之間，而上述第三引子與第四引子之使用量比例在約1：1至1：10之間。
在本發明一第二態樣中，本發明可提供用於偵測一目標核苷酸序列中之一特定區域的一突變及/或多形性的套組，其係用於偵測來自一個體之樣本中之一目標基因中之一特定區域的一突變及/或多形性。上述目標基因可為CYP2C9(序列辨識號：1)，而上述特定區域為CYP2C9*3(rs1057910)(序列辨識號：25)，又上述突變或及/或多形性CYP2C9*3(rs1057910(A->C))之發生位置位於序列辨識號：1之第47639個位置(即，序列辨識號：25之第401個位置)。
上述本發明套組可包括，但不限於，至少一第一引子、一第二引子、至少一第三引子與一第四引子，而用於設計這些引子之前方段落提及之所選擇的引子設計範圍為序列辨識號：25。
上述至少一第一引子，可由一第一片段與一第二片段所組成，第一片段之3’端連接第二片段之5’端，其中第一片段係為一第一序列之互補股，且具有約10-30個核苷酸，而第一序列係位於序列辨識號：25之第376個位置至第406個位置之間，且必須包含第401個位置，又第二片段係為一第二序列，且具有約10-30個核苷酸，而第二序列係位於序列辨識號：25之第332個位置至第359個位置之間。
上述第二引子係為一第三序列，且具有約10-30個核苷酸，而第三序列係位於序列辨識號：25之第301個位置至第328個位置之間。
再者，上述至少一第三引子，係由一第三片段與一第四片段所組成，第三片段之3’端連接第四片段之5’端。上述第三片段係為一第四序列，且具有約10-30個核苷酸，而第四序列係位於序列辨識號：25之第396個位置至第425個位置之間，且必須包含第401個位置，又第四片段係為一第五序列之互補股，且具有約10-30個核苷酸，而第五序列係位於序列辨識號：25之第448個位置至第478個位置之間。
又，上述第四引子係為一第六序列之互補股，且具有約10-30個核苷酸，而第六序列係位於序列辨識號：25之第470個位置至第501個位置之間。
上述本發明套組係使用於一聚合酶鏈鎖反應中，聚合酶鏈鎖反應的例子可包括，但不限於恆溫環形增幅法。在一實施例中，本發明之套組適用於恆溫環形增幅法中，而恆溫環形增幅法的溫度可為約55-65℃，較佳為60-65℃。
當上述特定區域之核苷酸序列包含一所預測之核苷酸序列時，於聚合酶鏈鎖反應中產生一互補股合成產物(對應於前方段落所述之第三股，其形成原理可參考前方段落之說明)，此互補股合成產物從5’端至3’端包括第四序列、第五序列之互補股、第四序列之互補股、第一序列之互補股、第二序列之互補股與第一序列，其中於互補股合成產 物中，第四序列與第四序列之互補股之間發生自身黏附，第一序列與第一序列之互補股之間發生自身黏附，或者此互補股合成產物從5’端至3’端包括第四序列之互補股、第五序列、第四序列、第一序列、第二序列與第一序列之互補股，其中於互補股合成產物中，第四序列之互補股與第四序列之間發生自身黏附，第一序列之互補股與第一序列之間發生自身黏附，而使互補股合成產物形成兩端皆形成有莖環的一股進而持續進行互補股合成反應。
而相對地，當特定區域之核苷酸序列並非一預測之序列時，聚合酶鏈鎖反應中之互補股合成反應會被抑制，由於無法形成兩端皆形成有莖環的互補股合成產物。
在一實施例中，於上述本發明套組中，至少一第一引子包括序列為序列辨識號：38之引子及/或序列為序列辨識號：39之引子，第二引子為序列辨識號：40、至少一第三引子包括序列為序列辨識號：43之引子及/或序列為序列辨識號：44之引子，而第四引子為序列為序列辨識號45之引子。於此實施例中，此套組具有偵測出野生型及/或突變型CYP2C9*3(rs1057910(A->C))的能力。
在另一實施例中，於上述本發明套組中，至少一第一引子包括序列為序列辨識號：38之引子，第二引子為序列辨識號：40、至少一第三引子包括序列為序列辨識號：43之引子，而第四引子為序列為序列辨識號45之引子。於此實施例中，此套組具有偵測出野生型CYP2C9*3(rs1057910(A))。
在另一實施例中，於上述本發明套組中，至少一第一引子包括序列為序列辨識號：39之引子，第二引子為序列辨識號：40、至少一第三引子包括序列為序列辨識號：44之引子，而第四引子為序列為序列辨識號45之引子。於此實施例中，此套組具有偵測出突變型CYP2C9*3(rs1057910(C))的能力。
此外，上述本發明之套組還可更包括一DNA聚合酶，其催化包含一股移位之互補股合成與核苷酸基質，但不限於此。上述DNA聚合酶的例子可包括，但不限於BstDNA聚合酶。在一實施例中，上述核苷酸基質可為一經過修飾之核苷酸基質，例如經連接一酵素或染劑，但不限於此。
在一聚合酶鏈鎖反應，特別是一恆溫環形增幅法中，上述第一引子與第二引子之使用量比例在約1：1至1：10之間，而上述第三引子與第四引子之使用量比例在約1：1至1：10之間。
在本發明一第三態樣中，本發明可提供用於偵測一目標核苷酸序列中之一特定區域的一突變及/或多形性的套組，其係用於偵測來自一個體之樣本中之一目標基因中之一特定區域的一突變及/或多形性。上述目標基因可為CYP4F2(序列辨識號：46)，而上述特定區域為rs2108622(序列辨識號：48)，又上述突變或及/或多形性CYP4F2(rs1799853(C->T))之發生位置位於序列辨識號：46之第23454個位置(即，序列辨識號：48之第417個位置)。
上述本發明套組可包括，但不限於，至少一第一引子、 一第二引子、至少一第三引子與一第四引子，而用於設計這些引子之前方段落提及之所選擇的引子設計範圍為序列辨識號：48。
上述至少一第一引子，係由一第一片段與一第二片段所組成，第一片段之3’端連接第二片段之5’端。上述第一片段係為一第一序列之互補股，且具有約10-30個核苷酸，而第一序列係位於序列辨識號：48之第393個位置至第423個位置之間，且必須包含第417個位置，又第二片段係為一第二序列，且具有約10-30個核苷酸，而第二序列係位於序列辨識號：48之第352個位置至第381個位置之間。
上述第二引子係為一第三序列，且具有約10-30個核苷酸，而第三序列係位於序列辨識號：48之第333個位置至第358個位置之間。
又，至少一第三引子，係由一第三片段與一第四片段所組成，第三片段之3’端連接第四片段之5’端。上述第三片段係為一第四序列，且具有約10-30個核苷酸，而第四序列係位於序列辨識號：48之第411個位置至第444個位置之間，且必須包含第417個位置，又第四片段係為一第五序列之互補股，且具有約10-30個核苷酸，而第五序列係位於序列辨識號：48之第460個位置至第488個位置之間。
又，上述第四引子，其中第四引子係為一第六序列之互補股，且具有約10-30個核苷酸，而該第六序列係位於序列辨識號：48之第492個位置至第519個位置之間。
上述本發明套組係使用於一聚合酶鏈鎖反應中，聚合酶鏈鎖反應的例子可包括，但不限於恆溫環形增幅法。在一實施例中，本發明之套組適用於恆溫環形增幅法中，而恆溫環形增幅法的溫度可為約55-65℃，較佳為60-65℃。
當上述特定區域之核苷酸序列包含一所預測之核苷酸序列時，於聚合酶鏈鎖反應中產生一互補股合成產物(對應於前方段落所述之第三股，其形成原理可參考前方段落之說明)，此互補股合成產物從5’端至3’端包括第四序列、第五序列之互補股、第四序列之互補股、第一序列之互補股、第二序列之互補股與第一序列，其中於互補股合成產物中，第四序列與第四序列之互補股之間發生自身黏附，第一序列與第一序列之互補股之間發生自身黏附，或者此互補股合成產物從5’端至3’端包括第四序列之互補股、第五序列、第四序列、第一序列、第二序列與第一序列之互補股，其中於互補股合成產物中，第四序列之互補股與第四序列之間發生自身黏附，第一序列之互補股與第一序列之間發生自身黏附，而使互補股合成產物形成兩端皆形成有莖環的一股進而持續進行互補股合成反應。
而相對地，當特定區域之核苷酸序列並非一預測之序列時，聚合酶鏈鎖反應中之互補股合成反應會被抑制，由於無法形成兩端皆形成有莖環的互補股合成產物。
在一實施例中，於上述本發明套組中，至少一第一引子包括序列為序列辨識號：61之引子及/或序列為序列辨識號：62之引子，第二引子為序列辨識號：63、至少一第三 引子包括序列為序列辨識號：66之引子及/或序列為序列辨識號：67之引子，而第四引子為序列為序列辨識號68之引子。於此實施例中，此套組具有偵測出野生型及/或突變型CYP4F2(rs2108622(C->T))的能力。
在另一實施例中，於上述本發明套組中，至少一第一引子包括序列為序列辨識號：61之引子及，第二引子為序列辨識號：63、至少一第三引子包括序列為序列辨識號：66之引子，而第四引子為序列為序列辨識號：68之引子。於此實施例中，此套組具有偵測出野生型CYP4F2(rs2108622(C))。
在另一實施例中，於上述本發明套組中，至少一第一引子包括序列為序列辨識號：62之引子及，第二引子為序列辨識號：63、至少一第三引子包括序列為序列辨識號：67之引子，而第四引子為序列為序列辨識號68之引子。於此實施例中，此套組具有偵測出突變型CYP4F2(rs2108622(T))的能力。
此外，上述本發明之套組還可更包括一DNA聚合酶，其催化包含一股移位之互補股合成與核苷酸基質，但不限於此。上述DNA聚合酶的例子可包括，但不限於BstDNA聚合酶。在一實施例中，上述核苷酸基質可為一經過修飾之核苷酸基質，例如經連接一酵素或染劑，但不限於此。
在一聚合酶鏈鎖反應，特別是一恆溫環形增幅法中，上述第一引子與第二引子之使用量比例在約1：1至1：10之間，而上述第三引子與第四引子之使用量比例在約1：1至 1：0之間。
在本發明一第四態樣中，本發明可提供用於偵測一目標核苷酸序列中之一特定區域的一突變及/或多形性的套組，其係用於偵測來自一個體之樣本中之一目標基因中之一特定區域的一突變及/或多形性。上述目標基因可為VKORC1(序列辨識號：69)，而上述特定區域為VKORC1-1639(rs9923231)(序列辨識號：71)，又上述突變或及/或多形性VKORC1-1639(rs9923231(T->C))之發生位置位於序列辨識號：69之第3586個位置(即，序列辨識號：71之第501個位置)。
上述本發明套組可包括，但不限於，至少一第一引子、一第二引子、至少一第三引子與一第四引子，而用於設計這些引子之前方段落提及之所選擇的引子設計範圍為序列辨識號：71。
上述至少一第一引子，其係由一第一片段與一第二片段所組成，第一片段之3’端連接第二片段之5’端，或上述至少一第一引子，其係由一第一片段、一第二片段與一第三片段所組成，該第一片段之3’端連接該第三片段之5’端，該第三片段之3’端連接該第二片段之5’端，該第三片段係由約2-10個胸腺嘧啶所組成。上述第一片段係為一第一序列之互補股，且具有約10-30個核苷酸，而第一序列係位於序列辨識號：71之第476個位置至第505個位置之間，且必須包含第501個位置，又第二片段係為一第二序列，且具有約10-30個核苷酸，而第二序列係位於序列辨 識號：71之第451個位置至第481個位置之間。
上述第二引子，其中第二引子係為一第三序列或其互補股，且具有約10-30個核苷酸，而第三序列係位於序列辨識號：71之第400個位置至第442個位置之間。
此外，上述至少一第三引子，係由一第三片段與一第四片段所組成，第三片段之3’端連接第四片段之5’端，或者上述至少一第三引子，其係由一第三片段、一第四片段與一第五片段所組成，該第三片段之3’端連接該第四片段之5’端，該第四片段之3’端連接該第五片段之5’端，該第三片段係由約2-10個胸腺嘧啶所組成。上述第三片段係為一第四序列，且具有約10-30個核苷酸，而第四序列係位於序列辨識號：71之第496個位置至第529個位置之間，且必須包含第501個位置，又第四片段係為一第五序列之互補股，且具有約10-30個核苷酸，而第五序列係位於序列辨識號：71之第523個位置至第550個位置之間。
又，上述第四引子，其中第四引子係為一第六序列或其互補股，且具有約10-30個核苷酸，而第六序列係位於序列辨識號：71之第542個位置至第572個位置之間。
上述本發明套組係使用於一聚合酶鏈鎖反應中，聚合酶鏈鎖反應的例子可包括，但不限於恆溫環形增幅法。在一實施例中，本發明之套組適用於恆溫環形增幅法中，而恆溫環形增幅法的溫度可為約55-65℃，較佳為60-65℃。
當上述特定區域之核苷酸序列包含一所預測之核苷酸序列時，於聚合酶鏈鎖反應中產生一互補股合成產物(對 應於前方段落所述之第三股，其形成原理可參考前方段落之說明)，此互補股合成產物從5’端至3’端包括第四序列、第五序列之互補股、第四序列之互補股、第一序列之互補股、第二序列之互補股與第一序列，其中於互補股合成產物中，第四序列與第四序列之互補股之間發生自身黏附，第一序列與第一序列之互補股之間發生自身黏附，或者此互補股合成產物從5’端至3’端包括第四序列之互補股、第五序列、第四序列、第一序列、第二序列與第一序列之互補股，其中於互補股合成產物中，第四序列之互補股與第四序列之間發生自身黏附，第一序列之互補股與第一序列之間發生自身黏附，而使互補股合成產物形成兩端皆形成有莖環的一股進而持續進行互補股合成反應。
而相對地，當特定區域之核苷酸序列並非一預測之序列時，聚合酶鏈鎖反應中之互補股合成反應會被抑制，由於無法形成兩端皆形成有莖環的互補股合成產物。
在一實施例中，於上述本發明套組中，至少一第一引子包括序列為序列辨識號：84之引子及/或序列為序列辨識號：85之引子，第二引子為序列辨識號：86、至少一第三引子包括序列為序列辨識號：89之引子及/或序列為序列辨識號：90之引子，而第四引子為序列為序列辨識號91之引子。於此實施例中，此套組具有偵測出野生型及/或突變型VKORC1-1639(rs9923231(T->C))的能力。
在另一實施例中，於上述本發明套組中，至少一第一引子包括序列為序列辨識號：84之引子，第二引子為序列 辨識號：86、至少一第三引子包括序列為序列辨識號：89之引子，而第四引子為序列為序列辨識號91之引子。於此實施例中，此套組具有偵測出野生型VKORC1-1639(rs9923231(T))的能力。
在另一實施例中，於上述本發明套組中，至少一第一引子包括序列為序列辨識號：85之引子，第二引子為序列辨識號：86、至少一第三引子包括序列為序列辨識號：90之引子，而第四引子為序列為序列辨識號91之引子。於此實施例中，此套組具有偵測出突變型VKORC1-1639(rs9923231(C))的能力。
此外，上述本發明之套組還可更包括一DNA聚合酶，其催化包含一股移位之互補股合成與核苷酸基質，但不限於此。上述DNA聚合酶的例子可包括，但不限於BstDNA聚合酶。在一實施例中，上述核苷酸基質可為一經過修飾之核苷酸基質，例如經連接一酵素或染劑，但不限於此。
在一聚合酶鏈鎖反應，特別是一恆溫環形增幅法中，上述第一引子與第二引子之使用量比例在約1：1至1：10之間，而上述第三引子與第四引子之使用量比例在約1：1至1：10之間。
在本發明一第五態樣中，本發明可提供用於偵測一目標核苷酸序列中之一特定區域的一突變及/或多形性的套組，其係用於偵測來自一個體之樣本中之一目標基因中之一特定區域的一突變及/或多形性。上述目標基因可為VKORC1(序列辨識號：69)，而上述特定區域為VKORC1 1173(rs9934438)(序列辨識號：93)，又上述突變或及/或多形性VKORC1 1173(rs9934438(A->G))之發生位置位於序列辨識號：69之第6399個位置(即，序列辨識號：93之第401個位置)。
上述本發明套組可包括，但不限於，至少一第一引子、一第二引子、至少一第三引子與一第四引子，而用於設計這些引子之前方段落提及之所選擇的引子設計範圍為序列辨識號：93。
上述至少一第一引子，係由一第一片段與一第二片段所組成，第一片段之3’端連接第二片段之5’端。上述第一片段係為一第一序列之互補股，且具有約10-30個核苷酸，而第一序列係位於序列辨識號：93之第373個位置至第407個位置之間，且必須包含第401個位置，又第二片段係為一第二序列，且具有約10-30個核苷酸，而第二序列係位於序列辨識號：93之第324個位置至第353個位置之間。上述第二引子係為一第三序列，且具有約10-30個核苷酸，而第三序列係位於序列辨識號：93之第288個位置至第317個位置之間。
另外上述至少一第三引子，係由一第三片段與一第四片段所組成，第三片段之3’端連接第四片段之5’端。上述第三片段係為一第四序列，且具有約10-30個核苷酸，而第四序列係位於序列辨識號：93之第395個位置至第427個位置之間，且必須包含第401個位置，又第四片段係為一第五序列之互補股，且具有約10-30個核苷酸，而第五 序列係位於序列辨識號：93之第451個位置至第479個位置之間。
又，上述第四引子係為一第六序列之互補股，且具有約10-30個核苷酸，而第六序列係位於序列辨識號：93之第487個位置至第514個位置之間。
上述本發明套組係使用於一聚合酶鏈鎖反應中，聚合酶鏈鎖反應的例子可包括，但不限於恆溫環形增幅法。在一實施例中，本發明之套組適用於恆溫環形增幅法中，而恆溫環形增幅法的溫度可為約55-65℃，較佳為60-65℃。
當上述特定區域之核苷酸序列包含一所預測之核苷酸序列時，於聚合酶鏈鎖反應中產生一互補股合成產物(對應於前方段落所述之第三股，其形成原理可參考前方段落之說明)，此互補股合成產物從5’端至3’端包括第四序列、第五序列之互補股、第四序列之互補股、第一序列之互補股、第二序列之互補股與第一序列，其中於互補股合成產物中，第四序列與第四序列之互補股之間發生自身黏附，第一序列與第一序列之互補股之間發生自身黏附，或者此互補股合成產物從5’端至3’端包括第四序列之互補股、第五序列、第四序列、第一序列、第二序列與第一序列之互補股，其中於互補股合成產物中，第四序列之互補股與第四序列之間發生自身黏附，第一序列之互補股與第一序列之間發生自身黏附，而使互補股合成產物形成兩端皆形成有莖環的一股進而持續進行互補股合成反應。
而相對地，當特定區域之核苷酸序列並非一預測之序 列時，聚合酶鏈鎖反應中之互補股合成反應會被抑制，由於無法形成兩端皆形成有莖環的互補股合成產物。
在一實施例中，於上述本發明套組中，至少一第一引子包括序列為序列辨識號：106之引子及/或序列為序列辨識號：107之引子，第二引子為序列辨識號：108、至少一第三引子包括序列為序列辨識號：111之引子及/或序列為序列辨識號：112之引子，而第四引子為序列為序列辨識號113之引子。於此實施例中，此套組具有偵測出野生型及/或突變型VKORC1 1173(rs9934438(A->G))的能力。
在另一實施例中，於上述本發明套組中，至少一第一引子包括序列為序列辨識號：106之引子，第二引子為序列辨識號：108、至少一第三引子包括序列為序列辨識號：111之引子，而第四引子為序列為序列辨識號113之引子。於此實施例中，此套組具有偵測出野生型VKORC1 1173(rs9934438(A))的能力。
在另一實施例中，於上述本發明套組中，至少一第一引子包括序列為序列辨識號：107之引子，第二引子為序列辨識號：108、至少一第三引子包括序列為序列辨識號：112之引子，而第四引子為序列為序列辨識號113之引子。於此實施例中，此套組具有偵測出突變型VKORC1 1173(rs9934438(G))的能力。
此外，上述本發明之套組還可更包括一DNA聚合酶，其催化包含一股移位之互補股合成與核苷酸基質，但不限於此。上述DNA聚合酶的例子可包括，但不限於BstDNA聚合酶。在一實施例中，上述核苷酸基質可為一經過修飾之核苷酸基質，例如經連接一酵素或染劑，但不限於此。
又在一聚合酶鏈鎖反應，特別是一恆溫環形增幅法中，上述第一引子與第二引子之使用量比例在約1：1至1：10之間，而上述第三引子與第四引子之使用量比例在約1：1至1：10之間。
【實施例】
A.藉由恆溫環形增幅法來測定CYP2C9基因之CYP2C9*2(rs1799853)多形性
比較例1
(1)樣本取得
由一人類全血樣本抽取獲得基因體DNA(genomic DNA)，並以市售核酸純化套組(廠商名稱：Chemagen，商品編號：101)進行純化，並以用分光光譜儀(廠商名稱：Nanodrop，商品編號：ND-1000)測定濃度。
(2)引子設計
利用日本榮研公司提供之網頁版設計軟體PrimerExplorer V4，來在對於CYP2C9基因之CYP2C9*2(rs1799853)所設之引子設計範圍(序列辨識號：3)中，選取六個區域與並根據此六個區域設計出引子。所選取之六個區域之所在位置與所設計出之引子如表1所示。
(3)恆溫環形增幅
分別使用野生型引子與突變型引子來對一樣本執行恆溫環形增幅，之後將產物進行電泳分析。恆溫環形增幅之操作條件與電泳分析條件如表2所示。電泳分析結果如第3A圖所示，其中由W、Wn、M與Mn所標示的泳道分別顯示使用野生型(wild type)引子之實驗組、使用野生型引子之負控制組(negative control)、使用突變型(mutant type)引子之實驗組，以及使用突變型引子之負控制組的結果。
由第3A圖所顯示之結果清楚顯示，在使用野生型引子之實驗組與使用突變型引子之實驗組中，皆沒有出現擴增產物。因此由上述可清楚得知，藉由日本榮研公司提供之網頁版設計軟體PrimerExplorer V4對於CYP2C9*2(rs1799853)所設之引子，並無法用於偵測CYP2C9*2(rs1799853)的多形性。
實施例1
(1)樣本取得
所使用之DNA樣本來源與比較例1相同。DNA樣本萃取步驟同比較例中所述步驟。
(2)引子設計
於此實施例中，在對於CYP2C9基因之CYP2C9*2(rs1799853)所設之引子設計範圍(序列辨識號：3)中，選取六個區域與並根據此六個區域設計出引子。所選取之六個區域之所在位置與所設計出之引子如表3所示。
(3)恆溫環形增幅
分別使用野生型引子與突變型引子來對一樣本執行恆溫環形增幅，之後將產物進行電泳分析。恆溫環形增幅之操作條件與電泳分析條件如表4所示。電泳分析結果如第 3B圖所示，其中由W、Wn、M與Mn所標示的泳道分別顯示使用野生型引子之實驗組、使用野生型引子之負控制組、使用突變型引子之實驗組，以及使用突變型引子之負控制組的結果。
由第3B圖所顯示之結果清楚顯示，在使用野生型引子之實驗組清楚出現擴增產物，而在使用突變型引子之實驗組中，沒有出現擴增產物。因此由此結果可以得知，此樣本之單核苷酸多形性CYP2C9*2(rs1799853)(C->T)之基因 型為CC(野生型)。
(4)產物的定序
將上述CYP2C9*2(rs1799853)基因進行PCR，並加以定序(以序列辨識號：18為引子來進行定序)，定序結果如第3C圖所示，其中圖上方所示之序列中以方框標示之核苷酸為CYP2C9*2(rs1799853)之單核苷酸多形性位點。由第3C圖可知，此樣本之單核苷酸多形性CYP2C9*2(rs1799853)(C->T)之基因型為CC。
根據比較例1與實施例1之結果可知，相較於比較例之引子，藉由使用本發明套組之引子可快速且正確地偵測CYP2C9基因之CYP2C9*2(rs1799853)之多形性。
B.藉由恆溫環形增幅法來測定CYP2C9基因之CYP2C9*3(rs1057910)多形性
比較例2
(1)樣本取得
所使用之DNA樣本來源與比較例1相同。DNA樣本萃取步驟同比較例中所述步驟。
(2)引子設計
利用日本榮研公司提供之網頁版設計軟體 PrimerExplorer V4，來在對於CYP2C9基因之CYP2C9*3(rs1057910)所設之引子設計範圍(序列辨識號：25)中，選取六個區域與並根據此六個區域設計出引子。所選取之六個區域之所在位置與所設計出之引子如表5所示。
(3)恆溫環形增幅
分別使用野生型引子與突變型引子來對一樣本執行恆溫環形增幅，之後將產物進行電泳分析。恆溫環形增幅之操作條件與電泳分析條件如表6所示。電泳分析結果如第4A圖所示，其中由W、Wn、M與Mn所標示的泳道分別顯示使用野生型引子之實驗組、使用野生型引子之負控制組、使用突變型引子之實驗組，以及使用突變型引子之負控制組的結果。
由第4A圖所顯示之結果清楚顯示，在使用野生型引子之實驗組與使用突變型引子之實驗組中，皆沒有出現擴增產物。因此由上述可清楚得知，藉由日本榮研公司提供之網頁版設計軟體PrimerExplorer V4對於CYP2C9*3(rs1057910)所設之引子，並無法用於偵測CYP2C9*3(rs1057910)的多形性。
實施例2
(1)樣本取得
所使用之DNA樣本來源與比較例1相同。DNA樣本萃取步驟同比較例中所述步驟。
(2)引子設計
於此實施例中，在對於CYP2C9基因之CYP2C9*3(rs1057910)所設之引子設計範圍(序列辨識號：25)中，選取六個區域與並根據此六個區域設計出引子。所選取之六個區域之所在位置與所設計出之引子如表7所示。
(3)恆溫環形增幅
分別使用野生型引子與突變型引子來對一樣本執行恆溫環形增幅，之後將產物進行電泳分析。恆溫環形增幅之操作條件與電泳分析條件如表8所示。電泳分析結果如第4B圖所示，其中由W、Wn、M與Mn所標示的泳道分別顯示使用野生型引子之實驗組、使用野生型引子之負控制組、使用突變型引子之實驗組，以及使用突變型引子之負控制組的結果。
由第4B圖所顯示之結果清楚顯示，在使用野生型引子之實驗組清楚出現擴增產物，而在使用突變型引子之實驗組中，沒有出現擴增產物。因此由此結果可以得知，此樣本之單核苷酸多形性CYP2C9*3(rs1057910)(A->C)之基因型為AA(野生型)。
(4)產物之定序
將上述CYP2C9*3(rs1057910)基因進行PCR，並加以定序(以序列辨識號：40為引子來進行定序)，定序結果如第4C圖所示，其中圖上方所示之序列中以方框標示之核苷酸為CYP2C9*3(rs1057910)之單核苷酸多形性位點。由第4C圖可知，此樣本之單核苷酸多形性CYP2C9*3(rs1057910)(A->C)之基因型為AA。
根據比較例2與實施例2之結果可知，相較於比較例之引子，藉由使用本發明套組之引子可快速且正確地偵測CYP2C9基因之CYP2C9*3(rs1057910)之多形性。
C.藉由恆溫環形增幅法來測定CYP4F2基因之rs2108622多形性
比較例3
(1)樣本取得
所使用之DNA樣本來源與比較例1相同。DNA樣本 萃取步驟同比較例中所述步驟。
(2)引子設計
利用日本榮研公司提供之網頁版設計軟體PrimerExplorer V4，來在對於CYP4F2基因之rs2108622所設之引子設計範圍(序列辨識號：48)中，選取六個區域與並根據此六個區域設計出引子。所選取之六個區域之所在位置與所設計出之引子如表9所示。
(3)恆溫環形增幅
分別使用野生型引子與突變型引子來對一樣本執行恆溫環形增幅，之後將產物進行電泳分析。恆溫環形增幅之操作條件與電泳分析條件如表10所示。電泳分析結果如第5A圖所示，其中由W、Wn、M與Mn所標示的泳道分別顯示使用野生型引子之實驗組、使用野生型引子之負控制組、使用突變型引子之實驗組，以及使用突變型引子之負控制組的結果。
由第5A圖所顯示之結果清楚顯示，在使用野生型引子之實驗組與使用突變型引子之實驗組中，皆沒有出現擴增產物。因此由上述可清楚得知，藉由日本榮研公司提供之網頁版設計軟體PrimerExplorer V4對於CYP4F2基因之rs2108622所設之引子，並無法用於偵測CYP4F2基因之rs2108622的多形性。
實施例3
(1)樣本取得
所使用之DNA樣本來源與比較例1相同。DNA樣本萃取步驟同比較例中所述步驟。
(2)引子設計
於此實施例中，在對於CYP4F2基因之rs2108622所設 之引子設計範圍(序列辨識號：48)中，選取六個區域與並根據此六個區域設計出引子。所選取之六個區域之所在位置與所設計出之引子如表11所示。
(3)恆溫環形增幅
分別使用野生型引子與突變型引子來對一樣本執行恆溫環形增幅，之後將產物進行電泳分析。恆溫環形增幅之操作條件與電泳分析條件如表12所示。電泳分析結果如第5B圖所示，其中由W、Wn、M與Mn所標示的泳道分別顯示使用野生型引子之實驗組、使用野生型引子之負控制組、使用突變型引子之實驗組，以及使用突變型引子之負控制組的結果。
由第5B圖所顯示之結果清楚顯示，在使用野生型引子之實驗組清楚出現擴增產物，而在使用突變型引子之實驗組中，沒有出現擴增產物。因此由此結果可以得知，此樣本之單核苷酸多形性CYP4F2基因之rs2108622(C->T)之基因型為CC(野生型)。
(4)產物之定序
將上述CYP4F2(rs2108622)基因進行PCR，並加以定序(以序列辨識號：63為引子來進行定序)，定序結果如第5C圖所示，其中圖上方所示之序列中以方框標示之核苷酸為CYP4F2基因之rs2108622之單核苷酸多形性位點。由第5C圖可知，此樣本之單核苷酸多型CYP4F2基因之rs2108622之基因型為CC。
根據比較例3與實施例3之結果可知，相較於比較例之引子，藉由使用本發明套組之引子可快速且正確地偵測CYP4F2基因之rs2108622之多形性。
D.藉由恆溫環形增幅法來測定VKORC1基因之VKORC1-1639(rs9923231)多形性
比較例4
(1)樣本取得
所使用之DNA樣本來源與比較例1相同。DNA樣本萃取步驟同比較例中所述步驟。
(2)引子設計
利用日本榮研公司提供之網頁版設計軟體PrimerExplorer V4，來在對於VKORC1基因之VKORC1-1639(rs9923231)所設之引子設計範圍(序列辨識號：71)中，選取六個區域與並根據此六個區域設計出引子。所選取之六個區域之所在位置與所設計出之引子如表13所示。
(3)恆溫環形增幅
分別使用野生型引子與突變型引子來對一樣本執行恆溫環形增幅，之後將產物進行電泳分析。恆溫環形增幅之操作條件與電泳分析條件如表14所示。電泳分析結果如第6A圖所示，其中由W、Wn、M與Mn所標示的泳道分別顯示使用野生型引子之實驗組、使用野生型引子之負控制組、使用突變型引子之實驗組，以及使用突變型引子之負控制組的結果。
表14、比較例4之恆溫環形增幅之操作條件與電泳分析條件
由第6A圖所顯示之結果清楚顯示，在使用野生型引子之實驗組與使用突變型引子之實驗組中，皆沒有出現擴增產物。因此由上述可清楚得知，藉由日本榮研公司提供之網頁版設計軟體PrimerExplorer V4對於VKORC1基因之VKORC1-1639(rs9923231)所設之引子，並無法用於偵測VKORC1基因之VKORC1-1639(rs9923231)的多形性。
實施例4
(1)樣本取得
所使用之DNA樣本來源與比較例1相同。DNA樣本 萃取步驟同比較例中所述步驟。
(2)引子設計
於此實施例中，在對於VKORC1基因之VKORC1-1639(rs9923231)所設之引子設計範圍(序列辨識號：71)中，選取六個區域與並根據此六個區域設計出引子。所選取之六個區域之所在位置與所設計出之引子如表15所示。
(3)恆溫環形增幅
分別使用野生型引子與突變型引子來對一樣本執行恆溫環形增幅，之後將產物進行電泳分析。恆溫環形增幅之操作條件與電泳分析條件如表16所示。電泳分析結果如第6B圖所示，其中由W、Wn、M與Mn所標示的泳道分別顯示使用野生型引子之實驗組、使用野生型引子之負控制組、使用突變型引子之實驗組，以及使用突變型引子之負控制組的結果。
由第6B圖所顯示之結果清楚顯示，在使用野生型引子之實驗組中清楚出現擴增產物，而在使用突變型引子之實驗組中沒有出現擴增產物。因此由此結果可以得知，此樣本之單核苷酸多形性VKORC1-1639(rs9923231)(T->C)之基因型為TT(野生型)。
(4)產物之定序
將上述VKORC1-1639(rs9923231)基因進行PCR，並加以定序(以序列辨識號：86為引子來進行定序)，定序結果如第6C圖所示，其中圖上方所示之序列中以方框標示之核苷酸為VKORC1-1639(rs9923231)之單核苷酸多形性位點。由第6C圖可知，此樣本之單核苷酸多形性VKORC1-1639(rs9923231)(T->C)之基因型為TT。
根據比較例4與實施例4之結果可知，相較於比較例之引子，藉由使用本發明套組之引子可快速且正確地偵測VKORC1-1639(rs9923231)之多形性。
E.藉由恆溫環形增幅法來測定VKORC1基因之VKORC1 1173(rs9934438)多形性
比較例5
(1)樣本取得
所使用之DNA樣本來源與比較例1相同。DNA樣本萃取步驟同比較例中所述步驟。
(2)引子設計
利用日本榮研公司提供之網頁版設計軟體PrimerExplorer V4，來在對於VKORC1基因之VKORC1 1173(rs9934438)所設之引子設計範圍(序列辨識號：93)中，選取六個區域與並根據此六個區域設計出引子。所選取之六個區域之所在位置與所設計出之引子如表17所示。
(3)恆溫環形增幅
分別使用野生型引子與突變型引子來對一樣本執行恆溫環形增幅，之後將產物進行電泳分析。恆溫環形增幅之操作條件與電泳分析條件如表18所示。電泳分析結果如第7A圖所示，其中由W、Wn、M與Mn所標示的泳道分別顯示使用野生型引子之實驗組、使用野生型引子之負控制組、使用突變型引子之實驗組，以及使用突變型引子之負控制組的結果。
由第7A圖所顯示之結果清楚顯示，在使用野生型引子之實驗組與使用突變型引子之實驗組中，皆沒有出現擴增產物。因此由上述可清楚得知，藉由日本榮研公司提供之網頁版設計軟體PrimerExplorer V4對於VKORC1 1173(rs9934438)所設之引子，並無法用於偵測VKORC1 1173(rs9934438)的多形性。
實施例5
(1)樣本取得
所使用之DNA樣本來源與比較例1相同。DNA樣本萃取步驟同比較例中所述步驟。
(2)引子設計
於此實施例中，在對於VKORC1基因之VKORC1 1173(rs9934438)所設之引子設計範圍(序列辨識號：93)中，選取六個區域與並根據此六個區域設計出引子。所選取之六個區域之所在位置與所設計出之引子如表19所示。
(3)恆溫環形增幅
分別使用野生型引子與突變型引子來對一樣本執行恆溫環形增幅，之後將產物進行電泳分析。恆溫環形增幅之操作條件與電泳分析條件如表20所示。電泳分析結果如第7B圖所示，其中由W、Wn、M與Mn所標示的泳道分別顯示使用野生型引子之實驗組、使用野生型引子之負控制組、使用突變型引子之實驗組，以及使用突變型引子之負控制組的結果。
由第7B圖所顯示之結果清楚顯示，在使用野生型引子之實驗組清楚出現擴增產物，而在使用突變型引子之實驗組中，沒有出現擴增產物。因此由此結果可以得知，此樣本之單核苷酸多形性VKORC1基因之VKORC1 1173(rs9934438)(A->G)之基因型為AA(野生型)。
(4)產物之定序
將上述VKORC1 1173(rs9934438)基因進行PCR，並加以定序(以序列辨識號：108為引子來進行定序)，定序結果如第7C圖所示，其中圖上方所示之序列中以方框標示之核苷酸為VKORC1 1173(rs9934438)之單核苷酸多形性位點。由第7C圖可知，此樣本之單核苷酸多形性VKORC1 1173(rs9934438)(A->G)之基因型為AA。
根據比較例5與實施例5之結果可知，相較於比較例之引子，藉由使用本發明套組之引子可快速且正確地偵測VKORC1 1173(rs9934438)之多形性。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
100‧‧‧目標基因
101‧‧‧順向內引子(forward inner primer,FIP)
103‧‧‧順向外引子(forward outer primer)
105‧‧‧逆向內引子(backward inner primer,BIP)
107‧‧‧逆向外引子(backward outer primer)
第1A-1B圖圖解說明恆溫環形增幅法的基本原理。
第2A圖顯示在進行恆溫環形增幅法期間，當所預期之F1區域的序列和所預期之B1c區域的序列分別與目標基因之F1區域與B1c區域相同時所產生的結果。
第2B圖顯示在進行恆溫環形增幅法期間，當所預期之F1區域的序列和所預期之B1c區域的序列分別與目標基因之F1區域與B1c區域不同所產生的結果。
第3A圖顯示以比較例1之引子進行恆溫環形增幅所獲得之產物的電泳圖(經負片處理)。
第3B圖顯示以實施例1之引子進行恆溫環形增幅所獲得之產物的電泳圖(經負片處理)。
第3C圖顯示以實施例1之引子進行PCR所獲得之產物的定序圖。
第4A圖顯示以比較例2之引子進行恆溫環形增幅所獲得之產物的電泳圖(經負片處理)。
第4B圖顯示以實施例2之引子進行恆溫環形增幅所獲得之產物的電泳圖(經負片處理)。
第4C圖顯示以實施例2之引子進行PCR所獲得之產物的定序圖。
第5A圖顯示以比較例3之引子進行恆溫環形增幅所獲得之產物的電泳圖(經負片處理)。
第5B圖顯示以實施例3之引子進行恆溫環形增幅所獲得之產物的電泳圖(經負片處理)。
第5C圖顯示以實施例3之引子進行PCR所獲得之產 物的定序圖。
第6A圖顯示以比較例4之引子進行恆溫環形增幅所獲得之產物的電泳圖(經負片處理)。
第6B圖顯示以實施例4之引子進行恆溫環形增幅所獲得之產物的電泳圖(經負片處理)。
第6C圖顯示以實施例4之引子進行PCR所獲得之產物的定序圖。
第7A圖顯示以比較例5之引子進行恆溫環形增幅所獲得之產物的電泳圖(經負片處理)。
第7B圖顯示以實施例5之引子進行恆溫環形增幅所獲得之產物的電泳圖(經負片處理)。
第7C圖顯示以實施例5之引子進行PCR所獲得之產物的定序圖。
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Claims (6)

  1. 一種用於偵測一目標核苷酸序列中之一特定區域的一突變及/或多形性的套組，包括：至少一第一引子，其擇自由一野生型順向內引子、一突變型順向內引子以及該野生型順向內引子與該突變型順向內引子的組合所組成之群組，其中該野生型順向內引子係序列為序列辨識號：84之引子，而該突變型順向內引子係序列為序列辨識號：85之引子；一第二引子，其中該第二引子係序列為序列辨識號：86之引子；至少一第三引子，其擇自由一野生型逆向內引子、一突變型逆向內引子以及該野生型逆向內引子與該突變型逆向內引子的組合所組成之群組，其中該野生型逆向內引子係序列為序列辨識號：89之引子，而該突變型逆向內引子係序列為序列辨識號：90之引子；以及一第四引子，其中該第四引子係序列為序列辨識號91之引子；其中該套組係用於偵測來自一個體之樣本中之一目標基因中之一特定區域的一突變及/或多形性，該目標基因為VKORC1(序列辨識號：69)，而該特定區域為VKORC1-1639(rs9923231)，而該突變及/或多形性之發生位置位於序列辨識號：69之第3586個位置，又其中該套組係使用於一聚合酶鏈鎖反應中，且其中該野生型順向內引子與該野生型逆向內引子為針對於野生型之VKORC1-1639(rs9923231)，且必須一起 使用，而該突變型順向內引子與該突變型逆向內引子為針對於突變型之VKORC1-1639(rs9923231)，且必須一起使用。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用於偵測一目標核苷酸序列中之一特定區域的一突變及/或多形性的套組，其中該至少一第一引子為該野生型順向內引子與該突變型順向內引子的組合，而該至少一第三引子為該野生型逆向內引子與該突變型逆向內引子的組合。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之用於偵測一目標核苷酸序列中之一特定區域的一突變及/或多形性的套組，其中該至少一第一引子為該野生型順向內引子，而該至少一第三引子為該野生型逆向內引子。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之用於偵測一目標核苷酸序列中之一特定區域的一突變及/或多形性的套組，其中該至少一第一引子為該突變型順向內引子，而該至少一第三引子為該突變型逆向內引子。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之用於偵測一目標核苷酸序列中之一特定區域的一突變及/或多形性的套組，更包括：一DNA聚合酶，其催化包含一股移位之互補股合成；以及核苷酸基質。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之用於偵測一目標核苷酸序列中之一特定區域的一突變及/或多形性的套組，其 中該聚合酶鏈鎖反應包括一恆溫環形增幅法。
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